Mimojaderná transgenoze: metodologie a aplikace

Transkript

1 Mimojaderná transgenoze: metodologie a aplikace Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc. BC AV ČR, v.v.i., ÚMBR a PřF JU, Branišovská České Budějovice

2 Úvod - první stabilní transformace jádra j rostlinné buňky chimérn rním selekčním m genem z bakterií pomocí A. tumefaciens v r (geny npti a nptii; Fraley et al.,, PNAS, 80: ), důkaz d Ti plasmidu jako vektoru pro vnáš ášení cizorodé DNA do rostlin v r (Hernalsteens( et al., Nature,, 287: , 656, 1980) - první transformace chloroplastů v r ( (Chlamydomonas reinhardtii, Boynton et al., Science, 240: , 1538, 1988), u vyšší šších rostlin v r transientní exprese (v chloroplastech tabáku, Daniell et al.,, PNAS, 87: 88-92, 1990) ) i stabilní transformace ptdna tabáku (Svab( et al., PNAS, 87: , 8530, 1990) - první transformace mitochondriáln lní DNA u S. cerevisiae v r (Johnston( et al.,, Science, 240: , 1541, 1988) a je to dosud jediný organismus, jehož mtdna je takto rutinně geneticky manipulována na (i když C. reinhardtii statečně náskok dohání; Remacle et al., PNAS, 103: , 2006)

3 Transformace rostlinné buňky Dosažen ení stabilní transformace rostlin je podmíněno no úspěšnou realizací tří kroků: 1) vnesení klonované DNA do vhodného cílovc lového pletiva 2) selekce buněk, které tuto DNA přijaly p a integrovaly do svého genomu 3) regenerace rostlin schopných další šího množen ení nebo pohlavního ho rozmnožov ování

4 Transformace mitochondrií - nově vyvinutá metoda biologick logické balistiky (biolistiky) otevřela ela cestu mj. k transgenozi mitochondrií a plastidů - první prokazatelně úspěšná a reprodukovatelná transformace mitochondrií byla uskutečněna na u S. cerevisiae: : respiračně deficientní kmen (kvůli deleci mitochondriáln lního genu kódujícího největší podjednotku cytochromoxidázy zy) ) byl opraven díky biolistickému vnesení DNA se standardním m verzí tohoto genu - analýza ukázala, že e k obnovení funkce genu došlo díky homologní rekombinaci do mitochondriáln lního genomu

5 Transformace mitochondrií - první mitochondriáln lní transformace rostlinné buňky (řasy C. reinhardtii) ) bylo dosaženo v r (Boynton( a Gillham, Meth. Enzymol., 264: , 296, 1996), avšak ak byla to spíš íše e výjimečná záležitost - mitochondriáln lní genom C. reinhardtii je lineárn rní,, 15,8 kb dlouhý s telomerami tvořenými invertovanými repeticemi 500 bp s 40 bp jednořet etězcovým přesahem - genom kóduje pouhých 8 proteinů

6 Transformace mitochondrií - skutečně rutinně se daří tento objekt mitochondriáln lně transformovat aža od r (Remacle( et al., PNAS, 103: , 4776, 2006) - šlo o transformaci buněk k mutovaných v genech cob, coxi nebo nd1 plasmidy nebo PCR generovanými fragmenty obsahujícími standardní formy mutovaných genů - oproti předchp edcházejícím m pracím m byly opraveny jak deleční tak posunové mutace a transformační účinnost dosáhla transformantů na µg g DNA (cca 50 x více) v

7 Typy plastidů: (1) chloroplasty (obsahují chlorofyl) (2) chromoplasty (obsahují žluté,, oranžov ové nebo červené karotenoidy) (3) amyloplasty (obsahují škrob) (4) elaioplasty (obsahují oleje) (5) etioplasty (částečně vyvinuté chloroplasty tvořící se při i klíčen ení semen ve tmě) (6) proplastidy (plastidové prekurzory) (7) gerontoplasty (chloroplasty během b senescence)

