MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2012 Bc. NELA DAŇKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Vliv strigolaktonu na větvení stonku rostlin a polární transport auxinu Diplomová práce Vedoucí práce: Mgr. Vilém Reinöhl, CSc. Vypracovala: Bc. Nela Daňková Brno 2012

3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv strigolaktonu na větvení stonku rostlin a polární transport auxinu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

5 PODĚKOVÁNÍ Tímto chci vyjádřit své upřímné poděkování vedoucímu mé diplomové práce Mgr. Vilému Reinöhlovi, CSc. za odborné vedení a cenné rady při zpracování mé práce. V neposlední řadě patří můj velký dík Ing. Petru Kalouskovi, Ph.D. za jeho obětavou pomoc při praktické realizaci experimentů., vstřícnost a cenné připomínky, kterých si velmi vážím. Chtěla bych také poděkovat PhDr. Aleně Daňkové nejen za pomoc s jazykovými úpravami, ale i za podporu při psaní této práce.

6 Abstrakt Pro studium působení rostlinného hormonu strigolaktonu v procesu větvení stonku rostlin a jeho vlivu na polární transport auxinů byly použity 7denní rostliny hrachu setého (Pisum sativum L.) cv. Vladan. Analýzou exprese genů PIN1 a DRM1 na transkripční úrovni v 2. axilárním pupenu bylo zjištěno, že v případě intaktních rostlin vede působení syntetického analogu strigolaktonu GR24 ke snížení exprese genu PIN1 kódujícího výstupní přenašeč auxinu i genu DRM1, který slouží jako marker inhibovaného stavu pupenů. V případě exprese PIN1 u dekapitované 1hodinové varianty ošetřené GR24 došlo ke zvýšení a u 6hodinové varianty ke snížení. Úroveň exprese genu DRM1 měla u intaktních i dekapitovaných rostlin obou časových variant po působení strigolaktonu klesající charakter. Metodou imunocytolokalizace byly detekovány PIN1 proteiny umístěné na bazální straně cytoplazmatické membrány buněk 6 hodin po dekapitaci. Získané výsledky naznačují, že krátkodobým působením strigolaktonu (do 1 hodiny) se výtok auxinu z buněk zvyšuje, což dokazuje intenzivnější PIN1 signál v pupenu. K opačné situaci dochází po dlouhodobějším působení strigolaktonu, kdy je signál PIN1 proteinů zeslaben, a pupen je tak částečně inhibován ve svém růstu. Klíčová slova: strigolakton, větvení stonku, PIN1, DRM1, polární transport auxinu Abstract To study the influence of strigolactone on stem branching and polar auxin transport 7- day old plants of field pea (Pisum sativum L.) cv. Vladan have been used. Analysis of expression of DRM1 and PIN1 genes at the transcriptional level in the 2 nd axillary bud revealed that in the case of intact plants treated with synthetic analogue of strigolactone - GR24 reduced the expression of PIN1 encoding an auxin efflux carrier, and of DRM1 marker of bud inhibition. In 1 hour decapitated GR24 treated variant PIN1 expression was increased and in 6-hour variant reduced. The level of DRM1 gene expression had decreasing character in decapitated and intact plants in both time variants after application of strigolactone. By immunocytolocalization PIN1 protein located on the cytoplasmic membrane at basal end of cells were detected 6 hours after decapitation. The results suggest that short-term effects of strigolactone (until 1 hour) cause enhanced auxin export from the cells, as evidenced by increased PIN1 signal in the bud. The opposite situation occurs after long-term effects of strigolactone when the signal of PIN1 proteins is decreased and the bud is partially inhibited in its growth. Keywords: strigolactone, shoot branching, PIN1, DRM1, polar transport of auxin

7 OBSAH 1 ÚVOD SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ Vývoj stonku a stonkový apikální meristém Větvení stonku Apikální dominance Růstové regulátory Auxiny Hormonální regulace AD Vliv auxinu Historie Podpora a inhibice růstu Transport auxinu Polární transport auxinu Sekundární poslové Cytokininy Strigolakton Kontrola axilárního větvení stonku na genetické úrovni MATERIÁL A METODY Rostlinný materiál Příprava rostlinného materiálu Ošetření rostlinného materiálu Odběr rostlinného materiálu Studium interakce auxinu a strigolaktonu - imunocytolokalizace PIN1 proteinu Fixace Odvodnění vzorků Zalití vzorků do parafínu Řezání vzorků a přilnutí na podložní sklíčko Odparafinování a dehydratace vzorků Blokování Navázání 1. protilátky Blokování a navázání 2. protilátky Přidání zalévacího média a mikroskopování Studium exprese genů Příprava a odběr materiálu Izolace RNA Stanovení koncentrace RNA Semikvantitativí PCR Reverzní transkripce Semikvantitativní polymerázová řetězová reakce (PCR) Elektroforéza a detekce genů VÝSLEDKY Stanovení růstových křivek Exprese genů Imunocytolokalizace PIN1 proteinu DISKUSE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 54

8 1 ÚVOD Rostlinné organismy jsou z morfologického hlediska poměrně jednoduché, avšak mají jedinečné fyziologické, vývojové i reprodukční procesy. Složitost a výjimečnost jejich molekulárně-genetických dějů, které jsou podobně komplexní jako u živočichů, je dána skutečností, že jejich genom je tripartitní. Genetická informace je přítomna nejen v jádře a mitochondriích, ale i v chloroplastech. Při ontogenezi rostliny dochází k mnohým změnám. Ty, které jsou na molekulární, genetické či biochemické úrovni, nelze okem pozorovat, avšak právě ony vyúsťují až k fenotypovému projevu, který lze okem rozlišit. Během vývoje rostliny, který je charakterizován jako časový sled růstových a diferenciačních změn, dochází k utváření stavby jejího těla. Habitus rostliny může být velmi rozmanitý a jeho konečnou podobu může zásadním způsobem ovlivnit schopnost větvení stonku. K větvení stonku dochází, vytváří-li rostlina více axilárních výhonů. Fenotyp obvykle odpovídá zdraví a výnosu rostliny. Zvýšení větvení stonku může vést k většímu objemu rostlinné biomasy a produkci více plodů a semen. Přítomnost více axilárních větví je žádoucí hlavně u obilnin a také u rýže, u kterých přímo souvisí se zvýšením výnosu. Stejně tak i u ovocných dřevin a révy vinné provádíme speciální způsoby řezu vedoucí k co nejvyšší produkci plodů. Oproti tomu u odrůd kukuřice se provádí selekce na nízký počet axilárních větví. Zvýšení výnosu můžeme dosáhnout genetickou modifikací, která by vedla ke změně počtu větví rostliny, anebo změnou dalších procesů souvisejících s růstem a vývojem rostliny. Vznik axilárních větví je regulován složitými interakcemi mezi geneticky podmíněnými vývojovými procesy a vlivy prostředí. Navození procesu větvení může být také do jisté míry dosaženo zvýšením množství používaných umělých hnojiv. Nicméně množství použitých hnojiv není přímo úměrné výši výnosu. Plané rostliny mají omezenou schopnost metabolizovat a beze zbytku využít tyto uměle aplikované anorganické živiny. Aplikace velkého množství umělých hnojiv, jehož výsledkem by byla vyšší tvorba postranních větví na rostlině, zahrnuje určité problémy. Jde nejen o nutnost zvýšení přiváděného množství hnojiv, která jsou pro farmáře finančně náročná, ale také především dochází k hromadění nevyužitých průmyslových hnojiv v půdě a ta pak mohou znečišťovat spodní vodu. Optimálním řešením se zdá být používání rozumného množství živin a genetické manipulace vedoucí ke změně počtu stonkových větví. Takto 8

