Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - Techniky/mody HPLC - I Příprava předmětu byla podpořena projektem PPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
2.3.1. Techniky HPLC - Mody HPLC 2.3.1.1. Adsorpční chromatografie Adsorption chromatography Normal phase chromatography (LSC) Selektrivní distribuce anlytu mezi rozpouštědlo a adsorpční povrch stacionární fáze Konkurence na povrchu sorbentu: analyt versus solvent Stacionární fáze: silikagel, alumina
likagel 2 * H 2 0 Charakteristické vlastnosti: šířka pórů ~5 nm, specifický povrch ~500 m 2 g -1, distribuce pórů, hustota Makroporézní silikagel - velikost pórů nad ~10 nm Neporézní silikagel 1.5 µm, malý specifický povrch Příprava silikagelu: dříve z vodního skla a dnes polymerací tetraethoxysilanu > podstatně vyšší čistota sorbentu Na povrchu různé silanolové skupiny, ~9 µmol/m 2 ty interagují s vodou a s polárními skupinami solutu a složek mobilní fáze, tvorba vodíkových můstků atd. Aktivace silikagelu - odstranění slabě vázané vody, 150-180 C Průměrná hodnota pk a ~ 3-5 Iontově-výměnná interakce bazických látek v kyselém ph Úprava aktivního silikagelu přidáním známého množství vody Schopnost dělit geometrické izomery, není dobrý pro separace v homologických řadách Lin. dynamická kapacita vysoká, kolem 10-3 g/g Výhody: Mimořádně vysoká mechanická odolnost Relativně snadná příprava materiálů odlišné velikosti pórů a částic, také snadná modifikovatelnost povrchu Nevýhody: Malá chemická odolnost vůči ph nad 8
RŮZNÉ DRUHY FUNKČNÍCH SKUPIN NA PVRCHU SILIKAGELU 1-Vicinální silanolové skupiny; 2-Geminální silanolové skupiny; 3-loxanové skupiny; 4-Asociované silanolové skupiny; 5-Izolovaná silanolová skupina H 1 H 2 3 H H H Amorfní silikagelová matrice H H H 4 H H H H 5 H
Alumina Amorfní nebo krystalická forma oxidu hlinitého - gama forma Dva interakční mechanismy: Mnoho solutů je adsorbováno na povrchu aluminy pomocí nukleofilní interakce. Stejná místa mohou také ochotně tvořit komplexy s přenosem náboje s typickými elektron-donory, např. s aromáty Alternativně, kyselé látky mohou interagovat s bazickými místy na povrchu aluminy přenosem protonu vedoucím k chemisorpci Povrch kolem 100 200 m 2 /g, na povrchu aktivní centra hydroxylové skupiny; interakce - idukované dipóly > plošná adsorpce aromatických látek > separace látek odlišné planarity Alumina je většinou bazická (závisí na postupu při přípravě) oddělení slabě kyselých látek ze směsí Alumina je ale obecně amfoterní Aktivace sorbentu: 400 C, přídavkem vody se nastaví aktivita sorbentu Lin. kapacita sorbentu menší než pro silikagel ~ 5.10-5 g/g Výhody: Mimořádně vysoká mechanická odolnost Vysoká stabilita v alkalickém prostředí, běžně do ph 12 Nevýhody: Nesnadná funkcionalizace povrchu
PVRCH ALUMINY V KYSELÉM A ZÁSADITÉM PRSTŘEDÍ Al Al Cl kyselá alumina Al Al H H HCl NaH H HCl NaH Al H Al zásaditá alumina Na
Typy interakcí mezi analytem a stacionární fází Dipól-dipól Dipol-indukovaný dipól Tvorba π-komplexů Vodíková vazba
