Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2

Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 1 destička - 96 72561 5 destiček - 480 72562 KOMBINOVANÁ SCREENINGOVÁ SOUPRAVA NA ZJIŠŤOVÁNÍ PROTILÁTEK ANTI-HCV A ANTIGENU VIRU HEPATITIDY C V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ TECHNIKOU ENZYMATICKÉ IMUNOANALÝZY 862224 2014/09 1 [CZ]

OBSAH 1. POUŽITÍ... 3 2. DIAGNOSTICKÝ VÝZNAM TESTU... 3 3. PRINCIP METODY... 3 4. REAGENCIE... 4 5. VAROVÁNÍ A UPOZORNĚNÍ... 5 6. VZORKY... 7 7. POSTUP... 7 8. OMEZENÍ TESTU... 10 9. FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY... 11 10. LITERATURA... 14 2 [CZ]

1. POUŽITÍ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 je kvalitativní enzymatická imunoanalýza pro detekci infekce virem hepatitidy C (HCV) založená na zjištění přítomnosti protilátek anti-hcv a kapsidového antigenu v séru nebo lidské plazmě. Tento skríningový test na hepatitidu C lze využívat v diagnostických laboratořích a krevních bankách. 2. DIAGNOSTICKÝ VÝZNAM TESTU Virus hepatitidy C (HCV) je obalený virus prokazovaný přítomností své RNA (9,5 kb), náležející do čeledi Flaviviridae, v níž bylo identifikováno šest hlavních genotypů. HCV je považován za hlavní příčinu virové hepatitidy non-a a non-b. Infekce HCV má charakteristickou akutní i chronickou formu, která může vést k cirhóze a hepatocelulárnímu karcinomu. Sérologický průkaz infekce HCV se provádí z krevních rozborů, kterými se zkoumají antigeny HCV, protilátky či RNA viru. Ve srovnání s testem na samotné protilátky anti-hcv může kombinovaného screeningového testu na protilátky anti-hcv i kapsidový antigen HCV redukovat sérologické okno a zlepšit detekci infekce. 3. PRINCIP METODY Test Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 je založen na pevné fáze připravené z purifikovaných antigenů: dvou rekombinantních proteinů z nestrukturální část (NS3 a NS4), peptidu ze strukturální části (kapsidu) viru hepatitidy C a monoklonální protilátky proti kapsidu hepatitidy C. Kapalná fáze sestává ze dvou konjugátů. První konjugát (R6) je složen z biotinylované myší monoklonální protilátky proti kapsidu hepatitidy C. Tato monoklonální protilátka nereaguje na kapsidový peptid použitý v pevné fázi. Druhý konjugát (R7) je směsí peroxidázou značených myších antilidských protilátek IgG a peroxidázou značeného streptavidinu. Reakční kroky analytické procedury: 1) Konjugát 1, testované vzorky a kontrolní séra se napipetují do jamek mikrodestičky. Jestliže jsou přítomny protilátky proti HCV, navážou se na antigeny zachycené na pevné fázi. Jestliže je přítomen kapsidový antigen hepatitidy C, navážou se na něj monoklonální protilátky tvořící povrch pevné fáze a biotinylované monoklonální protilátky proti kapsidovému antigenu hepatitidy C (konjugát 1). 2) Po 90minutové inkubaci při teplotě 37 C a promytí se do každé jamky mikrodestičky přidá konjugát 2 obsahující peroxidázou značené antilidské protilátky IgG a peroxidázou značený streptavidin. Jestliže je přítomen lidský IgG, po reakci s pevnou fází se naváže antilidský konjugát IgG na lidské protilátky. Pokud je ve vzorku kapsidový antigen HCV, konjugát peroxidáza-streptavidin se naváže na biotin konjugátu 1. 3) Po 30minutové inkubaci při teplotě 37 C se nenavázaný enzymatický konjugát vymyje a po přidání substrátu se prokáže komplex antigenu, protilátky a peroxidázy. 4) Po 30 minutách inkubace při teplotě laboratorní místnosti (18 30 C) a po ukončení reakce se odečtou hodnoty na spektrofotometru při 450/620 700 nm. Naměřená absorbance vzorku umožňuje ve vzorku detekovat protilátky proti HCV a kapsidové antigeny hepatitidy C. Intenzita barvy je úměrná množství protilátek proti HCV a kapsidového antigenu hepatitidy C navázaného na pevné fázi. 3 [CZ]