9 můžeme získat požadovaný tvar rostliny, který povede k maximalizaci výnosu u zemědělsky významných plodin. To však vyžaduje intenzivní výzkum a následné porozumění mechanismům a biosyntetických drah, které se podílejí na regulaci rostlinné architektury (Pua & Davey, 2010). V průběhu 20. století byl intenzivně studován růst rostlin, nejprve se prováděly jednoduché experimentálně morfologické pokusy, na základě kterých pak byly dokázány a vysvětleny mnohé zákonitosti v růstu a vývoji rostlin a postulovány různé teorie. Později se výzkum díky rozvíjejícím se technologiím a možnostem provádění exaktnějších pokusů obrátil i na využívání genetických metod. Následně byly klasické metody genetiky a šlechtění rostlin rozšířeny o techniky genetických manipulací. Ty se obecně provádějí in vitro a jejich podstatou je modifikace rostlinného genomu. Patří sem genového inženýrství, které zahrnuje vnášení klonovaných genů a jehož rozvoj přinesly především objevy bakteriálních restrikčních endonukleáz, DNA-polymeráz, ligáz a reverzních transkriptáz. Díky metodám genového inženýrství lze studovat a modifikovat fyziologické a morfologické procesy v rostlinných organismech. Exprese rostlinných genů je řízena na úrovni transkripce a translace a je závislá na posttranskripčních a posttranslačních modifikacích, proto se výzkum orientoval na snahu izolovat a identifikovat v rostlinném genomu geny a jejich transkripční a translační produkty. Začaly se hojně využívat metody jako polymerázová řetězová reakce (PCR), polymorfie délky restrikčních fragmentů (RFLP) využívaná k vytvoření vazebných map či srovnávání příbuznosti genomů nebo metoda náhodně amplifikované polymorfní DNA (RAPD) umožňující mapování genomu. Dále jsou nepostradatelné metody reverzní transkripce (RT- PCR), využití nachází například při identifikaci genů odpovědných za změněný fenotyp nebo při studiu specifické genové exprese v různých pletivech a orgánech za použití techniky srovnávání radioaktivně značených produktů amplifikované DNA, která je vytvořená z templátů cdna připravených právě reverzní transkripcí z populace izolovaných mrna s polyadenylovanými konci. Také konstrukce cdna knihoven z populací izolovaných mrna a jejich subatrakční hybridizace, při které jsou srovnávány cdna-klony připravené z různých genotypů nebo orgánů, umožňují izolovat geny, které jsou známé pouze svým fenotypovým projevem (Procházka et al., 1998). Významným nástrojem pro studium funkce a mechanizmu účinků fytohormonů se staly genetické přístupy využívající rostlinné mutanty, kteří obvykle mají pozměněnou biosyntézu některého hormonu nebo signální dráhu tohoto hormonu. K izolaci mutantů a genů je 9

10 využívána radiační a chemická mutageneze, mobilní genetické elementy a metody transgenoze (Vyskot, 1999). Konstrukce transgenních rostlin nemá význam pouze ve šlechtění, ale je cenným nástrojem výzkumu při studiu struktury a stability genomu, regulace genové exprese, izolaci genů i při analýze molekulárních mechanizmů vývoje a metabolizmu rostlin (Procházka et al., 1998). Díky technologiím genetického mapování a reverzní genetice bylo dosaženo významného pokroku vedoucího k porozumění mechanismům odpovědným za iniciaci a vývoj axilárního meristému. Reverzní genetika umožňující určení fenotypu prostřednictvím ztráty funkce genu přináší usnadnění v identifikaci genů, které dávají vznik rozdílným fenotypům s různým typem větvení. Geny, které byly identifikovány pomocí těchto technologií, vykazují rozdílný stupeň regulačních vztahů se známým mechanismem větvení a kódují produkty účastnící se hormonální mobilizace genové transkripce, navázání ubikvitinu na protein nebo degradačních drah (Pua & Davey, 2010). Ward & Leyser (2004) uvádí, že techniky roubování a klasické fyziologické přístupy jsou úspěšné v kombinaci s metodami molekulární genetiky a transgenoze. Tento trend bude bezpochyby pokračovat spolu s využitím nových vysoce výkonných genomických postupů, jako jsou metody sekvenování či genetické mapování. 10

11 2 SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ 2.1 Vývoj stonku a stonkový apikální meristém U některých dvouděložných rostlin je růst stonku zastaven, jakmile rostlina dosáhne svého geneticky predeterminovaného tvaru a velikosti, anebo v opačném případě může stále pokračovat v růstu během celého života. Všechny nadzemní části rostliny (listy, větve, stonek a květy) jsou produktem stonkového apikálního meristému (SAM). Proto pochopení rostlinného vývoje a architektury rostliny vyžaduje studium procesů odehrávajících se v apikálním meristému. Meristémy stonku i kořene jsou skupiny buněk, které si zachovaly svůj embryonální charakter a schopnost aktivního buněčného dělení, mohou tedy pokračovat ve tvorbě nových sektorů kořene a stonku. Proto mohou rostliny na rozdíl od většiny živočichů růst v průběhu celého života. Meristémy tvoří zduřeniny nody, které se opakují v pravidelných intervalech a posléze se vyvinou v listy, větve nebo květy. Meristém je zakryt listovými primordii, a tvoří tak pupen. Apikální stonkový meristém vytváří v průběhu vegetativního růstu fytomery, což jsou opakující se stonkové jednotky (obr. 1). Fytomery zahrnují listové a stonkové části a axilární pupeny a mohou se lišit svojí velikostí, délkou internodia a typem orgánu vznikajícího v úžlabí pupene v závislosti na jejím umístění na těle, stádiu vývoje rostliny a vnějším prostředí. Obr. 1: Schéma základní jednotky vegetativního prýtu s apexem - fytomery (Howell, 1998). 11

12 Rostlinný stonkový systém je odvozen z primárního stonkového apikálního meristému (SAM), který se utváří již během embryogeneze (Obr. 2). Základní funkcí SAM je vlastní udržování meristému, tvorba základů listů a axilárních meristémů. Stonkový apikální meristém obsahuje centrální zónu, ve které je udržována populace meristematických buněk, a periferní zónu, kde dochází k organogenezi listových primordií. Tvorba axilárních meristémů pak probíhá v úžlabí každého listu na bázi jeho řapíku. Může se zde začít utvářet také jeden či více sekundárních axilárních pupenů. Obr. 2: Příčné schéma struktury prýtového apikálního meristému krytosemenné rostliny (McSteen & Hake, 1998). 2.2 Větvení stonku Nejen v poslední době se výzkum soustředil na studium větvení stonku rostlin. Vytvářením více stonků a bohatším rozvětvováním hlavního stonku rostliny nebo naopak přítomností pouze jednoho stonku se ovlivní nejen celková konstituce a vzhled rostliny, ale má to význam i z hlediska stability rostliny, přizpůsobení se nepříznivým podmínkám, zlepšení orientace ke světelnému zdroji a v konečném důsledku u plodin i pro velikost výnosu, což je důležité pro praktické využití u zemědělsky využívaných plodin. Rostlinný organismus je odkázaný na jedno stanoviště, kde se nachází po celý život. Proto je možnost změny orientace růstu a větvení stonku velkou výhodou, ocitne-li se rostlina například na zastíněném místě. 12

13 Obecně větvení stonku probíhá tak, že se axilární pupeny vzniklé z axilárního meristému umístěné v úžlabí listů, ve spoji mezi listem a stonkem, se začnou vyvíjet a vyrůstat v nové větve či květy (Ongaro & Leyser, 2008). Proces, kdy dochází k větvení stonku, je důležitý pro determinaci tvaru rostliny. Poté, co jsou vytvořeny pupeny, dojde k vývojovému rozhodnutí uvnitř rostliny, zda bude pokračovat vývoj pupene a vznikne nová větev, nebo zda dojde k inhibici růstu v důsledku apikální dominance. Toto rozhodnutí vzniká na základě signálů přijatých z vnějšího prostředí a také signálů endogenní povahy (Ongaro & Leyser, 2008). Mechanismus regulace větvení stonku zahrnuje účinky a interakce mezi rostlinnými hormony, minerálními látkami, vodou, světlem a gravitační silou. Při studiu procesu kontroly iniciace větvení stonku byla vytvořena mutantní rostlina Arabidopsis s nefunkčním transkripčním faktorem Terminal Flower 1 (TFL1), která měla již v juvenilních stádiích determinovaný meristém, a vyznačovala se tedy brzkým kvetením (Shannon & Meeks-Wagner, 1991). TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) izolovaný z Arabidopsis je jeden z klíčových genů hrající roli v regulaci tvaru rostliny a jeho funkcí je udržování meristému. K jeho expresi dochází subapikálně v meristému a je nezbytný pro negativní regulaci genů meristémové identity v meristému květenství. Vývojová blokáda vývinu květenství je důležitá například u brukvovitých plodin květáku a brokolice z důvodu vhodného využití v potravinářství. Transkripční faktor TFL1 tedy ovládá růst fytomer zadržením exprese genů květní identity jako LEAFY (LFY) a APETALA1 (AP1), a tudíž ponechává více času pro iniciaci a růst vegetativních axilárních pupenů (Ratcliffe et al., 1999). Axilární meristém má stejný vývoj jako primární stonkový apikální meristém (SAM) a každý může dát vznik dalšímu sekundárnímu stonku - větvi. Obvykle se vytvoří jen několik listových primordií obklopujících axilární meristém před tím, než dojde k zadržení vývoje inhibičními vlivy a následné dormanci axilárních pupenů. Pupeny se mohou později reaktivovat, a začít tak vytvářet větve. Tato flexibilita v činnosti axilárního meristému je příčinou možných pozdějších změn ve stonkové architektuře, a dovoluje tak rostlině prostřednictvím změny stavby adaptaci na environmentální podmínky (Ongaro & Leyser, 2008). Už velmi dlouho je známo, že je-li odstraněn rostoucí vrchol primárního, řídicího stonku rostliny, jsou axilární pupeny na stonku pod ním iniciovány k růstu. Dekapitace vede k aktivaci axilárního pupenu a tím k růstu nového výhonu. A naopak, je-li vrchol přítomný, nedochází k vývoji axilárních pupenů v důsledku inhibice (Thimann & Skoog, 1933). 13