Používané mobilní fáze pro adsorpční chromatografii Především organická rozpouštědla odlišné polarity Retence analytů na polárních sorbentech obecně klesá s nárůstem polarity solventu => Elutropická řada, eluční síla Běžně je mobilní fáze tvořena směsí rozpouštědel lišících se polaritou Adsorpční chromatografie se používá především pro látky obtížně rozpustné ve vodě, tj. pro látky nepolární a látky střední polarity Aplikace malých množství polárních aditiv do mobilní fáze, například 0,1% isopropyl alkoholu do hexanu => povrch sorbentu se pokryje, kontrolovaně deaktivuje IPA Pomalé ustavení rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází, nelze většinou provozovat grafient Eluent by měl splnit následující požadavky: Eluční síla vede k retenčním (kapacitním) faktorům k 1 10 Mobilní fáze má malou viskozitu > zlepšení účinnosti kolony
2.3.1.2. Rozdělovací chromatografie Partition chromatography (LLC) A. Chromatografie kapalina kapalina Martin a Synge Nobelova cena v roce 1941 Stacionární kapalná fáze je fyzikálně poutána na povrchu inertního nosiče, obdoba GLC Kapalina tvořící stacionární fázi je nemísitelná s mobilní fází Mobilní fáze bývá obvykle nasycena stacionární fází ke snížení stripping efektu stacionární fáze LLC kapalina-kapalina lze rozdělit na normální a reverzní techniku Extrakční chromatografie Gradient vyloučen Malý význam techniky pro dnešní HPLC
B. Chemicky vázané stacionární fáze Bonded phase chromatography Na začátku 70. let první chemicky vázané fáze Plně porézní úzkoporézní silikagel, ~10 nm, 3-10 µm, je nejčastější matricí pro modifikace Výhody: Polární, nepolární, ionizovatelné i ionizované látky jsou na těchto sorbentech účinně děleny, často pouhou změnou složení mobilní fáze Je možno připravit sorbenty lišící se polaritou Lze aplikovat nejrůznější mobilní fáze Nejčastěji se užívá směs organického rozpouštědla a vody Gradient je samozřejmou technikou, bez nebezpečí strhávání stac. fáze Sorbent je ekvilibrován daleko dříve než nemodifikovaný silikagel v adsorpční technice Nevýhody: Stabilita vázaných fází obvykle od ph 2 po ph 8, hydrolýza vazby (silikagel/funkční skupina), resp. rozpouštění matrice
Syntéza vázaných fází Nejčastější vázané fáze jsou následující: 1. C18, C8, C4, C1, phenyl brácené (reverzní) fáze 2. -CH 2 CH 2 CH 2 CN, -CH 2 CH 2 NH 2, DIL středněpolární fáze + 3. Měniče iontů, -S 3 H, -CH, -NHR, -NR 2, -NR 3 Modifikace silanolových skupin 1. Esterifikace silanolové skupiny alkoholy Nestabilní vazba --R vzhledem k hydrolýze v alkoholických vodných prostředích 2. Chlorace silikagelu thionyl chloridem, pak reakce s Grignardovým nebo organolitným činidlem, reakce chlorsilanu s aminem vznik vazeb -C, -N -C vazba je vysoce stabilní, ale příprava vázané fáze značně náročná -N je hydrolyticky stabilní pouze od ph 4 po ph 8 ve vodných roztocích
3. Reakce silanolových skupin s organochlorsilany Vazba -- vykazuje dobrou stabilitu, hydrolyzuje se při ph menším než ~2 Příprava je poměrně snadná Vázané fáze na polymerních sorbentech Metakyláty, akryláty, kopolymery styren-divinylbenzen apod.