4. REAGENCIE 4.1. Popis R1 R2 R3 R4 R5a R5b Označení na štítku Microplate Concentrated washing solution (20X) Negative control Positive control Antigen positive control Antigen diluent R6 Conjugate 1 R7 Conjugate 2 R8 R9 Substrate buffer Chromogen: TMB solution (11X) Popis Mikrotitrační destička 12 proužků po 8 jamkách potažených monoklonální protilátkou proti apsidě VHC, purifikovanými rekombinantními antigeny hepatitidy C (NS3, NS4) a kapsidovým peptidem HCV. Specifické identifikační číslo = 93 Koncentrovaný promývací roztok (20X) Pufr Tris NaCl, ph 7,4 Konzervant: ProClin 300 (0,04 %) Negativní kontrola Pufr Tris HCI obsahující hovězí sérový albumin (BSA), Konzervant: ProClin 300 (0,1 %) Pozitivní kontrola Lidské sérum obsahující protilátky proti HCV, negativní na HBs antigen a na protilátky anti HIV-1 a anti HIV-2 ředěné v pufru Tris HCI s obsahem BSA a fotochemicky inaktivované. Konzervant: ProClin 300 (0,1 %) Kontrola pozitivní na antigen Syntetická antigen pozitivní kontrola obsahující lyofilizovaný kapsidový peptid. Ředící roztok pro antigen R5a Destilovaná voda s konzervantem: ProClin 300 (0,5 %) Konjugát 1 Myší biotinylované monoklonální protilátky proti kapsidovému antigenu HCV. Zabarveno fialově Konzervant: Azid sodný (< 0,1 %), Cosmocil CQ (0,025 %) Konjugát 2 Myší protilátky cílené proti lidskému IgG značené peroxidázou a streptavidin značený peroxidázou. Zabarveno zeleně Konzervant: ProClin 300 (0,5 %) Substrát Roztok kyseliny citronové a octanu sodného, ph 4,0, obsahující H 2 O 2 (0,015 %) a 4 % dimethylsulfoxidu Chromogen: Roztok TMB Roztok obsahující 3.3, 5.5 tetramethylbenzidin (TMB) Provedení Příprava 72561 1 destička 70 ml K naředění 1 ml 1,5 ml q.s. ad 1 ml K rekonstituci 1 ml K rekonstituci 15 ml 15 ml 60 ml K rekonstituci 5 ml K naředění Provedení Příprava 72562 5 destiček 235 ml K naředění 1 ml 3 ml q.s. ad 1 ml K rekonstituci 1 ml K rekonstituci 2 lahvičky 2 x 30 ml 2 lahvičky 2 x 30 ml 2 lahvičky 2 x 60 ml K rekonstituci 2 lahvičky 2 x 5 ml K naředění 4 [CZ]

R10 Stopping solution Zastavovací roztok Roztok kyseliny sírové (H 2 SO 4 1N) 4.2. Podmínky uchovávání a zacházení 28 ml 3 lahvičky 3 x 28 ml Soupravu uchovávejte při teplotě 2 8 C. Součásti soupravy uchovávané při 2 8 C lze použít do data exspirace uvedeného na obalu (není-li uvedeno jinak). Po otevření, nedojde-li ke kontaminaci, lze reagencie R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 a R10 uchovávané při 2-8 C použít do data exspirace uvedeného na štítku. Identifikace R1 R2 R5a + R5b R8 + R9 Uchovávání Po otevření vakuového obalu lze proužky s jamkami uchovávané při 2 8 C používat 1 měsíc, pokud jsou dobře uzavřené v původním obalu s páskou. Naředěný promývací roztok lze 2 týdny uchovávat při teplotě 2 30 C. Koncentrovaný promývací roztok (R2) uchovávejte při teplotě 2 30 C. Po rekonstituci lze pracovní roztok kontroly pozitivní na antigen (R5) uchovávat 1 měsíc při teplotě 2 8 C a 2 měsíce při teplotě -20 C (při zmrazování na -20 C snese až 5 cyklů zmrazení a rozmrazení). Po rekonstituci lze reagencie uchovávat při pokojové teplotě (18 30 C) 6 hodin. 5. VAROVÁNÍ A UPOZORNĚNÍ Pouze pro diagnostiku in vitro prováděnou odborným zdravotnickým personálem. 5.1. Upozornění k ochraně zdraví a bezpečnosti Tuto testovací soupravu smí používat pouze kvalifikovaní pracovníci vyškolení v laboratorních postupech a seznámení s možnými riziky. Používejte vhodný ochranný oděv, rukavice a brýle nebo obličejový štít a při manipulaci postupujte podle zásad správné laboratorní praxe. Testovací souprava obsahuje složky lidské krve. Materiály lidského původu použité pro přípravu reagencie R4 (pozitivní kontroly) byly zkouškami ověřeny jako nereaktivní na povrchový antigen hepatitidy B (HBs Ag), na protilátky proti virům lidské imunodeficience (HIV-1 a HIV-2 Ab) a jako pozitivní vůči protilátkám anti-hcv. Pozitivní kontrola R4 je teplem inaktivovaná. Žádná známá testovací metoda nemůže poskytnout záruku, že nejsou přítomny infekční složky. Z tohoto důvodu je nutné nakládat se všemi deriváty lidské krve, reagenciemi a vzorky lidského původu jako s materiálem schopným přenosu infekčních chorob a dodržovat doporučené bezpečnostní zásady stanovené platnými předpisy. Úniky biologického materiálu: Uniklý materiál lidského původu je nutno považovat za potenciálně infekční. Uniklý materiál neobsahující kyselinu musí být okamžitě dekontaminován stejně jako postižené místo, materiály a všechny kontaminované předměty a zařízení pomocí chemického dezinfekčního prostředku účinného na biologická nebezpečí hrozící v souvislosti s příslušnými vzorky. Obvykle se používá roztok chlornanového čisticího prostředku zředěného 1:10, 70 80% etanol, izopropanol, jodofor (například 0,5% Wescodyne Plus). Vše utřete do sucha. Uniklé látky s obsahem kyselin je nezbytné odpovídajícím způsobem vysát (vytřít) nebo neutralizovat a postižené místo omýt vodou a utřít do sucha. Materiály a pomůcky použité k likvidaci je třeba zlikvidovat jako biologicky nebezpečný odpad. Postižené místo je třeba dekontaminovat chemickým dezinfekčním prostředkem. POZNÁMKA: Roztoky obsahující chlornanový čisticí prostředek nevkládejte do autoklávu. 5 [CZ]

