MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2012 LUCIE URBÁNKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství Mykotoxiny v potravním řetězci Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Jiří Skládanka, Ph.D. Vypracoval: Lucie Urbánková Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Mykotoxiny v potravním řetězci vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. Podpis

PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych chtěla poděkovat doc. Ing. Jiřímu Skládankovi, Ph.D. za odborné vedení při zpracování této bakalářské práce, za všechen jeho věnovaný čas a poskytnuté informace.

Abstrakt Tato bakalářská práce poskytuje zpracovanou literární rešerši na téma Mykotoxiny v potravním řetězci. První část práce zahrnuje stručnou charakteristiku rodů Aspergillus, Fusarium, Penicillium a jejich sekundárních metabolitů - mykotoxinů. Druhá část práce popisuje vliv mykotoxinů na zdraví rostlin, živočichů a lidí. Třetí a poslední část práce je zaměřena na charakteristiku píce jako primárního zdroje mykotoxinů v potravním řetězci a na možnosti eliminace mykotoxinů v krmivech. Klíčová slova: Aflatoxin, Aspergillus, Fusarium, mykotoxin, Penicillium. Abstrakt This Bachelor s dissertation provides the processed literature search on the subject of Mycotoxins in the food chain. The first part of dissertation comprises of the brief characteristics of genera Aspergillus, Fusarium, Penicillium and their secondary metabolites mycotoxins. The second part of dissertation describes the impact of mycotoxins to health of vegetation, animals and humans. The third and last part of dissertation is focused on the characteristic of forage as a primary source of mycotoxins in the food chain and possibilities of elimination of mycotoxins in fodder. Key words: Aflatoxin, Aspergillus, Fusarium, mycotoxin, Penicillium.

OBSAH 1 ÚVOD... 9 2 CÍL... 10 3 VLÁKNITÉ MIKROMYCETY... 11 3.1 Charakteristika vláknitých mikromycet... 11 3.2 Mykotoxiny... 11 3.2.1 Historie... 11 3.2.2 Rozdělení mykotoxinů... 12 3.2.3 Významné toxiny rodu Aspergillius... 16 3.2.3.1 Aflatoxiny... 18 3.2.3.2 Tremorgeny... 20 3.2.3.3 Citreoviridin... 20 3.2.3.4 Kyselina α-cyklopiazonová... 21 3.2.3.5 Ochratoxin... 22 3.2.4 Významné toxiny rodu Penicillium... 23 3.2.4.1 Kyselina penicilová... 25 3.2.4.2 Citrinin... 25 3.2.4.3 Patulin... 25 3.2.5 Významné toxiny rodu Fusarium... 26 3.2.5.1 Fumonisiny... 28 3.2.5.2 Zearalenon... 29 3.2.5.3 Trichothecény... 29 3.2.5.4 Deoxynivalenol... 30 3.2.5.5 T-2 toxin... 31 3.2.6 Ergosterol... 32 3.2.7 Faktory ovlivňující výskyt mykotoxinů v potravinách a krmivech... 34 3.2.7.1 Vhodné podmínky pro růst plísní a tvorbu mykotoxinů... 35 4 VLIV VLÁKNITÝCH MIROMYCET A MYKOTOXINŮ NA ZDRAVÍ ROSTLIN, LIDÍ A ZVÍŘAT... 36 4.1Vliv vláknitých mikromycet na zdraví rostlin... 36 4.1.1 Fuzariózy obilnin... 36 4.2 Vliv mykotoxinů na zdraví lidí... 37 4.2.1 Ergotismus... 38 4.2.2 Akutní kardiální beri-beri... 38 4.2.3 Alimentární toxická aleukie (ATA)... 39 4.2.4 Aflatoxikóza... 39 4.3 Vliv mykotoxinů na zdraví zvířat, produkci a kvalitu potravin... 39 4.3.1 Nejvýznamnější mykotoxikózy zvířat... 41 4.3.1.1 Stachybotriotoxikóza... 41 4.3.1.2 Ochratoxikóza... 41 4.3.1.3 Leukoencefalomalacie... 41 4.3.1.4 Plicní edém prasat... 41 4.4 Prevence... 43 5 PÍCE JAKO PRIMÁRNÍ ZDROJ MYKOTOXINŮ V KRMIVECH... 44 5.1 Infekce zrnin plísněmi... 44 5.2 Mykotoxiny v travních porostech a píci... 45 5.3 Mykotoxiny v siláži... 47 5.4 Odběr vzorků... 50 5.5 Dekontaminace mykotoxinů v krmivech... 50 7

5.5.1 Fyzikální způsoby dekontaminace mykotoxinů v krmivech... 51 5.5.2 Chemické způsoby dekontaminace mykotoxinů v krmivech... 51 5.5.3 Biologické způsoby dekontaminace mykotoxinů v krmivech... 51 5.5.4 Použití enzymů... 52 6 LIKVIDACE NAPADENÉHO KRMIVA... 53 7 ZÁVĚR... 54 8 SEZNAM POUŽITÉ LITRATURY... 55 9 SEZNAM TABULEK... 58 11 SEZNAM OBRÁZKŮ... 59 12 SEZNAM ZKRATEK... 60 8

1 ÚVOD Vláknité mikromycety provází lidstvo od nepaměti a díky svým vlastnostem se vyskytuje téměř na celém světě. Plní nezastupitelnou funkci v koloběhu biogenních prvků v přírodě. Po staletí byly využívány pro úpravu potravin a v poslední době získávají také význam v dalších biotechnologických oborech. Velká pozornost v negativním smyslu je zaměřena právě na sekundární metabolity vláknitých mikromycet - mykotoxiny. Vědecké objevy na tomto poli sahají do konce 19. století, ale vědecká i laická veřejnost se o mykotoxiny začala cíleně zajímat až v 60. letech 20. století. V dnešní době se dají mykotoxiny považovat za globální problém. Jejich výskyt a koncentrace jsou rok od roku velmi odlišné. Závisí především na klimatických podmínkách, jejichž změny mohou výskyt mykotoxinů výrazně zvýšit. V 21. století při hektickém životním stylu se zaměřujeme především na zdravé potraviny nejen pro sebe, ale i pro zvířata. Sledujeme tak i obsah mykotoxinů, které mohou přecházet do produktů (např. mléko, maso, vejce). Mykotoxiny kontaminují ovoce, zeleninu a jiné plodiny, znehodnocují je a způsobují tak vysoké ekonomické ztráty. Po intoxikaci napadenými potravinami nebo krmivem vyvolávají mykotoxiny závažná onemocnění lidí a zvířat. Ale vše má dvě strany, a tak existují i mykotoxiny které jsou člověku prospěšné. Využívají se k úpravě některých potravin, výrobě léků (především antibiotik) nebo v chemickém průmyslu. 9

2 CÍL Cílem této bakalářské práce je: charakterizovat mykotoxiny a jejich producenty popsat onemocnění (zvířat a lidí) způsobené mykotoxiny zaměřit se na problematiku krmiv jako primárního zdroje mykotoxinů zamyslet se nad možností dekontaminace krmiva 10

3 VLÁKNITÉ MIKROMYCETY 3.1 Charakteristika vláknitých mikromycet Vláknité mikromycety neboli plísně řadíme do říše hub. Jsou heterotrofní a většina z nich i aerobní. Optimální teplota pro jejich růst je 18 až 32 C a relativní vlhkost 65 až 70 %. Základem jejich těla je stélka. Stavební jednotkou stélky je hyfa. Soustava hyf se nazývá mycelium a slouží k výživě. Vláknité mikromycety se mohou rozmnožovat prorůstáním hyf nebo sporami. Spory vznikají vegetativním (nepohlavním) způsobem nebo po spájení 2 buněk. Vláknité mikromycety produkují širokou škálu metabolitů. Některé z nich jsou pro člověka užitečné ve farmaceutickém, chemickém i potravinářském průmyslu a některé metabolity jsou toxické. Z celkového množství 114 mikromycet vyskytujících se na potravinách je 65 druhů toxikogeních [3] [10]. 3.2 Mykotoxiny Termín mykotoxin je odvozen z řeckého slova mycos houba a z latinského slova toxicum jed. Mykotoxiny jsou definovány jako nízkomolekulární sekundárně metabolické produkty houbových organismů, které jsou toxické pro rostliny, zvířata a člověka. V současnosti je popsáno téměř 400 druhů mykotoxinů produkovaných velmi širokým spektrem houbových patogenů. Pravidelně je kontrolován výskyt jen těch nejfrekventovanějších a nejškodlivějších [35]. Původ nejdůležitějších mykotoxinů je uveden v Tab. 1. 3.2.1 Historie Za první dokumentovanou epidemii ergotismu je považován Thúkididův mor (jedna z morových epidemií, popsaná antickým historikem Thúkididem). V Evropě byly velké epidemie ergotismu kolem roku 1200. Do roku 1879 bylo v Evropě známo 306 epidemií ergotismu. Onemocnění bylo v minulosti často označováno jako oheň sv. Antonína. Poslední popsaný případ ergotismu v Evropě byl ve Francii v roce 1950. V Severní Americe byly v souvislosti s ergotismem časté čarodějnické procesy, z nichž 11