14 Laterální pupen může být také inhibován růstem jiného bočního pupene, který převzal roli dominantního vrcholu. Iniciace axilárního větvení a vývoje je složitý proces, který je kontrolován určitými geny. Identifikace genů ovládajících tento proces je klíčová. Určené geny lze poté využít při změnách architektury rostliny za účelem zvýšení výnosu plodin. Mnoho genů souvisejících s iniciací axilárního větvení bylo objeveno na základě studia fenotypových efektů mutací s již určenými geny. Avšak v některých případech byl zaznamenán nepřímý vztah mezi těmito geny a mechanismem axilárního větvení. Nicméně výzkum se stále soustřeďuje na objasnění funkcí, které tyto geny mají v ovládání procesů větvení, a také na další faktory, které jsou těmito geny ovlivňovány. Například nedávno objevené geny byly určeny prostřednictvím změněných transkripčních a hormonálních drah jako jsou MAX signální dráha u Arabidopsis, karotenoidová dráha či dráha AXR1/AFB související s biosyntézou cytokininů (Pua & Davey, 2010). 2.3 Apikální dominance Růstový jev, při kterém nedochází k rozvětvování stonku, je tedy znám jako apikální dominance, hlavní stonek je dominantní a inhibuje růst axilárních pupenů. Snow (1929) se jako jeden z prvních zabýval studiem přenosu inhibičního signálu z apexu, stonkem dolů a vstupem do pupenů. Zjistil, že původcem signálu je mladý rostoucí list. K tomuto zjištění přišel pozorováním, že odstranění nově se vyvíjejícího listu z apexu vede k iniciaci růstu pupenů, které jsou umístěny pod vrcholem. Je obecně známo, že je-li porušen vliv apikální dominance odstraněním vrcholu rostliny, jsou laterální pupeny vymaněny z inhibice, což vede k postupnému rozvětvování rostliny (Leyser, 2005). Během počátečního intenzivního výzkumu apikální dominance prováděl Snow mnoho experimentů pro její objasnění. U modelu hrachu a fazolu pozoroval, že po dekapitaci hlavního stonku je aktivován axilární meristém v kotyledonech a dochází k růstu dvou výhonů. V některých případech po počátečním rovnoměrném růstu obou větví dochází k nadvládě jedné větve a inhibici větve druhé. Tento podřízený stonek může být znovu iniciován k růstu odstraněním dominujícího stonku (Snow, 1929). Stonkové větvení má důležitou úlohu při vytváření velkého množství rozmanitých tvarů rostlin, protože stupeň apikální dominance se liší v závislosti na druhu rostliny. U různých druhů rostlin se tedy vyvinul rozdílný stupeň apikální dominance stonku. Hrách setý (Pisum 14

15 sativum) patří mezi druhy se silnou apikální dominancí, kdy vrcholový pupen udržuje v růstové inhibici ostatní pupeny. Oproti tomu existují druhy jako bytel metlovitý (Kochia scoparia), u nichž nebyla zaznamenána žádna nadvláda vrcholu nad postranními větvemi (Procházka et al., 1997). Složitost typu větvení závisí také na stáří rostlinného organismu. Obecně platí, že starší rostliny vykazují slabší apikální dominanci, jejímž výsledkem je rozvětvenější tvar rostliny, který vede ke zvýšení počtu listů a květů a následně k vyššímu počtu plodů (Shimizu-Sato et al., 2009). 2.4 Růstové regulátory Růst byl dříve vysvětlován tak, že jeho podstata je pouze ve výživě rostliny. Ale už v 19. století vyslovil domněnku o existenci chemických signálů Julius von Sachs (Procházka et al,. 1998). Rostliny v různých částech svého těla a v určitých fázích vývoje vytvářejí několik skupin morfogenních látek, které se označují jako regulátory růstu nebo rostlinné hormony. Existuje pět základních skupin fytohormonů, kam patří auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselina abscisová a etylen. Dalším výzkumem se zjistilo, že je jich mnohem více. Následně byly popsány další látky, které mají vlastnosti signálních molekul a působí v rostlině v nízkých koncentracích - brassinosteroidy, jasmonáty, polyaminy, kyseliny salicylová, oligosachariny a systemin. Mezi přirozené rostlinné metabolity hormonální povahy byl zařazen i nedávno objevený strigolakton (Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008). Pomocí těchto tzv. morfogenů mohou rostlinné orgány mezi sebou navzájem komunikovat. Gradienty morfogenů mohou existovat v prostoru i v čase. Časový gradient morfogenního signálu může aktivovat nebo reprimovat odlišné geny podle své okamžité koncentrace. Pokud hladina morfogenu klesne pod určitou hodnotu, může dojít k zapnutí nebo naopak vypnutí exprese různých genů. Malé molekuly hormonů, pro které je charakteristické působení ve velmi nízkých koncentracích, se šíří uvnitř rostlinného těla, kde se vážou na membránové nebo cytoplazmatické proteinové receptory a zprostředkovávají další přenos signálu. Jejich účinky jsou pleiotropní, mají řadu biologických funkcí a fenotypových efektů a často působí navzájem synergicky nebo antagonicky. 15

16 2.4.1 Auxiny Jeden z nejvýznamnějších a nejdéle známých přirozených auxinů je kyselina indolyl- 3-octová (IAA). V rostlinách se kromě IAA vyskytuje celá řada indolových sloučenin a derivátů, mezi které patří prekurzory, degradační produkty a konjugáty IAA. Dalšími přirozenými auxiny jsou např. kyselina indolyl-3-máselná (IBA) a 4-chlor-IAA a kyselina fenyloctová (PAA). Také bylo nalezeno mnoho syntetických analogů auxinů, jako jsou: kyselina indolyl-3-propionová (IPA), kyselina α-naftyloctová (NAA) či 2,4- dichlorfenoxyoctová (2,4-D). Biosyntéza IAA vychází z aminokyseliny L-tryptofanu a poté se může uskutečňovat několika různými drahami a to: indolylpyruvátovou, tryptaminovou nebo indolylacetaldoximovou. U vyšších rostlin metabolismus nejčastěji probíhá indolylpyruvátovou cestou. U čeledi Poaceae převládá dráha tryptaminová a dráha indolylacetaldoximová probíhá výhradně v rostlinách čeledi Brassicaceae, Tovariaceae a Resedaceae. Rostlinný hormon auxin je syntetizován ve stonkovém apexu, v mladých listech, květních orgánech a vyvíjejících se plodech. U jednoděložných rostlin se jeho hladina snižuje od vrcholu k bázi, u dvouděložných je tomu stejně, s tím rozdílem, že nejvyšší hladina se nachází v subapikální zóně. Z tohoto místa se pohybuje bazipetálně, tedy stonkem směrem dolů, a svým působením inhibuje laterální větvení. Tento výrazný gradient auxinu, který je v rostlině vytvořen, má za následek jev apikální dominance vedoucí k potlačení růstu výše lokalizovaných axilárních pupenů. Dočasně však může dojít k vzestupu obsahu auxinů i v bazální části rostliny, např. v souvislosti s radiálním růstem. U kambia stromů také stoupá obsah auxinu na jaře z důvodu intenzivního růstu pupenů. Jeho obsah v rostlině tedy koreluje s růstovou intenzitou. Mezi hlavní fyziologické účinky, které jsou spojovány s působením auxinu, patří kromě apikální dominance způsobující inhibici růstu axilárních pupenů také stimulace dlouživého růstu buněk, jejich dělení a diferenciace, stimulace růstu kořenů a regulace fototropismu a gravitropismu. 2.5 Hormonální regulace AD Je známo mnoho molekul, které spolu působí a interagují a tím vytváří komunikační síť uvnitř rostliny. Díky stále se rozvíjejícímu výzkumu jsou objevovány nové informace a 16

