Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

Transkript

1 Příprava vektoru IZOLCE PLSMIDU LKLICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLCE DN E. coli plasmidová DN proteiny proteiny + + vysrážená plasmidová lyze buňky + snížení ph chromosomální DN centrifugace DN chromosomální ph 12< (renaturace) + DN (denaturace) chromosomální DN + buněčné zbytky membrána supernatant bakteriálního lyzátu vazba DN promývání eluce DN čistá plasmidová DN RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZ restrikční místo neštěpený vzorek štěpený vzorek OC L štěpení DN CCC restrikčním enzymem

2 Příprava inzertu IZOLCE ROSTLINNÉ DN PCR amplifikace DN 5 primer F DN lokus 3 3 primer R 5 lyze Taq polymeráza homogenizace denaturace C annealing C extenze 72 C dsdn primer F DN lokus primer R kolonková izolace DN PCR produkt (dsdn) IZOLCE MPLIKONU Z GELU separace amplikonů: gelová elektroforéza vyříznutí vybraného amplikonu z gelu kolonková izolace DN

3 T klonování a transformace bakterií LIGCE T klonování TRNSFORMCE TEPELNÝM ŠOKEM fragment DN E. coli ligáza/ topoizomeráza I lacz gen molekula CaCl 2 + teplotní šok rekombinantní 4 C/5 min. vektor DN 42 C/30 s 4 C/2 min. gen antibiotické rezistence Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ transport plasmidu do hostitelské buňky neúspěšná transformace transformace plasmidu s inzertem transformace plasmidu bez inzertu selekce buněk: detekce inzertu růst v přítomnosti antibiotika na základě modrobílého testu

4 Modrobílý test () Vektor bez vloženého inzertu klonovací místo (MCS = multiple cloning site) promotor operátor lacz další geny kultivace na LB médiu s ampicilinem, Xgal, IPTG RNpolymeráza represor mrn βgalaktosidáza IPTG XGal buňky s plasmidem bez inzertu (B) Vektor s vloženým inzertem klonovací místo narušení exprese βgalaktosidázy promotor operátor lacz další geny RNpolymeráza represor vložený inzert buňky s plasmidem s inzertem mrn βgalaktosidáza IPTG XGal inzert, který nenarušuje čtecí rámec

5 Imunodetekce proteinů PŘÍPRV VZORKU redukční činidlo (např. βmerkaptoethanol, HS SS dithiotreitol) SH lyze SDS buňky, tkáně tepelná denaturace v přítomnosti SDS TRNSFER PROTEINŮ SDSPGE IMUNODETEKCE N MEMBRÁNU enzym primární protilátka rozeznává protein filtrační papír rozdělené proteiny gel membrána enzymem značená sekundární protilátka substrát filtrační papír rozeznává primární protilátku produkt chemiluminiscence

6 Příprava rekombinantního proteinu příprava vektoru příprava inzertu E. coli restrikční endonukleáza izolace vektoru vektor/ plasmid lyze homogenizace selekční znak cdn kolonková ligace izolace RN vektor/ plasmid izolovaná RN cdn reverzně transkripční PCR E. coli transformace regenerace, selekce transformantů izolace proteinů detekce proteinů

7 Transgenní zvířata injekce cizorodé DN do jednoho z projader projádra fertilizovaný myší oocyt před fúzí samčího a samičího projádra přenos injikovaných oocytů do pěstounských matek přibližně % potomstva obsahuje injikovanou cizorodou DN cizorodá DN je přítomna ve stejném množství ve všech tkáních myši, které exprimují cizorodou DN jsou rozmnožovány a tak se rekombinantní DN přenáší v zárodečné linii

8 Knockoutované myši injekce embryonálních zárodečný buněk do dutiny blastocoelu časného embrya chirurgický přenos embrya do pseudopregnantní myši chimérické potomstvo homozygotní bílé potomstvo křížení chimérické myši s myší homozygotní černé potomstvo, které vzniklo z linie pohlavních buněk odvozených z embryonálních zárodečných buněk a je heterozygotní v poškozeném genu X

9 Formy buněčné smrti preautofagozomální struktura svraštění buňky a rozpad cytoskeletu lysozóm pyknóza chromatinu autofágní měchýřky lyze buňky autolysozóm fragmentace buňky a jádra apoptotická tělíska autolysozóm NEKRÓZ POPTÓZ UTOFÁGIE

10 poptóza při vývoji mnohobuněčných organismů Vyřezání buněk Odstranění struktur Odstranění nebezpečných nebo poškozených buněk Nastavení počtu buněk

11 Molekulární signalizace v buňce přímým kontaktem dutým spojem synaptická endokrinní parakrinní krevní řečiště autokrinní: jedna signální buňka autokrinní: skupina signálních buněk

12 Southernův přenos () Přenos DN z gelu na membránu DN standard štěpená DN filtrační papír nylonová membrána gel pufr nylonová membrána agarózový gel podložka (B) Hybridizace DN sonda hybridizační pruhy nylonová membrána autoradiograf

13 Modely replikace podle MeselsonStahlova experimentu původní (rodičovské) konzervativní disperzní semikonzervativní molekuly DN původní DN ( 15 N) nová DN ( 14 N) nové (dceřiné) molekuly DN reálný výsledek očekávané 1 zóna centrifugační zóny druhá generace molekul DN očekávané centrifugační 2 zóny zóny