nejznámější byl Massachusettský případ z roku 1692. V současné době se epidemie ergotismu vyskytují v Africe (např. v Etiopii) a v Asii (např. Indii) [22] [36]. První doložené zprávy o toxicitě plesnivých potravin pocházejí z konce 19. století z Japonska. Ve 30. a 40. letech 20. století byly na území SSSR zkoumány vzorky obilí, které byly napadeny plísněmi rodu Fusarium. Vzorky vykazovaly vysokou toxicitu pro pokusná zvířata a byly spojeny s onemocněním nazývaným alimentární toxická aleukie (ATA). Většina výzkumů v tomto období však byla zaměřena zejména na výzkum bakteriálních původců onemocnění. Zprávy o toxicitě z obilných extraktů a plísňových kultur byly odmítány. Velký zájem o vláknité mikromycety začal po skončení 2. světové války. Významný pokrok ve studiu vláknitých mikromycet nastal po objevu penicilinu. Vyvolal tak rozvoj biotechnologií, které využívaly vláknité mikromycety k produkci léků, enzymů, organických kyselin, vitamínů a fermentovaných potravin. Rok 1960 byl hlavním mezníkem ve změně pohledu na používání kontaminovaných potravin a krmiv. Ve Velké Británii došlo v té době ke zdecimování chovu krůt a drůbeže vlivem zkrmování podzemnice olejné napadené plísní Aspergillus. V ČSSR byl zahájen výzkum mykotoxinů na lékařské fakultě v Brně pod vedením doc. RNDr. Miroslava Polstera, CSc. V současné době výzkum toxinogenních mikromycet a mykotoxinů dosahuje velkého rozmachu. Každý rok jsou objevovány nové druhy mykotoxinů [10] [35]. 3.2.2 Rozdělení mykotoxinů Mykotoxiny se rozdělují podle velkého množství kritérií. Nejjednodušší je rozdělení mykotoxinů podle chemické struktury (Tab. 2). Dále lze využít třídění podle způsobu biosyntézy (Tab. 3) nebo podle účinku na buňku (Tab. 4). Pro toxikologickou praxi má význam dělení mykotoxinů podle toxických účinků (Tab. 5) [37]. 12

Tabulka 1: Původ nejdůležitějších mykotoxinů vyskytujících se v běžných krmivech a pícninách, (D Mello, 1999) Mykotoxiny Aflatoxiny Kyselina cyklopiazonová Ochratoxin A Citrinin Patulin Citreoviridin Deoxynivalenol Druhy plísní A. flavus, A. parasiticus A. flavus A. ochraceus, Penicillium viridicatum, P. cyclopium P. citrinum, P. expansum P. expansum P. citreo-viride Fusarium culmorum, F. graminearum T-2 toxin4 F. sporotrichiodes, F. poae Diacetoxyscirpenol (DAS) Zearalenon Fumonisiny, moniliformin, Kyselina fusarová Kyselina tenuazonová, alternariol, aternariol methyl ester, altenuen Ergopeptinové alkaloidy Lolitremové alkaloidy Námelové alkaloidy Phomopsiny Sporidesmin A F. sporotrichioides, F. graminearum, F. poae, F. culmorum, F. sporotrichoides graminearum, F. culmorum, F. graminearum, F. sporotrichoides F. moniliforme Alternaria alternata Neotyphodium coenophialum N. lolii Claviceps purpurea Phomopsis leptostromiformis Pithomyces chartarum 13

Tabulka 2: Chemické dělení mykotoxinů, (Polster, 1971) Furanofurany Substituované pyreny a hydroxypyreny Substituované chinony Nenasycené laktony Griseofulviny Epoxytrichotheceny Polycyklické substituované indolové deriváty Cyklické dipeptidy Mykotoxiny jiné struktury Aflatoxiny, sterigmatocystin, versicolorin aj. Kyselina koji, sekalonové kyseliny aj. Luteoskyrin, rubratoxin, xanthomegnin, viridicatumtoxin aj. Patulin, kyselina penicillová, kyselina mykofenolová, alternariol, citreoviridin, ochratoxiny, rubratoxin B, 4,5,8-trimetylpsoralen aj. Griseofulvin T-2 toxin, diacetoxyscirpenol (DAS), vomitoxin (deoxynivalenol), nivalenol, fusarenony, verrucariny, roridiny, satratoxiny aj. Kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy aj. Gliotoxin, sporidesminy, roquefortin, fumitremorgen, verruculogeny, brevianamidy aj. Zearalenon, curvularin, citrinin, PR-toxin, canthecellin, moniliformin, kyselina betanitropropionová Tabulka 3: Dělení mykotoxinů podle způsobu biosyntézy, (D Melllo, 2003) Primární metabolit Metabolická dráha Mykotoxin Acetyl Co A Polyketid Patulin, citrinin,ochratoxin, zearalenon, moniliformin, aflatoxiny, fumonisiny Kyselina mevalonová Isoprenoidy Trichotheceny,deoxynivalenol, nivalenol, T 2 toxin, HT 2 toxin, diacetoxyscirpenol Aminokyseliny Peptidy Ergotové alkaloidy 14

Tabulka 4: Rozdělení podle účinku na buňku, (Ueno, 1985) Inhibitory tvorby energie Citreoviridin, luteoskyrin, xanthomegnin, kyselina sekalonová D Inhibitory proteosyntézy Trichotheceny, ochratoxin A Modifikátory cytoskeletu Griseofulvin, cytochalasiny, cyclochlorotin Estrogenní mykotoxiny Zearalenon Tremorgeny Penitremy (A, B, C), fumitremorginy (A a B), verruculogeny Karcinogenní mykotoxiny Aflatoxin B-1, sterigmatocystin Řadu mykotoxinů do tohoto schématu dosud nedovedeme zařadit (Ueno, 1985). Tabulka 5: Toxické účinky mykotoxinů, (Šimůnek, 2003) Hepatotoxiny Nefrotoxiny Toxiny zažívacího traktu Neurotoxiny a mykotoxiny Dermotoxiny Toxiny dýchacího traktu Genitotoxiny Imunotoxiny Toxiny dostatečně neprozkoumané (neznámé) Aflatoxiny, sporidesminy, luteoskyrin, sterigmatocystin, phomopsin A AFB-1, ochratoxin A, citrinin, sterigmatocystin T-2 toxin a další trichotheceny Tremorgeny (např. penitrem A), citreoviridin Verrucariny, psoraleny, sporidesminy, trichotheceny aj. Paulin Zearalenony Aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny aj. 15

3.2.3 Významné toxiny rodu Aspergillius Rod Aspergillus tvoří v napadené kultuře obvykle černé, hnědé, žluté až bílé kolonie (Obr. 1). Do tohoto rodu zahrnujeme převážně velmi rychle rostoucí vláknité mikromycety, které jsou schopny již za tři až pět dní tvořit plně vybarvené kolonie. Aspergillie mají amylolytické, pektolytické a proteolytické enzymy a proto jsou schopny snášet nízkou vodní aktivitu. Díky těmto vlastnostem mohou přežívat na rozmanitých biologických materiálech a jsou tak významným patogenem znehodnocující krmiva a potraviny. Této vlastnosti je také využíváno pro průmyslovou produkci těchto enzymů, které nachází využití převážně v potravinářském průmyslu. Některé druhy jsou využívány pro výrobu organických kyselin. Aspergily jsou také schopny tvořit antibiotika, ale z důvodu jejich vysoké toxicity se nepoužívají. Některé druhy rodu Aspergillus způsobují infekční onemocnění nazývané aspergilóza. Mezi příznaky tohoto onemocnění patří alergické reakce projevující se zánětem nosní dutiny a horních cest dýchacích. Aspergillie kolonizuje i povrch pokožky a vnitřních prostor organismu, kdy u osob s nízkou imunitou může nastat i smrt. Nejvíce prozkoumané mykotoxiny rodu Aspergillius jsou aflatoxiny, aflatrém, kyselina α-cyklopiazonová, fumitremoginy, ochratoxin [3] [7] [10] [19]. V Tab. 6 je uveden přehled mykotoxinů produkovaných rodem Aspergillius. Obr. 1: Aspergillius 16

Tabulka 6: Přehled mykotoxinů produkovaných rodem Aspergillius, (Betina1990) Mykotoxiny Aflatoxiny Aflatrem Askladiol Aspochalaziny Austocystiny Citreoviridin Emodin Erytroglaucin Fumagilin Fumitremorgeny Fyscion Gliotoxin G Kyselina aspergilová Kyselina α-cyklopiazonová Kyselina helvolová Kyselina kójová Kyselina tereová Malforminy Ochratoxiny Patulin Sterigmatocystin Verzikoloriny Viomelein Druhy plísní A. flavus A. flavus A. clavatus A. microcysticus A. ustus A. terreus A. Pentii A. glaucus A. fumigatus A. fumigatus A. gaucus A. fumigatus A. flavus A. flavus A. fumigatus A. fumigatus A. terreus A. niger A.ochraceus A. clavatus A. versicolor A. versicolor A.ochraceus 17