17 skutečnosti, které přispívají k vytvoření obrazu kontroly procesu větvení stonku. Vývoj pupenu je regulován interakcemi signálů z prostředí a endogenními signály rostlinných hormonů. Tyto faktory mají hlavní efekt na stonkovou architekturu. Na základě regulace exprese genových systémů souvisejících s axilárním větvením byly některé druhy transkripčních faktorů genů popsány jako klíčové v regulaci transkripčních a hormonálních drah. To napovídá tomu, že pro získání fenotypů s rozdílným větvením je nutná koordinovaná exprese řady genů. Kromě toho také zjištění, že určité proteiny související s axilárním větvením jsou zapojeny v drahách hormonální regulace, potvrzuje, že hormony jsou životně důležité pro regulaci axilárního větvení stonku (Pua & Davey, 2010). Experimenty zabývající se nadprodukcí fytohormonů potvrdily, že cytokininy stimulují růst axilárních pupenů a auxiny mají inhibiční účinek na růst postranních pupenů. Přenosem genu kódujícího izopentenyltransferázu (ipt) z Agrobacterium tumefacins do rostlin tabáku byla zvýšena endogenní hladina cytokininů a byl iniciován růst laterárních pupenů (Klee a Estelle, 1991). Oproti tomu růst pupenů rostlin, které produkovaly auxin ve velkém množství, byl potlačen. Na základě těchto pozorování bylo potvrzeno, že poměr endogenních auxinů a cytokininů se podílí na regulaci větvení stonku a apikální dominanci Jak ukazuje poslední výzkum, hraje roli ve větvení stonku také ještě donedávna neznámý, chemicky neurčený hormon. Byli vytvořeni mutanti, kteří vypovídali o existenci dalšího typu hormonu, který výrazně negativně reguluje větvení. V roce 2008 dvě skupiny nezávisle zjistily, že jde o již dříve popsanou látku strigolakton (Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008). Základní představa o transportu fytohormonů předpokládá, že auxin je transportován bazipetálně ve stonku a inhibuje růst axilárních pupenů. Oproti tomu cytokininy jsou vedeny akropetálně a podporují jejich růst. Strigolakton se pohybuje také akropetálně, ale růst axilárů inhibuje (Ongaro & Leyser, 2008) Vliv auxinu Historie Fytohormon auxin byl jako první spojován s působením apikální dominance a tím i s regulací větvení stonku, kdy inhibuje růst axilárních pupenů. Auxin byl hlavním tématem studia po více než 80 let. V počátcích výzkumu apikální dominance, kdy ještě nebyl auxin přímo popsán, se ukazuje, že inhibice je pravděpodobně způsobena speciální sloučeninou (Snow, 1929). Předpoklad že, v té době ještě neidentifikovaná inhibující substance je stejného 17

18 původu jako látka, která růst podporuje u koleoptylí ovsa, byl potvrzen v práci (Thimann & Skoog, 1933). Později byla tato neznámá, růst podporující substance nazvána auxin. Typickou vlastností auxinu je podpora dlouživého růstu stonku a jiných orgánů. To bylo potvrzeno experimenty, kdy tato látka byla odebírána z bazálních části odřezaného vrcholu semenáčků ovsa a byla schopna znovu navodit prodlužovací růst po aplikaci zpět na pahýl stonku semenáčku (Thimann & Skoog, 1933) Podpora a inhibice růstu (Thimann, 1937) uvádí, že přímá aplikace auxinu ve formě lanolinové pasty na mladé laterální pupeny inhibuje jejich růst a stejně tak je tomu i při aplikaci auxinu na stonek nad pupeny. Jsou-li inhibovány laterální pupeny aplikací čistého auxinu, nedochází k růstu žádné jiné části rostliny. Od dob pokusů Thimanna a Skooga se mnoho vědců snažilo objasnit, jak auxin potlačuje růst pupenů a tím ovládá větvení stonku (Leyser, 2005). Bylo navrženo mnoho hypotéz, jak auxin v hlavním stonku může inhibovat růst axilárních pupenů. Tyto hypotézy vycházejí nejen ze studia množství auxinu ve stonku, ale i ze zkoumání jeho distribuce mezi intracelulárními a extracelulárními kompartmenty a z pozorování schopnosti pohybovat se mezi nimi (Leyser, 2005). Existují tři hypotézy pro vysvětlení role rostlinných hormonů auxinu a cytokininu v regulaci větvení stonku (Dun et al., 2006). Jde o klasickou hypotézu, hypotézu transportu auxinu a hypotézu přechodového stavu pupenu. Klasická hypotéza vysvětluje, že auxin reguluje stonkové větvení pomocí změny hladiny dalších signálů, které jsou nutné pro inhibici růstu pupenů (Dun et al., 2006). Tyto signály jsou sekundárními posly působení auxinu (McSteen & Leyser, 2005). Důkaz role sekundárních poslů byl získán z mnohých studií, které našly spojení mezi biosyntetickou drahou cytokininů a růstem pupenů. Základem druhé hypotézy je transport auxinu stonkem. Auxin je syntetizován v apikálním meristému a transportuje se stonkem do báze rostlinného organismu prostřednictvím polárního auxinového transportu (Ljung et al., 2005). Stonek je nasycený auxinem a tím je zabráněno toku auxinu z axilárních pupenů v rostlině, ve které je růst axilár inhibován (Li & Bangerth, 1999). Třetí hypotéza funkce auxinu ve stonkovém větvení je hypotéza přechodového stavu pupenů. Na základě této hypotézy zahrnuje vývoj pupene tři stádia dormance, přechodového stavu a trvalého růstu (Dun et al., 2006). Zdá se, že umístění pupenů na stonku ovlivňuje jeho 18

19 možný růst a jeho odpověď na cytokininy nebo dekapitaci. Například aplikace cytokininů na druhý nod je u hrachu účinná v indukci růstu axilárních pupenů. Bylo vysloveno, že růst pupenů závisí na stádiu, ve kterém se nachází, a auxin může způsobit inhibici růstu pupenu jen v přechodovém stadiu. Morris et al. (2005) uvádí, že po dekapitaci se na vstupu dormantního pupenu do přechodového stadia podílí rychlý signál. Jeho působením dochází k iniciaci, ale ne k trvalému růstu. To naznačuje spojení s klasickou hypotézou, která říká, že auxin může inhibovat růst pupenu v přechodovém stadiu ovlivněním cytokininové odpovědi (Pua & Davey, 2010) Transport auxinu Jak Snow prokázal při studiu apikální dominance na rostlinách hrachu a fazolu, inhibiční signál je schopný putovat stonkem dolů a stejně tak i směrem vzhůru (Leyser, 2005). (Obr. 3) Obr. 3: Schematické znázornění přenosu signálu z dominujícího do podřízeného výhonu u hrachu (Leyser, 2005). Xylém a jeho blízce přidružené parenchymatické pletivo vedou inhibiční signál směrem dolů stonkem. Podmínkou je, že pletivo musí být živé, protože bylo dokázáno, že ošetřením stonku se blokuje přenos (Snow, 1925). Předpokládalo se, že přítomnost živých buněk je podmínkou, aby mohl inhibiční vliv putovat stonkem vzhůru do zadržených pupenů či větví, stejně tak jako dolů dominující větví. Ukázalo se že, pohyb auxinu směrem vzhůru je možný i skrz mrtvou část pletiva (Snow, 1929). To naznačuje, že auxin nemá schopnost se 19

20 pohybovat směrem nahoru do výše položených větví, ale že tento děj probíhá nepřímo, například prostřednictvím sekundárních poslů (Leyser, 2005). Pohyb auxinu směrem dolů je zprostředkován bazálně lokalizovanými auxinovými výstupními přenašeči, které jsou ve velkém množství nahromaděny v buňkách přidružených ke xylému (Galweiler et al., 1998). Toto tvrzení se shoduje i s výše uvedeným pozorováním, které provedl Snow (1925), že pro převod auxinového inhibičního signálu je nutná přítomnost živého pletiva. Je-li radioaktivně značený auxin aplikován na apex rostliny, pohybuje se stonkem směrem dolů a inhibuje růst pupenů (Thimann & Skoog, 1934), ale nepohybuje se směrem vzhůru do pupenů. Přenos inhibičního signálu směrem vzhůru musí probíhat na jiném principu Polární transport auxinu Růst axilárních pupenů je ovládán dominantním vrcholem a souvisí s polárním transportem auxinu (PAT) ve stonku. Mechanismus transportu auxinu popisuje chemiosmotický model, podle kterého je energie dodávána protonovou pumpou (H + - ATPázou), jejíž funkcí je přenos protonů z cytoplazmy do buněčné stěny, čímž dochází k jejímu okyselení. Tak se IAA nachází mimo buňku v méně disociovaném stavu, než je v cytosolu, a vstupuje do buňky jako nedisociovaná molekula nebo jako anion elektronegativním symportem s 2 protony (Procházka et al., 1997). Na aktivním transportu auxinu se podílí několik proteinových rodin. Patří sem vstupní přenašeče AUXIN INFLUX CARRIER PROTEIN 1 (AUX1)/LIKE-AUX1 (LAX) proteiny (Parry et al., 2001), p-glykoproteinový auxinový výstupní přenašeč (PGP) (Geisler & Murphy, 2006) a proteiny PIN sloužící jako auxinové výstupní přenašeče (Paponov et al., 2005). PIN1 protein je lokalizován polárně na bazální straně plazmatické membrány parenchymatických buněk xylému (Galweiler et al., 1998). Výstupní přenašeče, jejichž úkolem je výdej auxinu z buňky, tak vynáší anion IAA spolu s protonem. PIN proteiny jsou důležité pro polární transport auxinu. Mutantní rostliny Arabidopsis se ztrátou funkce PIN1 měly závažný fenotyp. Tanaka et al. (2006) provedl měření hladiny IAA v axilárních pupenech a přilehlém stonku u rostlin hrachu (Pisum sativum) před dekapitací a po ní. Snížení obsahu IAA ve stonku po dekapitaci odpovídalo snížení exprese PsPIN1 ve stonku. Je-li tok auxinu obnoven de novo biosyntézou v rostoucím pupenu, exprese PsPIN1 ve stonku je taktéž znovu navozena. V axilárním pupenu se během dormance snižuje hladina IAA a během iniciace jeho růstu dochází k jejímu zvýšení. Toto zjištění 20

