PROTEOMIKA 2017 SHOT-GUN METODY

PROTEOMIKA 2017 SHOT-GUN METODY LC, IEF peptidů Kvantitativní přístupy SILAC,iTRAQ, dimetylace, 18 O, AQUA Label free MRM/SRM

proteiny proteiny 2-DE LC-MS shotgun peptidy peptidy

SPECIFICKÉ ŠTĚPENÍ BÍLKOVIN Cíl fragmentace: Definovaně fragmentovat protein, aby jednotlivé peptidy byly dostatečně malé na optimální MS analýzu, ale zároveň poskytly dostatečnou sekvenční informaci Optimum 6-20 AA, cca 800-2500 Da Proteáza Místo štěpení Poznámka Trypsin za Lys, Arg nenásleduje Pro Glu-C (Proteáza V8) za Glu a Asp nenásleduje Pro Chymotrypsin za Phe,Trp,Tyr, Leu, Ileu, Val, Met nenásleduje Pro Lys-C za Lys nenásleduje Pro Arg-C za Arg nenásleduje Pro Asp-N před Asp, Cys Chemická digesce CNBr Met organika, hydrofobní P.

Shot-gun strategies 10 000 proteins TRYPSIN ~ 400 000 peptides (2D)LC-MS IEF-LC-MS SDS-PAGE-LC-MS (gel-lc)

Shotgun postupy v proteomice 1D SDS-PAGE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů 10 5-10 7 různých IEF- RP LC In gel digesce 10-50 řízků a extrakce Komplexní směs peptidů 10 2-10 6 různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP-LC

Metody chromatografické separace peptidů VELIKOST AKTUÁLNÍ NÁBOJ Gelová filtrace (Size-exclusion chromatography) Iontoměničová chromatografie (Ion exchange chromatography) SPECIFICKÉ INTERAKCE Afinitní chromatografie (Affinity chromatography) HYDROFOBICITA HYDROFILNOST Chromatografie v reverzní fázi (Reverse phase chromatography) Chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic interaction LC, HILIC)

Identifikace proteinů v shot-gun experimentech Až stovky tisíc různých peptidů kontinuálně eluovaných z (RP) LC On-line MS přímé spojení LC kolony s ESI-MS. V reálném čase (60-600 minut) jsou eluované peptidy ionizovány. Změřeno MS, izolován prekurzor a provedena fragmentace. Cyklus přepnutí MS-MS/MS až několikrát za sekundu. Off-line MS např. LC-MALDI. Frakce eluujících peptidů jsou sbírány a MS probíhá až po sběru. Typicky sběr mikrofrakcí (nl) na MALDI destičku s následným měřením MS a MS/MS.

RP-LC ESI

RP-LC MS ESI

RP-LC MS MS/MS ESI

RP-LC MS ESI

RP-LC MS MS/MS ESI

LC-MALDI MS Nano LC s robotickým mikrosběračem frakcí. Frakce jsou on-line míchány s matricí a spotovány na MALDI destičku

Shotgun postupy v proteomice DIGESCE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP Extrémně komplexní směs peptidů 10 5-10 7 různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS

MudPIT (2002) Multidimensional protein identification technology 1484 proteinů identifikováno (kvasinka - cca 5000 ORF)

Peptidová online 2D HPLC-MS Nejčastěji ion-exchange/rp

Shotgun postupy v proteomice DIGESCE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP Extrémně komplexní směs peptidů 10 5-10 7 různých IEF- RP LC ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS

IEF-IPG peptidů Distribuce lidských peptidů dle pi Výhody IPG-IEF peptidů vysoká separační účinnost možnost vyšší nanášky informace o pi může sloužit k verifikaci ID snížení komplexity vzorku při zachování pokrytí proteomu Informace o pi může pomocí při ID stejné vybavení jako pro IEF proteinů 1/3 lidských peptidů má pi v rozmezí 3,5-4,5 Je zde zastoupeno 96% známých proteinů jednotlivé frakce jsou ze stripu extrahovány

Shotgun postupy v proteomice 1D SDS-PAGE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů 10 5-10 7 různých IEF- RP LC In gel digesce 10-50 řízků a extrakce Komplexní směs peptidů 10 2-10 6 různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP-LC

Protein identification in shot-gun experiments Unique (proteotypic) peptides X peptides present in different proteins Protein 1 Protein 2 Protein 3

Present in more proteins Unique

Kvatifikace pomocí MS? MS není kvantitiativní, z výšky individuálního signálu ve spektru nelze přímo odvozovat abundanci daného peptidu ve vzorku. Nelze získat (semi) kvantitativní informaci pouhým porovnáním dvou různých spekter. Relativní kvantifikace může být provedena u dvou chemicky identických látek v jednom spektru. Tyto látky se mohou lišit v izotopickém složení.