Se všemi vzorky a materiály použitými v testu zacházejte jako s infekčními. Při nakládání s laboratorním, chemickým a biologickým odpadem a při jeho likvidaci dodržujte veškeré platné místní, regionální a národní předpisy. Piktogramy na štítcích a v pokynech na konci návodu k upozorňují na nebezpečí a doporučení k některým součástem této testovací soupravy. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese www.bio-rad.com. 5.2. Upozornění k metodě 5.2.1. Příprava Spolehlivost výsledků je závislá na důsledné aplikaci zásad předepsané laboratorní praxe: Nepoužívejte prošlé reagencie. V testu nemíchejte a nekombinujte reagencie různých šarží. Před m nechte reagencie 30 minut ustálit na pokojovou teplotu (18 30 C). Rámeček každé mikrodestičky musí být označen názvem a specifickým identifikačním číslem testu. Toto specifické identifikační číslo musí být uvedeno také na každém proužku. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2: Specifické identifikační číslo = 93 Před m specifické identifikační číslo zkontrolujte. Pokud specifické identifikační číslo chybí, nebo je jiné než číslo připravované analýzy, proužek nepoužijte. POZNÁMKA: U promývacího roztoku (R2, označení na štítku: 20X, zeleně), peroxidázového substrátového pufru (R8, označení na štítku: TMB buffer, modře), chromogenu (R9, označení na štítku: TMB 11X, fialově) a zastavovacího roztoku (R10, označení na štítku: 1N, červeně) lze použít jiné šarže než z vlastní soupravy, stejná šarže však musí být použita na celou sérii testů. Tyto reagencie lze použít i s některými jinými našimi výrobky. Podrobnosti sdělí naše technická služba. Rekonstituci reagencií provádějte pozorně, aby nemohlo dojít k žádné kontaminaci. Používejte sklo důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou, nebo raději pomůcky na jedno. Chraňte mikrodestičky před vyschnutím v době mezi ukončením promývacího cyklu a přidáním reagencií. Reakce enzymů jsou velmi citlivé na ionty kovů. Chraňte proto veškeré roztoky konjugátů a substrátů před stykem s kovovými součástmi. Vyvíjecí roztok (substrátový pufr a chromogen) musí být zbarvené růžově. Změna růžové barvy během několika minut po rekonstituci znamená, že reagencie je nepoužitelná a je nutné ji vyměnit. Vyvíjecí roztok se připravuje v čisté plastové nádobě na jedno nebo ve skleněné nádobě omyté v 1N HCl, dobře vypláchnuté destilovanou vodou a vysušené. Tuto reagencii je nutné uchovávat v temnu. Nikdy nepoužívejte stejnou nádobu na konjugát a vyvíjecí roztok. 5.2.2. Zpracování Neměňte postup testu. Test neprovádějte v prostředí s reaktivními výpary (kyselin, alkálií, aldehydů) nebo prachem s potenciálem měnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Na každý vzorek používejte novou špičku. Promývání má na zpracování kritický vliv. Dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a přesvědčte se, zdali jsou všechny jamky zcela naplněny a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promývání může vést k nepřesným výsledkům. Pro maximální účinnost testu důsledně dodržujte předepsané promývací procedury. Pro akceptovatelnou úroveň OD negativních vzorků je na některých přístrojích nezbytné proceduru promývání optimalizovat (zvýšit počet cyklů promývání, změnit objem promývacího pufru na jeden cyklus). Pro úpravy a speciální postupy kontaktujte zástupce naší společnosti. 6 [CZ]

