HOLOTYPE HLA 96/7 KONFIGURACE A & CE A KONFIGURACE B & CE (REF: H32 A REF: H34) NÁVOD K POUŽITÍ VERZE 10 2.5.2018 Omixon Biocomputing Limited 0086 Příprava DNA pro sekvenční analýzu na Illumina MiSeq
Obsah INFORMACE O VÝROBCI... 7 KLÍČ K SYMBOLŮM... 7 OBSAH SOUPRAVY HOLOTYPE HLA-96/7 KONFIGURACE A & CE (REF:H32) NEBO KONFIGURACE B & CE (REF:H34)... 8 KRABIČKA S PRIMEROVÝMI KOMPONENTAMI... 8 KRABIČKA S REAGENCIEMI PRO PŘÍPRAVU KNIHOVNY... 8 96-WELL ADAPTOR PLATE (96JAMKOVÁ INDEXOVANÁ ADAPTÉROVÁ DESTIČKA)... 8 SEŠIT APLIKACE EXCEL... 9 SOFTWARE OMIXON HLA TWIN... 9 DOPRAVA A SKLADOVÁNÍ... 9 VAROVÁNÍ A OPATŘENÍ... 9 ZNÁMÁ OMEZENÍ PRODUKTU... 10 BEZPEČNOSTNÍ INFORMACE... 10 VÝKONNOSTNÍ PARAMETRY... 10 TECHNICKÁ PODPORA... 11 Podpora na telefonu:... 11 ZAŘÍZENÍ, REAGENCIE A SPOTŘEBNÍ MATERIÁL... 12 TECHNICKÁ DOPORUČENÍ A DOPORUČENÍ TÝKAJÍCÍ SE ZAŘÍZENÍ... 12 PŘIDRUŽENÁ DOPORUČENÍ TÝKAJÍCÍ SE REAGENCIÍ... 12 Kapacita soupravy reagencií MiSeq... 13 DOPORUČENÝ SPOTŘEBNÍ MATERIÁL... 13 PRÁVNÍ UPOZORNĚNÍ... 14 PŘEDPOKLÁDANÉ POUŽITÍ... 14 DŮLEŽITÉ UPOZORNĚNÍ PŘED SPUŠTĚNÍM... 15 DOPORUČENÁ IZOLACE GENOMOVÉ DNA... 15 PRINCIP METODY... 15 PŘEHLED KROKŮ... 17 SLOVNÍČEK/DEFINICE... 18 KROK 1 PŘÍPRAVA MASTER MIXU HLA ZESÍLENÍ... 19 SEZNAM REAGENCIÍ... 19 PROTOKOL... 19 Master mix: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 a DQA1... 19 Master mix: HLA-DQB1 sada 3... 20 KROK 2 ZESÍLENÍ HLA TŘÍDY I A II... 21 SEZNAM REAGENCIÍ... 21 PROTOKOL... 21 Master mix s Taq polymerázou: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 a DQA1... 21 Master mix s Taq polymerázou: HLA-DQB1 sada 3... 22 Zesílení třídy I (HLA-A, B a C)... 22 Strana 2 47
Zesílení třídy II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 a DQB1)... 22 Očekávané velikosti amplikonu... 23 KROK 3 KVANTIFIKACE A NORMALIZACE AMPLIKONU (POMOCÍ DESTIČKOVÉHO FLUOROMETRU)... 24 SEZNAM REAGENCIÍ... 24 PROTOKOL... 24 Směšování amplikonů... 26 Purifikace PCR ExoSAP-iT Express... 26 KROK 4 PŘÍPRAVA KNIHOVNY... 27 SEZNAM REAGENCIÍ... 27 PROTOKOL... 27 Fragmentační master mix... 27 Fragmentační program... 28 Master mix opravy konců... 28 Program opravy konců... 29 Ligační master mix... 30 Ligační program... 30 Směšování a čištění knihovny... 30 KROK 5 VÝBĚR VELIKOSTI KNIHOVNY... 32 SEZNAM REAGENCIÍ... 32 PROTOKOL... 32 KROK 6 KVANTIFIKACE KNIHOVNY POMOCÍ PŘÍSTROJE QPCR... 33 SEZNAM REAGENCIÍ... 33 PROTOKOL... 33 Směs primerů qpcr... 33 Master mix qpcr... 34 KROK 7 SEKVENOVÁNÍ NA ILLUMINA MISEQ... 35 SEZNAM REAGENCIÍ... 35 Kapacita soupravy reagencií MiSeq... 35 PROTOKOL... 35 KROK 8 ANALÝZA SEKVENČNÍCH DAT HLA... 37 AUTOMATIZOVANÝ PROTOKOL... 37 Nastavení a konfigurace IT... 37 Protokol jednotlivých analýz... 37 MANUÁLNÍ SERVEROVÝ PROTOKOL... 37 Nastavení a konfigurace IT... 37 Protokol jednotlivých analýz... 37 MANUÁLNÍ PROTOKOL DESKTOP... 37 Nastavení a konfigurace IT... 37 Protokol jednotlivých analýz... 38 DOPLŇKOVÉ OBRÁZKY... 39 PŘÍKLADY AMPLIKONOVÝCH DESTIČEK, ZESILOVACÍ DESTIČKA, AMPLIKONOVÝCH KVANTIFIKAČNÍCH DESTIČEK (PRO JEDNOTLIVÉ LOKUSY) A REAKČNÍCH DESTIČEK... 39 PŘÍKLAD KVANTIFIKAČNÍ DESTIČKY STANDARDŮ... 39 PŘÍKLAD KVANTIFIKAČNÍ DESTIČKY QPCR KNIHOVNY KAPA... 40 PŘÍLOHA 1: PIPPIN PREP... 41 Strana 3 47
PROGRAMOVÁNÍ PIPPIN PREP... 41 SPUŠTĚNÍ PIPPIN PREP... 41 PŘÍLOHA 2: KVANTIFIKACE AMPLIKONU POMOCÍ PŘÍSTROJE QPCR... 44 SEZNAM REAGENCIÍ... 44 PROTOKOL... 44 PŘÍLOHA 3: KVANTIFIKACE KNIHOVNY POMOCÍ INTERKALAČNÍHO FLUORESCENČNÍHO BARVIVA DSDNA 46 SEZNAM REAGENCIÍ... 46 PROTOKOL... 46 Strana 4 47
Historie dokumentu důležité poznámky a aktualizace Verze Datum Autor Přehled změn Schválil Datum vydání V1 5.12.2015 Robert Pollock V2 18.1.2016 Robert Pollock V3 10.2.2016 Robert Pollock V4 26.2.2016 Robert Pollock V5 5.4.2016 Robert Pollock V6 9.4.2016 Efi Melista V7 23.4.2016 Efi Melista V8 30.5.2016 Gergely Tölgyesi V9 21.8.2017 Gergely Tölgyesi V10 14.12.2017 Tünde Vágó Návrh první verze Druhý návrh, drobné opravy Třetí návrh, aktualizované vysvětlení symbolu, aktualizované doporučení pro cyklus mrazení/rozmrazování, aktualizované předpokládané použití Čtvrtý návrh, aktualizace části bezpečnostních informací Pátá verze, alternativní doporučení pro kvantifikaci amplikonů Malá změna ve formulaci z enzymu LR- PCR na Taq polymerázu na základě změny dokumentace společnosti Qiagen Aktualizace prohlášení DQB1 set 1 a set 2 Aktualizované metriky výkonu, aktualizované objemy činidel pro přípravu knihovny, aktualizované konfigurace produktů pro adaptérové destičky indexované A2/A3/A4. 96/7 Konfigurace B byla přidána konfigurace indexované adaptérové destičky Odstranění DQB z DQB Enhancerů, ověření gelu po LR-PCR nastaveno jako volitelné, zjednodušení kvantifikace amplikonu, změna objemu jednotlivých vzorků pro směsný objem v soupravách s 11 lokusy, výměna ExoSAP-IT za ExoSAP-IT Express, použití Qubit pro knihovnu kvantifikace, výměna směsi primerů DQB1 sada 1 a sada 2 za DQB1 sada 3, zkrácení reakčního času opravy konců, zkrácení ligačního reakčního času, aktualizace metody knihovny kvantifikace, List vzorků odebrán z Příloh Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi 5.12.2015 18.1.2016 10.2.2016 Gergely 26.2.2016 Tölgyesi Efi Melista 5.4.2016 Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi 9.4.2016 23.4.2016 Efi Melista 30.5.2016 Efi Melista 21.8.2017 Efi Melista 2.5.2018 Strana 5 47
Odmítnutí odpovědnosti Společnost Omixon vyvinula veškeré úsilí, aby zajistila přesnost tohoto Návodu k použití (IFU). Společnost Omixon odmítá odpovědnost za případné nepřesnosti nebo opomenutí, ke kterým mohlo dojít. Informace v tomto IFU mohou být změněny bez předchozího upozornění. Společnost Omixon nenese žádnou odpovědnost za případné nepřesnosti v tomto IFU. Společnost Omixon si vyhrazuje právo vylepšit tento IFU a/nebo produkty popsané v tomto IFU kdykoli a bez upozornění. Pokud v této příručce naleznete informace, které jsou nesprávné, zavádějící nebo neúplné, ocenili bychom vaše připomínky a návrhy. Zašlete je prosím na adresu support@omixon.com. Strana 6 47
Informace o výrobci Název společnosti: Omixon Biocomputing Ltd Adresa pro návštěvy: Fehérvári út 50-52/6 Město: Budapešť Poštovní směrovací číslo: H-1117 Země: Maďarsko Klíč k symbolům Číslo šarže Referenční/katalogové číslo Přečtěte si Návod k použití Obsahuje reagencii pro N testů Legální výrobce. Datum spolu s tímto symbolem odkazuje na datum výroby Doporučená skladovací teplota Datum exspirace In vitro diagnostické zdravotnické zařízení Náhradní komponenta Obsahuje náhradní komponentu Strana 7 47