3.2.3.1 Aflatoxiny Aflatoxiny se vytváří při vysoké relativní vlhkosti 80 až 100 % a teplotě 28 C. Dále má na tvorbu aflatoxinu vliv obsahu vlhkosti v zrnu 16 až 20 % [3]. Z více než dvaceti druhů známých aflatoxinů se pouze čtyři druhy vyskytují na potravinách. Jedná se o aflatoxiny B1, B2, G1 a G2. Aflatoxin B1 je nejtoxičtější dosud známý přírodní karcinogen. Aflatoxiny M1 a M2 se označují jako mléčné toxiny, vyskytují se v mléku dojnic krmených potravou kontaminovanou aflatoxiny B1 a B2 [10]. Potraviny citlivé na výskyt aflatoxinů jsou především skořápkové plody (ořechy, mandle, pistácie, aj.). Dále se aflatoxiny vyskytují v koření (pepř, chilli, muškátový oříšek, paprika, aj.). Důležité je sledovat jejich obsah v obilovinách včetně rýže, kukuřice a sladu. Aflatoxin M se nachází v sušeném mléku, sýrech a výrobcích z mléka. Plísně rodu Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus jsou v půdě, v prachu, na rostlinách a jejich plodech [20]. Obr. 2: Strukturní vzorec aflatoxinu B1 Objev aflatoxinů se datuje od roku 1960, kdy se dával do spojení s epidemií označovanou jako onemocnění X u krůt, při kterém zahynulo 100 tisíc krůťat v okolí Londýna. Podobný případ se stal v USA, kde byla zaznamenána epidemie hematomu u pstruhů. Později se zjistilo, že krmivo s obsahem arašídové moučky konzumované krůťaty i bavlníkový olej používaný pro krmení pstruhů byly kontaminované aflatoxinem produkovaným plísní Aspergillus flavus. V roce 1974 byl zaznamenán první případ onemocnění aflatoxikózy u člověka, kdy více než 100 lidí zemřelo po konzumaci kontaminované rýže v severozápadní Indii [10]. Dnes už jsou stanoveny přípustné limity aflatoxinů v krmivu např. v USA (Tab. 7 a Tab. 8). 18

Tabulka 7: Maximální hladiny aflatoxinu v krmivech, (FDA, 1996) Kategorie zvířat Krmivo Maximální hladina aflatoxinu Mláďata a drůbež Kukuřice a podzemnice 20 ppb Dojnice Kukuřice a podzemnice 20 ppb Chovný skot a prasnice Kukuřice a podzemnice 100 ppb Dospělá drůbež Kukuřice a podzemnice 100 ppb Prasata ve výkrmu Kukuřice a podzemnice 200 ppb Výkrm skotu Kukuřice a podzemnice 300 ppb Výkrm skotu, prasat a drůbež Bavlníkový šrot 300 ppb Všechna zvířata Ostatní krmiva 20 ppb Tabulka 8: Doporučené limity aflatoxinů v krmivu, (Neuman, 1990) Druh Pstruzi Mladá drůbež a bažanti Zvířata březí a v laktaci Prasata ve výkrmu a drůbež Ovce a skot ve výkrmu Množství 0,1 µg/kg 2,0 µg/kg 10,0 µg/kg 20,0 µg/kg 50,0 µg/kg 19

3.2.3.2 Tremorgeny Tremorgeny jsou chemicky nesourodá skupina mykotoxinů, produkovaných různými druhy vláknitých mikromycet, především rody Aspergillus a Penicillium. Základním představitelem skupiny jsou penitremy A-E. Penitrem A, P. palitans, P. crustosum, P. comune. Po podání tremorgenů pokusná zvířata hynou s příznaky třesu a křečí. Dalšími symptomy jsou zrychlené dýchání, slzotok, rozšířené zornice. Tremorgeny napadají nervový systém a patří mezi nejtoxičtější mykotoxiny [30]. Aflatrém byl objeven v roce 1964 a je prvním známým tremorgenním mykotoxinem. Produkují ho některé kmeny rodu Aspergillus flavus během růstu na rýži, bramborách a kukuřici [21]. 3.2.3.3 Citreoviridin Tento mykotoxin sytě žluté barvy je produkován plísní Penicillium citreoviride, která se velmi často vyskytuje na rýži a dodává jí charakteristickou žlutou barvu. Citreoviridin je také známý pod názvem yellow rice toxin [14]. Yellow rice způsobuje akutní kardiální onemocnění beri-beri a neurotoxické poruchy u lidí. Tato onemocnění se v minulosti běžně vyskytovala v Japonsku a v jiných zemích, kde je typickým pokrmem rýže. Citreoviridin byl kromě rýže nalezen také v kukuřici. Při pokusu toxicity citreoviridinu došlo u pokusných zvířat k ochrnutí končetin, zvracení, křečím a dýchacím potížím. V pokročilém stadiu se projevilo poškození kardiovaskulárního systému, ochablost, dušnost, bezvědomí, zástava dýchání a následná smrt [27]. Obr. 3: Strukturní vzorec citreoviridinu 20

3.2.3.4 Kyselina α-cyklopiazonová Kyselina cyklopiazonová patří k mykotoxinům střední toxicity. Byla objevena v roce 1968 Holzapfelem jako metabolit Penicillium cyclopium z podzemnice olejné na základě výskytu onemocnění káčat a ovcí konzumujících napadené krmivo. Kromě kmene Penicillium je produkována také kmenem Aspergillus, zejména A. flavus, A. versicolor, A. oryzae, A. tamarii. Některé kmeny Aspergillus flavus jsou schopny produkovat kyselinu cyklopiazonovou současně s aflatoxiny [11]. Po konzumaci krmiva napadeného kyselinou cyklopiazonovou dochází k degeneraci a nekróze jater, slinivky, ledvin, sleziny, slinných žláz, myokardu a kosterní svaloviny. Její účinky se dávají do souvislosti s Turkey X Disease ve Velké Británii [2]. Může se vyskytnout v kukuřici, prosu, rajčatech a sýrech camembertského typu. Rezidua vzniklá příjmem kyseliny cyklopiazonové krmivem byla experimentálně zjištěna v mléce laktujících ovcí, v mase a vejcích [11]. Hygienické limity pro kyselinu cyklopiazonovou v potravinách nejsou dosud stanoveny. Obr. 4: Strukturní vzorec kyseliny cyklopiazonové 21

3.2.3.5 Ochratoxin Tvorba ochratoxinů A, B a C je popsána především u druhů Aspergillus ochraceus, Penicillium viridicatum a P. verrucosum. Ochratoxiny jsou výsledkem laboratorního výzkumu toxigenních vláknitých mikromycet izolovaných z polních plodin v Jižní Africe. Vyskytují se v ječmeni, žitě, ovsu, pšenici, rýži, kukuřici, kávě, koření, sušeném ovoci (fíky, rozinky). Dalším zdrojem jsou masné výrobky protože ochratoxin A vytváří rezidua ve tkáních a tím přechází do masa. V našich klimatických podmínkách se ochratoxiny nacházejí poměrně často [13]. Existují čtyři homology ochratoxinů a to A, B, C a D. Ochratoxin A je nejrozšířenější a spolu s ochratoxinem C nejvíce toxický. Ochratoxin A je bílá krystalická látka bez zápachu. Nejzávažnějším biologickým účinkem zaznamenaným u zvířat je nefrotoxicita. Dále byla prokázána jeho hepatotoxicita, genotoxicita, imunotoxicita a karcinogenita. Způsobuje neuropatii u prasat, poškození ledvin, imunitního systému a poruchy trávení. Nejcitlivější jsou prasata, kuřata a krůty, u přežvýkavců dochází v bachoru k mikrobiologické degradaci a toxicita není tak výrazná [8]. Obr. 5: Strukturní vzorec ochratoxinu A 22

3.2.4 Významné toxiny rodu Penicillium Tento rod zahrnuje značné množství druhů. Vyskytuje se v půdě, i na různém organickém materiálu. Růst penicilií je podobně jako u aspergilů velmi rychlý. Kolonie se tvoří v odstínech zelené až bílé barvy (Obr. 6). Způsobují trvalé znehodnocení ovoce a zeleniny, některé druhy jsou schopny vyvolávat u citlivějších jedinců alergické reakce. Mykotoxiny tvoří i zástupci penicilií, které se používají v potravinářství při produkci sýrů [19]. Mezi nejvýznamnější mykotoxiny z penicilií patří citrinin, patulin a kyselina penicilová. V Tab. 9 je uveden přehled mykotoxinů produkovaných rodem Penicillium. Obr. 6: Penicillium 23

Tabulka 9: Přehled mykotoxinů produkovaných druhem Penicillium, (Betina, V., 1990) Mykotoxiny Emodin Chryzofanol Islandicin Katenarin Luteoskyrin Regulin Regulozin Skytán Citreoviridin Citrnin Dehydrogliotoxin Grizeofulvin Jantitremy Kyselina mykofenolová Kyselina penicilová Kyselina sekalonová D Ochratoxin Patulin Padolin Penitremy PR toxin Rubratoxiny Verukulogen Viomelein Viridikatumtoxin Xantocilin Xantomegnin Xantoviridikatiny Druhy plísní P. islandicum P. islandicum P. islandicum P. islandicum P. islandicum P. regulosum P. regulosum P. islandicum P. citreo-viride P. citronům P. terlikowskii P. griseofulvum P. janthinellum P. brevicompactum P. verrucosum P. oxalicum P. viridicatum P. patulum P. paxilli P. crustosum P. roqueforti P. rubrik P. simplicissimum P. viridicatum P. viridicatum P. notátám P. viridicatum P. viridicatum 24