8 Stabilní transformace integrací vnáš ášené DNA do ptdna homologní rekombinací nebo pomocí fágové integrázy Transientní vnesení cizorodé DNA

9 Plastidový transformační vektor plazmid s 2 plastidovými sekvencemi (1-2 kbp), mezi nimi vnáš ášené geny; neobsahuje replikační počátek, takže e je záhy z ztracen Aktivní systém homologní rekombinace - plastidový genom je ve stavu neustálých inter- i intramolekulárn rních výměn - (Maliga, Curr. Opin. Plant Biol., 5: , 172, 2002).

10

11 Integráza fága φc31 integrace cizí DNA do ptdna činností místně specifické integrázy (INT) z fága φc31 (Lutz et al., Plant J. 37: , 913, 2004); předpoklp edpokládá se její užití u druhů,, kde standardní transformace na základz kladě homologní rekombinace nepřin ináší výsledky

12 Člunkové vektory plazmidy s replikačním počátkem ColE1 z E. coli a plastidovým replikačním počátkem ori (Staub & Maliga,, Mol. Gen. Genet.. 249: 37-42, 1995); nemají praktické využit ití,, neboť po odstranění selekčního tlaku jsou rychle ztráceny. Exprese transientně vnesené DNA byla studována exprese GUS (Sporlein( et al.,, TAG 82: , 722, 1991) nebo GFP (Hibberd( et al., Plant J. 16: , 632, 1998)

13 Výhody transformace plastidového genomu: Plastidy vykazují (až na výjimky) uniparentáln lní přenos,, tzn. nejsou přenášeny do další generace pylem. Díky D tomu nemohou být transformované plastidy přeneseny p do nekulturních příbuzných p druhů a vytvořit tak tzv. superplevele,, nebo způsobit genetické znečištění jiných plodin. Řešení problému plodin nesoucích ch v jaderném m genomu transgen pro δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis (suboptimální exprese - vytvořen ení rezistentních hmyzích škůdců). Kole et al. (PNAS, 96: , 1845, 1999) dokázali plastidovou hyperexpresí nového genu pro δ-endotoxin zničit it stoprocentně nejen citlivé škůdce, ale i škůdce, kteří již vykazovali u jaderně transformovaných rostlin vůčv ůči i tomuto toxinu rezistenci. Přítomnost P Bt genu v plastidovém m genu brání toxickému účinku pylu z transgenních rostlin na jiné hmyzí druhy (známý případ p pad motýla monarcha stěhovavý), neboť pyl díky d absenci chloroplastové DNA žádný toxin neobsahuje - De Cosa et al., Nat. Biotechnol., 19: 71-74, 74, 2000: toxin v pylu nepřítomen, v listech těchto t rostlin tvořil aža 47 % (!) všech v rozpustných bílkovin. b

14 Výhody transformace plastidového genomu: Chloroplastové transformační vektory obsahují dvě plastidové sekvence, které obklopují z obou stran vnáš ášený transgen.. Díky D nim dochází homologní rekombinací k inzerci transgenu do daného předem zvoleného místa m plastidového genomu. To vede k eliminaci pozičního efektu a je dosaženo uniformity exprese transgenu u všech v získaných transgenních rostlin. Fenomén n umlčov ování genů (gene silencing), který se často vyskytuje u jaderně transformovaných rostlin, dosud nebyl u rostlin s transformovanými plastidy pozorován. Byla prokázána exprese transgenů na vysoké úrovni jak u chloroplastů tak u chromoplastů (plody rajčete), což umožň žňuje využívat vat k produkci požadovaných látek l nezelených částí rostlin. Při i selekci ani tady není třeba využívat vat jako selekční znak rezistenci k antibiotikům m (viz dále). d