6. VZORKY Krevní vzorky odeberte obvyklým způsobem. Analýzy se provádějí v séru nebo plazmě v neředěném stavu (odběry do EDTA, do citrátu sodného nebo ACD). Použití vzorků odebraných do zkumavek obsahujících heparinát lithný se nedoporučuje. Ze vzorků testovaných na antigen HCV byl pozorován signál nižší úrovně. Vzorky, v nichž se vyskytují agregované shluky, je nezbytné před analýzou pročistit odstředěním. Rozptýlené fibrinové částice nebo jiné agregáty mohou způsobit chybně pozitivní výsledky. Pro testy do 7 dnů po odběru lze vzorky uchovávat při teplotě 2 8 C, jinak musí být zamrazeny na - 20 C. Vzorky smí projít nanejvýš třemi cykly zmrazení a rozmrazení. Vzorky rozmrazujte při pokojové teplotě (18 30 C). Před m se doporučuje homogenizace vzorku několikerým převrácením. Vzorky obsahující max. 120 g/l albuminu, 50 µg/l biotinu a 200 mg/l bilirubin nebo max. 33 g/l trioleinu a vzorky obsahující 2 g/l hemoglobinu neovlivňují výsledky. Nedoporučuje se ovšem používat kontaminované hyperlipemické a hyperhemolyzované vzorky. Vzorky se nedoporučuje zahřívat, protože tím dochází k oslabení schopnosti detekovat antigen HCV. Pokud se vzorky přepravují, musí být adjustované podle platných zásad pro přepravu etiologických činidel a nejlépe zmrazené. 7. POSTUP 7.1. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Destilovaná voda Chlornan sodný a bikarbonát sodný. Absorpční papír Adhezivní fólie Rukavice na jedno Ochranné brýle Zkumavky na jedno Automatické či poloautomatické nastavitelné pipety nebo multipipety na měření a dávkování 50, 80, 100, 200 μl a 1 ml. Odměrné válce se značením 10, 200 a 1000 ml. Míchačka Vortex Automatický, poloautomatický a ruční systém promývání mikrotitračních destiček Vodní lázeň nebo vhodný inkubátor mikrodestiček, termostaticky nastavený na teplotu 37 ±1 C (*). Nádoba na biologicky nebezpečný odpad. Spektrofotometr pro mikrotitrační destičky s filtry 450, 490 a 620 700 nm (*). (*) Doporučené vybavení je účelné konzultovat s naším technickým úsekem. 7.2. Příprava reagencií 7.2.1. Reagencie hotové k Reagencie 1 (R1): Mikrotitrační destička Každý rámeček na 12 proužků je zabalen do uzavíratelného sáčku. Sáček rozstřihněte nebo rozřízněte 0,5 až 1 cm nad uzávěrem. Rozevřete sáček a vyndejte rámeček. Nepoužité proužky uložte zpět do sáčku. Uzavřete sáček opatrně s páskou a dal ji zpět do skladu při teplotě +2 8 C. Reagencie 6 (R6): Konjugát 1 Před m několikerým převrácením zhomogenizujte. Reagencie 7 (R7): Konjugát 2 Před m několikerým převrácením zhomogenizujte. 7 [CZ]