3.2.4.1 Kyselina penicilová Kyselina penicilová je látka chemicky příbuzná patulinu. Je produkována vláknitými mikromycetami rodu Penicillium nartensii, P. palitans, a P. puberulum na navlhlých skladovaných obilovinách při nízkých teplotách 1 až 10 C. Kyselina penicilová působí tukovou degeneraci a nekrotické změny jater. Při opakovaném podávání zvířatům byl tento mykotoxin prokázán jako karcinogenní [10]. 3.2.4.2 Citrinin Citrinin byl objeven jako jedno z prvních antibiotik, ale pro jeho toxicitu nebyl používán [21]. Tento toxin je produkován zejména plísněmi rodu Penicillium, Aspergillus, Monascus, nejčastěji však rodem Penicillium citrinum. Může se vyskytovat společně s ochratoxinem a pravděpodobně se jedná i o jeho prekursor. Nachází se v obilovinách, rýži, silážích a často způsobuje žlutou barvu obilí. U hospodářských zvířat vyvolává řadu syndromů, jako například průjmy. Citrinin je silný nefrotoxin a teratogen u kuřat. U lidí způsobuje poškození ledvin a napadá dýchací ústrojí [28]. Obr. 7: Strukturní vzorec citrininu 3.2.4.3 Patulin Patulin byl objeven ve 40. letech jako antibiotikum a dokonce byl po krátký čas i léčebně využíván. Patulin je produkován plísněmi Penicillium urticae, P. expansum, P. vlaviforme a některými plísněmi rodu Aspergillus. Při dlouhodobém podávání je karcinogenní. Optimální teplota pro jeho tvorbu je 25 C. Nachází se v rýži, nahnilém ovoci, ovocných šťávách a silážích. Poškozuje slezinu, játra, žaludek, ledviny a dýchací systém. Nejčastější intoxikace jsou popsány u drůbeže, kde způsobují poškození centrální nervové soustavy, sleziny, jater, žaludku, ledvin a dýchacího ústrojí [6]. Obsah patulinu v potravinách je ukazatel špatných výrobních postupů a souvisí i s používání plesnivých surovin ve výrobním procesu. 25

3.2.5 Významné toxiny rodu Fusarium Plísně rodu Fusarium jsou v přírodě hojně rozšířené především v půdě a kontaminují tak užitkové plodiny. Některé druhy Fusarií jsou schopny tvořit výrazně červené, modré, zelené a černé barvivo a zbarvovat tak starší mycelium (Obr. 8). V klimatických podmínkách mírného pásma jsou nejrozšířenější právě mykotoxiny produkované vláknitými mikromycetami rodu Fusarium. Ideální podmínkou pro růst těchto vláknitých hub je teplota 11 až 23 ºC a vlhkost 95 až 100 %. Kolonie jsou obvykle velmi rychle rostoucí v barvách bělavé, žluté až hnědé. Zrno obilovin může být napadeno již během růstu rostlin anebo v průběhu skladování zrna v silech. K nákaze dochází obvykle ze zbytků rostlin, které zůstávají na poli z předchozí sklizně, nebo z infikované setby. K šíření infekce klimatickým vlivem hojně přispívá větrné a vlhké počasí. Mezi nejčastěji se vyskytující druhy patříf. graminearum a F. culmorum [10]. Obr. 8: Fusarium Mikromycety rodu Fusarium bývají označovány jako polní plísně, které poškozují zrna i jiné rostlinné tkáně v předsklizňovém období. Za příznivých podmínek však mohou růst také v průběhu skladování. V Tab. 11 je uveden přehled mykotoxinů produkovaných druhem Fusarium. 26

Tabulka 10: Přehled mykotoxinů produkovaných druhem Fusarium, (Betina, V., 1990) Mykotoxiny Druhy plísní Nemakrocyklické Diacetoxyscirpenol F. equiseti Deoxynivalenol F. culmorum Fuzarenon F. nivale Nivalenol F. nivale Neosolaniol F. culmorum Scirpentriol F. roseum Sporotrichinol F. trichioides T-2 toxin F. tricinctum Trichodermadien M. verrucaria Trichodermin Trichoderma viride Trichodermol M. roridum Trichotecin Trichothecium roseum Makrocyklické Myrotoxiny M. roridum Roridiny M. roridum Satratoxiny Stachybotrys atra Verukariny M. verrucaria Vertisporin Verticimonosporium diffractum 27

3.2.5.1 Fumonisiny Fumonisiny jsou skupinou mykotoxinů produkované plísněmi rodu Fusarium (F.moniliforme, F. proliferatum). Byly poprvé izolovány v roce 1988 v jižní Africe Gelderblomem z kultury Fusarium moniliforme vyskytující se na kukuřici [9]. Nejvýznamnější z hlediska kontaminace obilovin jsou fumonisiny B1 a B2. Napadají především kukuřici, její produkty, rýži a proso. Fumonisiny vyvolávají u hospodářských zvířat řadu závažných onemocnění, která mohou při vyšší intoxikaci vést k úhynu. Nejznámější je leukoencefalomalácie koní (smrtelné nemocnění postihující mozek, játra a ledviny, projevující se svalovým třasem, poruchami koordinace pohybů, vrávoravou chůzí, natažením nohou a krku až celkovým ochrnutím). Prasata hynou na plicní edém. U hlodavců byla prokázána hepatotoxicita a nefrotoxicita, u drůbeže fumonisiny vyvolávají tzv. syndrom toxicity krmiva. Výjimku tvoří skot, který je k mykotoxinům této skupiny relativně málo vnímavý [29]. Dnes už jsou stanoveny přípustné limity fumonisinu v krmivech např. v USA (Tab. 11). Obr. 9: Strukturní vzorec Fumonisinu B1 Tabulka 11: Maximální hladiny fumonisinu v krmivech, (FDA, 1996) Kategorie zvířat Krmná dávka Maximální hladina fumonisinu Koně KD bez objemu 5 ppm Prasnice Celková KD 10 ppm Drůbež Celková KD 10 ppm Výkrmový skot KD bez objemu 50 ppm Mléčný skot KD bez objemu Bez doporučení 28

3.2.5.2 Zearalenon Zearalenon je produkován vláknitými mikromycetami rodu fusarium zejména F. graminearum, F.culmorum. Jedná se o jeden z nejběžnějších mykotoxinů, který způsobuje největší ekonomické ztráty v Evropě [3]. Při kontaminaci pšenice dochází k vysokému poklesu množství sklizně a produkci toxinů znehodnocující zrno. Zearalenon se nachází v obilovinách (ječmen, kukuřice, žito, oves, pšenice, čirok), kde je velmi stabilní a zůstává v nezměněném stavu i po tepelném zpracování mouky, či fermentaci. Vyskytuje se tak i v krmivech, a v menší míře dochází k přesunu zearalenonu do mléka. U hospodářských zvířat může způsobovat hyperestrogenismus a problémy s reprodukcí. Typické je zduření rodidel u prasat, ovcí, dobytka a drůbeže [10]. Obr. 10: Strukturní vzorec Zearalenonu 3.2.5.3 Trichothecény Jedná se o nejrozšířenější skupinu mykotoxinů. Nejznámějšími zástupci jsou deoxynivalenol (DON), známý jako vomitoxin, nivalenol (NIV), diacetoxyscirpenol (DAS) a T-2 toxin (Tab. 12). Hojný výskyt byl zaznamenán v cereáliích (pšenice, kukuřice), sójových bobech, semenech olejnin ale také v pivu z kontaminovaného ječmene. Mezi biologické účinky trichothecenů patří pokles imunity, nevolnost, zvracení. Celá skupina trichothecenů silně inhibuje syntézu bílkovin. Jsou mutagenní, genotoxické a karcinogenní [5]. V současné době je známo více než 150 trichothecenů. 29

Tabulka 12: Vláknité houby rodu Fusarium produkují nejčastěji trichotheceny typu A a B., (Betina, V., 1990) Typ Název mykotoxinu Zkratka A HT-2 toxin HT-2 T-2 toxin T-2 B nivalenol NIV deoxynivalenol DON 15-acetyldeoxynivalenol 15-ADON 3-acetydeoxynivalenol fusarenon-x 3-ADON FUS-X 3.2.5.4 Deoxynivalenol Nejčastěji vyskytujícím se trichothecenovým mykotoxinem je deoxynivalenol (DON) neboli vomitoxin a bývá považován za indikátor mykotoxinové kontaminace [3]. Běžně se nachází v pšenici, ječmeni a kukuřici. Jeho výskyt byl také prokázán v rýži, čiroku, hořčičném semenu, sojových bobech, podzemnici olejné, bramborách a slunečnici. DON je relativně termostabilní a jeho degradace byla pozorována při teplotách vyšších než 210 o C [5]. K velmi citlivým zvířatům na DON patří prasata. V Tab. 13 jsou uvedeny maximální limity DONu v krmivech. Postižená zvířata odmítají krmivo, zvrací a trpí průjmy. K dalším projevům intoxikace patří poruchy koordinace pohybů, hemoragie na sliznicích, aborty u březích samic či náhlý úhyn. U přežvýkavců se působení DONu projevuje snížením mléčné produkce, sníženou konverzí krmiva a průjmy [8]. Obr. 11: Strukturní vzorec deoxynivalenolu 30