Obsah soupravy Holotype HLA-96/7 Konfigurace A & CE (REF:H32) nebo Konfigurace B & CE (REF:H34) Krabička s primerovými komponentami Primerová komponenta poskytuje specifické roztoky primerů připravené k okamžitému použití pro cílené LR-PCR zesílení genů HLA A, B, C, DPB1, DQA1, DQB1 a DRB1. Dále obsahuje také dva typy aditiv PCR (Enhancer 1 a Enhancer 2). Směs primerů REF č. Rxns Objem/zkumavka Počet zkumavek Barevný kód HLA-A P012 96 220 μl 1 Žlutá HLA-B P022 96 220 μl 1 Červená HLA-C P032 96 220 μl 1 Oranžová HLA-DRB1 P042 96 220 μl 1 Zelená HLA-DQB1 (sada 3) P122 96 220 μl 1 Modrá HLA-DQA1 P072 96 220 μl 1 Hnědá HLA-DPB1 P082 96 220 μl 1 Fialová Enhancer 1 E01 96 1100 μl 1 Průhledná Enhancer 2 E02 96 300 μl 1 Průhledná Krabička s reagenciemi pro přípravu knihovny Krabička s reagenciemi pro přípravu knihovny poskytuje reagencie pro přípravu knihovny (fragmentace, tupě zakončuje a adenyluje konce amplikonů a liguje k nim indexované adaptérové sekvence) z amplikonů HLA. Reagencie REF č. Rxns Objem/zkumavka Počet zkumavek Barevný kód Fragmentační enzym (A) R11 96 278 μl 1 Žlutá Fragmentační pufr (B) R21 96 278 μl 1 Červená Enzym opravy konců (C) R31 96 162 μl 1 Zelená Pufr opravy konců (D) R41 96 324 μl 1 Oranžová Ligační enzym (E) R51 96 324 μl 1 Modrá Ligační pufr (F) R61 96 1800 μl 2 Černá 96-well Adaptor Plate (96jamková indexovaná adaptérová destička) Komponenta 96jamkové indexované adaptérové destičky obsahuje indexované NGS adaptéry (dvouvláknové DNA oligonukleotidy) v 5 μl roztoku připravené k okamžitému použití pro generování jednotlivých NGS knihoven. 96jamková indexovaná adaptérová destička obsahuje dostatečné množství indexovaných adaptérů pro generaci 96 samostatných NGS knihoven a pro downstreamovou identifikaci vzorků. Strana 8 47
Verze soupravy Reagencie REF č. Rxns Objem/jamka Počet destiček H32 Adaptérová destička A (i1-96) N1 96 5 μl 1 H34 Adaptérová destička B (i97-192) N2 96 5 μl 1 Sešit aplikace Excel Sešit aplikace Excel je k dispozici, aby podporoval protokol Holotype HLA 96/7 pomocí výpočtů, rozložením destiček, vedením záznamů, generováním listu vzorků MiSeq a mnoho dalšího. Pokud jeho kopii nemáte, kontaktujte prosím support@omixon.com. Software Omixon HLA Twin Kvůli kreditům Omixon HLA Twin spojeným s vaším nákupem soupravy Holotype HLA 96/7 kontaktujte sales@omixon.com. Důležitá poznámka: Používejte všechny tři komponenty soupravy Omixon Holotype HLA 96/7 a software Omixon HLA Twin ve stejném pracovním postupu, abyste vytvořili pracovní postup pro diagnostiku in vitro. Přečtěte si část Upozornění a bezpečnostní opatření týkající se omezení použití produktu. Náhradní komponenty jsou k dispozici na základě zvláštního požadavku uživatele. Vezměte prosím na vědomí, že společnost Omixon zajišťuje pouze výměnu krabiček s komponentami, nikoli jednotlivých lahviček. Pro více informací kontaktujte sales@omixon.com. Doprava a skladování Dodávají se v baleních se suchým ledem v přepravním boxu z polystyrénu Styrofoam a po příjezdu je třeba je skladovat při teplotě -20 C. Ověřte prosím regulaci teploty a proces monitorování vašich mrazniček a pravidelně je udržujte. Neotevřené soupravy jsou stabilní až do data exspirace soupravy (napsané na štítku sady), pokud jsou skladovány při teplotě -20 C. Po otevření produktu se doporučuje provést maximálně čtyři (4) cykly zmrazení/rozmrazení, aby se zajistila stabilita produktu. Otevřené soupravy jsou při skladování při -20 C stabilní až 3 měsíce. Varování a opatření Omezení použití produktu Pro dosažení nejlepšího výkonu prosím použijte pracovní postup soupravy Holotype HLA 96/7 a software Omixon HLA Twin pro HLA typizaci NGS s materiály, reagenciemi a vybavením doporučeným v sekci Vybavení a reagencie. Použití jiných materiálů, než které jsou uvedeny v části Vybavení a reagencie, musí uživatel ověřit a potvrdit. Strana 9 47
Reagencie nerekonstruujte ani neřeďte v jiných objemech, než jak je popsáno v tomto IFU. Nepoužívejte menší objem reagencií, než jak je uvedeno v tomto IFU. Takové aktivity mohou vést k chybám ve výkonu. Společnost Omixon nemůže poskytnout podporu v případě jakýchkoli problémů vyplývajících z nedodržení kroků protokolu popsaných v tomto IFU. Nepoužívejte tento produkt v případě, že dojde ke zjevnému poškození jeho komponent (rozbité lahvičky, destičky, volné uzávěry apod.). Známá omezení produktu Informace o známých nejednoznačnostech a známém omezení softwaru produktu Holotype HLA naleznete v dokumentu Product Known Limitations Guide (Průvodce známými omezeními produktu). Průvodce je distribuován s IFU, ale lze jej také nalézt na webové stránce společnosti Omixon pod MyHolotype/Support and Services/HLA Twin Instructions for Use, nebo si jej můžete vyžádat na adrese support@omixon.com. Bezpečnostní informace Před spuštěním si přečtěte sekce Bezpečnostní informace a Důležité poznámky všech reagencí nebo souprav uvedených v části Zařízení, reagencie a spotřební materiál. Při práci s chemikáliemi vždy noste vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (SDS) dostupných u konkrétního dodavatele produktu. Přehled chemických komponent reagencií produktu naleznete v bezpečnostních listech soupravy Holotype HLA 96/7 a jsou k dispozici na vyžádání. Komponenty produktu likvidujte jako obecný zdravotnický odpad. Výkonnostní parametry Stanovené hlavní výkonnostní parametry podle ověření produktu. HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 Citlivost 99,054 % 99,171 % 98,335 % 96,310 % 98,818 % 98,927 % 95,724 % Specificita 99,966 % 99,982 % 99,956 % 99,863 % 99,946 % 99,881 % 99,775 % Přesnost 99,054 % 99,171 % 98,335 % 96,310 % 98,818 % 98,927 % 95,724 % Správnost 99,935 % 99,965 % 99,915 % 99,736 % 99,897 % 99,785 % 99,572 % Reprodukovatelnost 100,00 % 100,00 % 99,28 % 100,00 % 99,28 % 100,00 % 99,28 % Opakovatelnost 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % Strana 10 47
Technická podpora Pokud potřebujete všeobecnou pomoc s tímto protokolem, kontaktujte support@omixon.com Podpora na telefonu: Spojené státy +1 (617) 500-0790 Evropa +36 70 574 8001 Zbytek světa +1 (617) 500-0790 Strana 11 47
