ELISA-VIDITEST EDUCO Vitamin OD-351

ELISA-VIDITEST EDUCO Vitamin OD-351 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II 365, Vestec, 252 42 Jesenice, Česká Republika, tel.: +420 261 090 565, 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST EDUCO Vitamin - souprava pro školní využití k objasnění analýzy vzorku na principu přímé kompetice demonstrované na příkladu detekce vitaminu H ve vzorcích potravin. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro didaktické účely. Umožňuje stanovení přibližné koncentrace vitaminu H ve vzorcích. Vitamin H (také označován jako biotin nebo vitamin B7) se vyskytuje v různých potravinách. Vyšší obsah tohoto vitaminu je v játrech, houbách, ořechách, luštěninách, dále se nachází také v různých druzích ovoce a zeleniny. Je přidáván do různých výživových doplňků, multivitaminových preparátu a léčiv. Tento test umožňuje semikvantitativní analýzu tedy určení přibližného obsahu vitaminu H (v případě manuálního vyhodnocení) nebo jeho kvantitativní stanovení (použitím fotometrického stanovení absorbance). Zároveň slouží jako demonstrace imunoanalytického stanovení látky na principu přímé kompetice analytu s detekční afinitní molekulou. V návodu jsou popsány jednotlivé kroky stanovení, doplněné praktickou ukázkou testu. Souprava obsahuje 4 standardy s různou koncentrací vitaminu H, které umožňují stanovení přibližného obsahu vitaminu H ve vzorcích. Rozsah citlivosti je 0,5 až 1000 ng/ml. Výsledek lze hodnotit bez speciálního laboratorního vybavení (reader/fotometr). 3. OBSAH SOUPRAVY: ELISA dvojstripy (16 jamek) potažené antigenem STRIPS Sada reagencií pro studenty obsahující: kalibrační standardy vitaminu H 1000, 100, 10 a 1 ng/ml, r.t.u.* á 0,5 ml STAN konjugát Str-Px s odlamovacím kapátkem, r.t.u., á 2 ml CONJ Str-PX chromogensubstrátový roztok TMB s odlamovacím kapátkem, r.t.u., 3 ml SUBS stop roztok s odlamovacím kapátkem, r.t.u., á 3 ml STOP Promývací roztok, 10x konc., á 60 ml WASH 10x Ředicí roztok, r.t.u., 125 ml DIL kapátko 1 ml se stupnicí členěnou po 0,25 ml přehledný návod a protokol pro studenty** návod k použití soupravy** certifikát kontroly kvality 6 ks 6 ks 4ks 1 ks 1 ks 6 ks pozn.: * r.t.u. ready to use (připraveno k použití), složka je v pracovní koncentraci a nevyžaduje další ředění ** protokol a návod je volně ke stažení ve formátu pdf na > Ke stažení > Návody a bezpečnostní listy. 1

4. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Vzorky potravin (více v sekci 6. Příprava vzorků), destilovaná voda pro ředění promývacího roztoku (lze použít i obyčejnou vodu, ta však může v závislosti na kvalitě slabě zabarvit pozadí reakce), odměrný válec pro přípravu promývacího roztoku, kádinka nebo vanička s vodou na promývání kapátka, odpadní nádoba, zkumavky, gáza/filtrační papír/buničitá vata na osušení stripů po promývání, hodinky/stopky na měření inkubačních časů. 5. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST EDUCO Vitamin je imunoanalytický test na pevné fázi na principu přímé kompetice. Pro stanovení vitaminu H je využitá jeho velmi silná (vysokoafinitní) a specifická vazba na protein streptavidin. Na povrch jamek mikrotitrační destičky je již navázaný vitamin H, který v této soupravě kompetuje ( soupeří ) s volným vitaminem ve vzorku o vazebné místo na streptavidinu. Spolu se vzorkem se přidává i detekční agens (v tomto případě streptavidin), který se specificky váže na stanovovanou látku. Streptavidin se zachytí na vitamin H uchycený na povrchu jamky. V případě, že ve vzorku je přítomný volný vitamin H, část streptavidinu se spojí s tímto volným vitaminem a není už schopný vytvořit vazbu s ukotveným vitaminem na povrchu jamky. Nezachycený streptavidin je při následném promytí jamek pomocí promývacího roztoku odstraněn. Množství zachyceného streptavidinu je proto nepřímo úměrné koncentraci volného vitaminu H ve vzorku. Aby bylo možné určit množství zachyceného streptavidinu, je tento spojen (konjugován) s enzymem křenovou peroxidázou. Tento enzym reakcí s chromogenním substrátem proměňuje barvu roztoku substrátu z čiré na modrou, a to v intenzitě