V posledních letech se začaly rozšiřovat i chemotypy mikromycet produkující ve velké míře další mykotoxin typu B - nivalenol (NIV). Poprvé byla tato látka izolována z F. nivale. Nejčastějšími producenty NIV jsou F. cerealis, F. poaea v malém množství také F. culmorum a F. graminearum. NIV byl detekován v cereáliích (ječmenu, pšenici, kukuřici) a také ve sladu, pivu a chlebě [10]. V současné době je v rámci EU věnována velká pozornost mykotoxinům T-2 toxinu a HT-2 toxinu. Oba toxiny patří mezi významné kontaminanty cereálií, především ovsa, žita, pšenice a ječmene. K hlavním producentům HT-2 a T-2 patří druhy plísní jako F. poae, F. sporotrichoides, F. equiseti a F. acuminatum. Jejich výskyt je v poslední době velmi často a v relativně vysokých koncentracích zaznamenáván v ovsu [5]. 3.2.5.5 T-2 toxin Byl objeven jako zbraň ruskými vědci poté, co byla po jarní sklizni opožděná dodávka zásob, kvůli 2. světové válce. Z mouky, která byla kontaminována vláknitými mikromycetami rodu Fusarium byl vyroben chléb a mnoho lidí po konzumaci bylo postiženo, mnozí i smrtelně. Z hlediska toxicity je T-2 nejúčinnější z trichothecenových mykotoxinů. Zůsobuje onemocnění známé jako alimentární toxická aleukie, dále kožní problémy doprovázené krvácivými ložisky v oblasti hlavy a pohlavních orgánů. U prasat způsobuje nejčastěji poruchy reprodukce, u skotu sníženou imunitu telat, poruchy srážlivosti krve a hemoragie. Dobytek je na T-2 toxin citlivější než prasata a drůbež. Je považován za potenciální karcinogen. T-2 toxin je známý svojí vysokou akutní toxicitou. T-2 snadno metabolizuje na HT-2, a proto jsou tyto látky většinou stanovovány společně a jejich koncentrace je uváděna v sumě. Pro ČR nejsou hygienické limity tohoto toxinu zatím stanoveny [16]. Obr. 12: Strukturní vzorec T-2 toxin 31

3.2.6 Ergosterol Ergostrol ((22E)-ergosta-5,7, 22-trien-3β-ol) je bílá krystalická látka, za normálních podmínek stabilní, patřící do skupiny fytosterolů. Je biologickým prekursorem (provitamínem) vitamínu D2 [18]. Ergosterol je hlavním sterolem produkovaným mnoha druhy nižších i vyšších hub. Jedná se o specifický membránový lipid těchto hub. Jedná se například o rody Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Mucor, Penicilium, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium a Paecilomyces. Mnoho z těchto vláknitých mikromycet může být izolováno např. ze zrna nebo jiných částí obilnin. Zatímco některé houby tvoří přirozenou mikroflóru zrna, jiné mohou způsobit plesnivění a kontaminaci toxiny. Koncentrace těchto toxinů často velmi výrazně korespondují s obsahem ergosterolu v kontaminovaném obilí [15] (Tab. 16). Na základě nových pokusů (Tab. 13) nebyla prokázána korelace mezi mykotoxiny a ergosterolem.. Tabulka 13: Změny obsahu ergosterolu, zearaleonu a deoxynivalenolu, (Skládanka a kol., 2011) Druh Deoxynivalenol Zearalenone Ergosterol x (ppb) s.e. x (ppb) s.e. x (mg kg 1 ) s.e. Jílek vytrvalý 46,02 10,83 34,06 30,87 76,61 ab 29,8 Festucoidní hybrid 37,78 9,6 9,82 5,05 35,65 a 13,12 Festulolium braunii 33,83 9,06 72,85 48,53 82,53 b 32,55 Směs s kostřavou 46,6 11,54 91,81 61,18 71,71 ab 24,3 Směs s lipnicí luční 45,55 13,25 96,24 59,5 68,05 ab 23,74 Měsíc Červen 12,34 a 5,07 0.0 a 0,01 3,84 a 0,92 Červenec 71,43 b 7,67 122,3 ab 62,54 13,07 a 3,72 Říjen 52,95 bc 9,16 173,0 b 66,17 31,87 a 3,91 Listopad 51,71 bc 12,04 3,7 a 3,59 94,94 b 11,31 Prosinec 21,35 ac 6,07 5,8 a 3,82 190,82 c 23,89 Rok 2008 37,63 7,66 115,76 a 37,82 68,5 19,18 2009 46,28 5,67 6,15b 2,5 65,31 12,05 Směrodatná odchylka, x znamená, průměrné hodnoty v jednom sloupci s různými horních ( a, b, c ) jsou významné na úrovni P <0,05. 32

Výskyt ergosterolu v jiných organismech je velmi omezený, pouze v některých bakteriích a kvasinkách byly nalezeny zanedbatelné koncentrace ergosterolu v sušině. Díky tomuto specifickému výskytu je ergosterol často používán jako indikátor zaplísnění zkoumaného vzorku, ať už se jedná například o obilné zrno nebo jiný rostlinný materiál [7]. Obr. 13: Strukturní vzorec ergosterolu 33

3.2.7 Faktory ovlivňující výskyt mykotoxinů v potravinách a krmivech Obr. 14: Faktory ovlivňující výskyt mykotoxinů v potravinách a krmivech [20]. 34

3.2.7.1 Vhodné podmínky pro růst plísní a tvorbu mykotoxinů Tvorba mykotoxinů je ovlivněna řadou faktorů (Tab. 14), které můžeme rozdělit do dvou skupin: Faktory biotické: Složení substrátu je nejvýznamnějším faktorem, který má vliv na produkci mykotoxinu (vysoký obsah tuků a sacharidů). Nejčastějšími přenašeči spor vláknitých mikromycet jsou zejména roztoči, různé druhy hmyzu a skladištní škůdci. Faktory abiotické: Patří sem zejména vlhkost substrátu (min. 14 %), relativní vlhkost vzduchu (nad 65 %), teplota substrátu a vnějšího prostředí, ph a přítomnost kyslíku. Významný činitel je i vodní aktivita. Jedná se o obsah volné vody, která není vázaná na molekuly rozpuštěných látek a je využitelná mikroorganismy. Vláknité mikromycety rostou při vodní aktivitě 0,75 a jejich rozvoj ustává, pokud hodnota klesne pod 0,65. Pro produkci mykotoxinu u většiny plísní je optimální teplota v rozmezí 15 až 30 C. Vláknité mikromycety a především jejich spory mohou přežívat jak při extrémně nízkých tak i vysokých teplotách. V teplejších klimatických podmínkách se vyskytují častěji aflatoxiny a fumonisiny, v oblastech chladnějších s vysokou vlhkostí představují větší nebezpečí ochratoxiny, zearalenon, deoxynivalenol, T-2 toxin. Dalším důležitým faktorem jsou změny ph. Mikromycety snášejí rozpětí ph od 3 do 8, ale kolísání mezi těmito hodnotami může mít vliv na jejich citlivost vůči ostatním okolním faktorům. Podstatný je obsah kyslíku v prostředí. Pokles koncentrace O 2 pod 1 % vede k útlumu produkce mykotoxinů (např. aflatoxin). Výjimkou je plíseň Fusarium verticillioides, která je schopna růst v prostředí s obsahem až 60 % CO 2 [8] [20] [41]. Tabulka 14: Faktory podporující produkci vybraných mykotoxinů během uskladnění, (Malíř, Ostrý, 2003) Mykotoxiny Vláknité mikromycety Druh substrátu Podporující podmínky Aflatoxiny Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus Ochratoxin A Aspergillus ochraceus, Paulin Penicillium viridicatum Penicillium expansum, Byssochlamys arašídy, bavlna, cereálie, olejniny, sušené ovoce káva, ječmen, oves, žito, pšenice jablka, kompoty, džusy, siláž vlhké teplo, tropické oblasti, přehřátí při uložení vlhkost při uskladnění, studené a vlhké klima makroskopické poškození plodu, nedostatek anaerobiózy 35