7.2.2. Reagencie k rekonstituci Reagencie 2 (R2): Koncentrovaný promývací roztok (20X) Destilovanou vodou nařeďte v poměru 1:20 na hotový promývací roztok. Pro jednu destičku s 12 proužky připravte 800 ml. Reagencie 8 (R8) + reagencie 9 (R9): Enzymatický vyvíjecí roztok Chromogen (R9) nařeďte 1:11 v substrátovém pufru (např. 1 ml reagencie R9 + 10 ml reagencie R8). Pro 12 proužků je třeba 10 ml. Zhomogenizujte roztok. Reagencie 5a (R5a) + reagencie 5b (R5b): Pracovní roztok (R5) Nalijte obsah ředícího roztoku R5b do lahvičky s lyofilizovaným Ag R5. Zavřete lahvičku a nechte ji 10 minut stát při pokojové teplotě (18 30 C). Čas od času ji pro účinnější rozpouštění protřepte a převraťte. 7.3. Postup analýzy Předepsaný postup důsledně dodržujte. Pro každou sérii testu proveďte kontrolu negativním i pozitivním sérem pro validaci kvality testu. Dbejte zásad správné laboratorní praxe: 1) Pečlivě sestavte plánek distribuce a identifikace vzorků. 2) Nařeďte si promývací roztok R2 a pracovní roztok pozitivní kontroly na antigen (R5a + R5b). (Viz 7.2) 3) Vyndejte z ochranného obalu rámeček a potřebný počet proužků (R1). Nepoužité proužky uložte zpět do sáčku. Uzavřete sáček a uložte jej do místa s teplotou 2 8 C. 4) Naplňte jamky následujícím (doporučeným) způsobem: 100 μl konjugátu 1 (R6) do každé jamky 50 μl negativní kontroly (R3) do jamky A1 50 μl pozitivní kontroly (R4) do jamek B1, C1, D1 50 μl pracovního roztoku pozitivní kontroly na antigen (R5a + R5b) do jamky E1 50 μl prvního vzorku (R3) do jamky F1 50 μl druhého vzorku (R3) do jamky G1 atd. Zhomogenizujte směsi alespoň trojí aspirací nebo pětisekundovým protřepáním v třepačce pro mikrotitrační destičky. Pokud pipetování vzorků trvá déle než 10 minut, doporučuje se pipetovat negativní i pozitivní kontrolu až po vzorcích určených k testování. V závislosti na použitém systému, je možné upravit umístění kontrol, nebo je možno změnit pořadí pipetování. POZNÁMKA: Po napipetování vzorků se barva v jamkách se vzorky (nebo kontrolami) změní z fialové v modrou. Přítomnost (vzorků + konjugátu1)v jamkách je možno ověřit pomocí spektrofotometrického měření při 620 nm (viz 7.7). 5) Pokud možno, překryjte destičku novou adhezívní fólií. 6) Inkubujte mikrodestičku 90 (± 5) minut při 37 ±1 C. 7) Pokud je třeba, odstraňte adhezívní fólií. Odsajte obsah všech jamek do odpadní nádoby a napusťte do každé jamky alespoň 370 µl promývacího roztoku. Znovu odsajte a alespoň 5krát tento cyklus promývání zopakujte. Zbytkový objem musí být menší než 10 μl (podle potřeby proužky obraťte dnem vzhůru a vysušte savým papírem). Pokud používáte automatickou promývačku, proveďte promývací cykly stejně. 8) Rychle napipetujte 100 μl roztoku konjugátu 2 (R7) do každé jamky v destičce. Konjugát předem opatrně promíchejte. Podle možností překryjte novou adhezívní fólií a inkubujte 30 (± 5) minut při 37 ±1 C. POZNÁMKA: Konjugát má zelenou barvu. Přítomnost konjugátu v jamkách lze ověřit pomocí spektrofotometrického měření při 620 nm (viz 7.7). 9) Odstraňte adhezívní fólii, odsajte obsah jamek a alespoň 5krát promyjte výše zmíněným způsobem. 10) Připravte si enzymatický vyvíjecí roztok (reagencie R8 + R9). 8 [CZ]

11) Rychle stříkněte 80 μl enzymatického vyvíjecího roztoku (R8 + R9) do každé jamky. Nechte v temnu 30 (± 5) minut při pokojové teplotě (18 30 C) probíhat reakci. Při této inkubaci nepoužívejte adhezívní krycí fólii. POZNÁMKA: Distribuci růžového vyvíjecího roztoku lze v této fázi vizuálně kontrolovat. Mezi zbarvením prázdných jamek a jamek s růžovým roztokem je zřetelný rozdíl. (Viz 7.7). 12) Ve stejném pořadí jako vyvíjecí roztok napipetujte do jamek po 100 μl zastavovacího roztoku (R10). POZNÁMKA: Distribuci bezbarvého zastavovacího roztoku lze v této fázi vizuálně kontrolovat. Po přidání zastavovacího roztoku se růžová barva substrátu (negativních vzorků) v jamkách postupně změní v bezbarvou a modrá barva (pozitivních vzorků) ve žlutou. 13) Dno mikrotitrační destičky pečlivě otřete. Nejméně za 4 minuty po přidání zastavovacího roztoku a do 30 minut po zastavení reakce změřte optickou denzitu pomocí spektrofotometru pro mikrotitrační destičky při 450/620-700 nm. 14) Zkontrolujte, zda se shodují spektrofotometricky naměřené hodnoty s vizuálně odečteným stavem a zda se shodují s plánkem distribuce a identifikace vzorků. 7.4. Kontrola kvality S každou sérií testů použijte pozitivní (R4 a R5) a negativní kontrolu (R3) pro validaci analýz. (Viz 7.5) 7.5. Kritéria validyty testů Tento test je validní za následujících podmínek: 1) Negativní kontrola R3: Naměřené hodnoty absorbance musí být nižší než 60 % hodnoty cut-off OD < cut-off x 0,6 2) Pozitivní kontrola pro protilátky R4: 0,800 průměr OD R4 2,700 Pokud se jedna z pozitivních kontrol R4 liší o více než 30 % průměrné hodnoty, vyřadí se a výpočet se provede ze dvou zbývajících hodnot. 3) Pracovní roztok R5: OD > 0,500 7.6. Výpočet a interpretace výsledků Určení hodnoty cut-off pro pozitivní kontrolu R4: Vypočtěte průměr naměřených hodnot absorbance pro pozitivní kontrolu R4. Vypočtěte hodnotu cut-off (CO): Průměr OD R4 CO = --------------------- 5 9 [CZ]