15 Výhody transformace plastidového genomu: Bylo zjištěno, že e v chloroplastech mohou přímo p vznikat biologicky aktivní proteiny,, které vyžaduj adují vytvářen ení bisulfidických můstků (lidský somatotropin, Staub et al., Nat. Biotechnol., 18: , 338, 2000). To otvírá možnost produkovat v chloroplastech rekombinantní terapeutické proteiny v nativní formě. Některé proteiny kódovank dované transgeny v jaderném m genomu a hromadící se v cytosolu,, jsou pro buňku toxické.. Jsou-li však v stejné geny vneseny do genomu plastidu, kde se následnn sledně rovněž hromadí vznikající proteiny, bývají často netoxické a mohou se hromadit do velmi vysoké koncentrace. Umožň žňují suborganelové cílení genových produktů do plastoglobulí lipidy obsahujících ch struktur připojených p k thylakoidním membránám m a účastnících ch se hlavně metabolismu tokoferolů,, vývoje thylakoidů a procesů reagujících ch na stres.

16 Výhody transformace plastidového genomu:

17 Metody transformace chloroplastů: Základní metodou transformace se stala biolistická metoda. Postupně byly vytvářeny vektory pro transformaci chloroplastů dvoudělo ložných rostlin (Daniell( et al.,, PNAS, 87: 88-92, 1990, tabák) i jednodělo ložných rostlin (Daniell( et al., Plant Cell Rep., 9: , 619, 1991, transientní exprese v chloroplastech listů a kalusů pšenice). Další možné metody transformace: - transformace chloroplastů v izolovaných protoplastech pomocí PEGu (Biotechnology, 11: 95-97, 97, 1993; Plant J., 3: , 738, 1993) - tato metoda mám však nižší účinnost než biolistická metoda - přímá mikroinjekce DNA do chloroplastu buněk k listového mesofylu tabáku (Knoblauch( et al., Nat. Biotechnol., 17: , 909, 1999) - historická: : pomocí baktéri rií A. tumefaciens (De Block et al., EMBO J., 4: , 1372, 1985; Venkateswarlu et al., Biotechnology, 9: , 1105, 1991) - tyto výsledky se však již nepodařilo nikdy zopakovat

18 Selekce Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: a) C. reinhardtii : k transformaci využívány nefotosyntetizující kmeny nesoucí mutaci v jednom z chloroplastových genů podílej lejících ch se na fotosyntéze. Vnáš ášeny byly funkční kopie stejných genů,, což vedlo u transformantů k obnovení fotosyntézy a umožnilo tak jejich selekci (Boynton( et al., Science, 240: , 1538, 1988). b) Použit ití bodových mutací v genech pro ribosomáln lní RNA nebo ribosomáln lní proteiny plastidů,, které zajišťovaly resistenci k antibiotikům spektinomycinu,, streptomycinu a erytromycinu (Newman et al., Genetics,, 126: , 888, 1990). Tuto selekci se podařilo realizovat i u vyšší šších rostlin (Svab et al.,, PNAS, 87: , 8530, 1990), nicméně úspěšnost transformace byla velmi nízkn zká.

19 Selekce Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: c) Frekvenci transformace se podařilo významně zvýšit aža použit itím genu aada kódujícího enzym adenosyl-3 -adenyl adenyl transferasu.. Tento enzym z E. coli inaktivuje některá antibiotika jako spektinomycin nebo streptomycin (Svab( et al.,, PNAS, 90: , 917, 1993). aada je v současnosti při i transformaci plastidů nejdůle ležitějším m selekčním genem. d) Gen nptii byl využit při p úspěšné selekci plastidových transformantů tabáku (Carrer( et al., MGG, 241: 49-56, 1993), gen apha-6 z Acinetobacter baumannii (Bateman & Purton,, Mol. Gen. Genet., 263: , 410, 2000) při p transformaci C. reinhardtii.