4 VLIV VLÁKNITÝCH MIROMYCET A MYKOTOXINŮ NA ZDRAVÍ ROSTLIN, LIDÍ A ZVÍŘAT 4.1Vliv vláknitých mikromycet na zdraví rostlin Rostliny mohou být napadeny vláknitými mikromycetami v průběhu všech vývojových stádií (klíčení, vzcházení, odnožování, sloupkování, metání, kvetení). Nejčastěji dochází k napadení vláknitými mikromycetami při poranění rostliny, kdy je poškozena epidermis nebo průnikem průduchy. Napadení má několik fází. V první fázi dochází ke kontaktu rostliny se spórou. Spóra začne po 3 až 4 hodinách klíčit a primární klíček hledá místo pro vstup do buňky. Některé vláknité mikromycety mají dost energie prorazit buněčnou stěnu a napadnout buňku. Po cca 17 hodinách po dosednutí nastává druhá fáze. Dochází k tvorbě apresoria, které proniká pod epidermální buňky. Ve třetí fázi pronikají haustoria do cytoplazmy mezofilních buněk a rozvětvují se. Rostlina se brání napadení pasivně, kutikulou s povrchovou vrstvou vosku, trichomy nebo fenologickými látkami. Aktivní obrana je zaměřena přímo proti patogenu, který působí poškození. Úkolem je odradit ho nebo poškodit např. látkami, které jsou pro něj toxické. Schopnost bránit se je závislá na genech. Proti každému patogenu, který je schopen překonat obranné mechanizmy se v průběhu evoluce vyvinuly rezistentní geny. Tyto geny jsou schopny rozpoznat napadení patogenem a spustit obranný systém. 4.1.1 Fuzariózy obilnin Příznaky napadení Fusárií se obvykle projevují v průběhu června na stéblech, která v dolní třetině tmavnou. Tmavě hnědé nekrózy bez ostrého ohraničení se šíří po celém stéblu směrem vzhůru. Pokud je v porostu vysoká vlhkost objevuje se na stéblech kompaktní bílé mycelium. Napadeny nejsou jenom stébla a kořeny. Na listech se objevují světlé nepravidelné a neohraničené skvrny. Napadení klasů je nejvíce zřejmé ve fázi zelené zralosti. Jednotlivé klásky mají modrozelené zbarvení, nepravidelně dozrávají a později zasychají. Fusariózy kukuřice jsou dobře rozpoznatelné díky oranžovému až skořicovému zbarvení listenů. Pod listeny jsou 36

palice rozrušeny s nádechem purpurové barvy. V pokročilém stádiu má vřeteno hnědočervenou barvu a je silně zpuchřelé. Nejvíce napadené klasy pocházejí z minimalizačního zemědělství. Napadení stébel je částečně možné omezit aplikací fungicidu. Vhodné je i ošetření klasů v době před kvetením, popř. po květu. 4.2 Vliv mykotoxinů na zdraví lidí Mykotoxiny u lidí způsobují závažná onemocnění. Přehled významných mykotoxinů ovlivňující lidské zdraví je uveden v (Tab. 15). Mykotoxikózy můžeme dělit: Jistá: Ergotismus, Akutní kardiální beri-beri, Alimentární toxická aulekie (ATA) Multifaktoriální, kde mykotoxin je jedním z možných činitelů: aflatoxikóza, primární hematom, Reyův syndrom, Kwashiorkor, defekty nervové trubice. Nejistá či nedostatečně prokázaná: kardiomyopatie, Kešanská kardiomyopatie, pelagra, karcinom jícnu, balkánská endemická neuropatie, poruchy imunity [36]. Tabulka 15: Hlavní mykotoxiny ovlivňující lidské zdraví a jejich výskyt, (D Melllo, 2003) Mxkotoxiny Plíseň Potravina Ergotové alkaloidy Claviceps purpurea Obilniny Aflatoxiny Aspergillus flavus, A. parasiticus Ořechy, kukuřice Kys. cyklopiazonová A. flavus Ořechy Ochratoxin A A. ochraceus, Penicillium viridicatum Obilniny a obilné výrobky P. cyclopum Surová káva Citrinin P. citrinum, P. expansum Obilniny Patulin P. expansum Jablečné výrobky Citreoviridin P. citreo-viride Rýže T - 2 toxin Fusarium sporotrichoides, F. poae Obilniny Diacetoxyscirpenol F. sporotrichoides, F. poae Obilniny Deoxynivalenol F. culmorum, F. graminearum Obilniny Zearalenon F. culmorum, F. graminearum Obilniny Fumonisin, moniliformin F. moniliforme Kukuřice Kyselina tenuazonová Alternaria alternata Ovoce, zelenina, obilniny 37

4.2.1 Ergotismus Ergotismus je onemocnění, které způsobují námelové alkaloidy. Je to v podstatě otrava toxiny plísně paličkovice nachové (Claviceps purpurea). Ergotismus je historicky první mykotoxikózou popsanou u člověka. Vyskytoval se po konzumaci mouky (hlavně žitné) infikované paličkovicí. Formy ergotismu: Vaskulární forma U vaskulární formy dominují spasmy drobných cév, vyvolávající při opakovaném působení toxinů a po větších dávkách odumření akrálních částí těla (ušní boltce, nos, brada, rty, prsty apod.). Ve středověku se onemocnění nazývalo nemoc sv. Antonína. Ve stádiu akutní otravy je známo náhlé přechodné oslepnutí, vyvolané spasmem drobných cév na sítnici. Psychotropní forma U psychotropní formy se vyskytují zejména tělové a sluchové halucinace, korespondující s lidovými představami o příznacích očarování. Působení na plod Paličkovice nachová, resp. látky v ní obsažené kromě výše uvedených projevů působí i jako teratogen, způsobuje poškození plodu, především v raných stádiích těhotenství [22]. 4.2.2 Akutní kardiální beri-beri Toto onemocnění bylo popsáno v roce 1942 po konzumaci pokrmů ze žluté rýže a poté v době 2. světové války v jižní Asii. Za příčinu byl nejprve považován nedostatek vitaminu B1, ale později bylo zjištěno, že původcem je Penicillium citreoviride způsobující kardiální beri-beri. Onemocnění se projevuje křečemi a vzestupnou paralýzou. Na srdci je výrazná porucha rytmu (Wenckebachovy periody) a může skončit úmrtím na zástavu srdce. Není léčitelné vitamínem B1. Toxin má jasně žlutou barvu, která je na rýži patrná. Pokud je žlutá rýže vystavena slunečním paprskům dochází k její úplné detoxikaci, protože je citreoviridin silně fotolabilní [14]. 38

4.2.3 Alimentární toxická aleukie (ATA) První zmínky o této nemoci byly zaznamenány v roce 1913. Na konci druhé světové války byli Rusové na Sibiři donuceni z nedostatku potravy jíst obilniny zanechané na poli během zimy. Tající sníh zvýšil vlhkost zrna a podporoval růst vláknitých mikromycet. Výsledkem bylo vypuknutí mykotoxikózy zvané Alimentární toxická aleukie. Onemocnění je způsobeno T-2 toxinem a příbuznými trichotheceny, které jsou produkovány houbami rodu Fusarium. Onemocnění probíhá ve třech fázích: V první fázi se je napadeno trávicí ústrojí - záněty sliznice, zvracení, průjmy. Ve druhé fázi dochází k zdánlivé úlevě, která je doprovázená poklesem počtu krevních destiček a bílých krvinek. Ve třetí fázi jsou nemocní postiženi bakteriálními infekcemi a krvácením. Rekonvalescence pacientů, kteří přežijí, trvá několik měsíců. Při nemoci je důležitý přísun plnohodnotných bílkovin [36] [44]. 4.2.4 Aflatoxikóza V roce 1974 došlo k vypuknutí akutní aflatoxikózy v Indii jako následek konzumace kukuřice kontaminované aflatoxinem. Choroba se projevovala zvracením, bolestmi břicha, plicním edémem a nekrózou jater. Jako hlavní příčina smrti bylo uvedeno krvácení gastrointestinálního traktu [26]. 4.3 Vliv mykotoxinů na zdraví zvířat, produkci a kvalitu potravin Každý druh mykotoxinu má své specifické účinky, ale dá se říci, že u řady mykotoxinů kontaminující krmiva se projevují společné negativní vlivy. Přehled nejběžnějších mykotoxikóz je uveden v Tab. 16. U intoxikovaných zvířat můžeme sledovat pokles přírůstků, mléčné a masné užitkovosti a snášky. Obecně se dá říci, že nejhorší je kontaminace krmiva malým množstvím mykotoxinu, protože pokud je krmivo napadené hodně, zvíře ho nikdy nesežere. 39

Toxické účinky mykotoxinů: Akutní toxicita se projevuje po požití vyšších dávek mykotoxinu a to ve velmi krátkém časovém intervalu. Způsobují zjevné a specifické onemocnění, jejichž nástup je velmi rychlý, mohou způsobit i smrt. Chronická toxicita vzniká při opakovaném podávání menších dávek mykotoxinů. Často probíhá bez zjevných klinických příznaků, a tím může uniknout pozornosti. U hospodářských zvířat se tato toxicita projevuje sníženou užitkovostí, poruchami imunitního systému, poruchami rozmnožování nebo sníženou jakostí živočišných produktů. Pozdní toxické účinky se vyskytují za delší dobu po expozici mykotoxinů, přičemž závisí na koncentraci mykotoxinu. Patří sem účinky mutagenní, karcinogenní, imunosupresivní a embryotoxické [10]. Pokud dojde k intoxikaci krmivem, jsou klinické příznaky málo specifické. Mykotoxiny mohou u zvířat vyvolat řadu změn jako např. patologické změny na orgánech (játra, ledviny, CNS), sníženou plodnost, potraty, alergické reakce, oslabení imunitního systému, hromadí se a vylučují v produktech (často v metabolicky a toxikologicky aktivnějších formách) a tím ohrožují i zdraví člověka. Působení na zvířata je dáno druhem mykotoxinu, přijatou dávkou, přítomností více druhů mykotoxinů, délkou zkrmování, druhem zvířete, pohlavím (rozdílná citlivost samců a samic, estrogenní aktivita), nutričním stavem (podvyživená zvířata jsou citlivější), fyziologickým stavem (vyčerpání, gravidita) a zdravotním stavem [41]. U skotu pozorujeme snížený příjem krmiva, nízké přírůstky a sníženou produkci mléka, zvýšený výskyt potratů a embryonální mortality, tiché říje, nepravidelný pohlavní cyklus, nižší procento zabřezávání, zadržení a záněty dělohy, sníženou imunitu, dysfunkce slezu, ketózy a ztučnění jater, rezidua v mléce. U drůbeže je patrný zhoršený růst, snížený příjem krmiva, atrofie vaječníků, deformovaná vejce, ztučnění jater, snížený počet bílých krvinek a T-lymfocytů. U prasat se projevuje nechutenství, poruchy reprodukce, průjmy, zvracení. 40

