Systém Jasco LC 2000 (HPLC High Performance Liquid Chromatography) Princip: Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je separační metoda založená na rovnovážné distribuci analytů mezi vzájemně nemísitelnými fázemi. Stacionární fáze (SF) je nepohyblivá, nejčastěji je zakotvená na pevném nosiči uvnitř chromatografické kolony, mobilní fáze (MF) je pohyblivá a je pod vysokým tlakem protlačována okolo stacionární fáze. Během separace se analyt rozděluje mezi mobilní (kapalnou) a stacionární (pevnou) fázi podle své afinity ke každé z nich. V metodě HPLC s normální fází je stacionární fáze tvořena látkami polární povahy, jako je silikagel, aminopropyl, kyanopropyl nebo dioly. Mobilní fáze pak látkami méně polární povahy, např. n-hexanolem, chloroformem, apod. Požadavky na analýzy (z návrhu grantu): - stanovení obsahu imunoglobulinů (IgA, IgG), - stanovení hladiny somatotropního hormonu, - složení mléčných bílkovin, - stanovení obsahu močoviny, - stanovení ovoalbuminu a ovotransferinu, ovomukoid - obsahu vitaminů (beta-karoten, A, E, C) - obsah anorganického fosforu, - tvorba organických kyselin (např. kyselina mléčná a jantarová), - rezidua cizorodých látek, zejména těžkých kovů, - aminokyselinové složení živočišných proteinů. 1
Technické parametry: 7 8 4 9 10 1 2 5 11 3 6 12 Popis sestavy: 1) Refraktometrický detektor RI 2000, 2) detektor diodového pole Jasco MD 2018 Plus, 3) fluorescenční detektor Jasco FP 2020 Plus, 4) vakuový degasser VD 020, 5) termostat kolon Jasco CO 2060 Plus, 6) mixer pro HPLC Sunchrom, 7 + 8) mobilní fáze A + mobilní fáze B, 9) 1 pumpa pro mobilní fázi A Jasco PU 2080 Plus, 10) 2 pumpa pro mobilní fázi B Jasco PU 2080 Plus, 11) autosampler Jasco AS 2059 Plus, 12) sběrná datová linka Jasco LC-Net II/ADC. 2
1) Refraktometrický detektor RI 2000 Refraktometrický detektor má vynikající citlivost a stabilitou signálu. Je určený pro univerzální detekci v HPLC. Nevhodný pro gradientovou eluci. Optické komponenty jsou dokonale tepelně izolovány a s pomocí přesného řízení teploty detektor dosahuje stabilní nulové linie a vysokého poměru signálu k šumu. Detektor je vybaven ventilem pro automatický proplach referenční cely a funkcí autozero pro celý měřící rozsah. Píky mohou být pozitivní i negativní, nízká citlivost. Vhodný pro látky, které neabsorbují, nefluoreskují, tj. cukry, lipidy, polymery. Princip měření Výchylkový Rozsah RI jednotek 1.00 to 1.75 Průtok 0,2 3,0 ml/min Objem cely 9 μl, 45 angle Max. tlak v cele 6 kg/cm 2 Mrtvý objem před celou 24 μl Lineární rozsah 0-1000 μriu Šum 5 x 10-9 RIU Rozsah nulování Celý měřící rozsah Drift při 1ml H2O/min < 1mV/hour Promývací ventil Ano Integrátorový výstup +/- 1 Volt Výstup na zapisovač +/- 10mV / 100mV / 1Volt Komunikace RS232 obousměrná, Purge, Autozero, Start, Stop Data Out 1 Hz, 10 Hz, Lock Digitální výstupy TTL: Intensity Alarm Digitální vstupy TTL: Purge, Autozero, Start, Marker Temperace Ambient, 35 C to 55 C in 1 C steps, Thermal Fuse 75 C Časová konstanta RAW (0,0sec), Fast (0,4sec), Medium (0,8sec), Slow (1,2sec) Napájení AC 100-120/220-240V, 50/60 Hz, 50VA Rozměnry (cm) 22(W) 35(D) 15,5(H) Hmotnost 12 kg 2) Detektor diodového pole Jasco MD 2018 Plus Jednopaprskový detektor diodového pole s vysokým rozlišením (1024 diod) vybavený deuteriovou a wolframovou lampou pro citlivá měření v rozsahu 190-900 nm. Termostatování cely a kompartmentu lamp zvyšuje stabilitu nulové linie. 3