Zařízení, reagencie a spotřební materiál Technická doporučení a doporučení týkající se zařízení Termocykler s 96jamkovým formátem Destičkový fluorometr (nebo jakýkoliv přístroj schopný detekovat fluorescenci ve 96jamkovém formátu destičky, pro použití se systémem Promega QuantiFluor dsdna) Pippin Prep (kat. č. PIP0001) nebo Blue Pippin (kat. č. BLU0001) od společnosti SAGE Science přístroj qpcr s 96 nebo 384jamkovým formátem destičky Qubit fluorometr (kat. č. Q33216, Thermo Fisher Scientific) (volitelný) Illumina MiSeq (kat. č. SY-410-1003) 64bitový počítač s minimálně 4 jádry a 16 GB paměti RAM Dlouhodobé úložiště dat (přibližně 2 TB dat na MiSeq za rok) Přidružená doporučení týkající se reagencií Soupravy pro LongRange PCR společnosti Qiagen (kat. č. 206401, 206402 nebo 206403) Každý vzorek vyžaduje 3,2 μl Taq polymerázy Kat. č. 206401 souprava LongRange PCR (20) obsahuje 8 μl Taq polymerázy Kat. č. 206402 souprava LongRange PCR (100) obsahuje 40 μl Taq polymerázy Kat. č. 206403 souprava LongRange PCR (250) obsahuje 100 μl Taq polymerázy ExoSAP-IT od společnosti Affymetrix (kat. č.75001-200, 75001-1ML, 75001-4X-1ML nebo 75001-10ML) Každý směsný vzorek vyžaduje 4 μl enzymu ExoSAP-IT Kat. č. 75001-200 obsahuje 200 μl enzymu ExoSAP-IT Express Kat. č. 75001-1-ML obsahuje 1 ml enzymu ExoSAP-IT Express Kat. č. 75001-4X-1ML obsahuje 4 ml enzymu ExoSAP-IT Express Kat. č. 75001-10ML obsahuje 10 ml enzymu ExoSAP-IT Express Library Quantification Kit (souprava kvantifikace knihovny) Illumina/Universal od společnosti KAPA Biosystems (kat. č. KK4824) Souprava Qubit dsdna BR Assay Kit (kat. č. Q32850 nebo Q32853) (volitelná) Kat. č. Q32850 obsahuje 100 testů Kat. č. Q32853 obsahuje 500 testů Systém QuantiFluor dsdna od společnosti Promega (kat. č. E2670) Kuličky Agencourt AMPure XP beads od společnosti Beckman Coulter (kat. č. A63880, A63881, nebo A63882) Každý pracovní cyklus Holotype HLA vyžaduje maximálně 900 μl kuliček AMPure XP beads. Kat. č. A63880 obsahuje 5 ml kuliček AMPure XP beads Kat. č. A63881 obsahuje 60 ml kuliček AMPure XP beads Kat. č. A63882 obsahuje 450 ml kuliček AMPure XP beads Gelová kazeta, 1,5% agaróza, bez barviv s vnitřním standardem (Marker K/R2), pro Pippin Prep/Blue Pippin (kat. č. CDF1510 pro Pippin Prep a BDF1510 pro Blue Pippin) Strana 12 47
Ultračistý ethanol (bezvodý alkohol) Ultračistá voda (bez DNázy a RNázy) Hydroxid sodný 1 TE pufr (ph 8,0) Souprava reagencií MiSeq od společnosti Illumina Kapacita soupravy reagencií MiSeq Souprava reagencií Illumina MiSeq Cyklus Std 500 (MS-102-2003) Cyklus Std 300 (MS-102-2002) Cyklus Micro 300 (MS-103-1002) Cyklus Nano 500 (MS-103-1003) Cyklus Nano 300 (MS-103-1001) Čas Hodiny Vzorky 96/7 ~39 96 ~24 96 ~19 28 ~28 12 ~17 6 Doporučený spotřební materiál Mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml Mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml Mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 2,0 ml (doporučují se Eppendorf DNA LoBind kat. č. 022431048) Tenkostěnné trubičky o objemu 0,5 ml pro nástroj Qubit (doporučují se Qubit Assay tubes kat. č. Q32856) Pipety s nastavitelným objemem (kapacita 1,0 1000 μl) 8kanálové pipety s nastavitelným objemem (kapacita 1,0 100 μl) 96jamkové destičky kompatibilní s termocyklerem 96jamkové optické destičky kompatibilní s destičkovým fluorometrem 96jamkové destičky kompatibilní s qpcr nástrojem Těsnění na destičky pro všeobecné použití Těsnění na destičky kompatibilní s termocyklerem (testované pro LR-PCR) Těsnění na optické destičky kompatibilní s qpcr nástrojem (volitelné) Magnetický stojan kompatibilní s mikrocentrifugačními zkumavkami o objemu 2 ml 96jamkové chladicí stojany (2 kusy) Kónické zkumavky o objemu 50 ml Zásobníky o objemu 50 ml Strana 13 47
Právní upozornění Návod k použití pro Holotype HLA 96/7 a veškerý obsah je majetkem společnosti Omixon Biocomputing Limited ( Omixon ) a jsou určeny výhradně pro smluvní užívání zákazníkem s ohledem na zde popsaný(é) produkt(y) a nikoli na jiné účely. Tento dokument a jeho obsah se nesmí používat nebo distribuovat pro žádný jiný účel a/nebo nesmí být jinak sdělován, zveřejněn nebo reprodukován jakýmkoli způsobem bez předchozího písemného souhlasu společnosti Omixon. Společnost Omixon tímto dokumentem neposkytuje žádnou licenci na základě patentu, ochranné známky, autorských práv nebo společných práv ani obdobných práv jakýchkoli třetích osob. Licence na Omixon HLA Twin ( Software ) je zákazníkovi poskytnuta za obchodních podmínek Omixon HLA Twin EULA (www.omixon.com/hla-twin-eula/). Pokud se zde uvedenými obchodními podmínkami nesouhlasíte, společnost Omixon vám na Software neposkytne licenci a vy byste tento Software neměli používat ani instalovat. Pokyny uvedené v tomto dokumentu musí přísně a jednoznačně dodržovat kvalifikovaní a řádně vyškolení pracovníci, aby se zajistilo správné a bezpečné používání zde popsaného produktu (popsaných produktů). Před použitím tohoto produktu (těchto produktů) si musíte přečíst a pochopit veškerý obsah tohoto dokumentu. NEPŘEČTENÍ CELÉHO DOKUMENTU A NEDODRŽOVÁNÍ VŠECH ZDE UVEDENÝCH POKYNŮ MŮŽE VÉST K POŠKOZENÍ PRODUKTU(Ů), ZRANĚNÍ OSOB, VČETNĚ UŽIVATELŮ NEBO JINÝCH OSOB, A POŠKOZENÍ MAJETKU JINÝCH OSOB. SPOLEČNOST OMIXON NEPŘEBÍRÁ ŽÁDNOU ODPOVĚDNOST VYPLÝVAJÍCÍ Z NESPRÁVNÉHO POUŽITÍ ZDE POPSANÉHO PRODUKTU (POPSANÝCH PRODUKTŮ) (VČETNĚ JEHO ČÁSTÍ NEBO SOFTWARU) NEBO JAKÉHOKOLI POUŽITÍ TAKOVÉHO PRODUKTU (PRODUKTŮ) MIMO ROZSAH VÝSLOVNÝCH PÍSEMNÝCH LICENCÍ NEBO POVOLENÍ UDĚLENÝCH SPOLEČNOSTÍ OMIXON V SOUVISLOSTI S NABYTÍM TAKOVÉHO PRODUKTU (PRODUKTŮ) ODBĚRATELEM. PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Všechna práva vyhrazena. Předpokládané použití Produkt Holotype HLA 96/7 Konfigurace A & CE a Konfigurace B & CE (dále jen Holotype HLA ) je kombinací in vitro diagnostických reagencií testu a softwaru pro analýzu dat (Omixon HLA Twin ) a je určen k identifikaci a definici lidských leukocytárních antigenů (HLA) třídy I a II a je určen pro použití při HLA typizaci s využitím platformy sekvenování nové generace Illumina MiSeq. Holotype HLA poskytuje pomocí lidské genomové DNA informace o histokompatibilitě lidských lokusů HLA třídy I (A, B a C) a třídy II (DPB1, DQA1, DQB1 a DRB1). Strana 14 47
Software Omixon HLA Twin obsažený v produktu Holotype HLA má interpretovat a spárovat se se sekvenčními daty generovanými systémem Illumina MiSeq, což vede k velmi přesné jednoprůchodové HLA typizaci na úrovni alely s velmi nízkou mírou nejednoznačnosti na úrovni pole 2. Produkt Holotype HLA je určen k in vitro diagnostickému použití odborným zdravotnickým personálem, jako jsou laboratorní technici a lékaři, kteří byli vyškoleni k HLA typizaci v diagnostických laboratořích akreditovaných EFI nebo ASHI nebo v laboratořích, které jsou schopny pracovat podle specifikací EFI nebo ASHI. Důležité upozornění před spuštěním Doporučená izolace genomové DNA Lidská genomová DNA by se měla připravit za použití dobře testovaných komerčně dostupných souprav pro přípravu DNA, aby byla zajištěna konzistence přípravku. Pro důkladný výkon testu se bez ohledu na přístup požaduje přesné stanovení koncentrace a čistoty. DNA nesmí obsahovat kontaminující látky, které mohou ovlivnit pozdější zesílení, přípravu