4.3.1 Nejvýznamnější mykotoxikózy zvířat 4.3.1.1 Stachybotriotoxikóza Je onemocnění vyvolávané safratoxiny, trichotecenovými mykotoxiny produkovanými plísní Stachybotrys atra. U drůbeže způsobují difteroidní záněty sliznice dutiny zobáku, jícnu, volete a svalnatého žaludku. Postižená kuřata mohou uhynout po 1-2týdenním trvání nemoci [24]. 4.3.1.2 Ochratoxikóza Je onemocnění vyvolané plísněmi Aspergillus ochraceous a Penicillium viridicatum. U drůbeže se projevuje nekrózou epitelu proximálních tubulů, inhibuje sekreci kys. močové. Postižené ledviny jsou zduřelé a tuhé, dochází k jejich selhání a úhynu. Napadená zvířata jsou zakrslá, jsou viditelné poruchy opeření, anémie a zhoršená srážlivost krve [23]. 4.3.1.3 Leukoencefalomalacie Je smrtelné nemocnění postihující mozek, játra a ledviny, projevuje se svalovým třasem, poruchami koordinace pohybů, vrávoravou chůzí, natažením nohou a krku až celkovým ochrnutím. Onemocnění je způsobeno požitím krmiva kontaminovaného fumonisiny [36]. 4.3.1.4 Plicní edém prasat Plicní edém prasat se projevuje jaterními lézemi, nekrózou jater a zvýšenou hladinou sérového cholesterolu, dochází i k selhání srdce. Onemocnění je způsobeno požitím krmiva kontaminovaného fumonisiny [36]. 41

Tabulka 16: Třídění a obecná charakteristika mykotoxikóz u hospodářských zvířat, (Kummer a kol., 2001) Mykotoxin Plíseň Onemocnění Klinické příznaky Aflatoxiny Aspergillus Aflatoxikóza Slepota, chůze flavus a dokola, křeče, pěna další u tlamy, úhyn během 48hod. Fumonisiny Fusarium Leukoencefalomalácie Třes, nejistý pohyb, moniliforme neschopnost koní polykat, deprese, polehávání, úhyn Ochratoxiny Aspergillus Nefropatie Průjem, žíznivost, ochraceus polyurie Nemakrocyk lické tichotheceny (T-2 toxin, deo- Fusarium sporotrichoi des, F. roseum, Fuzariotoxikóza Zvracení, odmítání krmiva, průjem, vředy, poruchy reprodukce xynivalenol) F.culmorum Zearalenon Fusarium Estrogenní Poruchy plodnosti roseum, F. syndrom samců a samic, culmorum, zduření vulvy, Giberella vaginy a mléčné zeae a další žlázy, výhřez rekta Druh zvířete Prasata, ovce, skot Koně, osli Všechny druhy, zjm. prasata Všechny druhy Prasata, skot Substrát Skladované obilí, mleté ořechy, arašídy, plesnivý chleba, plodiny na poli Plesnivé obilí, uskladněné nebo stojící na poli Skladované obilí Skladované obilí Plesnivá kukuřice nebo ječmen 42

4.4 Prevence Plísňová a mykotoxinová kontaminace není obtížná, protože se plísně nachází jak v půdě, prachu tak i na rostlinách a jejich plodech. Preventivní opatření při pěstování a sklizni krmiv: - střídání plodin v osevních postupech. - zpracování půdy. - výběr vhodné odrůdy, hybridu. - protiplísňové ošetření osiv. - vyrovnaná výživa porostů. - boj proti plevelům, škůdcům a chorobám. - šlechtění hybridů odolných proti houbovým chorobám a škůdcům. - udržování porostů v dobrém zdravotním stavu. - využitím atoxigenních kmenů (konkurenčně vyloučit z prostředí toxikogenní plísně). - zabránit mechanickému poškození zrna (při sklizni a uskladnění nebo manipulaci). - kvalitní ošetření a uskladnění krmiv po sklizni. Preventivní opatření při skladování a konzervaci krmiv: - udržovat vlhkost zrnin pod 12 %. - nepoužívat poškozená zrna. - uskladnění v suchém prostředí do 65 % relativní vlhkosti. - u siláží udržovat nízké ph a zamezit pronikání vzduchu. - ošetření krmiv protiplísňovými přípravky. - zkrmovat siláž a zrniny v čerstvém stavu. - odstranění kontaminovaných částí krmiva. - udržovat silážní a skladovací prostory, žlaby v čistotě, odstranit zbytky starých krmiv, řádně vyčistit zásobníky před každým plněním [41]. 43

5 PÍCE JAKO PRIMÁRNÍ ZDROJ MYKOTOXINŮ V KRMIVECH 5.1 Infekce zrnin plísněmi Vláknité mikromycety jsou součástí půdní biocenózy a plní nezbytnou úlohu v recyklaci živin. Nepříznivé počasí, nevhodné podmínky pěstování a ošetření, umožňují sporám plísní klíčení, růst a množení přímo na poli. Spory, které se v prostředí šíří větrem nebo hmyzem napadají rostliny již během jejich růstu. Vláknité mikromycety pronikají do hostitelských pletiv přes kořen, stonek i listy. Vláknité mikromycety rodu Fusarium napadají zárodečné tkáně semen. Je zajímavé, že byla prokázána větší koncentrace zearalenonu na stonku kukuřice, nežli na palici. Plísně kontaminují zrniny a krmné plodiny v průběhu celého výrobního procesu. Proto včasná a správně realizovaná sklizeň a posklizňová úprava zrnin není posledním článkem k zajištění kvality. Důležitý je i transport. Zrniny musí být až do jejich spotřeby řádně uskladněny a ošetřovány [41]. Rozlišujeme tři skupiny vláknitých mikromycet: polní (rod Fusarium, Alternaria, Cladosporidium, Diplodia, Giberella a další), jsou přítomny v zrnu již před sklizní obilovin. skladištní (rod Aspergillus, Penicillium), v podmínkách skladování produkují mykotoxiny. polní i skladištní (rod Penicillium). Skladování zrnin je poměrně složitou záležitostí. Zrniny podléhají celé řadě endogenních a exogenních faktorů, které je mohou znehodnotit nebo zcela zničit. Jakmile se vytvoří vhodné podmínky pro klíčení spor, dochází k růstu a množení vláknitých mikromycet. Podmínky nutné pro růst vláknitých mikromycet jsou často odlišné od podmínek indukujících vláknité mikromycety ke tvorbě toxinů. Po počáteční infekci vláknitých mikromycet omezuje tvorbu mykotoxinů nízký obsah vody a sacharidů v rostlině. Jakmile vláknité mikromycety napadnou krmiva, začnou využívat jejich živiny pro svůj metabolismus a rozmnožování a snižují jejich obsah. Kukuřice napadená vláknitými mikromycetami ztrácí až 10 % metabolizovatelné energie a 5 % bílkovin. Metabolická činnost vláknitých mikromycet je v krmivech spojena s aerobním dýcháním, při kterém se spotřebovávají významné živiny, 44

především tuky a sacharidy. Uvádí se, že po 50 dnech skladování se snížil obsah tuku u kontaminované kukuřice o 52 až 57 %. Tím dochází k výraznému snížení energické složky krmiva. Pro skladování krmiv jsou určující faktory především technologie krmení, druhy krmiv, počet chovaných zvířat a klimatické podmínky. Skladovací sila musí konstrukčně vyhovovat zásadám optimální kapacity a zachování jakosti zrnin. Zásobníky nesmí podporovat vlhnutí zrnin a musí umožňovat vyprazdňování samospádem. Zvláště při změnách atmosférických teplot může dojít na vnitřních stěnách sil ke srážení páry, a tím k tvorbě vláknitých mikromycet. Používané halové sklady jsou vhodné především ke krátkodobému uskladnění. Krmivo se v nich skladuje na podlahách v hromadách, a proto je nutné dbát na hygienu skladovacích prostor. Vhodná je i průběžná laboratorní kontrola zrnin včetně sledování vlhkosti [41]. Na přítomnost vláknitých mikromycet a mykotoxinů v krmivech upozorňují změny, jako je charakteristický zápach, barva nebo morfologické změny na semenech a plodech [36]. Metabolity vláknitých mikromycet výrazně snižují i chutnost krmiva. Podle odhadu FAO je 25 % světových zásob obilnin kontaminováno mykotoxiny. 5.2 Mykotoxiny v travních porostech a píci Jak už bylo, řečeno vláknité mikromycety jsou součástí půdní biocenózy a není tak jednoduché vyhnout se kontaktu s nimi. Travní porosty mohou být v průběhu vegetace napadeny různými druhy vláknitých mikromycet nebo hub. Například houby rodu Neotyphodium produkují toxiny - alkaloidy, které můžou způsobit poruchy pohybu, plodnosti nebo gangrénu končetin. V Evropě infikuje Neotyphodium zejména trávy např. jílek vytrvalý (Lolium perrene), ale jeho výskyt byl popsán i na přírodních loukách, ovšem v závislosti na roční době a počasí. Počet odrůd s endofyty v českém sortimentu odrůd trav narůstá díky registraci zahraničních materiálů. Hyfy rodu Neotyphodium byly detekovány u 35 % sortimentu odrůd jílku vytrvalého, 58 % odrůd kostřavy luční, 46 % odrůd kostřavy rákosovité, 12 % odrůd jílku mnohokvětého italského, 7 % odrůd sortimentu kostřavy červené a 27 % odrůd sortimentu kostřavy ovčí. Jedinci obsahující endofyty jsou přítomni především v odrůdách využívaných pro trávníky. Výjimkou je kostřava luční, která je výhradně využívaná pro pícninářské účely. 45