20 Selekce Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: e) Využit ití tolerance k herbicidům,, jejichž mechanismem působení je inhibice plastidově specifických metabolických drah (u C. reinhardtii vnesen do plastidového genomu mutantní gen zajišťuj ující toleranci k atrazinu - Boyton a Gillham, Methods Enzymol., 217: , 536, 1993). U vyšší šších rostlin se nepodařilo zopakovat, a to ani za použit ití jiných herbicidů: Lutz et al. (Plant Physiol., 125: , 2001) sice získali z plastidové transformanty tabáku exprimujíci gen bar,, kódujk dující fosfinotricinacetyl transferasu (PAT) zajišťuj ující rezistenci vůčv ůči herbicidům m s účinnou látkou fosfinotricinem,, ale pouze po selekci na spektinomycinu,, která byla možná díky přítomnosti p genu aada v konstruktu. PřímáP selekce transformantů na médiu m s fosfinotricinem se nezdařila, přestop estože úroveň exprese PAT byla vysoká a dosáhla aža 7 % celkových rozpustných proteinů.

21 Selekce Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: f) Daniell et al. (Curr. Genet., 39: , 116, 2001) použili jako selekční marker gen ze špenátu kódujk dující betainaldehyd dehydrogenasu (BADH).. Tento enzym je přítomný jen v chloroplastech několika n druhů adaptovaných k zasoleným a suchým půdám. p Selekce je založena na konverzi toxického betainaldehydu (BA) tímto enzymem na netoxický betainglycin. Transformační účinnost při p i této t to selekci byl asi 25x vyšší než při i použit ití selekčního systému tvořen eného genem aada a spektinomycinem a navíc c byl celý proces transformace daleko rychlejší ší.. Nicméně dosud v jiných laboratořích nepotvrzeno!

22 Selekce Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: g) Barone et al. (J. Exptl.. Bot. 60: , 3202, 2009) použili k selekci systém m založený na genu pro alfa-podjednotku antranilátsyntasy tsyntasy necitlivé ke zpětn tné vazbě (tj. k tryptofanu) ) a na 4-methylindolu4 nebo 7-methyl7 methyl-dl- tryptophanu jako selekčních látkl tkách

23 Selekce Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: h) Kombinace vizuáln lního a selektovatelného markeru (Klaus et al., Plant J. 35: , 822, 2003) k rychlé identifikaci transplastomických segmentů na regenerované rostlině použili pigment deficientní tabák, kde knokautovaný gen byl nahrazen genem aada; ; transformační vektor pak obsahuje standardní pigmentový gen spolu s další ším selektovatelným genem.

24 Metody transformace chloroplastů:

25 Selekce Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: ch) Negativní selekce (Serino et al., Plant J., 12: , 701, 1997): využita pro prokázání funkčnosti nosti systému CRE/lox v plastidech (Corneille( et al., Plant J., 72: , 178, 2001). Selekční systém m je založen na bakteriáln lním m genu coda kódujícím cytosindeaminasu. Letalita plastidových transformantů exprimujících ch tento gen je způsobena příjmem p do média m přidanp idaného 5-fluorocytosinu,, který je cytosindeaminasou snadno konvertován n na toxický inhibitor biosyntézy pyrimidinů 5-fluorouracil.

26 Metody transformace chloroplastů: Regulační sekvence při p i transformaci plastidů a) Nejpoužívan vanější promotory v expresních kazetách: promotory plastidových genů pro 16S rrna (rrn), trna pro valin (trnv), velkou podjednotku Rubisco (rbcl), ribosomáln lní protein 16S ( (rps16)) a protein D1 reakčního centra fotosystému II ( (psba)) (Heifetz( Heifetz, Biochimie,, 82: , 666, 2000). Na všechny v promotory nasedá heteromerická RNA polymerasa kódovaná plastidovým genomem (PEP).

27 Metody transformace chloroplastů: Regulační sekvence při p i transformaci plastidů b) Regulační oblast 5 : 5 : 5 -UTR 5 nebo 5 -TCR (translation( control region), což je 5 -UTR 5 plus kódujk dující sekvence pro několik n aminokyselin z N-konce plastidového genu, která je translačně fúzovaná s kódující sekvencí vnáš ášeného genu. 5 -TCR vede ke zhruba zdvojnásoben sobení exprese transgenu,, a to díky d optimalizaci zahájen jení translace na plastidových ribosomech.