ENZYMATICKÉ CHEMICKÉ METABOLICKÉ Kvatifikace pomocí MS SILAC Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture itraq - isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation Dimethylation isotope labeling 18 0 labeling enzymatic digestion in 18 0 and 16 0 water AQUA a QconCAT Absolute Quantification of Abundance

SILAC Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture HEAVY 1-2 AMK značené stabilním izotopem LIGHT běžné AA 13 C, 15 N-lysin 13 C, 15 N-arginin smíchání subcell. frakcionace separace štěpení trypsinem LC-MS/MS Esenciální AMK Bezsérové systémy nebo dializované sérum! Kvantifikace: MS Identifikace: MS/MS MW

SILAC MYŠ F1 F2 F3-F4 93% 13 C 6 lysine 97% 13 C 6 lysine nearly 100 % 13 C 6 lysine Kruger, Moser et al.

ITRAQ Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation

1352.84 m/z

itraq experiment (relativní exprese proteinu ve 4 vzorcích) 1 a b c 114- A B b 114- C c 114-2 115-115- 115-3 116-116- 116-116- 116-116- 4 117-117- 117-117- 117-117- Naštěpení trypsinem Všechny peptidy jsou značeny, vždy jedním typem značky na vzorek

Skupiny smíchány a peptidy separovány HMOTNOSTNÍ ANALÝZA 115-114- 115-116- 114-116- 114-115- 114-117- 116-115- 116-114- 116-114- IEF-HPLC nebo 2D HPLC a b c MS spektrum 117-116- MS/MS spektrum 4700 MS/MS Precursor 1200.66 Spec #1 MC=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>TR[BP = 117.1, 838] 100 116 117.1 117 837.5 116.1 90 % Intensity 80 70 60 50 40 114 115.1 30 114.1 20 10 0 112.0 113.4 114.8 116.2 117.6 119.0 Mass (m/z) Kvantifikace Reportérových iontů Dvojnásobná exprese ve vzorcích 3 a 4 Odečtení sekvence peptidu a identifikace proteinu EPMQTGIK ATP syntáza, H+ transportující, mitochondriálníl F1 komplex, podjednotka alfa

itraq isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation 8plex Reagents Reporter Group mass 113 121 (Retains Charge) Skip 120 N Isobaric Tag Total mass = 305 N N O O O ~~~~~ N N N O O O Balance Group Mass 192-184 Skip 185 O O Amine specific peptide reactive group (NHS) N N N N 13 CH 2 N+ N+ 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 13 CH 2 113 114 115 116 13 CH 3 13 CH 3 13 CH 3 N 15 N 15 N 15 N 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 117 118 119 121

Dimetylace peptidů (N-konec a e-aminoskupina Lys) Reakce formaldehydu s primárními aminy (v přítomnosti kyanoborohydridu) + 28 Da light D D + 32 Da intermediate C + 36 Da heavy Kvantifikace MS, identifikace MS/MS Hsu JL, et al. Anal Chem. 2003;75(24):6843-52.

18 O enzymatické značení Digesce jednoho vzorku v normální vodě a druhého vzorku ve značené vodě 18 O Dochází k inkorporaci 16/18 O vzorky se smíchají a analyzují. Podle intenzit píků peptidu s 16 OH a 18 OH určujeme relativní kvantitu peptidu. H 2 N R 1 C H 18 OH C O N H R 2 C C H O N H H R 3 C COOH H H 2 N R 1 C H C O + R 3 COOH N H R 2 C C H O 18 OH H 2 N C trypsin H 999.5 1001.5 H 2 18 O

AQUA Absolute Quantification of Abundance Princip: kvantifikace signálu peptidu se signálem identického (ale značeného) peptidu známého množství Použitelné pro kvantifikaci jednoho nebo několika vybraných peptidů.. Kritický je výběr vhodného peptidu. Kvantifikace MS Identifikace MS/MS

QconCAT - absolutní kvatnifikace (AQUA) pomocí značených peptidů produkovaných v arteficiálním proteinu složeném z tryptických peptidů z různých bílkovin (konkatemeru ) v E.coli