Přítomnost nebo nepřítomnost protilátek proti HCV a/nebo kapsidového antigenu HCV se prokazuje porovnáním zjištěné absorbance každého vzorku vůči vypočtené hodnotě cut-off. Pro každý vzorek se vypočítá následující poměr: Poměr = OD vzorku / hodnota CO Vzorky s optickou hustotou nižší než hodnota cut-off se podle testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 považují za negativní (poměr < 1). Výsledky bezprostředně pod hodnotou cut.off (CO-10 % < O.D. < CO, poměr mezi 0,9 a 1) je ovšem třeba interpretovat opatrně. Pokud to systém a laboratorní zásady dovolují, doporučuje se test opakovat na duplikátu vzorku. Vzorky s optickou hustotou vyšší nebo rovné hodnotě cut-off se podle testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 považují za primárně pozitivní. Před konečnou interpretací je třeba test opakovat na duplikátu vzorku. Pokud je v opakovaném testu hodnota poměru alespoň jednoho ze 2 duplikátů větší nebo rovna 1, je primární výsledek považován za opakovatelný a vzorek podle testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 za pozitivní. Pokud je hodnota obou 2 duplikátů vzorku menší než 1, považuje se primární test za neopakovatelný a vzorek za negativní. Vzorky, které byly v duplikátu retestovány a podle testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 jsou negativní, avšak s některou z hodnot blízkou hodnotě cut-off (poměr mezi 0,9 a 1), vyžadují zvýšenou pozornost. Je doporučeno provést pacientovi test ještě jinou metodou nebo na jiném vzorku. Výsledky vzorků s velmi nízkou optickou hustotou (negativní OD) zkontrolovaných z hlediska přítomnosti vzorku i reagencie se interpretují jako negativní. Pozitivní výsledky se doporučuje konfirmovat podle platných národních předpisů a algoritmů. 7.7. Spectrofotometrické ověření pipetování vzorku a konjugátu (volitelně) Ověření pipetování vzorku a konjugátu 1 (R6) Přítomnost konjugátu 1 (R6) se vzorkem lze ověřit v jamkách automatickým načtením hodnot při 620 nm. Každá jamka obsahující vzorek a konjugát 1 (R6) musí mít OD vyšší než 0,800. POZNÁMKA: Po přidání vzorku se zbarvení konjugátu 1 (R6) změní do modra. Ověření pipetování konjugátu 2 (R7) Konjugát 2 (R7) má zelenou barvu. Přítomnost konjugátu 2 (R7) v jamkách lze ověřit automatickým načtením hodnot při 620 nm: Hodnota OD v každé jamce musí být větší než 0,300 (nižší hodnota indikuje špatné dávkování konjugátu). Ověření pipetování vyvíjecího roztoku Přítomnost růžového vyvíjecího roztoku v jamkách lze ověřit automatickým načtením hodnot při 490 nm. Jamka s vyvíjecím roztokem musí mít optickou hustotu vyšší než 0,100 (nižší OD indikuje špatné dávkování vyvíjecího roztoku). Pro prázdné jamky je po přidání připraveného roztoku substrátu s chromogenem signifikantní změna zbarvení z bezbarvého na růžovou. 8. OMEZENÍ TESTU Vzhledem k rozdílné imunologické reakci pacientů infikovaných virem hepatitidy C (zvláště během sérokonverze), mohou být pozorovány určité rozdíly detekce mezi testy v závislosti na druhu použitých antigenních proteinů. Negativní výsledek skríningového testu nevylučuje možnost expozice nebo infekce virem hepatitidy C. Podle literatury mohou mít přenašeči HCV, kteří podstupující imunosupresivní léčbu nebo jsou koinfikováni viry HIV a HCV, hladiny protilátek obzvláště nízké, až pod mez detekce pomocí testů na HCV. 10 [CZ]