28 Metody transformace chloroplastů: Regulační sekvence při p i transformaci plastidů Např. Kuroda a Maliga (Plant Physiol., 125: , 436, 2001) translačně fúzovali kódujk dující oblast pro nptii s kódující sekvencí pro 14 prvních AK N-konce N genu rbcl.. NPTII tvořila 10,8 % všech v rozpustných bílkovin, b zatímco bez této t to 14 AK sekvence pouze 4,7 %. Zavedením m tiché mutace do této t to sekvence bylo vyloučeno, že to nebyl pouze důsledek d zvýšen ené stability fúzního proteinu. Aminokyselinové složen ení fúzního proteinu zůstalo z stejné,, ale koncentrace NPTII byla 35x nižší (0,31 %), což mohlo být způsobeno jedině dramatickým poklesem účinnosti translace v důsledku zavedené mutace. Také Ye et al. (Plant J., 25: , 270, 2001) popsali pozitivní efekt 5 -TCR sekvence na expresi plastidového transgenu,, když gen pro 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntasu (EPSPS) fúzovali f se sekvencí pro prvních 14 AK genu pro GFP, jenž je v plastidech velmi účinně translatován.. Zvýšen ení exprese fúzního genu bylo dokonce třicetinásobné.

29 Metody transformace chloroplastů: Regulační sekvence při p i transformaci plastidů c) Regulační oblast 3 : 3 : expresní kazeta zakončena regulační sekvencí 3 -UTR, která má význam především m pro stabilitu mrna.. Nejběž ěžněji se používaj vají sekvence odvozené z genů psba, rbcl a rps16.

30 Metody transformace chloroplastů:

31 Metody transformace chloroplastů: C B A

32 Metody transformace chloroplastů:

33 Metody transformace chloroplastů: Příklady úrovně akumulace rekombinantních proteinů v chloroplastech u plastidových transformantů při i použit ití Prrn promotoru a různých r 5 5 a 3 3 UTRs (Maliga, Curr. Opin. Plant Biol., 5: , 172, 2002).

34 Metody transformace chloroplastů: Transaktivace plastidových genů Někdy je žádoucí (když konstitutivní exprese transgenů vede k redukci růstu, ke zvýšen ení náchylnosti k chorobám či i dokonce k výraznému snížen ení až zastavení regenerace nebo k znemožnění selekce), aby exprese transgenů byla omezena jen na určit ité období vývoje rostliny. Pro tyto účely je ideáln lním řešením m použít t k regulaci exprese transgenů exogenně aplikované chemické aktivátory tory (Ward( et al., Plant Mol. Biol., 22: , 366, 1993; Gatz,, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: , 1997). Pro řízení exprese plastidových transgenů je možné využít t do plastidů směrovaných transaktivačních proteinů kódovaných jaderným genomem a ovládaných chemicky indukovaným promotorem. Tento systém m je ilustrován n na obr. 3 (Heifetz( Heifetz, Biochimie, 82: , 666, 2000), kde inducibilním promotorem je promotor tabákov kového genu PR-1a (pathogenesis( pathogenesis-related protein). Tento promotor je indukován n pomocí aktivátor torů typu BTH (benzothiadiazolové deriváty), což jsou látky l indukující u rostlin tzv. získanou resistenci (systemic( acquired resistance).