závislé na množství přítomného komplexu streptavidinperoxidázy v jamce. Po určitém čase se reakce zastaví přidáním tzv. STOP roztoku, aby reakce dál neprobíhala, a zároveň dojde k změně zbarvení z modré na žlutou. Protože se jedná o přímou kompetici, v jamkách, kde nebyl žádný volný vitamin ve vzorcích, je zbarvení nejintenzivnější, a naopak, kde je vitaminu H nejvíc, k zabarvení nedojde vůbec, nebo jenom částečně. Promývání: Mezi jednotlivými kroky testu je potřeba odstranit z jamek nenavázané komplexy. Pokud by nedošlo k promytí jamek, na konci testu by došlo k zabarvení jamek i bez přítomnosti hledaných látek. Konjugát Str/Px: Konjugace znamená sloučení dvou či více látek pomocí chemické či jiné reakce. Pro potřeby imunologických testů se nejvíce používá konjugát zvířecí protilátky proti cílové molekule s indikátorem reakce, v tomto testu je to peroxidáza (Px). Dalšími indikátory mohou být např. fluorescein isothiokyanát (FITC), biotin (BIOT), alkalická fosfatáza (AP),... Ze zvířat se na produkci anti-lidských protilátek běžně používají kozy, prasata, ovce, myši. Substrátový roztok: Roztok na bázi barviva tetramethyl benzidin s obsahem peroxidu vodíku. Díky enzymu (v tomto testu peroxidáza obsažená v konjugátu) dojde v substrátu ke katalytické reakci a postupné změně zbarvení roztoku do modra. Pokud v jamkách není navázaný peroxidázový konjugát, nedojde k aktivaci substrátu a jamky zůstanou bez zabarvení. Stop roztok: Slabý roztok kyseliny, který zastaví reakci v substrátu. Reakce substrátu by jinak probíhala pozvolna až do vyčerpání některé složky substrátu. Aby v laboratorní praxi byly výsledky srovnatelné, reakce se po daném časovém úseku zastavuje. Zároveň dojde ke změně barvy z modré na žlutou, která je měřitelná na fotometru při vlnové délce přibližně 450 nm. V případě pozitivních vzorků je žluté zbarvení viditelné i okem. 2

6. PŘÍPRAVA VZORKŮ: Pro provedení testu je vhodné použít různé vzorky s potenciálním, nebo deklarovaným obsahem vitaminu H. Deklarovaný obsah vitamínu H mají zejména různé ve vodě rozpustné multivitaminy, multivitaminové džusy a výživové doplňky pro sportovce, léčiva apod. Vitamin H se dále nachází v různých ovocných a zeleninových šťávách a džusech. Také je možné připravit vodné extrakty z jiných materiálů. Extrakty před stanovením v testu zbavte pevných částic pomocí filtrace. Tekuté vzorky nařeďte pro stanovení volného vitaminu H v závislosti na předpokládané koncentraci vitaminu H (práškové nebo tabletované výživové doplňky rozpusťte v definovaném poměru ve vodě, např. 1 šumivá tableta do 100 ml vody). Vzorky s uměle přidaným vitaminem H v koncentraci více než 1 µg/100 ml (většina multivitaminových preparátů) nařeďte v poměru 1:1 a 1:100. Příhodné šťávy, extrakty a vzorky s neznámým obsahem nařeďte 1:1 a 1:10. Ředění vzorku v poměru 1:1 proveďte pomocí kapátka tak, že 1 dílek na kapátku (250 µl) vzorku smíchejte ve zkumavce s 1 dílkem (250 µl) ředicího roztoku (DIL). Pro ředění 1:10 do zkumavky přidejte 2,25 ml ředicího roztoku (2 celá kapátka a jeden dílek) a smíchejte s 1 dílkem (250 µl) vzorku. Podobně pro ředění 1:100 smíchejte ve zkumavce 2,5 ml ředicího roztoku s jednou kapkou (25 µl) vzorku. Zkumavky krouživým pohybem důkladně promíchejte. Ředicí roztok může změnit barvu po přidání vzorku. Pro jednu pracovní skupinu je optimální 3 až 5 vzorků naředěných dvěma způsoby, tedy 6 až 10 zkumavek s neznámým obsahem vitaminu H. Použité vzorky a jejich ředění zaznamenejte do protokolu. Kalibrační standardy nijak neřeďte, jsou v pracovní koncentraci připravené k použití. 