21 prokázalo, že exprese PsPIN1 odpovídá toku auxinu ve stonku a to jak před před dekapitací, tak i po ní (Balla et al., 2011). Návrh molekulárního mechanismu stonkového větvení ukazuje, že k interakci mezi auxinem a cytokininem dochází prostřednictvím funkce genů PsIPT, PsCKX a PsPIN1 (obr. 4). U intaktní rostliny bazipetální tok auxinu putující směrem z apexu stonku potlačuje expresi PsIPT a zároveň ve stonku udržuje expresi PsPIN1. Díky tomu nedochází k růstu axilárních pupenů. Po dekapitaci rostliny je hladina auxinu ve stonku snížena a porušen inhibující vliv na expresi IPT. Cytokininy jsou tak syntetizovány de novo ve stonku a transportovány do axilárního pupenu do té doby dormantního a následuje zahájení jeho trvalého růstu. Poté de novo syntetizovaná IAA z nového stonkového vrcholu proudí stonkem, kde potlačuje expresi IPT a indukuje CKX za účelem ustálení hladiny cytokininů ve stonku (Shimizu-Sato et al., 2009). Obr. 4: Model interakce mezi auxinem a cytokininem na základě působení PsIPT, PsCKX a PsPIN1 při větvení stonku (Shimizu-Sato et al., 2009). U dekapitovaných rostlin je polární transport auxinu ustanoven v aktivních axilárních pupenech u hrachu, přičemž dochází k rychlé polarizaci PIN1 auxinového přenašeče v pupenech a následné indukci jeho exprese ve stonku. Tím se vytvoří napojení transportu auxinu na tok v hlavním stonku. Případ, kdy dochází k pronikání auxinu z axilárních pupenů a následné kanalizaci, či kanalizace laterálně aplikovaného auxinu nastane pouze, je-li primární zdroj auxinu odstraněn nebo oslaben. Mechanismus představuje případ kompetitivní kanalizace mezi primárním a sekundárním zdrojem auxinu (Balla et al., 2011). 21

22 2.5.2 Sekundární poslové Auxin aplikovaný na vrchol dekapitované rostliny má za následek inhibici růstu laterálních pupenů, i přesto, že do pupenů nevstupuje. Jeho přímé působení tak bylo vyloučeno a předpokládalo se, že tento inhibiční efekt je zprostředkován pomocí sekundárních poslů. Byl studován vliv ostatních růstových regulátorů jakožto možných sekundárních poslů, kteří souvisí s nepřímým účinkem auxinu způsobujícího inhibici růstu laterálních pupenů. Experimenty byly provedeny na modelové rostlině Arabidopsis thaliana, přičemž byly na apikální a bazální stranu jednonodového úseku s rostoucím pupenem varianty planého typu a varianty mutanta v hormonální signalizaci aplikovány jednotlivé fytohormony (Chatfield et al., 2000). Autoři dokazují, že biosyntéza etylénu a jeho působení není pro navození inhibice růstu pupenů nezbytná. Role etylénu jakožto sekundárního posla pro auxinem zprostředkovanou inhibici pupenů byla vyloučena. Stejně tak kyselina abscisová, která je známa pro svůj dormantní účinek na pupeny, není nutná pro inhibiční působení auxinu, přestože její aplikace na bázi může zvýšit inhibici způsobenou auxinem a apikální aplikace ji potlačuje (Chatfield et al., 2000). Výzkum se stále zabývá osvětlením role kyseliny abscisové ve stonkovém větvení a jejími interakcemi s auxinem. Přesná funkce a působení tohoto rostlinného hormonu v mechanismu větvení a kontrole růstu axilárních pupenů je zatím nejasná, hlavně vzhledem ke skutečnosti, že ABA je přirozený hormon dormance a inhibice růstu (Pua & Davey, 2010) Cytokininy Hlavním místem biosyntézy cytokininů je kořen, odtud jsou tyto fytohormony exportovány do stonku prostřednictvím transpiračního toku v xylému. Je-li cytokinin aplikován na laterální pupen, stimuluje jeho růst, dokonce i u intaktní rostliny (Chatfield et al., 2000). Cytokininy jsou jedinou známou látkou schopnou vymanit axilární pupeny z dormantního stavu. Tato skupina rostlinných hormonů se oproti auxinům projevuje opačným vlivem na fyziologii rostliny. Auxin působí z intaktního stonkového vrcholu a potlačuje růst axilárních pupenů, zatímco cytokininy iniciované dekapitací apexu stonku působí přímo jako podpora růstu axilárních pupenů. Cytokininy jsou tedy hormony, které mají schopnost zeslabit apikální dominanci. 22

23 Turnbull et al., (1997) uvádí, že v laterálních pupenech cizrny se po dekapitaci zvyšovala hladina cytokininů a že růst axilárů je přímo úměrný množství cytokininů v těchto pupenech. Studie ukazují, že exogenně aplikovaný cytokinin nebo overexprese genů kódujících enzymy, které hrají roli v biosyntéze cytokininů, iniciují růst pupenů. Někteří mutanti se zvýšenou hladinou cytokininů se tedy projevují výraznějším větvením stonku (Dun et al., 2006). Auxin při svém bazipetálním transportu stonkem směrem dolů ovlivňuje přívod akropetálně se pohybujících sekundárních poslů, kteří jinak vstupují do pupenů a přímo ovlivňují jejich aktivitu. Dochází k potlačení cytokininové biosyntézy a snížení množství cytokininů přiváděných z kořene xylémem. Tudíž jeden ze způsobů pro inhibici zprostředkovanou auxinem je mechanismus snížení přívodu cytokininů do pupenu (McSteen & Leyser, 2005). To potvrzuje dekapitace leguminóz vedoucí ke zvýšení endogenní koncentrace cytokininů v axilárních pupenech, které je pravděpodobně zprostředkováno zvýšením exprese genů podílejících se na biosyntéze cytokininů (izopentenyl transferáza IPT1 a IPT2) ve stonku. Toto zvýšení je částečně odstraněno aplikací auxinu (Tanaka et al., 2006) a následkem toho dojde k redukci přiváděných cytokininů do pupenu (McSteen & Leyser, 2005). Produkt genu izopentenyltransferázy (ipt), která kondenzací izopentenylpyrofosfátu a adenozinmonofosfátu (AMP) dává vznik izopentenyl-amp, je klíčovým enzymem v biosyntéze cytokininů. Poté je izopentenyl-amp v rostlině rychle metabolizován na biologicky aktivní cytokininy. Do rostlin tabáku byl spolu se silným promotorem z viru mozaiky květáku vnesen gen kódující izopentenyltransferázu z Agrobacterium tumefaciens. Takto vytvořené transgenní rostliny, u nichž byla detekována až stonásobně vyšší hladina cytokininů ve srovnání s kontrolními rostlinami, vykazovaly ztrátu apikální dominance, zpomalení procesu senescence a neschopnost tvorby kořenů. Bylo prokázáno, že po dekapitaci probíhá lokální biosyntéza cytokininů v jednotlivých nodech stonku spíše než v kořeni. Gen IPT2, který je specificky exprimován ve stonkovém nodu po dekapitaci, byl identifikován subtrakční metodou analýzy mrna odebranou z nodálních segmentů před dekapitací a po ní. Produkt tohoto genu - IPT2 protein - má významnou roli v řízení hladiny cytokininů v rostlině (Tanaka et al. 2006). Zdá se, že PsIPT2 má hlavní funkci v ovládání růstu axilárních pupenů po dekapitaci, protože PsIPT2 byl jediný izolovaný klon ze subtrakční c-dna knihovny připravené z nodálních segmentů po dekapitaci (Shimizu-Sato et al., 2009). Tanaka et al. (2006) uvádí, že auxin odvozený ze 23