35 Metody transformace chloroplastů: Transaktivace plastidových transgenů 1

36 Metody transformace chloroplastů: Transaktivace plastidových transgenů 2 Surzycki et al. (PNAS 104: , 53, 2007) vyvinuli transaktivační (inducibilní)) systém m u C. reinhardtii za využit ití k mědi citlivého promotoru genu pro cytochrom c 6 a jaderně kódovaného chloroplastového ho proteinu Nac2, který specificky zajišťuje stabilizaci chloroplastové psbd mrna (kóduje protein D2 PSII), neboť funguje na její 5`UTR. Vybavíme me-li plastidový transgen 5`UTR z genu psbd,, můžm ůžeme řídit jeho expresi pomocí měďnatých iontů (protože e by se netvořil ani D2 protein a tedy ani PSII, je třeba t pro tento případ p pad vložit do plastidového transformačního vektoru i gen psbd vybavený jiným promotorem a 5`UTR5 `UTR,, např.. z genu peta). Musí se však v použít Nac2 deficientní kmen.

37 Metody transformace chloroplastů: Eliminace selektovatelných transgenů Děje se ze třít důvodů: (i) nepřijatelnost jakýchkoliv komerčně šířených GMP se selektovatelným genem pro veřejnost ejnost (ii)) nedostatek (v podstatě jen 2) spolehlivých selektovatelných genů pro transgenozi ptdna (iii)) metabolické zatížen ení rostliny s tímto t genem v případp padě jeho velmi vysoké exprese a) Delece na základz kladě homologní rekombinace mezi přímými p repeticemi ohraničuj ujícími markerový gen (Iamtham( & Day, Nat. Biotechnol.. 18: , 1176, 2000)

38 Metody transformace chloroplastů:

39 Metody transformace chloroplastů: Eliminace selektovatelných transgenů b) Transientní kointegrace markerového genu (za využit ití pigmentově deficientního plastidového mutanta, Klaus et al., Nat. Biotechnol. 22: , 229, 2004)

40 Metody transformace chloroplastů: Eliminace selektovatelných transgenů c) Excise markerového genu místnm stně specifickým rekombinačním systémem Cre/loxP (Corneille et al., Plant J. 72: , 178, 2001) z fága P1 nebo Int/attBattPattBattP (Kittiwongwattana et al., Plant Mol. Biol., 64: , 143, 2007) z fága φc31

41 Metody transformace chloroplastů: Eliminace selektovatelných transgenů

42 Metody transformace chloroplastů: Eliminace selektovatelných transgenů d) Kotransformace a následnn sledná segregace 2 různých r plastidových transformačních vektorů (jeden s markerovým genem, druhý s jiným transgenem, Ye et al., Plant Physiol., 133: , 410, 2003).

43 Příklady transformace chloroplastů: Transplastomické rostliny tabáku bez užitu ití selekce pomocí antibiotik (Daniell et al., Curr. Genet., 39: , 116, 2001). Univerzáln lní chloroplastový vektor obsahuje takové sekvence chloroplastové DNA, které jsou vysoce konzervativní a mohou být proto užity u pro transformaci chloroplastů velké řady vyšší šších rostlin.

44 Příklady transformace chloroplastů: Oba geny vytvořily operon ovládaný promotorem Prrn a regulovaný 3 UTR 3 plastidového genu psba.. Promotor obsahoval také RBS (ribosome( binding site) ) sekvenci z leaderu plastidového genu rbcl,, tj. sekvenci zajišťuj ující optimáln lní vazbu chloroplastových ribosomů. Celý proces transformace trval při p i použit ití BA měsíce, m při p použit ití spektinomycinu 3-66 měsíců. m Regenerované prýty se objevily při p i použit ití BA za 12 dní u 80 % listových disků,, (až 23 na disk), zatímco při p i druhém m způsobu selekce se prýty objevily u 15 % disků za 45 dní,, (1-2 2 na disk). Transformační účinnost byla při p i použit ití BA 25x vyšší než při použit ití spektinomycinu. Southernova hybridizace potvrdila stabilní integraci transgenů do genomu plastidů i skutečnost, že e v buňkách se vyskytovaly jen transformované plastidy. Rostliny byly fenotypově normáln lní a fertilní.