ENZYMATICKÉ CHEMICKÉ METABOLICKÉ Kvatifikace pomocí MS SILAC jen živé buňky, metabolické značení, kvantifikace MS itraq (TMT) dimetylace značí aminoskupiny, značení na úrovni peptidů, multiplex, kvantifikace až při MS/MS značí aminoskupiny, značení na úrovni peptidů, kvantifikace MS 18 O digesce v místě štěpení trypsinem, kvantifikace MS, identifikace při MS/MS AQUA QCONCAT jen pro předem vybrané peptidy, je možná absolutní kvantifikace,

SHOT-GUN přístupy v kombinaci se značením SILAC 18 O 1D SDS-PAGE itraq, dimetylace DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů 10 5-10 7 různých In gel digesce 10-50 řízků a extrakce 2D LC SCX-RP IEF- RP LC Komplexní směs peptidů 10 2-10 6 různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP LC

Rat model of chronic heart failure Chronic volume overload iduced by aorto-caval fistula Garcia R, Diebold S:Cardiovasc Res. 1990; 24(5):430-2.

Hart Failure in 24th week after fistula ACF CTRL AVF = arterio-venous fistula 6 Heart weigth/ BW, g/kg Symptoms: 4 2 0 2.4x p<0.0001 AVF CTRL n=6/group Water retention Increased LV ED pressure Breathlessness Lethargy

IEF-LC-MALDI/MS/MS analysis using itraq chemistry HF 114 115 CTRL Digestion 116 117 IEF of peptides 32 fractions MALDI-MS/MS collection RP-nLC

160 nlc runs ~ 40 000 MALDI spots ~110 000 MS/MS 2030 identified proteins + itraq based quantitation ~ 66 diferentially expressed proteins

gi 25742739 acyl-coa synthetase long-chain family member 1 [Rattus norvegicus] GFQGSFEELCR LLLYYYDDVR LLLEGVENK

gi 21326447 EH-domain containing 4 [Rattus norvegicus] ADQVDTQQLMR AMQEQLENYDFTK EYQISAGDFPEVK

Mechanism of fludarabine resistance in Mantle cell lymphoma Mantle cell lymphoma, MCL a rare B-cell lymphoma t(11;14)(q13;q32) overexpression of cyclin D1 therapy includes antinucleosides frequent drug resistance poor prognosis

Resistance of MCL to antinucleoside fludarabine Deoxyadenosine Fludarabine (phoshate) Incorporation to DNA Inhibition of replication

The mechanism of fludarabine resistance in MCL Cross resistance to all tested antinucleosides Sensitivity to other drug types preserved

Proteomic analysis of Mino a Mino/FR cells SILAC Stable Isotope Labeling with Amino acids in Culture FORWARD REVERSE Mino Mino/FR Mino/FR Mino HEAVY 13 C 6, 15 N 2 Lys 13 C 6, 15 N 4 Arg Digestion with trypsin Digestion with trypsin

Proteomic analysis of Mino a Mino/FR cells 312 diferentially expressed proteins forward a reverse SILAC correlation Bioinformatic anlysis (KEGG via DAVID) DNA replication and repair Missmatch repair NER Purine a pyrimidine metabolism Deoxycytidine kinase

DEOXYCYTIDINE KINASE the rate limiting enzyme of nucleoside utilization and salvage Fludarabine ENT 1,2 DEOXYCYTIDINE KINASE Fludarabine Fludarabine-P Fludarabine-P-P Fludarabine-P-P-P

Proteins upregulated in Mino/FR

Proteins downregulated in Mino/FR Bruton tyrosine kinase Disrupted B cell signaling?

Decreased bruton tyrosine kinase (BTK) expression and resistance to ibrutinib

Proteiny upregulované v Mino/FR

Upregulation of Bcl-2 and the toxic efect of Bcl-2 inhibitor ABT-199 ABT-199

Lorkova L, et al. PLoS One; 2015,10(8):e0135314. Klanova M, et al. Mol Cancer. 2014 Jun 27;13:159.

Resistance to fludarbine in MCL is associated with cross resistence to all other anti-nucleosides due to the marked downregulation of DCK. MCL patients with the antinucleoside resistance should be treated with drugs with different mechanism of action (cisplatin, ibrutinib, bortezomib, bendamustine ). However ibrutinib and rituximab may be less effective in these cells. ABT199 seems highly promissing. Lorkova L, et al. PLoS One; 2015,10(8):e0135314. Klanova M, et al. Mol Cancer. 2014 Jun 27;13:159.