7. PRACOVNÍ POSTUP: Test je možné kompletně provést pomocí přiložených kapátek a jedno kapátko je možné použít na celý test. Je nutné po každém kroku kapátko propláchnout min. 2x vodou, než bude použito pro další složku. Při promývaní kapátka nasajte čistou (destilovanou) vodu po balónek a kapátko vyprázdněte do odpadní nádoby. Jedna kapka je přibližně 25 µl. Vyvarujte se nasátí roztoku až do balónku kapátka. V případě, že jsou v laboratoři k dispozici mikropipety s vhodnými jednorázovými špičkami, test je možné provést pomocí nich. Z lahvičky konjugátu, substrátu a stop roztoku lze po ulomení špičky kapat roztok přímo do jamek. Celá skupina (1 souprava = 6 dvojstripů): a. Vyndejte složky soupravy na stůl a nechte je přizpůsobit laboratorní teplotě (cca 10 minut). Stripy s jamkami vyjměte ze sáčku až po vytemperování na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení jamek. Všechny složky důkladně promíchejte několikanásobným otočením lahviček. Pokud provádíte test na barevném stole, je vhodné podložit si stripy bílým papírem pro lepší přehled při kapání do jamek a posouzení barvy v jamkách. Ředicí roztok může být rozdělen pro jednotlivé pracovní skupiny přelitím do vhodných lahviček (zkumavek) po 20 ml. b. Pro celou skupinu připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu vody pomocí odměrného válce (např. 60 ml promývacího roztoku + 540 ml H 2 O). Použitý postup přípravy promývacího roztoku zaznamenejte do protokolu. Promývací roztok přelijte do vhodné kádinky/vaničky, aby se dal při promývání snadno nasávat kapátkem. Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, nechte jej uložený při laboratorní teplotě, případně jej zahřejte ve vodní lázni na cca +37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok naředěný na pracovní koncentraci lze skladovat maximálně 2 týdny při teplotě +2 až +10 o C. V případě, že se naředěný promývací roztok skladováním zakalí nebo v něm vznikne sediment, dál ho nepoužívejte a zlikvidujte ho. 3

Jednotlivci (1 dvojstrip): c. Do protokolu si připravte rozpis vzorků. Jako negativní kontrolu použijte ředicí roztok. Kalibrační standardy a vzorky je vhodné přidat v duplikátech dvě jamky. Dvě jamky se používají pro minimalizování laboratorní chyby. Doporučený rozpis je uveden ve schématu aplikace vzorků níže. Vzorky lze ale uspořádat v závislosti na jejich počtu a způsobu ředění i jinak. d. Nakapejte 2 kapky (50 µl) standardů a vzorků do jamek podle rozpisu. Po každém vzorku kapátko důkladně propláchněte vodou! Kapátkem se nedotýkejte stěn nebo dna jamek aby nedošlo k porušení navázané vrstvy! e. Do všech jamek nakapejte 2 kapky (50 µl) konjugátu streptavidin-peroxidázy (CONJ Str-PX) přímo z lahvičky s kapátkem. Stopujte čas od přidání konjugátu do poslední jamky. Obsah jamek opatrně promíchejte jemným poklepáním po straně stripu. f. Inkubujte 30 minut (± 1 min.) při laboratorní teplotě. g. Promytí. Otočením stripu dnem vzhůru a mírným švihem vyklepněte obsah jamek do sběrné odpadní nádoby nebo do výlevky (umyvadla). Všechny jamky naplňte kapátkem (nebo jiným vhodným způsobem, např. stříkačkou) po okraj naředěným promývacím roztokem. (Do jamky se vejde cca 0,3 ml promývacího roztoku). Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Poté opět vyklepněte promývací roztok z jamek. Celkem proveďte promytí 5x a na konci vyklepněte promývací roztok, aby jamky zůstaly před dalším krokem prázdné. Kapky na povrchu stripu můžete otřít poklepáním o kousek gázy nebo filtračního papíru. h. Nakapejte přímo z lahvičky s kapátkem do všech jamek chromogensubstrátový roztok TMB (SUBS) po 3 kapkách (0,1 ml TMB/jamka). Stopujte čas od přidání substrátu do první jamky. i. Inkubujte 15 minut (± 1 min.) při laboratorní teplotě. V jamkách s nízkou koncentrací vitaminu H se začne objevovat modré zbarvení. j. Zastavte reakci přidáním 3 kapek stop roztoku (STOP) do všech jamek (0,1 ml STOP/jamka). Obsah jamek opatrně promíchejte jemným poklepáním po straně stripu. k. Zkontrolujte výsledné zbarvení jamek. V jamkách s aplikací ředicího roztoku by mělo dojít k intenzivnímu žlutému zabarvení, neboť neobsahuje žádný vitamin H. Naopak v jamkách s kalibračními standardy byste měli pozorovat snižování intenzity zabarvení v závislosti na koncentraci vitaminu H. Ve vzorku standardu 1000 ng/ml (nejvyšší koncentrace vitamínu H) by nemělo dojít k žádnému zbarvení. Podle schématu přiřaďte jednotlivým standardům odpovídající hodnocení +++ (intenzivně zbarvené) až - (nezbarvené). Srovnáním intenzity zabarvení standardů a vzorků přiřaďte taktéž hodnocení +++ až - jednotlivým vzorkům. 8. HODNOCENÍ TESTU: Schéma aplikace vzorků a vyhodnocení testu: Vzorky 1 2 Odečet hodnot Přibližný obsah vitaminu H A NK NK +++ < 0,5 ng/ml B 1 ng/ml 1 ng/ml ++ 0,51 5 ng/ml C 10 ng/ml 10 ng/ml + 5,1 50 ng/ml D 100 ng/ml 100 ng/ml +/- 51 500 ng/ml E 1000 ng/ml 1000 ng/ml - > 501 ng/ml F VZ1 1:1 VZ1 1:100 G VZ2 1:1 VZ2 1:100 H VZ3 1:1 VZ3 1:100 4