knihovny a sekvenční kroky (např. alkohol, soli, detergenty, formaldehyd a heparin). Krev by se neměla odebírat do heparinizovaných zkumavek a vzorky krve od pacientů léčených heparinem a lipemické nebo hemolyzované vzorky by se neměly používat. Připravená genomová DNA se může použít ihned, pokud je připravena ve vodě prosté nukleáz nebo je skladována po delší dobu při teplotě -20 C nebo nižší. Pro přípravu gdna doporučujeme použít vodu, protože EDTA v pufru TE může inhibovat reakce LR-PCR. Aby se snížila míra degradace, měli byste se vyhnout opakovanému zmrazování a rozpouštění. K poskytnutí vstupní genomové DNA 100 150 ng na PCR zesílení se důrazně doporučuje koncentrace DNA 20 30 ng/µl. Pro stanovení koncentrace gdna důrazně doporučujeme použít metodu kvantitativní analýzy na základě fluorescence. Důrazně se doporučuje poměr absorbance 260 nm/280 nm a 260 nm/230 nm hodnot 1,7 2. Pro zesílení HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 a HLA-DQB1 se vyžaduje 0,8 1,2 µg gdna. Princip metody Komunita HLA už mnoho let pracuje na tvorbě metody, která přesně identifikuje rozsáhlý polymorfismus genů HLA a jejich genových produktů. Nástup PCR, kombinovaného s dalšími technologiemi (sekvenování Sanger, SSOP, SSP, Luminex), poskytl vzorec pro významné zlepšení detekce HLA polymorfismu, avšak s několika omezeními, které nadále potlačují naši schopnost komplexně charakterizovat HLA geny. Technologie vyvinuté v průběhu posledních několika let, kumulativně nazvané sekvenování nové generace (NGS), poskytly nové možnosti, které umožňují komplexní charakterizaci HLA genů haploidním způsobem. NGS má dva typické rysy: 1) klonové Strana 15 47
sekvenování fragmentů DNA a 2) mimořádně vysokou propustnost. NGS poskytuje schopnost fázovat polymorfismy, čímž eliminuje veškeré nejednoznačnosti a poskytuje HLA typizaci na úrovni tří až čtyř úrovní bez reflexního testování, čímž přináší potenciálně úplné řešení problému HLA typizace. Zde popsaný protokol využívá tuto technologii a kombinuje zesílení HLA genů pomocí LR-PCR se sekvenováním na platformě Illumina MiSeq. Konkrétněji jsou HLA geny A, B, C, DQA1 a DQB1 zesíleny pro celou jejich kódovací délku, včetně prvků 5' a 3' konce netranslatovaných oblastí, zatímco DRB1 se zesiluje z intronu 1 na intron 4 a DPB1 se zesiluje z intronu 1 na 3' netranslatované oblasti. Amplikony jsou pak zpracovány prostřednictvím řady kroků, které: 1. Fragmentují amplikony na velikost vhodnou pro sekvenování na platformě Illumina, 2. Tupě zakončují a adenylují konce fragmentovaných amplikonů 3. Ligují adaptérové sekvence, které se používají v procesu na MiSeq, aby došlo k zachycení, zesílení a sekvenaci DNA. Adaptéry také obsahují index, což je krátká sekvence, jedinečná pro každý adaptér, která identifikuje počátky knihovny (vzorek/lokus). Po smísení indexovaných knihoven, výběru velikosti a kvantifikaci je vzorek umístěn na MiSeq pro sekvenování. Celý proces trvá 3 5 dní v závislosti na výběru průtokové buňky na platformě Illumina. Přehled kroků protokolu je vyobrazeno na následujícím obrázku: Strana 16 47
Přehled kroků PŘÍPRAVA GDNA PŘÍPRAVA MASTER MIXU HLA TŘÍDY I A II ZESÍLENÍ PRACOVNÍ ČAS: 1 H 45, CELKOVÝ ČAS: 1H 45 PRACOVNÍ ČAS: 1 H 50, CELKOVÝ ČAS: 7 H 50 KVANTIFIKACE A NORMALIZACE AMPLIKONU PŘÍPRAVA KNIHOVNY PRACOVNÍ ČAS: 1 H 50, CELKOVÝ ČAS: 1 H 50 PRACOVNÍ ČAS: 1 H 20, CELKOVÝ ČAS: 3H VÝBĚR VELIKOSTI KNIHOVNY KVANTIFIKACE KNIHOVNY PRACOVNÍ ČAS: 0H 15, CELKOVÝ ČAS: 1H PRACOVNÍ ČAS: 0H 15, CELKOVÝ ČAS: 1H 15 SEKVENOVÁNÍ ZAPNUTO ILLUMINA MISEQ HLA ANALÝZA SEKVENOVÁNÍ DAT PRACOVNÍ ČAS: 0H 20, CELKOVÝ ČAS: 23 H PRACOVNÍ ČAS: 0H 0, CELKOVÝ ČAS: 6H Strana 17 47
Slovníček/definice Amplikonová destička alternativní název pro Zesilovací destičku Amplikonová kvantifikační destička 96jamková destička kompatibilní s destičkovým fluorometrem, kde se zředěné amplikony kvantifikují Zesilovací destička 96jamková PCR destička, která se používá na zesílení lokusů HLA Konečná knihovna knihovna, která obsahuje všechny Knihovny vzorků připravené k sekvenování v jediném cyklu MiSeq Reakční destička destička, kde se provádějí sekvenční reakce, které fragmentují, opravují konce a ligují indexované adaptéry s Knihovnami vzorků Destička s reagenciemi destička, která se používá k přesnému rozdělení různých reagencií použitých pro přípravu Knihoven Knihovna vzorků knihovna připravená zkombinováním (smícháním) všech HLA lokusů pro daný vzorek Smíchaná amplikonová destička destička obsahující knihovnu vzorků (všechny lokusy jsou kombinované) na každou jamku Kvantifikační destička standardů 96jamková destička kompatibilní s destičkovým fluorometrem, kde jsou umístěny standardy DNA, které umožňují kvantifikaci amplikonu Strana 18 47
Krok 1 Příprava master mixu HLA zesílení Doba trvání: ~1 hodina 45 minut Účelem tohoto kroku je připravit lokusově specifické master mixy pro individuální zesílení každého cíleného HLA lokusu. Lokusy zesílené tímto protokolem jsou HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA- DPB1, HLA-DQA1 a HLA-DQB1. Poznámka: Master mixy připravované v tomto kroku zahrnují všechny reagencie potřebné pro zesílení s výjimkou Taq polymerázy. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Směs primerů HLA-A -20 C Omixon Směs primerů HLA-B -20 C Omixon Směs primerů HLA-C -20 C Omixon Směs primerů HLA-DRB1-20 C Omixon Směs primerů HLA-DPB1-20 C Omixon Směs primerů HLA-DQA1-20 C Omixon Směs primerů HLA-DQB1 (sada 3) -20 C Omixon Enhancer 1-20 C Omixon Enhancer 2-20 C Omixon LongRange PCR pufr (10 ) -20 C Qiagen dntps (10 mm každý) -20 C Qiagen Ultračistá H 2 O -20 C Qiagen Protokol 1.1 Vyjměte všechny směsi primerů, Enhancer 1 a 2, dntp a LR-PCR pufry (10 ) ze skladovacího prostoru a nechte je roztát při pokojové teplotě. 1.2 Připravte Kombinovaný Enhancer: přidejte 132 μl Enhanceru 2 do zkumavky Enhanceru 1. Přejmenujte zkumavku Enhancer 1 na Kombinovaný Enhancer. 1.3 Připravte master mix pro každou směs primerů podle tabulek níže: Master mix: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 a DQA1 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Směs primerů 2 μl 204 μl LongRange PCR pufr (10 ) 2,5 μl 255 μl Směs dntp (10 mm každý) 1,25 μl 127,5 μl Ultračistá H 2 O 13,85 μl 1412,7 μl Celkový objem 19,6 μl 1999,2 μl Strana 19 47
Master mix: HLA-DQB1 sada 3 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Směs primerů 2 μl 204 μl LongRange PCR pufr (10 ) 2,5 μl 255 μl Směs dntp (10 mm každý) 1,25 μl 127,5 μl Kombinovaný Enhancer 5,6 μl 571,2 μl Ultračistá H 2 O 7,85 μl 800,7 μl Celkový objem 19,2 μl 1958,4 μl 1.1 Promíchejte každý master mix na vortexu a odstřeďte jej po dobu 1 sekundy. Uložte master mix na led. 1.2 Všechny gdna zřeďte na koncentraci 30 ng/μl (minimální objem je 45 μl). Poznámka: Holotype HLA obsahuje dostatečné množství reagencií na 96 reakcí plus další objem na ztrátu při pipetování a selhání zesílení. Strana 20 47