24 stonkového vrcholu potlačuje expresi PsIPT2 v nodálním stonkovém segmentu intaktních rostlin a vyprázdnění auxinu z nodů po dekapitaci okamžitě indukuje expresi genu PsIPT2. Každý gen IPT genové rodiny má při ovládání interakcí mezi auxinem a cytokininem individuální roli. V rozdílných orgánech intaktních semenáčků hrachu, včetně jeho kořene, byla zaznamenána velmi nízká exprese genu PsIPT2. Geny PsIPT mohou vyvolat biosyntézu CK v kořenech a jiných pletivech v závislosti na různých stádiích rostlinného vývoje (Shimizu-Sato et al., 2009). Díky skutečnosti, že cytokininy jsou syntetizovány v kořenovém systému a že dochází k výrazným rozdílům v hladině xylémových exudátů, se předpokládalo, že jsou cytokininy transportovány z kořene do axilárních pupenů, aby podpořily jejich růst (Letham, 1994). U rostlin hrachu se hladina CK ve stonku a axilárních pupenech zvyšovala 3 hodiny po dekapitaci, navzdory faktu, že gen PsIPT2 není exprimován v rostoucích pupenech. To naznačuje, že cytokininy jsou syntetizovány ve stonku a transportovány do axilárních pupenů a tím stimulují jejich růstu po dekapitaci. Další experiment na rostlinách hrachu potvrzuje, že cytokininy nejsou transportovány z kořene, ale že dochází k jejich biosyntéze ve stonku. Množství vytvořených cytokininů bylo shodné u izolovaných segmentů stonku, stejně tak jako u stonku, kterému byly ponechány kořeny. Aplikace IAA v lanolinové pastě na stonek vedla k zastavení nárůstu cytokininů v izolovaných segmentech stonku. Množství cytokininů, které jsou lokálně syntetizovány de novo v nodálních stonkových segmentech, je dostačující pro podporu růstu axilárních pupenů (Shimizu-Sato et al., 2009) Strigolakton Strigolaktony se vyskytují v kořenových exudátech různých druhů rostlin. Skutečnost, že se strigolaktony nacházejí i u neparazitujících rostlin, naznačuje, že mají u rostlin i jiné funkce. Gomez-Roldan et al., (2008) uvádí, že na základě známých vlastností strigolaktonů a jejich výzkumu jako první učinili zjištění týkající se symbiózy hub, klíčení parazitických semen a následně i větvení stonku. Regulují tedy nadzemní architekturu stonkového systému a zároveň mají funkci v podzemní komunikaci mezi sousedními organismy (Umehara et al., 2008). Semena parazitických rostlin rodu Striga a Orbanche (záraza) využívají strigolakton jako signál vytvořený hostitelem, který indukuje jejich klíčení. Tato semena přežívají celé roky v dormantním stavu. Klíčení začíná až po stimulaci chemickým signálem vylučovaným 24

25 kořenovým systémem hostitelské rostliny do blízkého okolí. Hostitelská rostlina tedy vydá signál v podobě strigolaktonů, který zahájí růst parazitické rostliny. Po tom, co molekula strigolaktonu pronikne do semene, již během několika minut dochází ke stimulaci mitochondrií, během hodiny k nastartování biosyntézy a poté následuje exprese genů aktivujících buněčné dělení, růst a diferenciaci (Brewer et al., 2009). Strigolaktony slouží i jako signální molekuly pro symbiotické mikroorganismy, které žijí na kořenech rostlin. Hrají roli v arbuskulární mykorhizní symbióze, což je nejrozšířenější a nejvýznamnější symbióza v přírodě (Brachmann & Parniske, 2006). Její výskyt byl potvrzen u více než 80% suchozemských rostlin. Strigolaktony působí jako signály vycházející z kořene, a umožňují tak rostlině snadnější příjem živin dostupných z půdy (Umehara et al., 2008). Jde o skupinu terpenoidních laktonů (obr. 5). Zatím bylo identifikováno 9 strigolaktonů, jejichž základem jsou čtyři kruhy nesoucí různé substituenty (Gomez-Roldan et al., 2008). Obr. 5: Chemická struktura zástupců strigolaktonů (Umehara et al., 2008). Apikální dominance tedy souvisí s interakcemi mezi dvěma rostlinnými hormony auxiny a cytokininy, avšak nedávné studie skupiny recesivních mutantů vykazujících zvýšené větvení stonku ukázaly, že do inhibice růstu axilárních pupenů je zahrnut ještě třetí hormon. Jde o fytohormon inhibující stonkové větvení, který je odvozený od karotenoidů. Karotenoidy jsou třída isporenoidních derivátů. K jejich tvorbě dochází v plastidech. Tyto sloučeniny mají schopnost absorbovat světelnou energii a poté nadbytek energie rozptýlit. Jsou prekurzory pro biosytézu hormonů (Pua & Davey, 2010). Stirnberg et al. (2002) uvádí, že byla identifikována nová sloučenina podobající se hormonům, která je řízená skupinou genů známých jako MORE AXILLARY GROWTH 25

26 (MAX1-4) a která hraje roli v syntéze a transportu donedávna nepopsaného růstového regulátoru. Genová rodina MAX má homology u hrachu RAMOSUS (RMS) (Sorefan et al., 2003) a petunie DECREASED APICAL DOMINANCE 1 (DAD1) (Snowden et al., 2005) a rýže DWARF (DW) (Arite et al., 2007). Poté co Gomez-Roldan et al. (2008) a Umehara et al. (2008) popsali do té doby neurčený hormon jako strigolakton, třetí fytohormon zapojující se do mechanismu větvení stonku. Pokusy vzájemného roubování, analýzy dvojitých mutantů a klonování těchto genetických lokusů ukázaly, že biosyntéza strigolaktonu vychází z karotenoidů a že jeho transport je akropetální a vede k inhibici růstu axilárních pupenů. V kořenech mutantů (max/rms/dwarf) s fenotypem zvýšeného větvení stonku byla výrazně redukována hladina strigolaktonů (Gomez-Roldan et al., 2008). Umehara et al. (2008) uvádí, že že u rýže a Arabidopsis byli vytvořeni mutanti se zvýšeným větvicím fenotypem deficientní nebo necitliví ke strigolaktonu, u nichž bylo větvení stonku inhibováno aplikací exogenního strigolaktonu. Enzym štěpící karotenodiy, ze kterého biosyntéza strigolaktonu vychází, je zachován v rostlinné říši u mnoha rozmanitých druhů rostlin (Umehara et al., 2008). U ccd8 mutantů Pisum sativum byla ovlivněna mykorhizní symbióza a byl zde nízký obsah strigolaktonu. Aplikace exogenního strigolaktonu na mutanty ccd8 vede k obnovení symbiózy a byla pozorována inhibice větvení stonku. Při aplikaci syntetického strigolaktonu GR24 na pupen 4. nodu došlo k inhibici růstu axilárních pupenů u mutantů ccd8, zatímco u mutantů rms4 byla odpověď na aplikovaný strigolakton negativní a větvení potlačeno nebylo. Výsledek odpovídá tomu, že strigolakton působí v signální dráze po CCD8 a před RMS4 a že účinek strigolaktonu je pro určité signální dráhy specifický. To ukazuje i experiment u Arabidopsis, kde exogenní aplikace také inhibuje větvení mutanta max1, ale nemá účinek u mutanta max2. Na základě reakce ccd8 a rms4 mutantů bylo prokázáno, že strigolakton má klasické vlastnosti hormonu zahrnující potlačení jeho působení pomocí genetických přístupů, obnovení funkce hormonu jeho exogenní aplikací, specifické signální působení, možnost transportu stonkem na dlouhé vzdálenosti a působení v nízkých koncentracích (Gomez-Roldan et al., 2008). 26

27 2.6 Kontrola axilárního větvení stonku na genetické úrovni Geny ovlivňující axilární větvení stonku byly identifikovány především u rostlin huseníčku (Arabidopsis thaliana), hrachu (Pisum sativum) a rýže (Oryza). Skutečnost, že mechanismy axilárního větvení jsou u celé řady rostlin stejné, umožnila izolovat nové geny i z rozdílných druhů. Proteiny související s biosyntézou, metabolismem, resp. transportem fytohormonů mají přímé účinky na axilární větvení. Auxin je známý jako základní hormon ovládající proces axilárního větvení prostřednictvím fenoménu apikální dominance. Proto ztráta vrcholového stonkového meristému vede ke zvýšené tvorbě postranních větví. Mutace v proteinech souvisejících s auxinovým polárním transportem vede k zakrslému a rozvětvenému fenotypu u bud1 mutantu (Dai et al., 2006). Ztrátou funkce genu AUXIN- RESISTANCE (AXR1) u rostlin Arabidopsis je snížena schopnost odpovědi rostliny na auxin, což taktéž vede ke zvýšenému projevu axilárního větvení (Leyser et al., 1993). Existuje také spojitost mezi MAX drahou u Arabidopsis a auxinem. Pupeny rostlin max mutantů byly rezistentní k inhibičním účinkům daným působením auxinu z apexu (Sorefan et al., 2003). To naznačuje, že MAX dráha je nutná pro úplnou inhibici růstu pupenů zprostředkovanou auxinem. MAX dráha se také uplatňuje při ovládání auxinové transportní kapacity v hlavním stonku. U max mutantů dochází k akumulaci PIN1 proteinů, což vede ke zvýšení transportní kapacity auxinu ve stonku (Bennett et al., 2006). Zvýšená transportní kapacita způsobuje zvýšené větvení stonku. To vysvětluje model, který předpokládá kompetici s omezenou transportní kapacitou auxinu v hlavním stonku (Balla et al., 2011). U stonku planého typu rostliny MAX dráha reguluje auxinové přenašeče a transportní kapacita je zcela nasycena auxinem z stonkového vrcholu. Axilární meristém představující sekundární zdroj auxinu tak nemůže vytvořit tok auxinu do hlavního stonku a tím je zamezen jeho růst, zatímco u max mutantů je transportní kapacita stonku zvýšena, což vede k exportu auxinu z axilárních pupenů a jejich následnému růstu, který se projeví charakteristickým rozvětveným fenotypem (obr.6). 27