Techniky ELISA mohou způsobovat falešně pozitivní reakce. Doporučuje se ověřit specifičnost reakce pro každý vzorek prokázaný jako opakovaně pozitivní podle interpretačních kritérií soupravy MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA V2 za vhodných metod: pomocí skríningového ELISA testu nebo imunoblotového detekčního testu na protilátky anti-hcv za účelem průkazu protilátek anti-hcv. V případě potřeby použijte pro zjištění genomu HCV molekulárně biologický test. Kolorimetrická metoda ověření pipetování vzorku, konjugátu a substrátového roztoku neumožňuje ověřit přesnost napipetovaných objemů. Tato metoda pouze ukazuje přítomnost vzorku, konjugátu a substrátového roztoku v jamkách. Počet nesprávných odpovědí získaných touto metodou je těsně spojen s přesností použitého systému (kumulované variační koeficienty pipetování a měření vyšší než 10% signifikantně snižují kvalitu ověření). Test Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 není schválen k pro poolované vzorky a na ředěné vzorky. Jemné částice by mohly být vidět výjimečně v konjugátu 1 (R6) lze výjimečně pozorovat jemné částice, které však v žádném případě neovlivňují kvalitu reagencie. 9. FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY 9.1. Přesnost měření Ke stanovení opakovatelnosti a mezilehlé přesnosti bylo použito vzorků s různými koncentracemi protilátek anti-hcv a antigenů HCV. Vzorky byly pro stanovení opakovatelnosti v každé sérii testů analyzovány 30krát. Mezilehlá přesnost byla hodnocena analýzou duplikátů vzorků po 20 dnů, každý den ve 2 nezávislých sériích. Vypočítaly se hodnoty průměrů poměrů, směrodatné odchylky a variačního koeficientu (CV). 9.1.1. Opakovatelnost Vzorky N Střední hodnota poměrů Směrodatn á odchylka CV (%) Negativní S1 30 0,23 0,024 10,4 Pozitivní na antigen HCV Pozitivní na protilátky anti-hcv CV pro 6 pozitivních vzorků je <10 %. S2 30 1,21 0,048 4,0 S3 30 1,43 0,053 3,7 S6 30 7,18 0,166 2,3 S4 30 1,42 0,046 3,2 S5 30 1,35 0,083 6,1 S7 30 6,73 0,153 2,3 11 [CZ]

Vzorky 9.1.2. Mezilehlá přesnost N Střední hodnota poměrů Intra-analytická Směrodatná odchylka CV (%) Inter-analytická / vliv operátora Směrodatná odchylka CV (%) Během dne Směrodatná odchylka CV (%) Celková opakovatelnost Směrodatná odchylka Negativní S1 80 0,22 0,017 7,5 0,028 12,5 0,029 12,7 0,043 19,4 Pozitivní na antigen HCV Pozitivní na protilátky anti-hcv S2bis 80 2,80 0,143 5,1 0,277 9,9 0,283 10,1 0,421 15,0 S3 80 1,56 0,124 7,9 0,129 8,2 0,083 5.3 0,197 12,6 S6 68 6,69 0,500 7,5 0,621 9,3 0,557 8,3 0,973 14,5 S4 80 1,57 0,062 3,9 0,125 8,0 0* - - - 0,140 8,9 S5 80 1,75 0,075 4,3 0,164 9,3 0* - - - 0,181 10,3 S7 80 7,69 0,285 3,7 0,531 6,9 0* - - - 0,603 7,8 *: Předpokládaná hodnota rozptylu negativních odchylek je 0. CV pro 6 pozitivních vzorků nepřekročil 15 %. 9.2. Klinická účinnost Účinnost testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 byla stanovena ze vzorků náhodných dárců krve, hospitalizovaných pacientů, pacientů s akutní nebo chronickou infekcí virem hepatitidy C a pacientů s klinickými projevy nesouvisejícími s virem hepatitidy C. Vyšetření se prováděla na 2 místech krevního odběru v nemocnici a v laboratoři Bio-Rad. 9.2.1. Diagnostická specificita Vyšetření se prováděla na vzorcích séra a vzorcích EDTA plazmy. Odběry se prováděly na 2 místech od náhodných dárců. Specificita se zkoumala také na vzorcích od hospitalizovaných pacientů. Všechny vzorky byly analyzovány testem anti-hcv se značením CE. CV (%) Testovaná populace Dárci krve Pracoviště Typ vzorku Počet #1 Opakované reaktivní vzorky (RR) Specificita (%) sérum 537 1 536/537 plazma 2002 0 2002/2002 #2 sérum 2638 2 2636/2638 Interval spolehlivosti 95 % #1 + #2 5177 3 99,94 % 5174/5177 99,83 až 99,99 % Nemocniční pacienti #3 sérum 502 1 99,80 % 501/502 98,92 až 100,00 % *: Tři dárci s nejednoznačným výsledkem v referenčním testu byli z výpočtů vyřazeni. 12 [CZ]