Krok 2 Zesílení HLA třídy I a II Doba trvání: ~7 hodin 50 minut Účelem kroku 2 je zesílení lokusů HLA. Zesílení HLA třídy I a II byla optimalizována pomocí dvou samostatných setů podmínek PCR. Jakmile jsou PCR reakce dokončeny, zesílení se ověří elektroforézou na agarózovém gelu (volitelně). Rychlý tip elektroforéza na agarózovém gelu (krok 2.5), přestože se doporučuje, není nutná, aby došlo k úspěšnému dokončení protokolu Holotype HLA. Když jsou amplikony kvantifikovány (Krok 3), považuje se jakákoliv koncentrace nad 50 ng/μl za úspěšné zesílení. Elektroforéza na agarózovém gelu je důležitým krokem kontroly kvality a neměla by se bez dostatečných zkušeností s kompletním protokolem Holotype HLA vynechávat. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Master mix HLA-A -20 C Krok 1 Master mix HLA-B -20 C Krok 1 Master mix HLA-C -20 C Krok 1 Master mix HLA-DRB1-20 C Krok 1 Master mix HLA-DPB1-20 C Krok 1 Master mix HLA-DQA1-20 C Krok 1 Master mix HLA-DQB1 (sada 3) -20 C Krok 1 Taq polymeráza -20 C Qiagen gdna 4 C Uživatel Ultračistá H 2 O 20 C Uživatel Protokol 2.1 Vyjměte Taq polymerázu ze skladovacího prostoru, odstřeďte ji a přidejte ji do každého master mixu podle níže uvedených tabulek, přičemž důkladně opláchněte špičky pipety pipetováním: Master mix s Taq polymerázou: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 a DQA1 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Master mix z Kroku 1 19,6 μl 1999,2 μl Taq polymeráza 0,4 μl 40,8 μl Celkem 20 μl 2040 μl Strana 21 47
Master mix s Taq polymerázou: HLA-DQB1 sada 3 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Master mix z Kroku 1 19,2 μl 1958,4 μl Taq polymeráza 0,8 μl 81,6 μl Celkem 20 μl 2040 μl 2.2 Krátce promíchejte a odstřeďte všechny master mixy s Taq polymerázou. Rozdělte 20 μl každého master mixu s Taq polymerázou do samostatných jamek 96jamkových PCR destiček. Poznámka: Zesílení třídy I a II bylo optimalizováno pomocí dvou rozdílných podmínek PCR, takže by master mixy třídy I a třídy II neměly být na stejné destičce. 2.3 Přidejte 5 μl každé zředěné gdna do příslušné jamky destiček připravených v předchozím kroku. Pipetováním promíchejte. Utěsněte je tepelným těsněním a vizuálně zkontrolujte všechny jamky. Odstřeďte všechny Zesilovací destičky v odstředivce. 2.4 Umístěte Zesilovací destičky do termocyklerů a spusťte programy pro zesílení třídy I a třídy II podle níže uvedených tabulek: Zesílení třídy I (HLA-A, B a C) Počet cyklů Teplota Čas 1 95 C 3 minuty 95 C 15 sekund 35 65 C 30 sekund 68 C 5 minut 1 68 C 10 minut 1 4 C Zesílení třídy II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 a DQB1) Počet cyklů Teplota Čas 1 95 C 3 minuty 93 C 15 sekund 35 60 C 30 sekund 68 C 9 minut 1 68 C 10 minut 1 4 C Poznámka: Úspěch zesílení lze ověřit tím, že se 2 μl z každého amplikonu otestují ve standardním 2% agarózovém gelu při 250 V po dobu 30 minut. (Volitelné) Strana 22 47
Očekávané velikosti amplikonu Lokus HLA Očekávaná velikost amplikonu (kb) HLA-A, B a C ~3 HLA-DRB1 ~4,3 HLA-DPB1 ~6,7 HLA-DQA1 ~6 HLA-DQB (sada 3) ~6,6 Bezpečné místo pro zastavení. Amplikony lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. Strana 23 47
Krok 3 Kvantifikace a normalizace amplikonu (pomocí destičkového fluorometru) Doba trvání: ~1 hodina 50 minut Za účelem zajištění přesného vstupu do kroku přípravy knihovny se doporučuje provést kvantifikaci a normalizaci amplikonu (volitelné). Koncentrace amplikonu se měří za použití systému QuantiFluor dsdna, který obsahuje fluorescenční barvivo vázající DNA a DNA standard pro citlivou kvantifikaci malého množství dvouvláknové DNA (dsdna). Pokyny k provádění kvantifikace amplikonu pomocí přístroje qpcr naleznete v Příloze 2. Rychlý tip kvantifikace amplikonu, přestože se doporučuje, není nutná, aby došlo k úspěšnému dokončení protokolu Holotype HLA. Normalizace amplikonu nevyžaduje přesné měření koncentrace amplikonu. Namísto toho lze použít odhad koncentrací amplikonu provedený na základě zkušeností nebo elektroforézy na agarózovém gelu. Kvantifikace amplikonu by se neměla bez konzistentních zkušeností s kompletním protokolem Holotype HLA vynechávat. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Zesilovací destička třídy I 4 C Krok 2 Zesilovací destička třídy II 4 C Krok 2 DNA standard Lambda (100 ng/μl) 4 C Promega Barvivo QuantiFluor dsdna (200 ) 4 C Promega 20 pufr TE (ph 7,5) 4 C Promega Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel ExoSAP-iT Express -20 C Affymetrix Protokol 3.1 Připravte DNA standardy sériovým ředěním DNA standardu Lambda (100 ng/μl), který se dodává v soupravě QuantiFluor, podle níže uvedené tabulky ředění: Štítek na zkumavce Vstupní DNA Objem DNA (μl) Objem 1 TE (μl) Finální koncentrace (ng/μl) Standard 1 Lambda DNA 7,5 μl 492,5 μl 1,5 ng/μl Standard 2 Standard 1 250 μl 250 μl 0,75 ng/μl Standard 3 Standard 2 250 μl 250 μl 0,38 ng/μl Standard 4 Standard 3 250 μl 250 μl 0,19 ng/μl Standard 5 Standard 4 250 μl 250 μl 0,09 ng/μl Standard 6 Standard 5 250 μl 250 μl 0,05 ng/μl Slepý roztok Slepý roztok 0 μl 250 μl 0 ng/μl Strana 24 47
3.2 Připravte Kvantifikační destičky amplikonu (viz doplňkové obrázky). Rozdělte 99 μl 1 TE pufru do jamek 96jamkové optické destičky pro celkový počet amplikonů, které se mají kvantifikovat. 3.3 Přidejte 1 μl amplikonů z odpovídajících jamek na Amplikonových destičkách do jednotlivých jamek na Kvantifikačních destičkách amplikonu. Pipetováním promíchejte. 3.4 Připravte 1 pracovní roztok barviva QuantiFluor podle následujícího vzorce: 0,5 μl barviva QuantiFluor (200X) + 99,5 μl 1 pufru TE. Připravte dostatečné množství 1 pracovního roztoku barviva QuantiFluor tak, aby každý vzorek (celkový počet vzorků na Amplikonových destičkách) a standard (celkem 14) obdržel 100 μl alikvotního podílu. 3.5 Připravte Kvantifikační destičku standardů a Kvantifikační destičky amplikonu. Přidejte 100 μl 1 pracovního roztoku barviva QuantiFluor do jamek 96jamkové optické destičky, která bude Kvantifikační destičkou standardů, a do Kvantifikačních destiček amplikonu z Kroku 3.2. 3.6 Pomocí výše připravených standardů přidejte ve dvou duplikátech 100 μl každého standardu do jednotlivých jamek Kvantifikační destičky standardů (celkem 14 jamek). Pipetováním promíchejte. 3.7 Dobře promíchejte na vortexu a odstřeďte. 3.8 Otestujte Kvantifikační destičku standardů na destičkovém fluorometru a následně Kvantifikační destičky amplikonu. 3.9 Vypočítejte koncentraci DNA v Kvantifikačních destičkách amplikonu pomocí RFU dat generovaných destičkovým fluorometrem. Informace o kalkulacích naleznete v záložce Ředění v dodaném sešitu aplikace Excel. 3.10 Na Amplikonových destičkách zřeďte DNA ultračistou H 2 O tak, aby konečná koncentrace DNA byla přibližně 67 ng/μl. Pokud je koncentrace DNA 150 ng/μl nebo vyšší: přidejte 25 μl H 2 O Pokud je koncentrace DNA 100 150 ng/μl: přidejte 10 μl H 2 O Pokud je koncentrace DNA nižší než 100 ng/μl: žádnou H 2 O nepřidávejte Strana 25 47