28 Obr. 6: Model funkce MAX dráhy v regulaci transportní kapacity auxinu (Ongaro & Leyser, 2008). Auxin vytvořený v apikálním meristému má při polárním transportu stonkem směrem dolů rozdílné účinky (obr. 7). Jednak dochází k snížené biosyntéze cytokininů prostřednictvím dráhy AXR1/AFB a jednak omezuje auxinovou transportní kapacitu, aby nedošlo k exportu auxinu z axilárního meristému. Obr. 7: Hormonální kontrola větvení stonku u Arabidopsis (Ongaro & Leyser, 2008). Kapacita transportního toku je regulována MAX dráhou, ve které geny MAX3, MAX4 a MAX1 působí v syntéze hormonu pohybujícího se směrem vzhůru stonkem. Ten řídí hladinu PIN1 proteinu prostřednictvím exprese MAX2. U rms1/dad1/max4 mutantů nepřítomnost signálu směřujícího vzhůru vede k zvýšené transportní kapacitě auxinu ve stonku, která dovoluje export auxinu z axilárních pupenů a jejich zvýšený růst. Zvýšený obsah auxinu v polárním transportním toku také vede ke snížené syntéze cytokininů a ke zvýšené expresi 28

29 RMS1/DAD1/MAX4. U axr1 mutantů je schopnost odpovědi na auxin redukována, takže hladina cytokininů stoupla a auxin nemůže zvýšit expresi genu MAX4 (Stirnberg et al., 1999). MAX geny jsou zodpovědné za represi růstu axilárních větví a max mutant se projevuje vyšším větvicím fenotypem než kontrolní rostliny (Stirnberg et al., 2002). Strigolakton byl díky analýzám větvících mutantů u Arabidopsis, hrachu a petunie dán do souvislosti s regulací růstu pupenů. Ztrátou funkce genů MAX1, MAX2, MAX3, MAX4 u Arabidopsis a RMS1, RMS2, RMS3 RMS4, RMS5, RMS6 u hrachu a DAD1, DAD2, DAD3 u petunie bylo dosáhnuto zvýšeného větvení stonku vzhledem k planému typu rostlin. Funkce těchto genů je nutná pro mobilní signál pohybující se stonkem dolů, který inhibuje větvení (Bennett et al., 2006). Mutace v genu MAX4 vedla u rostlin Arabidopsis ke zvýšenému růstu pupenů a schopnosti rezistence vůči působení auxinu. Návratu k normálnímu fenotypu větvení bylo docíleno roubováním na podnož původní, geneticky nezměněné rostliny. Bylo tak dokázáno, že auxin ovlivňuje větvení stonku prostřednictvím regulace transkripce RMS1 / MAX4. Správná funkce genu MAX4 je důležitá pro tvorbu signálů, které inhibují větvení. U rostlin hrachu byly objeveny geny RMS1 se stejnou funkcí. Tyto MAX4 a RMS1 geny jsou kódujícími orthology pro auxinem indukovatelné členy polyenové dioxygenázové rodiny (Sorefan et al., 2003). Karotenoidová dráha je důležitá pro syntézu mobilního signálu, který reguluje vývoj stonku. U Arabidopsis thaliana bylo objeveno 9 genů, které tvoří rodinu dioxygenáz (CCDs) štěpících karotenoidy. Pět členů této rodiny je zapojeno do syntézy kyseliny abscisové a dva enzymy CCD7/MAX3 a CCD8/MAX4 souvisí s biosyntézou později popsaného hormonu - strigolaktonu, který je odvozen od karotenoidů a má vliv na větvení stonku (Auldridge et al., 2006). U DAD1, MAX4 a RMS1 mutantů je potlačena správná funkce genu, který kóduje enzym dioxygenázu štěpící karotenoidy (CCD). Zvýšené větvení u těchto mutantů je důsledkem neschopnosti syntetizovat od karotenoidů odvozené signální molekuly - strigolaktony, které jsou jinak schopné inhibovat vývoj axilárního meristému (Bennett et al., 2006). K inhibici větvení stonku dochází prostřednictvím MAX (More axillary branching) dependentní dráhy u Arabidopsis (Umehara et al., 2008). V této dráze byly identifikovány čtyři geny (MAX 1,2,3,4) a syntéza akropetálně transportovaných molekul strigolaktonu je závislá na působení MAX1, AtCCD7 (MAX3) a AtCCD8 (MAX4), zatímco gen MAX2 je zapojen do přenosu signálu (Booker et al., 2005). 29

30 MAX1 je cytochrom P450 monooxygenáza pravděpodobně zapojená v pozdějším biosyntetickém kroku (Booker et al., 2005). Substrát této třídy cytochromu P450 je často vytvářen dioxygenázou, což odpovídá pozici MAX1 působící po MAX3 a MAX4 v navrhované biosyntéze strigolaktonu (Ongaro & Leyser, 2008). MAX2 a RMS4 jsou ortologní členové proteinové rodiny obsahující F-box bohaté na leucinové repetice (LRR) (Stirnberg et al., 2002). Působí jako substrátově selektivní podjednotka ubiquitin-proteinové ligázy, která katalyzuje polyubikvitinaci vybraných proteinů vedoucí k jejich degradaci (Ongaro & Leyser, 2008). Obr. 8: Biosyntetická dráha strigolaktonu (Umehara et al., 2008). 30

31 3 MATERIÁL A METODY 3.1 Rostlinný materiál V praktické části této diplomové práce byly pro laboratorní experimenty použity rostliny hrachu setého (Pisum sativum L.) cv. Vladan. Semena této odrůdy byla dodána společností Semo Smržice. Odrůda Vladan je charakterizována jako raná až velmi raná odrůda hrachu zahradního. Rostliny dosahují výšky cm, mají tenkou, pevnou, podklesávající lodyhu, tmavozelený habitus, menší list i palist. Lusk je 7 cm dlouhý, tupě ukončený, se 7-8 zrny. Zrno je v technologické zralosti velké, tmavě zelené, HTS 210 g ( Z důvodu silné apikální dominance je tento kultivar hrachu na pracovišti Ústavu biologie rostlin Mendelovy univerzity již tradičně využíván jako modelová rostlina Příprava rostlinného materiálu Semena hrachu setého (Pisum sativum) byla po 24hodinovém bobtnání v čisté vodě, které usnadní proces klíčení, vyseta do perlitu. Po pětidenním klíčení byly rostliny umístěny do kultivačních plastových nádob naplněných čistou vodou bez přídavku minerální výživy z důvodu zesílení apikální dominance. Následně byly kultivovány 7 dnů v řízených podmínkách klimaboxu za střídání teploty 25 C přes den a 22 C přes noc a fotoperiodě 16/8 hod (den/noc). Intenzita světla byla 150 µmol.m -2.s -1 a vlhkost 80% Ošetření rostlinného materiálu Část rostlin bylo dekapitováno a zbytek byl ponechán v intaktním stavu. Na 2. axilární pupen vybraných dekapitovaných (obr. 9) a intaktních rostlin byl aplikován syntetický strigolakton GR24 (Chiralix) v aplikačním roztoku. Bylo aplikováno 0,5 µl připraveného roztoku, který obsahoval 50 µmol/l GR24 v 50% ethanolu, 2% polyethylenglykolu, 0,2% acetonu a 0,2% dimethyl sulfoxidu (složení dle (Brewer et al. 2009)). Ethanol zajistí lepší pronikání do pletiv a polyethylenglykol lepší ulpění na povrchu pupenů. Ostatní rostliny byly ošetřeny pouze aplikačním roztokem bez přídavku strigolaktonu. 31

32 Obr. 9: Dekapitovaná rostlina hrachu, varianta s aplikací GR Odběr rostlinného materiálu Z ošetřených rostlin byly izolovány pupeny 2. nodu, u kterých byla následně provedena imunocytolokalizace PIN1 proteinu. Odběr pupenů byl uskutečněn 1 hodinu po dekapitaci a následně po 6 hodinách. Ke skupině dekapitovaných ošetřených/neošetřených rostlin byla vytvořena varianta kontrolní, na kterou byl aplikován pouze roztok ethanolu a polyethylenglykolu bez přídavku strigolaktonu a odběr byl proveden ihned a poté po jedné a 6 hodinách. Stejně tomu bylo i u rostlin intaktních ošetřených/neošětřených. Bylo tak vytvořeno 10 variant. (Tab. 1) Pro účely studia imunolokalizace byly navíc vytvořeny ještě dvě dlouhodobé varianty, na které byl aplikační roztok s obsahem syntetického strigolaktonu GR24 resp. bez obsahu GR 24 (varianta kontrolní) aplikován vždy po 24 hodinách po dobu 5 dnů. Tab. 1: Vytvořené varianty u rostlin hrachu VARIANTA 1hod. dekapitovaná GR24 dekapitovaná kontrola intaktní GR24 intaktní kontrola 0hod. KONTROLA k 1hod. VARIANTA 6hod. dekapitovaná GR24 dekapitovaná kontrola intaktní GR24 intaktní kontrola 0hod. KONTROLA k 6hod. 32