Rozsah λ: 190 900 nm Počet diod: 1024 Rozlišení: 0,7 nm/diodu Šířka štěrbiny: 1, 4 a 8 nm Správnost λ: +/- 1 nm Šum: 0,7 x 10-5 AU Drift: 1x10-4 AU/h Sběr dat: simultánní sledování signal až při 8 různých vlnových délkách Průtoková cela: analytická: optická dráha 10 mm, objem 10 μl 3) Fluorescenční detektor Jasco FP 2020 Plus Vysoce citlivý fluorescenční detektor, který měří v rozsahu vlnových délek 220 až 700nm pro excitaci i emisi. Možnost časového programování a skenování v režimu excitace i emise. Monochromator: holografická konkávní difrakční mřížka jak pro emisi tak i pro excitaci. Zdroj světla: 150 W Xe lampa Rozsah λ: 220 700 nm Sppektrální šířka: Ex: 18 nm Em: 18 nebo 40 nm Správnost λ: +/- 2 nm Opakovatelnost λ: +/- 0,3 nm Průtoková cela: 16 μl 4) Vakuový degasser VD 020 Dvoukanálový HPLC degasser s mrtvým objemem pouze 480 µl. Použitá Teflon AF membrána. Speciální vakuová pumpa zajišťuje konstantní vakuum v průběhu provozu. Odplyňovací kapacita je na úrovni cca 2 ppm rozpuštěných plynů při 1/ml min. Maximální průtok 10 ml/min. 5) Termostat kolon Jasco CO 2060 Plus Kolonový termostat s aktivní cirkulací vzduchu vybavený Peltiérovým článkem určený jak pro chlazení tak i vyhřívání chromatografických kolon. Rozsah teplot: 4 C 80 C s nastavením po 0,1 C Přesnost teploty: +/- 1 C Stabilita teploty: +/- 0,1 C 4
Kapacita kolon: prostor 120 x 425 x 120 mm (š x v x h) pro až 6 ks analytických kolon o délce do 40 cm Programování: teplotní gradient až v 64 krocích 6) Mixer pro HPLC Sunchrom Vysokotlaký dymanický mixér se směšovacím objemem 150 μl, který zajišťuje extrémní požadavky na stabilitu nulové linie. 9 + 10) Pumpy 1 a 2 pro mobilní fáze A a B Jasco PU 2080 Plus Podporují vysokotlaký binární gradient, sestava má dvě nezávislí HPLC čerpadla s rozsahem průtoku 1 μl/min 10ml/min nastavitelným po 1 μl v krocích. Přesnos průtoku: lepší než 0,1% RSD, Správnost průtoku: +/-1% z nastavené hodnoty Max. tlak: 50 Mpa do průtoku 5 ml/min Každé čerpadlo je ovladatelné z klávesnice na přístroji nebo řízené z datastanice ChromNAV. 11) Autosampler Jasco AS 2059 Plus Plně automatický autosampler s modulem TC-2059 pro termostatování. Možnost dávkování ze standardních vialek nebo ze vzorkovacích destiček. Uživatelské programování s 64 programovými kroky pro předkolonovou derivatizaci, ředění vzorku. Metody nástřiku: celá smyčka, částečně plněnná smyčka, nulová ztráta vzorku Počet vzorků: 120 standardních 2 ml vialek Objem nástřiku: 0,1 200 μl s krokem 0,1 μl Opakovatelnost nástřiku: < 0,2 % Přenos vzorku: < 0,002% Oplach jehly: speciální oplachový port pro vnitřní i vnější oplach jehly Programování: uživatelské programování (64 kroků), až 6 vialek pro reagencie Termostatování vzorku: v rozsahu teplot +4 C 60 C s přesností +/- 1 C 12) Sběrná datová linka Jasco LC-Net II/ADC Chromatografická datastanice pro řízení a sběr dat JASCO HPLC systému. Data stanice je vybavena pro sběr a vyhodnocení 3D dat z detektoru diodového pole. Software umožňuje tvorbu uživatelských reportů a export změřených dat použitelný v tabulkových procesorech. 5
Kolony, které máme: ReproSil 100 C18, 3 μm, 150 x 4,6 mm analyt. kolona, ph stab. ph 10, Cena: cca 6000 Kč, Sun Shell C18, 2,6 μm, 75 x 4,6 mm analyt. kolona, částice s pevným jádrem, stab. ph 10, Cena: cca 10000 Kč, ZORBAX Eclipse XDB - C18, 1,8 μm, 4,6 x 50 mm analyt. kolona pro stanovení AMK, Cena: cca 7000 Kč. Metodiky + normy - lze čerpat z dobře napsané metodiky článku (separáty na WOS) nutné, aby bylo uvedeno: příprava vzorku, použité chemikálie, mobilní fáze A a B, použitá kolona - typ, program (gradientový x isokratický), standard. - norma normalogický ústav, zakoupení metodiky. Příprava vzorku + chemikálie (kdo + z čeho) - celkový počet vzorků!!!, - náročnost předpřípravy vzorku rozklad - olejová lázeň, centrifugace, extrakce, atd. - chemikálie - možnost k zakoupení aldrich sigma, p-lab., veterinární zásobování. Z informačního letáku Jasco LC 2000 Plus Series N-methyl-karbamát pesticidů Post-kolonová derivatizace se semi-mikro HPLC. Tento systém N-methyl karbamát pesticidů využívá pro analýzu OPA