Směšování amplikonů 3.11 U každého vzorku smíchejte všechny lokusy na jednu Smíchanou amplikonovou destičku. Abyste získali konečný objem 35 μl, zkombinujte objemy uvedené pro každý lokus, jak je uvedeno v následující tabulce: Lokus HLA A B C DRB1 DPB1 DQA1 DQB1 sada 3 Směsný objem 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 3.12 Do každé knihovny vzorku přidejte 4 μl ExoSAP-iT Express. Opláchněte špičky pipety pipetováním. Utěsněte destičku tepelným těsněním a odstřeďte ji. 3.13 Umístěte Smíchanou amplikonovou destičku do termocykleru a spusťte následující program: Purifikace PCR ExoSAP-iT Express Počet cyklů Teplota Čas 1 37 C 4 minuty 1 80 C 1 minuta 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Amplikony lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. Strana 26 47
Krok 4 Příprava knihovny Doba trvání: ~3 hodiny Během tohoto kroku se smíchané amplikony připravují na sekvenování na Illumina MiSeq. Amplikony jsou enzymaticky fragmentovány, konce jsou opraveny a adenylovány a na konce jsou ligovány adaptérové indexy. Knihovny se poté shromažďují a následně se provádí jediný krok čištění a koncentrace za použití kuliček AMPure XP beads. Poznámka: Společnost Omixon doporučuje používat objemy větší, než je nutné pro 96 vzorků, protože mnoho enzymů a pufrů je viskózních, což vede k nadměrné ztrátě při pipetování. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Smíchaná amplikonová destička 4 C Krok 3 Fragmentační enzym (A) -20 C Omixon Fragmentační pufr (B) -20 C Omixon Enzym opravy konců (C) -20 C Omixon Pufr opravy konců (D) -20 C Omixon Ligační enzym (E) -20 C Omixon Ligační pufr (F) -20 C Omixon Adaptérová destička -20 C Omixon Kuličky AMPure XP beads 4 C Beckman Coulter 80% ethanol (čerstvě připravený) 20 až 25 C Uživatel Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel Protokol 4.1 Zapněte termocykler. Ověřte, že se vyhřívané víko zahřívá. Poznámka: Nezapomeňte před použitím důkladně promíchat Fragmentační enzym (A). 4.2 Připravte fragmentační master mix podle tabulky níže: Fragmentační master mix Reagencie Objem na knihovnu (μl) Doporučené objemy pro 96 knihoven (μl) Barevný kód Fragmentační enzym (A) 2 μl 220,8 μl Žlutá Fragmentační pufr (B) 2 μl 220,8 μl Červená Celkový objem 4 μl 441,6 μl Strana 27 47
4.3 Připravte Destičku s reagenciemi: umístěte novou 96jamkovou PCR destičku na poličku chladiče PCR a umístěte alikvotní podíl stejného množství fragmentačního master mixu do každé jamky jednoho sloupce. Poznámka: Fragmentační reakce byla navržena tak, aby poskytovala ideální velikost DNA pro sekvenování na Illumina MiSeq. Aby nedošlo k nadměrné fragmentaci, je důležité udržovat reagencie studené, dokud nezačne reakce v termocykleru. Pro dosažení minimalizace příležitostí k nadměrné fragmentaci se doporučuje používat vícekanálové pipety. 4.4 Smíchanou amplikonovou destičku odstřeďujte po dobu 10 sekund a umístěte ji na led nebo studený blok. 4.5 Připravte Reakční destičku: umístěte novou 96jamkovou PCR destičku na studený PCR blok. 4.6 Přidejte 4 μl fragmentačního master mixu z Destičky s reagenciemi do jamek Reakční destičky tak, aby to odpovídalo vzorkům na Smíchané amplikonové destičce. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. 4.7 Pomocí multikanálové pipety přeneste 16 μl každého amplikonu ze Smíchané amplikonové destičky do odpovídající jamky na Reakční destičce. Pipetováním promíchejte. 4.8 Reakční destičku uzavřete tepelným těsněním a centrifugujte po dobu 10 sekund. 4.9 Reakční destičku inkubujte v termocykleru pomocí následujícího programu: Fragmentační program Počet cyklů Teplota Čas 1 37 C 10 minut 1 70 C 15 minut 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. 4.10 Připravte master mix opravy konců podle tabulky níže: Master mix opravy konců Reagencie Objem na knihovnu (μl) Doporučené objemy pro 96 knihoven (μl) Ultračistá H 2 O 1,25 μl 139,2 μl Barevný kód Enzym opravy konců (C) 1,25 μl 139,2 μl Zelená Pufr opravy konců (D) 2,5 μl 278,4 μl Oranžová Celkový objem 5 μl μl Strana 28 47
4.11 Přidejte stejné množství master mixu opravy konců do jednoho nepoužitého sloupce Destičky s reagenciemi. 4.12 Reakční destičku (obsahující fragmentované Vzorky) odstřeďujte po dobu 10 sekund. Přidejte 5 μl master mixu opravy konců z Destičky s reagenciemi do každé jamky reakční destičky. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. Pipetováním promíchejte. 4.13 Reakční destičku uzavřete tepelným těsněním a centrifugujte po dobu 10 sekund. 4.14 Reakční destičku inkubujte v termocykleru pomocí následujícího programu: Program opravy konců Počet cyklů Teplota Čas 1 20 C 30 minut 1 70 C 5 minut 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. 4.15 Ze skladovacích prostor vyjměte Destičku indexovaných adaptérů a rozmrazte ji při pokojové teplotě poté, co v termocykleru dojde k zahájení Programu opravy konců. Jakmile Adaptérová destička dosáhne pokojové teploty, centrifugujte ji 3 minuty při 3000 ot./min. 4.16 Opatrně z Adaptérové destičky sejměte těsnění. Netřeste s Adaptérovou destičkou po odstranění těsnění, aby nedošlo ke křížové kontaminaci. 4.17 Přeneste celý objem každé jamky z Reakční destičky (25 μl) do odpovídající jamky na Adaptérové destičce. Poznámka: Pokud nebude použita celá Adaptérová destička, lze použít pouze potřebný počet adaptérů. Odřízněte těsnění destičky mezi jamkami, které se mají používat, a jamkami, které se mají zachovat. Opatrně z Adaptérové destičky sejměte těsnění tak, aby zůstalo na místě nad jamkami, které se mají zachovat. a. Přeneste 25 μl z každého vzorku s opravenými konci z Reakční destičky do jamky na Adaptérové destičce a dobře promíchejte pipetou. b. Přeneste celý objem každého vzorku z Adaptérové destičky do původní jamky na Reakční destičce. c. Znovu utěsněte Adaptérovou destičku a vraťte ji do teploty -20 C. U zbývajících kroků v manuálu použijte Reakční destičku místo Adaptérové destičky. 4.18 Připravte ligační master mix. Připravte dostatečné množství ligačního master mixu pro každý vzorek. Strana 29 47