9.2.2. Diagnostická citlivost Diagnostická citlivost byla zkoumána na 575 vzorcích od pacientů infikovaných virem hepatitidy C. Mezi těmito vzorky bylo 25 odebráno pacientům během 24 hodin před analýzou. Zkoumáno bylo 481 vzorků různých genotypů (1, 2, 3, 4, 5, 6). Tabulka 1: Zkoumané genotypy Genotypy 1 2 3 4 5 6 (1, 1a, 1b, 1a/b) (2, 2a/c, 2a, 2b, 2b/3) (3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r) (5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n) N 241 56 107 63 8 6 481 Diagnostická citlivost za všechny analyzované vzorky činí 100 % (575/575) s intervalem spolehlivosti 95 % na [99,4 100,0]. Celk em Vzorky od pacientů s akutní infekcí: Celkem 39 sérokonverzních panelů (10 profilů kapsidových, 10 profilů NS3 a 19 profilů kombinovaných) bylo testováno testem Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 a výsledky byly porovnány s výsledky testů pomocí kombinované soupravy antigen/protilátka a soupravy na protilátky anti-hcv, obě označené CE značkou. Pro všechny panely byla měřena časnost detekce. Z těchto 39 panelů nebyl testem Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 detekován jeden. Srovnávacím kombinovaným testem Ag-Ab nebyly detekovány tři panely. Mezi 38 panely detekovanými testem Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 bylo 5 případů dřívější detekce, 27 případů ekvivalentní detekce a 6 případů pozdější detekce v porovnání se srovnávacím kombinovaným testem Ag-Ab. V porovnání s analýzou protilátek anti-hcv mělo 28 panelů dřívější detekci, 9 ekvivalentní a v 1 případě byla detekce pozdější. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 versus kombinovaný test Ag-Ab Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 versus test anti-hcv Počet panelů 38 38 Dřívější detekce 5 28 Ekvivalentní detekce 27 9 Pozdější detekce 6 1 9.3. Analytická specificita / studie zkřížené reaktivity Testem Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 bylo vyšetřeno 365 potenciálně interferujících vzorků obsahujících protilátky patogenů, které mohou působit infekční onemocnění (cytomegalovirus, virus Epstein-Barrové, VZV, viry spalniček, zarděnek, příušnic, herpes, chřipky, hepatitidy A, hepatitidy B, HIV 1/2, HTLV 1/2, syfilis, toxoplasma gondii, dengue, Chagasovu chorobu), vzorků od rizikových skupin (pacientů podstupujících dialýzu, trpících mimojaterní cirhózou, gravidních žen, multigravidních žen) a vzorků od pacientů s poruchou imunitního systému (protilátek, revmatoidního faktoru, antimyších protilátek a myelomu). Dva vzorky byly v testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 opakovaně pozitivní. Specificita zjištěná na této cílové populaci z 99,45 % (363 z 365) byla obdobná jako specificita klinických vzorků. 9.4. Hook efekt Možnost výskytu hook efektu byla zkoumána analýzou 5 vzorků s vysokým titrem při různých koncentracích. Ekvivalence výsledků mezi neředěnými a ředěnými vzorky ukazuje, že hook efekt nenastal. 13 [CZ]

10. LITERATURA Bhartia A.R., Letendrea S.L., Wolfsona T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52 : 328 332. Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, 36 : 211-218. Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina- Selby A., Barp P.J., Weiner A.J., Bradley D.W., Kuo G. and Houghton M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: 2451-2455. EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2): 245-64. Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT for HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43: 721-729. Lambert N. Value of HCV Antigen-Antibody Combined HCV Assay in Hepatitis C Diagnosis. Dev. Biol. (Basel), 2007, 127: 113-121. Laperche S., Le Marrec N., Girault A., Bouchardeau F., Servant-Delmas A., Maniez-Montreuil M., Gallian P., Levayer T., Morel P., Simon N. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-hcv antibodies improves the early detection of HCV infection. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(8): 3877-83. Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1045. Rider P.J. and Liu F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32. Schnuriger A., Dominguez S., Valantin M.A., Tubiana R., Duvivier C., Ghosn J., Simon A., Katlama C. and Thibault V. Early Detection of Hepatitis C Virus Infection by Use of a New Combined Antigen-Antibody Detection Assay : Potential Use for High-Risk Individuals. J. Clin. Microbiol. 2006, 1561-1563. Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : 1147-1171. Widell A., Busch M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281. 14 [CZ]

15 [CZ]

16 [CZ]

17 [CZ]

18 [CZ]

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 19 [CZ] 92430 Marnes-la-Coquette, Francie Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 2014/09 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 862224 www.bio-rad.com