Manuální vyhodnocení: Podle přiřazeného odečtu intenzity zbarvení přiřaďte vzorkům odhadovanou koncentraci vitaminu H. Podle ředění přepočtěte stanovenou koncentraci vitaminu H na skutečný obsah v neředěném vzorku. V případě ředění 1:1 hodnotu vynásobte 2x, v případě ředění 1:10 násobte hodnotu 11x, podobně v případě ředění 1:100 násobte 101x. Vypočtené hodnoty zapište do protokolu. Fotometrické vyhodnocení: Pokud máte k dispozici vhodný fotometr, ať už pro 96 jamkové destičky nebo pro kyvety, je možné zpřesnit stanovení koncentrace vitaminu H a odečet hodnot na základě kalibrační křivky. Pomocí fotometru určete absorbanci všech standardů a vzorků při vlnové délce 450 nm (+- 20 nm). Z naměřených hodnot standardů sestrojte kalibrační křivku se závislosti absorbance (A450) na koncentraci vitaminu H. Určete rovnici kalibrační křivky pro přepočet absorbance na koncentraci (např. pomocí programu MS Excel). Hodnoty absorbance neznámých vzorků přepočtěte na koncentraci a vynásobte použitým ředěním (2x v případě ředění 1:1, 11x v případe 1:10 resp. 101x z ředění 1:100). Vypočtené hodnoty zapište do protokolu. Příklad kalibrační křivky: Interpretace nestandardních výsledků: Pokud ve vzorku ředěného 1:1 nedojde k žádnému zbarvení a substrát zůstal čirý, je hodnota obsahu vitaminu H nad rozsahem stanovení pomocí tohoto testu. V tomto případě použijte odhad jenom z vyššího ředění. Pokud je naopak v ředění vzorku 1:10 nebo 1:100 zbarvení stejné intenzity jako negativní kontrola, použijte pro odhad koncentrace jenom ředění 1:1. V případě, že jsou obě ředění intenzivně zbarvené na úrovni negativní kontroly, je obsah vitaminu H nižší než je citlivost tohoto testu (méně než 0,5 ng/ml), a vzorek neobsahuje množství vitaminu H stanovitelné tímto testem. Pokud by v případě ředění 1:1 byl vzorek bez zbarvení, ale ředění 1:100 by bylo v intenzitě odpovídající negativní kontrole, mohlo dojít v důsledku nespecifické inhibice testu koncentrovaným vzorkem k falešně pozitivnímu výsledku (např. příliš kyselá ovocná šťáva). Pokud je ve všech jamkách intenzivní žluté zbarvení, stripy byly nedostatečně promyté nebo nebyly správně přidané vzorky standardů. Slabý signál ve všech (i negativních) kontrolách může být způsobený zkrácením inkubačních časů nebo deaktivací konjugátu streptavidin-peroxidázy např. nevhodným skladováním. 5

9. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Tekuté odpady vzniklé při promývání a po ukončení testu likvidujte naředěním pod tekoucí vodou do výlevky. Se stop roztokem (velmi slabý roztok kyseliny sírové) pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími pomůckami. Při práci doporučujeme používat ochranné rukavice. Po práci si umyjte ruce mýdlem. Souprava neobsahuje složky připravené z lidské krve (séra) ani jiný potenciálně infekční materiál. Obalový materiál jednotlivých složek likvidujte do směsného odpadu. 10. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. Použitím jiných než přiložených složek může dojít k nesprávnému výsledku testu. b. Při odebírání, ředění a manipulaci s reagenciemi postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. c. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. d. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout například nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím; nedodržováním inkubací uvedených v bodě 7; nepřesným kapáním a potřísněním sousedních jamek vzorky nebo konjugátem; použitím stejného kapátka bez vypláchnutí při aplikaci různých roztoků. e. Kapátka můžete používat i opakovaně. Po použití je několikrát propláchněte vodou a nechte uschnout. 11. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C (v lednici). Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoli složky soupravy, ihned informujte výrobce. Datum poslední revize: 9/2013 6