brácené fáze (Reverzní fáze) na bázi silikagelu Reversed-phase chromatography (RPC) Nejrozšířenější sorbenty v HPLC Hydrofobní interakce je základní podstatou zadržování analytu na sorbentu Monomerní (monofunkční) fáze Monofunkční silany jsou užity k modifikaci silikagelu Definovaná modifikace, snadná kontrola reakce a výsledného sorbentu 8-12% C na sorbentu Blokování nezreagovaných silanolových skupin end-capping Polymerní (di a trifunkční) fáze Di nebo trifunkční silany jsou využity pro modifikaci povrchu silikagelu btížnější sledování průběhu a výsledku reakce, v přítomnosti vody je možno pozorovat horizontální polymeraci Kontrola přítomnosti vody a parametrů v průběhu reakce je velmi podstatná 17%-25% C na sorbentu
V každém případě přibližně 40% silanolových skupin zůstane na povrchu sorbentu, přestože proběhne end-capping Stabilita obou modifikací - ph 2-8 Retenční mechanizmus na reverzní fázi není do detailů znám, v každém případě je složitý a závislý na mnoha faktorech Neustále jsou otevřeny diskuse ohledně důležitosti adsorpce a absorpce na obrácených fázích Retence analytu roste s prodlužováním délky alkanového řetězce vázaného na sorbentu (za předpokladu nezměněného stupně pokrytí sorbentu) Bazické látky často chvostují vlivem interakcí s reziduálnními silanoly=> base deactivated sorbents Polymerní reverzní fáze, makroporézní gely Hybridní fáze XTERRA
Volba mobilní fáze pro chromatografii na reverzní fázi Voda, pufry, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran (THF) a jejich směsi jsou nejběžnějšími mobilními fázemi Eluční schopnost roste v pořadí: methonol, acetonitril, THF Retence je citlivě řízena množstvím organického modifikátoru v mobilní fázi, čím více organického modifikátoru, tím menší retenční faktor solutu Existuje lineární závislost mezi logaritmem retenčního faktoru a obsahem organického modifikátoru v mobilní fázi
Vliv ph mobilní fáze na retenci analytů Vliv na neionizovatelné látky je poměrně malý Vliv na ionizovatelné látky je zásadní Pro slabě kyselé látky platí: Snižování ph mobilní fáze vede ke zvyšování retence, v jisté oblasti ph, oblasti závislé na pk a kyseliny Pro bazické látky platí: Snižování ph mobilní fáze vede ke snižování retence, opět v určité oblasti ph, podle pk a bazického analytu
Pro kyselou látku lze psát: k = K k0+ k1 [H K 1+ [H a(a) + ] m a(a) + ] m k 0 a k 1 jsou retenční faktory neutrální, resp. deprotonizované formy kyselé látky, K a(a) je disociační konstanta kyseliny ve vodném prostředí, [H + ] m je molární koncentrace iontů H + ve vodné mobilní fázi
Pro bazickou látku lze psát: = k 0 + k 1 [H 1+ K [H K k + ] a(b) + a(b) m ] m k 0 a k 1 jsou retenční faktory neutrální, resp. protonizované formy bazické látky, K a(b) je disociační konstanta protonizované báze (její konjugované kyseliny) ve vodném prostředí, [H + ] m je molární koncentrace iontů H + ve vodné mobilní fázi
Phase collapse in Reversed-Phase LC (e.g., LCGC Europe 15 (2002) 652) Phase collapse is best described as a dewetting phenomenon. It can cause a total loss of retention and chromatographic problems such as peak tailing, non-reproducible retention times and gradient regeneration delays.
(a) water-meh (b) 100 % water
Polar-Embedded Alkyl Phases (e.g., Recent Developments in LC Column Technology, June 2003) polar groups are generally incorporated in the alkyl ligand close to the surface silica a variety of polar groups including amide, carbamate, urea and ether originally developed for deactivation of silanols interacting with basic analytes important side effect high stability in 100 % aqueous environment, no dewetting of the RP
Porézní grafitický uhlík (Porous Graphitic Carbon) Nepolární adsorbent na rozdíl od silikagelu a aluminy Použití v reverzním i normálním modu (selektivita je odlišná ve srovnání s RP na bázi silikagelu) Mimořádná chemická stabilita v kyselém i alkalickém prostřed (0-14 ph), navíc i za vysoké teploty Schopnost dobře dělit polární, ionizované látky a stereoizomery
2.3.1.3. Iontově výměnná chromatografie Ion exchange chromatography (IEC) Technika separace ionizovaných látek Prováděna obvykle ve vodném prostředí Aplikace: dělení anorganických i organických a biochemicky důležitých analytů - bílkovin, nukleových kyselin, peptidů aj. Sorbenty- iontoměniče: na bázi silikagelu nebo častěji na kopolymerní bázi styren/divinylbenzen apod. lný katex: sulfo skupina S 3 H Slabý katex: karboxylová skupina CH lný anex: kvarterní amin N + R 3 Slabý anex: sekundární, primární amin NHR, -NH 2 Kapacita iontoměniče, ~ 2 mmol/g sorbentu