45 Příklady transformace chloroplastů: tabák k (jasně nejsnadněji ji transformovatelný) rajče e (Ruf( et al., Nat. Biotechnol., 19: , 875, 2001), brambor (Sidorov( et al., Plant J., 19: , 216, 1999), Arabidopsis (Sikdar et al., Plant Cell Rep., 18: 20-24, 24, 1998), Lesquerella fendleri (Skarjinskaia et al., Transgenic Res., 12: , 122, 2003) s daleko menší účinností lepší transformační účinnost dosažena u sóji s (Dufourmantel( et al., Plant Mol. Biol., 55: , 489, 2004), mrkve (Kumar( et al., Plant Physiol., 136: , 2854, 2004) a bavlníku (Kumar et al., Plant Mol. Biol., 56: , 216, 2004) důležitý produkční a modelový druh mechu Physcomitrella patens (čepenka odstálá) - Sugiura a Sugita, Plant J., 40: , 321, 2004

46 Příklady transformace chloroplastů: Recentně úspěšně transformovány ny locika zahradní (Lelivelt et al., Plant Mol. Biol., 58: , 774, 2005; Kanamoto et al., Transgenic Res., 15: , 217, 2006), květák (Nugent et al., Plant Sci., 170: , 142, 2006), topol (Okumura et al., Transgenic Res., 15: , 646, 2006), zelí (Liu et al., Plant Cell Rep., 26: , 1744, 2007), cukrová řepa (De Marchis et al., Transgenic Res., 18:17-30, 2009), N. benthamiana (Davarpanah et al.,, J. Plant Biol., 52: , 250, 2009), lilek (Singh et al., Transgenic Res., 19: , 119, 2010), N. sylvestris (Maliga and Svab,, 2010) nebo řepka (Cheng et al., Plant Cell Rep., 29: , Metoda transformace plastidové (chloroplastové)) DNA se pomalu stává běžným postupem používaným pro vnáš ášení cizorodých genů do genomu rostlin. Díky četným výhodám m je jíj věnována na velká pozornost, takže e se stává stále účinnější a spolehlivější ší.

47 Příklady transformace chloroplastů:

48 Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (i) Guan et al. (J. Exptl. Botany,, 59: , 3484, 2008) pomocí chitinázy BjCHI1 z Brassica juncea ukázali u transplastomického tabáku na potenciál l jejího využit ití proti řadě houbových i bakteriáln lních patogenů. (ii) Craig et al. (Transgenic Res., 17: , 782, 2008) použili δ-9- desaturázu ke změně lipidového metabolismu transplastomických rostlin (zvýšen ení podílu nenasycených MK) jak ve vegetativních tak generativních tkáních s vedlejší ším účinkem zvýšen ení odolnosti vůčv ůči i chladu. (iii) Hasunuma et al. (J. Biosci. Bioeng., 105: , 526, 2008) získali z transplastomický tabák k s nadprodukcí 1-deoxy-D- xylulosareductoisomerázy (DXR) katalyzující první krok dráhy vedoucí v plastidech k tvorbě isoprenoidů.. Transformované rostliny měly m zvýšený obsah různých r isoprenoidů jako chlorofylu a,, karotenu, luteinu atd.

49 Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (iv) Morgenfeld et al. (Mol. Biotechnol., 43: , 249, 2009) produkovali onkogenní protein E7 z HPV16 (samotný či i ve fúzi f s CP viru X bramboru) v plastidech tabáku

50 Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (v) Daniell et al. (BMC Biotechnol., 9: 33, 2009) produkovali IGF-1 protein v plastidech tabáku. Expresní úroveň dosáhla 9,5 % TSP pro nativní gen a 11,3 % pro gen syntetický.

51 Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (vi) Zhang et al. (Plant Sci., 180: 480, 2011) ukázali, že e hybridní RUBISCO složen ené z rajčatov atové velké podjednotky a tabákov kové malé podjednotky je u tabáku funkční (ryze základnz kladní výzkum). (vii)) Lee et al. (Plant Biotechnol.. J., 9: 100, 2011) popsali úspěšnou produkci retrocyklinu-101 a protegrinu-1 1 (dvou důled ležitých antimikrobiáln lních peptidů užívaných k léčběl některých bakteriáln lních i virových infekcí) ) v chloroplastech tabáku (aplikovaný výzkum).