Ligační master mix Reagencie Objem (μl) Doporučené objemy pro 96 knihoven (μl) Barevný kód Ligační enzym (E) 2,5 μl 252,5 μl Modrá Ligační pufr (F) 30 μl 3030 μl Černá Celkový objem 32,5 3282,5 μl 4.19 Přidejte stejné množství ligačního master mixu do 3 nepoužitých sloupců Destičky s reagenciemi. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. 4.20 Přidejte 32,5 μl ligačního master mixu do každé jamky reakční destičky. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. Pipetováním promíchejte. 4.21 Reakční destičku uzavřete tepelným těsněním a centrifugujte po dobu 10 sekund. 4.22 Reakční destičku inkubujte v termocykleru pomocí následujícího programu: Ligační program Počet cyklů Teplota Čas 1 25 C 10 minut 1 70 C 10 minut 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. Směšování a čištění knihovny 4.23 Umožněte kuličkám AMPure XP beads dosáhnout pokojové teploty. Zajistěte, aby byly homogenní (žádné shluky). Připravte 5 ml čerstvě připraveného 80% ethanolu (4 ml EtOH + 1 ml H 2 O). 4.24 Knihovnu vytvořte kombinací alikvotního podílu z každého smíseného amplikonu, nyní knihovny, která je pro vzorek specifická, do jedné mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 2,0 ml. I. Pro 16 nebo více vzorků vypočítejte množství každé knihovny vzorku, aby se společně smísily do jedné Knihovny s celkovým objemem 900 μl. Vydělte 900 μl počtem knihoven vzorků. To je objem alikvotního podílu, který se má odebrat z každé knihovny vzorku a napipetovat do Knihovny. II. Pro méně než 16 vzorků přeneste 60 μl z každé knihovny vzorku do Knihovny. 4.25 Do zkumavky s Knihovnou přidejte 900 μl kuliček AMPure XP beads. Pečlivě promíchejte na vortexu a krátce odstřeďte. Nedovolte, aby se kuličky oddělily. Knihovnu inkubujte po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Strana 30 47
Poznámka: Pokud je v Konečné směsi méně než 900 μl knihovny, přidejte ekvivalentní množství kuliček AMPure XP beads. Mezi Konečnou směsí a kuličkami AMPure XP beads by měl vzniknout poměr 1:1. 4.26 Vložte zkumavku s Knihovnou do magnetického stojanu a inkubujte po dobu 10 minut. 4.27 Zatímco máte zkumavku na magnetickém stojanu, opatrně odejměte a zlikvidujte supernatant ze zkumavky s Knihovnou, aniž byste se dotkli kuliček. 4.28 Zatímco máte zkumavku na magnetickém stojanu, přidejte do zkumavky s Knihovou ~1,5 2 ml čerstvě připraveného 80% ethanolu. Objem přidaného ethanolu by měl být takový, aby zakryl kuličky. Poznámka: Aplikujte ethanol na stranu zkumavky, kde nejsou kuličky. 4.29 Inkubujte zkumavku s Knihovnou při pokojové teplotě po dobu 30 sekund; poté pečlivě odstraňte a zlikvidujte supernatant. 4.30 Zopakujte kroky 4.28 a 4.29. 4.31 Rychle odstřeďte zkumavku s Knihovnou a umístěte ji s otevřeným víkem zpět na magnetický stojan. Pomocí pipety odstraňte zbytkový ethanol. Nedotýkejte se kuliček. Poznámka: Ujistěte se, že shluk kuliček neobsahuje zbytkový ethanol. To může vyžadovat otáčení zkumavky na magnetickém stojanu tak, aby se odstranil ethanol bez narušení shluku kuliček. 4.32 Kuličky nechte na magnetickém podstavci oschnout po dobu 5 8 minut, dokud nebude shluk kuliček suchý. 4.33 Odstraňte zkumavku s Knihovnou z magnetického stojanu a eluujte Knihovnu 31 μl ultračisté vody. Nedovolte, aby se špička pipety dotkla kuliček, protože by se k ní přilepily. 4.34 Promíchejte Knihovnu na vortexu, aby došlo k úplné resuspenzi kuliček. Jestliže na bočních stěnách zůstávají kapičky, krátce odstřeďte. Ujistěte se, že kuličky zůstávají v suspenzi. 4.35 Knihovnu inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě. 4.36 Umístěte Knihovnu na 2 minuty na magnetický stojan. 4.37 Odeberte Knihovnu: zatímco máte zkumavku s Konečnou knihovnou na magnetickém stojanu, odeberte 31 μl supernatantu do nové mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml. Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě -20 C po delší dobu. Strana 31 47
Krok 5 Výběr velikosti Knihovny Doba trvání: ~1 hodina Krok 5 převezme Knihovnu z Kroku 4 a provede výběr velikosti pomocí Pippin Prep. Pippin Prep může automaticky vybrat rozsah velikostí fragmentů DNA a eluovat je do sběrné komory. Poznámka: Místo Pippin Prep lze použít Blue Pippin. Návod k použití Pippin Prep naleznete v Příloze 1. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Kazeta s 1,5% agarózovým gelem, bez barviv 20 až 25 C Sage Science Plnicí roztok Pippin/markerový mix (označený K) 4 C Sage Science Směsná knihovna 4 C Krok 4 Poznámka: Marker K se používá spolu s Pippin Prep. Blue Pippin používá Marker 2. Protokol 5.1 Uveďte plnicí roztok Marker K na pokojovou teplotu. 5.2 Zkombinujte 31 μl Směsi s 10 μl plnicího roztoku Marker K. 5.3 Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 5.4 Nakonfigurujte Pippin Prep tak, abyste získali DNA fragmenty mezi 650 a 1300 bps. Vložte vzorek o velikosti 40 μl do portu pro vzorek a spusťte program. Doba běhu je 45 50 minut. 5.5 Odeberte celý obsah (přibližně 40 μl) z elučího portu přístroje Pippin Prep a přeneste jej do nové mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml. Toto je knihovna vybraná podle velikosti. Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě -20 C po delší dobu. Strana 32 47
Krok 6 Kvantifikace Knihovny pomocí přístroje qpcr Doba trvání: ~1 hodina 15 minut Aby se dosáhlo optimálního využití výstupu ze sekvenceru Illumina MiSeq, je nutné Knihovnu vybranou podle velikosti kvantifikovat. Koncentraci Knihovny vybrané podle velikosti lze přesně změřit pomocí qpcr. Volitelně můžete použít soupravu Qubit dsdna BR a přístroj pro měření koncentrace knihovny Qubit. Tento protokol naleznete v Příloze 3. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal 10 Primerový premix Illumina -20 C KAPA Biosystems 2 Master mix KAPA SYBR FAST qpcr -20 C KAPA Biosystems Std 1 (20,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 2 (2,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 3 (0,20 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 4 (0,02 pm) -20 C KAPA Biosystems DNA standard Illumina -20 C KAPA Biosystems Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel 1 TE pufr (ph 8,0) 20 až 25 C Uživatel Knihovna vybraná na základě velikosti 4 C Krok 5 Protokol 1 Pomocí 10 primerového premixu Illumina a 2 master mixu KAPA SYBR FAST qpcr připravte směs primerů qpcr: Poznámka: Reagencie soupravy KAPA SYBR FAST qpcr (master mix qpcr, primerový premix a roztoky ROX) se zkombinují při prvním použití soupravy. Tento zkombinovaný roztok je stabilní v průběhu nejméně 30 cyklů zmrazení/rozmrazení. Postupujte podle dokumentace KAPA a zjistěte, zda se pro váš přístroj qpcr doporučuje ROX. Směs primerů qpcr Reagencie Objem (ml) 10 Primerový premix Illumina 1 ml 2 Master mix KAPA SYBR FAST qpcr 5 ml Celkový objem 6 ml 2 Připravte master mix qpcr. Strana 33 47