post- kolonovou derivatizaci a fluorescenční detekci. Vysokotlakový gradient eluce se semi-mikro HPLC a vysoce citlivé detekce používá fluorescenční detektor, který umožňuje maximální 18-komponentní analýzu v jedné injekci. Látky typu: Oxamyl, Methomyl, Methiokarb sulfoxide, Aldikarb, Methiokarb sulfone, Methiodicarb, Primicarb, Metholcarb (MTMC), Propoxur (PHC), Karbofuran, Bendiocarb, Xylylcarb (MPMC), Macbal (XMC), Karbaryl, Ethiofencarb, Isoprocarb (MIPC), Fenobcarb (BPMC), Methiokarb. Formaldehyd a acetaldehyd ve vodě z kohoutku 1, 3 - cyclohexanedion post-kolonová derivatizace 6
Tento systém umožňuje vysoce citlivé měření formaldehydu a acetaldehydu v ppb úrovni bez jakékoliv předběžného zpracování, pomocí kolonové derivatizace a fluorescenční detekce. 3-cyclohexanedion jako reakční činidlo. Tato metoda může být použita nejen na sledování životního prostředí (analýza vody, včetně dešťové vody, říční vody, a jezerní vody), ale také k analýze potravin. Iminoctadine triacetát - systém analýzy Post-kolonová derivatizace a fluorescenční detekce Tento systém je navržen pro analýzu iminoctadine triacetátcelulózových vláken. Využívá fluorescenční detektor pro měření iminoctadine prostřednictvím iontové chromatografie a kolonové derivatizace. Cyanide ion a cyanogen chloride Iontová chromatografie post-kolonová absorpční spektrometrie Iontová chromatografie post-kolonová absorpční spektroskopie je používána v analýze kyanidových iontů a chlorkyanidů. Tato metoda analýzuje kyanid tím, že chloramin T reaguje s dikyanovými eluovány z kolony. Kyanid pak reaguje s 4-pyridinecarboxylovou kyselinou / pyrazolonovou sloučeninou. Získá se modrá barva, která se měří při vlnové délce 638 nm a stanovuje množství kyanidových iontů a chlorkyanidu. Bílkovinný hydrolyzát aminokyseliny OPA post-kolonová derivatizace a fluorescenční detekce Tato analýza (AMK) používá systém post- kolonovou derivatizaci a fluorescenční detekci. Používá se O-phthalaldehyde (OPA) jako reakční činidlo. Z bílkovinného hydrolyzátu bylo analyzováno asi v 30 minutách 20 druhů amino kyselin. AMK typu: CysSO 3, Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Cys, Val, Met, Ile, Leu, Tyr, Phe, Lys, His, Trp, Arg. Polyfosforečné kyseliny v přídatných látkách potravin Post-kolonová derivatizace a viditelné absorpční detekce Tento systém analyzuje polyfosforečné kyseliny v přídatných látkách potravin použitých v rybím mase a mléčných výrobcích, prostřednictvím kolonové derivatizace a viditelné absorpční detekce. Zjistitelná vlnová délka je 830 nm pro heteropoly modrého komplexu, který je generován molybdenem a fosforem. 7
eluce. Systém může měřit tripolyfosforečnan z metafosfátu v krátké době pomocí izokratické Sloučeniny jako přídatné látky potravin Diodového pole a fluorescenční detekce Tento systém je pro současnou analýzu 43 různých najednou přidaných látek. Detektor s diodovým polem a fluorescenční detektor selektivně detekují více složek. Obrázek ukazuje chromatogramy získané u každé vlnové délky v poli fotodioda detektoru a fluorescenčního detektoru. Sloučeniny typu: - vitamíny (vitamin A, B1, B2, B12, sodium erythorbate, kys. askorbová), - umělá sladidla (aspartam, didraselný glycyrhizát, sacharin sodný, acesulfam-k, stevioside, rebaudioside, isosteviol), - antioxidanty (EDTA.2Na, butylhydroxyanisol (BHA), propylgalát (PG), nordihydroguaiaretic kyselina (NDGA), 2,4,5-Trihydroxybutyrophenone (THBP)), terc-butylhydrochinon (TBHQ), oktyl gallát (OG), dodecyl gallát (DG), 4-hydroxymethyl-2,6-di-terc-butyl-fenol), - konzervační (kyselina sorbová, parahydroxybenzoate, ethyl parahydroxybenzoate, propylparaben, butyl parahydroxybenzoate), - fungicidy (difenyl (DP), O-fenylfenol (OPP), thiabendazol (TBZ), imazalil), - ostatní (kofein), 8