Největší část proteomu (včetně kvantifikace) Molecular & Cellular Proteomics 7:672 683, 2008.

Mouse Embryonic Stem Cells (SILAC) Graumann et al. Molecular & Cellular Proteomics 7:672 683, 2008. Digest v roztoku IEF peptidů 24 x Extrakce a čištění (tips) 24x RP-LC-MS/MS Frakcionace (cytosol,jádra a membrány) SDS page in gel digest 3 x 15 gel slices 45x RP-LC-MS/MS 260 000 MS/MS 27 000 peptidů 3972 proteinů Celkem 5100 proteinů včetně kvantifikace 516 000 MS/MS 35 900 peptidů 4036 proteinů

Boisvert FM, et al. A quantitative spatial proteomics analysis of proteome turnover in human cells. Mol Cell Proteomics. 2012 Mar;11(3):M111.011429. HeLa Cells/SILAC SDS-PAGE (16 frakcí) RP-LC 80 000 peptidů 8041 bílkovin

>10 000 proteinů v jednom experimentu Beck M, et al. (Aebersold R.) The quantitative proteome of a human cell line. Mol Syst Biol. 2011 Nov 8,7:549 (peptide IEF-LC) Nagaraj N, et al., (Mann M.) Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol. 2011 Nov 8;7:548. (SAX-LC) Geiger T, et al. (Mann M.) Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals ubiquitous but varying expression of most proteins. Mol Cell Proteomics. 2012 Mar;11(3):M111.014050. (SAX-LC)

Kvatifikace pomocí MS MS není kvantitiativní, z výšky individuálního signálu ve spektru nelze přímo odvozovat abundanci daného peptidu ve vzorku. Nelze získat (semi) kvantitativní informaci pouhým porovnáním dvou různých spekter. Nebo ano?

Label Free MS metody relativní kvantifikace bílkovin Při dodržení identických podmínek separace Existuje vztah mezi intenzitou MS signálu peptidu a jeho abundancí porovnávání (iontových) intenzit peptidů

http://www.zmbh.uni-heidelberg.de

Label Free MS metody relativní kvantifikace bílkovin Při dodržení identických podmínek separace Existuje vztah mezi intenzitou MS signálu peptidu a jeho abundancí porovnávání iontových intenzit peptidů Při dodržení identických podmínek separace Existuje vztah mezi abundancí daného proteinu a počtem jeho naměřených MS/MS spekter Spectral (a)counting

Porovnávání iontových intenzit peptidů (AUC) Spectral counting

Label Free Quantitation Only works for almost identical samples Requires absolutely reproducible LC separation Needs more MS equipment time (more replicates) More sensitive but less accurate compared to SI labeling

shot-gun metody (pros and cons) až 10000 proteinů v jednom experimentu izotopická nebo label-free kvantifikace náročnost na instrumentaci a (bio)informatiku problém s inferencí proteinu (stejné peptidy v různých proteinech) analýza PTM je možná ztráta informace o proteoformách

Když víme co chceme detekovat či kvantifikovat, ale nemáme protilátku. SRM/MRM (Selected Reaction Monitroing, Multiple Reaction Monitroing) Western bez protilátky

Když víme co chceme detekovat či kvatifikovat, ale nemáme protilátku.. SRM/MRM Single/Multiple reaction monitoring Triple quadrupole MS (2 molekulární filtry a jedna kolizní cela) Známý protein k detekci Reprezentativní peptide známé hodnoty m/z Fragment téhož peptidu o známé hodnotě m/z Retenční čas 1. Q1 - Filtr je nastaven na známou m/z rodičovského peptidu 2. Q2 Vybraný peptid je fragmentován 3. Q3 - Filtr je nastaven na známou m/z vybraného fragmentu

SRM/MRM Single/Multiple reaction monitoring Výběr vhodného peptidu: Proteotypický peptid peptid unikátní pro daný protein dobře ionizovatelný, pozrovatený MS vhodná velikost, známá retenční doba na LC nesmí být náchylný k PTM Fragment hojný, dobře ionizovatelný, pozrovatený MS Absolutní kvatifikace je možná při použití známé koncentrace izotopicky značeného peptidu identické sekvence (AQUA)