52 Stručná historie transformace chloroplastů:

53 Příklady transformace chloroplastů: Význam pro studium biogeneze plastidů a jejich funkce (počátky replikace, RNA editing,, promotory, translační elementy, fotosyntéza za ) Vyřazov azování genů fotosyntézy nebo jejich náhrada n modifikovanými (např. ycf6, ndh geny, clpp, ) Rubisco: : celá řada prací,, ale doposud se nepodařilo vytvořit lepší variantu enzymu; nicméně výsledky přispp ispěly k prohloubení znalostí jeho funkce a regulace

54 Transformace genem E7/GUS v rámci grantu zabývajícího se produkcí proteinů lidského papilomaviru (HPV16) v rostlinách jsme přistoupili p mj. k transformaci ptdna tabáku naše e předchozp edchozí práce ukázaly (Šmahel( et al.,, 2006, Bříza B et al.,, 2007), že e samotný onkoprotein E7 je v buňkách vysoce nestabilní jeho stabilizace jsme dosáhli fúzovf zováním m s - glukuronidázou (Vlasák et al.,, 2006) pro transgenozi ptdna jsme se však v nejdříve rozhodli vyzkoušet fúzi f onkogenu E7 s genem aada (Ryba 2006), který kóduje k enzym adenosyl-3 -adenyl adenyl transferázu a slouží tedy při p i plastidové transformaci jako gen selekční (rezistence ke spektinomycinu)

55 Transformace genem E7/GUS celkem bylo získz skáno z 20 střel 8 rostlin, které regenerovaly na selekčním m médiu m RMOP s 500 mg/l spektinomycinu (Svab et al.,, 1990) po provedené analýze pomocí PCR se ukázalo, že e 7 z nich je transplastomických (zbývající rostlina byla zřejmz ejmě spontánn nní specifický mutant v genu pro 16S rrna) RT-PCR prokázala přítomnost p specifické mrna odpovídaj dající svojí velikostí fúznímu genu ve všech v 7 rostlinách westernová hybridizace za použit ití monoklonáln lní protilátky tky HPV16-E7 však v opakovaně neprokázala přítomnost p fúzního proteinu zdá se tedy, že e protein E7 je v chloroplastech i ve fuzi se selekčním m proteinem aada velmi nestálý

56 Transformace genem E7/GUS když se ukázala nestabilita proteinu E7/aadA aada,, použili jsme k transformaci ptdna fúzní gen E7/GUS,, jehož produkt byl po jaderné transformaci rajčete a bramboru stabilní (Bříza et al., 2007) transformační vektor obsahoval mezi sekvencemi plastidové DNA z oblasti sousedících ch genů rpob a trnc v oblasti LSC (integrační místo č.. 3) fúzní gen E7/GUS s promotorem z genu pro 16S rrna a s terminační sekvencí z genu rbcl z Chlamydomonas reinhardtii a gen aada se stejnými regulačními sekvencemi

57 Transformace genem E7/GUS

58 Transformace genem E7/GUS PCR: primery P1+P2 PCR: primery P3+P4

59 Transformace genem E7/GUS SB: sonda rpob SB: sonda GUS

60 Transformace genem E7/GUS RT-PCR: E7/GUS RT-PCR: aada

61 WB: antigus Transformace genem E7/GUS

62 Transformace genem E7/GUS výsledkem je získz skání 6 homoplasmických rostlin nesoucích ch pouze gen E7/GUS,, jedné rostliny pouze s genem aada a jedné rostliny nesoucí v její ptdna buď oba geny v původnp vodní konfiguraci nebo pouze fúzní gen E7/GUS fúzní protein E7/GUS však, zdá se, ani v tomto případp padě nevzniká,, detekován n byl pouze protein GUS