Master mix qpcr Reagencie Směs primerů qpcr Ultračistá H 2 O Celkový objem Objem (μl) 228 μl 76 μl 304 μl 3 Připravte sériové ředění Knihovny vybrané na základě velikosti. a. Připravte ředění 1:1000 přidáním 1 μl Knihovny vybrané na základě velikosti do 999 μl 1 TE pufru (ph 8,0), důkladně opláchněte špičku pipety. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. b. Připravte ředění 1:2000 přidáním 100 μl 1:1000 roztoku do 100 μl 1 TE pufru (ph 8,0). Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 4 Připravte Kvantifikační destičku qpcr na nové PCR destičce, která je kompatibilní s vaším systémem qpcr. 5 Rozdělte alikvotní podíl 16 μl master mixu qpcr ve třech kopiích pro standardy 1 4, ředění 1:1000 a ředění 1:2000 (viz doplňkové obrázky). 6 Rozdělte alikvotní podíl 4 μl standardů 1 4, ředění 1:1000 a ředění 1:2000 do odpovídajících jamek. 7 Utěsněte Kvantifikační destičku qpcr a odstřeďte ji po dobu 10 sekund. Poznámka: Vyhněte se tvorbě bublin v jamkách Kvantifikační destičky qpcr. Odstřeďujte podle potřeby, abyste odstranili bubliny. 8 Nastavte triplikáty 1:1000 a 1:2000 jako cílené vzorky a definujte standardy (body: 4, počáteční koncentrace: 20 pm, ředění: 1:10). Abyste určili koncentraci DNA Knihovny vybrané na základě velikosti, spusťte následující program na přístroji qpcr: Počet cyklů Teplota Čas 1 95 C 5 minut 25 (bez křivky tání) 95 C 30 sekund 60 C 90 sekund (získání dat) 9 Abyste mohli převést výsledek qpcr z koncentrace pm na nm, zadejte výsledky Quantity mean (průměrného množství) dvou replikátů knihoven do karty sešitu aplikace Excel společnosti Omixon, která se nazývá Library Quantification (Kvantifikace knihovny). 10 Pomocí objemů ze sešitu zřeďte 10 μl Knihovny vybrané na základě velikosti na koncentraci 2 nm sterilní H 2 O v nové mikrocentrifugační zkumavce se sníženou vazností o objemu 1,5 ml. Skladujte Knihovnu vybranou na základě velikosti při teplotě -20 C. Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě -20 C po delší dobu. V případě dlouhodobého skladování se důrazně doporučuje provést kvantifikaci knihovny předtím, než se spustí na MiSeq. Strana 34 47
Krok 7 Sekvenování na Illumina MiSeq Doba trvání: ~24 40 hodin Illumina MiSeq je automatizovaný přístroj NGS, který může sekvenovat Knihovnu vybranou podle velikosti, která byla připravena v předchozích krocích. Demultiplexování indexovaných vzorků se provádí automaticky po dokončení sekvenčního cyklu. Rychlý tip Jako další kontrolu sledování sekvenční reakce můžeme použít 1% PhiX spike-in. Další informace o kontrole PhiX naleznete v dokumentaci Illumina. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Kazeta reagencií -20 C Illumina HT1-20 C Illumina PR2 4 C Illumina MiSeq Flow Cell 4 C Illumina Knihovna při 2nM 4 C Krok 6 1 N nebo 2 N NaOH 20 až 25 C Uživatel Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel Kapacita soupravy reagencií MiSeq Souprava reagencií Illumina MiSeq Cyklus Std 500 (MS-102-2003) Cyklus Std 300 (MS-102-2002) Cyklus Micro 300 (MS-103-1002) Cyklus Nano 500 (MS-103-1003) Cyklus Nano 300 (MS-103-1001) Čas Hodiny Vzorky 96/7 ~39 96 ~24 96 ~19 28 ~28 12 ~17 6 Protokol 7.1 Podle standardních Illumina protokolů připravte MiSeq. 7.2 Připravte 1nM Denaturovanou knihovnu: V nové mikrocentrifugační zkumavce se sníženou vazností o objemu 1,5 ml smíchejte 10 μl čerstvě připraveného 0,2N NaOH a 10 μl 2nM zředěné Knihovny vybrané na základě velikosti. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. Tuto 1nM Denaturovanou knihovnu inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Strana 35 47
7.3 Připravte 20pM Denaturovanou knihovnu: Přidejte 980 μl chlazeného HT1 do 20 μl 1nM Denaturované knihovny. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 7.4 Připravte 9pM Denaturovanou knihovnu: Do nové mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml přidejte 550 μl chlazeného HT1 a 450 μl 20pM Denaturované knihovny. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 7.5 Přeneste 600 μl 9pM Denaturované knihovny do Plnicího rezervoáru na vzorky v kazetě reagencií MiSeq. Rychlý tip K vytvoření Listu vzorku, který požaduje Miseq., se doporučuje použít poskytnutý sešit. Strana 36 47
Krok 8 Analýza sekvenčních dat HLA Illumina MiSeq zpracuje 9pM Směsnou knihovnu a vygeneruje sekvenční data ve formátu souborů fastq. Informace o správné instalaci HLA Twin a informace o interpretaci genotypové analýzy vašich sekvenčních dat naleznete v příručce HLA Twin. Pro implementaci Automatizovaného protokolu a kvůli problémům týkajícím se instalace nebo analýzy dat kontaktujte support@omixon.com. Automatizovaný protokol Nastavení a konfigurace IT 1. Nainstalujte HLA Twin Server na Server. Nainstalujte Klienta HLA Twin na počítač klienta na server se může připojit více Klientů HLA Twin. Pro získání vlastních instalačních pokynů týkajících se Automatizace kontaktujte podporu společnosti Omixon (support@omixon.com). Protokol jednotlivých analýz 1. Spusťte Klienta HLA Twin a přihaste se. 2. Data jsou již zpracovávána nebo se zpracovávají. Zkontrolujte výsledky pomocí systému Traffic Light System v aplikaci HLA Twin. 3. Podle potřeby exportujte výsledky genotypizace a/nebo shodné sekvence. Manuální serverový protokol Nastavení a konfigurace IT Nainstalujte HLA Twin Server na Server. Nainstalujte Klienta HLA Twin na počítač klienta. Protokol jednotlivých analýz Spusťte Klienta HLA Twin a přihaste se. Ve formátu fastq nebo fastq.gz vyberte data MiSeq a spusťte cyklus typizace Holotype HLA typing. Po skončení cyklu typizace Holotype HLA typing zkontrolujte výsledky pomocí systému Traffic Light System v aplikaci HLA Twin. Podle potřeby exportujte výsledky genotypizace a/nebo shodné sekvence. Manuální protokol Desktop Nastavení a konfigurace IT Nainstalujte HLA Twin Desktop. Strana 37 47
Protokol jednotlivých analýz 6 Spusťte HLA Twin a přihaste se. 7 Ve formátu fastq nebo fastq.gz vyberte data MiSeq a spusťte cyklus typizace Holotype HLA typing. 8 Po skončení cyklu typizace Holotype HLA typing zkontrolujte výsledky pomocí systému Traffic Light System v aplikaci HLA Twin. 9 Podle potřeby exportujte výsledky genotypizace a/nebo shodné sekvence. Strana 38 47
Doplňkové obrázky Příklady Amplikonových destiček, Zesilovací destička, Amplikonových kvantifikačních destiček (pro jednotlivé lokusy) a Reakčních destiček Příklad Kvantifikační destičky standardů Strana 39 47
Příklad Kvantifikační destičky qpcr Knihovny KAPA Strana 40 47