Domácí odrůdy endofyty zatím neobsahují [32]. Výskyt vláknitých mikromycet zaznamenáváme v průběhu celého vegetačního období, ale nejvíce bývají travní porosty napadeny v pozdním létě a na podzim. Mezi nejznámější a nejstudovanější mykotoxiny vyskytující se v píci patří pro jejich toxicitu a četnost zejména DON, T-2 toxin, zearalenon a fumonisiny. Na porostech jílku vytrvalého, festucoidního a loloidního hybridu byl sledován obsah mykotoxinů od června do října. Pro detekci mykotoxinů byla využita metoda ELISA. Nejvyšší obsah DON a zearalenonu byl v píci loloidního hybridu. DON byl detekován v píci z června a zearalenon z července. Nejvyšší obsah zearalenon byl v píci v říjnu [33]. Na obsah mykotoxinů v píci má vliv nejen roční období a počasí, ale i druh rostliny (Tab. 17). Tabulka č. 17: Vliv druhu a termínu odběru na obsah mykotoxinů (ppb) a ergosterolu (mg.kg -1 ) u vybraných druhů trav v letech 2008-2010, (Skládanka a kol., 2011) Faktor DON Fuminisiny Aflatoxiny Zearalenon Ergosterol Druh Jílek vytrvalý 47,72 < LOQ < LOQ 37,81 16,43 Festucoidní hybrid 43,54 < LOQ < LOQ 4,09 12,53 Loloidní hybrid 40,81 < LOQ < LOQ 80,92 17,17 Termín odběru Počátek června 19,97 < LOQ 0,00 < LOQ 3,71 Červenec/srpen 64,09 < LOQ < LOQ 40,52 14,27 Počátek října 48,02 < LOQ < LOQ 82,28 30,12 Rok 2008 43,4 0,00 < LOQ 115,44 11,44 2009 41,18 < LOQ < LOQ 7,32 17,2 2010 47,5 < LOQ 0,00 < LOQ 18,53 Kromě výše uvedených faktorů má na obsah mykotoxinů v píci vliv i intenzita využívání travních porostů. Při srovnávání tří různých druhů trav na výskyt ergosterolu a zearalenonu na konci vegetačního období se ukázalo, že nejméně byl napaden druh festulolium a to u dvousečných porostů (sklizeň počátkem června a srpna) [17]. 46

Po srovnání obsahu mykotoxinů u alternativně a konvenčně pěstovaného žita a pšenice, byl v žitě pěstovaném alternativně zjištěn průměrný obsah deoxynivalenolu v množství 427 µg.kg -1, zatímco v žitě z konvenčního zemědělství v množství 160 µg.kg -1. V pšenici pěstované alternativně byl obsah zearalenonu 24 µg.kg -1, v konvenčně pěstované 6 µg.kg -1. Vzhledem k tomu, že do studie bylo zahrnuto jen málo vzorků, nelze z této studie dělat konečné závěry. Uvedené zjištění však ukazuje na to, že je třeba se v budoucnu zaměřit i tímto směrem [38]. V seně a slámě byly nalezeny vláknité mikromycety rodu Fusarium a to zejména T-2 toxin a satratoxin, které patří do skupiny dermatotoxinů a způsobují poškození pokožky. Satratoxiny jsou termostabilní a fotostabilní a ovlivňují krvetvorbu, nervový systém a mají vliv aborty. 5.3 Mykotoxiny v siláži Siláž je konzervovaná zelená píce a je používána především jako náhrada pastvy v zimních měsících. V dnešní době je hlavním krmivem pro přežvýkavce. Siláž je zdrojem živin, vlákniny, vitamínů, organických kyselin a minerálních látek, ale také může být zdrojem zdraví nebezpečných a technologicky nežádoucích mikroorganismů, toxických látek (Tab. 18) a faktorů působících metabolické poruchy hospodářských zvířat [41]. Základem pro výrobu kvalitních siláží nekontaminovaných mykotoxiny je integrovaný systém pěstování rostlin s vhodně volenými prvky ochrany rostlin, kam můžeme zařadit volbu optimálního stanoviště pro pěstovanou plodinu, výběr vhodné odrůdy pro pěstitelskou oblast, výživa, přiměřená pesticidní ochrana proti houbovým chorobám a hmyzím škůdcům, kteří svojí činností vytvářejí vstupní bránu pro patogeny produkující toxické látky [25]. Důležité je i načasování sklizně v optimální silážní zralosti (28 až 35 % sušiny), zajištění dokonalé fermentace viz Tab. 19, rychlé naplnění sila, vytěsnění kyslíku v průběhu konzervace, zakrytí silážního prostoru a zamezení sekundární kontaminace houbovými patogeny [36]. Silážování je proces, kdy se uchovává hmota v kyselém anaerobním prostředí, které tvoří vhodné podmínky pro bakterie mléčného kvašení jako jsou např. laktokoky, streptokoky, laktobacily. Tyto bakterie produkují ze zkvasitelných cukrů kyselinu mléčnou (která prostoupí krmivem a konzervuje ho), CO 2 a vodu. Obsah cukru je ovlivněn hlavně použitou surovinou. Nejvíce kvalitní a zároveň nejvíce 47

problematická je siláž kukuřičná. Anaerobní podmínky zajistíme tím, že je rostlinná hmota nařezána na drobné kousky o velikosti 5 až 10cm a je důkladně utlačena v silážním žlabu. Silážní žlab je po stranách částečně zakryt nejprve stranovými fóliemi, poté se na celý povrch silážní jámy rozprostře podkladová folie, která přilne k povrchu. Následně se aplikuje vlastní silážní fólie. Na povrch se může umístit ochranná síť proti divokým zvířatům a nakonec se povrch rovnoměrně zatíží. K zatížení je vhodné použít místo klasických ojetých pneumatik např. zátěžové rašlové pytle naplněné štěrkem [40]. V dobře založené a utěsněné silážní jámě, kde je vytvořeno anaerobní prostředí nemohou vláknité mikromycety rodu Fusarium dlouhodobě přežívat. Mezi tolerantní plísně můžeme zařadit rod Aspergillus fumigatus, některé Mucorales a Penicillium. Jediným druhem vláknitých mikromycet nalezených v životaschopném stavu i po 60 dnech byl rod Penicillium roqueforti [1]. Dalším faktorem ovlivňující množství vláknitých mikromycet během fermentace jsou změny ph, způsobené přirozenou produkcí organických kyselin. Samotná úroveň ph plísně nijak neovlivňuje, ale široké rozpětí ph od 3 do 8 a kolísání mezi těmito hodnotami má vliv na jejich citlivost vůči ostatním faktorům. Kyselina mléčná nemá většinou žádné negativní účinky, ale kyselina propionová je možným inhibitorem vláknitých mikromycet [25]. Tabulka č. 18: Průměrná koncentrace mykotoxinů (ppm) v siláži v letech 200-2003, (Gonzáles-Pereyra a kol., 2007) Druh siláže Aflatoxiny T-2 toxin Fuminisiny DON Zearalenon Vojtěšková 0,0035 0,176 0,050 0,500 0,577 100 Kukuřičná 0,0014 0,260 1,870 0,960 1,377 96 Jetelotravní 0,0028 0,242 0,470 0,630 0,179 100 Travní 0,0024 0,207 1,110 0,550 1,197 93 % pozitivních vzorků 48

Tabulka č. 19: Výskyt mykotoxinů v siláži před a po fermentaci, (Gonzáles-Pereyra a kol., 2007) Vzorek siláže Zearalenon Deoxynivalenol Fumonisin B1 Před silážováním 18 ± 7 a 150 ± 60 a 600 ± 440 a Po silážování 50 ± 60 a 276 ± 130 b 1100 ± 500 b Výsledky jsou uvedeny v ng.g -1 se statisticky významně liší (P<0,05). siláže. Hodnoty ve sloupcích s různými indexy K rozvoji vláknitých mikromycet dochází hlavně po otevření sila, a to nejvíce v zimních měsících. Menší množství mykotoxinů, je obtížně zjistitelné, protože siláž nemusí být viditelně napadená. Charakteristickým projevem u intoxikovaných zvířat je snížená žravost, pokles užitkovosti, změny v jakosti a skladbě mléka a masa. Velmi často je kladená otázka jak se mění obsah mykotoxinů v průběhu silážování. V následujícím grafu je uveden průměrný obsah mykotoxinů v založené kukuřičné siláži [43]. Obr. 15: Graf Průměrný obsah mykotoxinů v založené kukuřičné siláži 49