Klonování gen a genové inženýrství

Transkript

1 Klonování gen a genové inženýrství

2 Genové inženýrství užite né termíny Rekombinantní DNA = DNA, ve které se nachází geny nejmén ze dvou zdroj, asto ze dvou zných druh organism Biotechnologie = manipulace s organismy nebo jejich sou ástmi za vzniku užite ného produktu Plasmid = malá kruhová DNA, nacházející se v bakteriích. Plasmid není sou ástí bakteriálního chromosomu Vektor = molekula DNA, která je schopna dopravit cizí DNA do bu ky a replikovat ji zde. Vektorem m že být plasmid

3 Klonování DNA

4 Klonování DNA 1. Isolace plasmidu z bakterie a isolace genu, který nás zajímá z genomu jiného organismu 2. Vložení genu do plasmidu 3. Vrácení plasmidu do bakterie 4. každým rozd lením bakterie dojde rovn ž k replikaci plasmidu a tím i genu Využití: bu za ú elem genového produktu (insulin, r stový hormon), nebo za ú elem namnožení samotného genu

5 Restrik ní analýza

6 Restrik ní enzymy V p írod tyto enzymy chrání bakterie proti cizorodé DNA, pronikající do bu ky, typicky proti virové DNA Umí št pit DNA, = provád t její restrikci Št pí DNA na ur itých, specifických místech, o délce obvykle 4 8 nukleotid, asto symetrických, nap. GAATTC (= enzym EcoR1). Protože se toto místo nachází náhodn na mnoha místech cizí DNA, prob hne v nich št pení Vlastní bakteriální DNA je na restrik ních místech chrán na proti št pení p idáním metylové skupiny na adeniny a cytosiny

7 Restrik ní enzymy

8 EcoR1 Restrik ní endonukleázy

9 Restrik ní enzymy Protože dochází ke št pení pouze v konkrétních restrik ních místech, i mnoho kopií stejné DNA poskytne tytéž restrik ní fragmenty Restrik ní fragmenty jsou št peny tak, že vzniknou tzv. kohezní konce (sticky( ends)

10 Restrik ní enzymy Kohezní konce (sticky ends) Kohezní konce budou tvo it vodíkové vazby s jinými restrik ními fragmenty, vzniklými p sobením téhož restrik ního enzymu Enzym DNA ligáza (nám známý z kapitoly o replikaci DNA) vytvo í fosfodiesterové kovalentní vazby

11 Klonování gen do plasmid

12 Klonování eukaryotického genu do bakteriáln lního plasmidu 1. Isolace vektoru a genu, o který máme m me zájemz V našem p ípadp pad pochází plasmid z E. coli a obsahuje Gen amp R zajiš uj ující resistenci proti antibiotiku ampicilínu Gen lacz,, kódujk dující enzym -galaktozidázu,, která katalyzuje št pení cukru laktózy Jediné restrik ní místo dané restriktázy zy,, které se nachází uvnit genu lacz

13 Klonování eukaryotického genu do 2. Inserce DNA do vektoru bakteriálního plasmidu Plasmid i lidskou DNA našt píme restriktázou: enzym rozšt pí plasmid na jediném míst v lacz genu a lidskou DNA na mnoha místech. Jeden restrik ní fragment z nich bude obsahovat i náš gen

14 Klonování eukaryotického genu do 2. Inserce DNA do vektoru bakteriálního plasmidu Vznikne pochopiteln mnoho útvar : dva plasmidy slepené k sob, plasmid s n kolika kusy DNA, re-formovaný plasmid atd. Díky náhod ale vznikne i plasmid obsahující gen našeho zájmu, jak ukazuje obrázek

15 Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 3. Vrácení vektoru do bakterie Tzv. transformací se plasmidy vrátí do bakterie Tyto bakterie jsou p edem upraveny tak, že mají lacz - mutaci = neumí hydrolyzovat laktózu

16 Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 4. Klonování bakteriálních bun k ( a plasmid v nich) Bakterie jsou vloženy na živné médium obsahující ampicilin a cukr zvaný X-galX gal. Každá reprodukující se bakterie nakonec vytvo í kolonii viditelnou pouhým okem

17 Klonování eukaryotického genu do bakteriáln lního plasmidu 4. Klonování bakteriáln lních bun k k ( a( plasmid v nich) Vyrostlé kolonie budou ur it it obsahovat plasmid,, nebo v médiu m je antibiotikum ampicilin,, které ostatné bakterie zahubí Cukr X-galX je hydrolyzován -galaktosidázou za vzniku mod e e zbarvených bakteriáln lních kolonií Pokud ale baktérie nemá funk ní gen lacz, kolonie budou bíle b zbarvené ty nás n s zajímaj mají

18 Klonování eukaryotického genu do bakteriáln lního plasmidu 4. Klonování bakteriáln lních bun k k ( a( plasmid v nich) Tímto zp sobem ovšem získz skáme kolonie bakterií,, obsahujících ch mnoho a mnoho r zných fragment lidské DNA, nejen ten, o který nám n m jde Následuje nejt ž žší krok: rozeznat kolonii bakterií,, která obsahuje v plasmidu gen našeho zájmuz

19 Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 5. Identifikace klonu nesoucí gen našeho zájmu žeme hledat bu gen sám nebo jeho proteinový produkt Pokud víme, jakou sekvenci gen obsahuje, použijeme metodu hybridizování nukleových kyselin (nucleic( acid hybridization) za užití krátké jednovláknové DNA, která je komplementární ke známé sekvenci genu. Tato DNA se nazývá nucleic acid probe.

20 Klonování gen do plasmid

21 Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 5. Identifikace klonu nesoucí gen našeho zájmu Próbu ozna íme radioaktivním isotopem nebo fluorescen ním barvivem

22 Identifikace klonovaného genu ležitým krokem je denaturace bakteriální DNA. Provádí se bu teplem, nebo chemicky. i následné renaturaci se próba naváže ke hledanému genu, je-li p ítomen

23 Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 5. Identifikace klonu nesoucí gen našeho zájmu Pokud bu ky p ekládají hledaný gen do proteinu, m žeme detekovat p ímo protein A to bu specifickými protilátkami Nebo za pomoci jeho enzymatické aktivity

24 Klonování a exprese eukaryotických gen Klonovaným gen m chybí bakteriální promotor Bakteriální geny nemají introny a bakterie tedy postrádají aparát schopný sest ihu. Tomuto problému elíme vytvo ením tzv. cdna Mnoho eukaryotických protein funguje až po posttransla ních úpravách idání sacharidové složky atd.

25 cdna Nejprve pot ebujeme získat z eukaryotické bu ky již hotovou, sest iženou mrna Tuto mrna isolujeme a za pomocí reverzní transkriptázy vytvo íme komplementární vlákno DNA a v následujcícím kole replikace dvoušroubovici DNA Tato DNA je zvána komplementární DNA, neboli cdna

26 cdna