33 3.2 Studium interakce auxinu a strigolaktonu - imunocytolokalizace PIN1 proteinu Níže uvedený pracovní postup byl převzat podle metodiky (Paciorek et al., 2006) Fixace Odebrané pupeny byly přes noc inkubovány v roztoku kyseliny octové a methanolu (3:1) při -20 C. Následně byly pupeny jednotlivých variant 3krát promyty po dobu 15 minut v roztoku PBS (Tab. 2), který slouží k odstranění přebytečného fixačního činidla. ph připraveného roztoku PBS bylo upraveno na hodnotu 7,4. Tab. 2: Příprava roztoku PBS (1litr) chemikálie g/l NaCl 9 KH 2 PO 4 0,21 Na 2 HPO 4. 12H 2 O Odvodnění vzorků Pupeny jednotlivých variant byly odvodněny pomocí ethanolové řady. Řada se skládala z 10/30/50/70/90 % ethanolu, v každém byly pupeny ponechány 15 min. Poté byly 2krát promyty 96% ethanolem po dobu 45 min a 2krát 100% ethanolem taktéž 45 min. Následovala infiltrace xylénem. Byly použity roztoky uvedené v tabulce 3. Tab. 3: Roztoky xylenu chemikálie zředění doba působení ethanol/xylén (3:1) 60 min ethanol/xylén (1:1) 60 min ethanol/xylén (1:3) 60 min xylén 100% 60 min xylén 100% přes noc 33

34 3.2.3 Zalití vzorků do parafínu Do xylénu s pupenem byl přidán rozpuštěný parafín a následná inkubace při pokojové teplotě trvala 12 hod. Parafín Paraplast Plus (Kendall, USA) má teplotu tání 56 C. Potom, co byla přisypána další vrstva parafínu, trvala inkubace 12 hod. při 42 C. Následovalo poslední přidání parafínu a 4hodinová inkubace při 58 C. Posléze byla vrstva parafínu a xylénu nahrazena čistým parafínem a vzorek byl inkubován přes noc při 58 C. Čistý parafín pak ještě 3krát nahradil parafín původní, přičemž pokaždé inkubace trvala 12 hod. za teploty 58 C. Takto připravené vzorky pupenů byly umístěny do připravených plastových bločků a zality rozpuštěným parafínem. Každý pupen byl preparační jehlou opatrně nasměrován doprostřed dna bločku a rychle zchlazen, čímž se zafixovala jeho správná poloha, která zajistí správné provedení řezů na mikrotomu Řezání vzorků a přilnutí na podložní sklíčko Takto vytvořené parafínové bločky se zalitými vzorky pupenů byly řezány na sáňkovém mikrotomu OE-908/1 (FOK-GYEM, Hu). Jednotlivé řezy měly tloušťku 15 µm. Nařezané vzorky, které tvořily souvislý pruh parafínu s tenkým řezem pupenu uprostřed, byly žehleny ve vodní lázni při teplotě 42 C. Po opatrném přenesení na pozitivně nabité podložní sklíčko typu Super Frost Plus (Menzel-Gläser, Ge) byly vzorky po dobu 2 hod. inkubovány na elektrické desce při teplotě 42 C Odparafinování a dehydratace vzorků Vzorky na podložních sklíčkách vložené do stojanu na sklíčka byly promyty v 100% xylénu po dobu 20 minut. Následovalo 10minutové promytí v 50% xylénu a 50% ethanolu, nakonec ve 100% ethanolu. Vybrané zdařené vzorky, u kterých bylo okem možné pozorovat nepoškozenou strukturu pupenů, byly dehydrovány v ethanolové řadě. Postupně v 100/90/70/50/30/10 % ethanolu byly vzorky ponechány 6 minut. Následovalo 10minutové promytí v roztoku PBS Blokování Po přípravě blokovacího roztoku bylo na každé podložní sklíčko napipetováno 500 µl. Celkově bylo připraveno 40 ml blokovacího roztoku, který se skládal z roztoku PBS a 34

35 albuminu. Albuminový protein pochází z bovinního krevního séra, byl dodaný firmou Sigma Life Science. Sklíčka s naneseným blokovacím roztokem byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 0,5-1 hod v nádobě s navlhčenou buničinou, která zajišťovala vlhké prostředí Navázání 1. protilátky Na sklíčko bylo napipetováno 100 µl 1. protilátky anti-arabidopsis-pin1 naředěné 1:500 v blokovacím roztoku. Poté byla podložní skla zakryta Parafilmem M (Sigma, USA) a přes noc ve tmě inkubována ve vlhkém prostředí při pokojové teplotě. Pro studium lokalizace PIN1 byla využita králičí polyklonální anti-arabidopsis-pin1 protilátka, která rozeznává také homologický PsPIN1 protein u hrachu (Sauer et al., 2006). Protilátka byla poskytnuta Dr. J. Frimlem (Universität Tübingen). Po odstranění protilátky byla podložní sklíčka 3x vložena na 5-10 min. do roztoku PBS, do kterého byl navíc přidán 0,2 % Tween-20 sloužící jako detergent na promytí, který ze vzorku odstraní zbytky nenavázané protilátky Blokování a navázání 2. protilátky Po napipetování 500 µl blokovacího roztoku (PBS + albumin) na sklíčka se vzorky proběhlo blokování při pokojové teplotě a ve vlhkém prostředí po dobu 0,5 hod. Po odstranění blokovacího roztoku z podložních sklíček bylo na každé napipetováno 100 µl sekundární protilátky konjugované s fluorescenčním barvivem (polyklonální Cy3-anti-rabbit, Dianova, Ge), která byla naředěná s blokovacím roztokem 1:500. Po zakrytí jednotlivých sklíček parafilmem a jejich umístění do nádoby, která byla později zakryta víkem, aby zajistila temné a vlhké prostředí následovala 2-4hodinová inkubace v termostatu při teplotě 37 C Po odstranění protilátky byla podložní sklíčka 3x vložena na 5-10 min. do roztoku PBS, do kterého byl opět přidán 0,2 % detergent Tween-20. Nakonec byla ještě sklíčka promyta roztokem PBS, který již neobsahoval 0,2 % detergent Tween-20, po dobu 10 min. a vysušena při pokojové teplotě Přidání zalévacího média a mikroskopování Nakonec byly vzorky na podložních sklech zality zalévacím médiem Citifluor (UK) a zakryty krycím sklíčkem. Takto připravené vzorky byly mikroskopovány a snímány na konfokálním laserovém mikroskopu BX 60 CLSM FluoView 300 (Olympus, Japan) (obr. 10). 35

36 Obr. 10: Konfokální laserový mikroskop BX 60 LSM FluoView 300 (Olympus, Japan) 3.3 Studium exprese genů Příprava a odběr materiálu Příprava a ošetření rostlin proběhlo podle výše uvedeného postupu (kap. 3.1). Poté byly z rostlin izolovány pupeny 2. nodu, u kterých bylo následně provedeno studium exprese vybraných genů Izolace RNA Odebrané pupeny o přibližné navážce 100 mg byly zhomogenizovány v tekutém dusíku a následně byla izolována RNA. K izolaci celkové RNA byl použit izolační kit RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Neměcko). Princip této izolace je založen na rozrušení a denaturaci buňky, kterou zajistil přidaný lytický pufr RTL, a následné precipitaci obou nukleových kyselin přidaným ethanolem. Lytický pufr RTL obsahuje guanidin isothiokyanát (GITC), který stabilizuje buněčný obsah a chrání RNA před působením degradujících RNáz. Po centrifugaci lyzátu ve speciální kolonce QIAshredder spin column byl vzniklý supernatant opatrně separován od buněčných zbytků, které vytvořily pelet, a poté byl přidán ethanol. Vysrážené nukleové kyseliny zachycené na silikagelové membráně kolony RNeasy mini column byly přečištěny a přídavkem připraveného roztoku DNázy byla odstraněna deoxyribonukleová kyselina. Poté byly vzorky RNA z kolonek eluovány 20 µl RNázy prosté 36

37 vody, která byla součástí používaného kitu, a zamrazeny při teplotě -70 C v hlubokomrazicím boxu MDF-U3286S (Sanyo, Japonsko). Při celém postupu izolace RNA se pracovalo v latexových rukavicích ošetřených přípravkem RNase Zap (Sigma, USA), aby bylo eliminováno riziko působení RNáz, které se běžně nacházejí v prostředí laboratoře a degradují ribonukleové kyseliny. Také byly používány autoklávované špičky na pipety a mikrozkumavky a část práce byla prováděna v sterilním prostředí flow-boxu vysvíceného UV-zářením Stanovení koncentrace RNA Stanovení koncentrace izolované RNA ze vzorků bylo provedeno pomocí přístroje Picodrop Pico100 (Picodrop, UK). Vzorek RNA byl zvortexován (MS2 Minishaker, IKA, USA) a množství 2,5 µl bylo nabráno elektronickou pipetou, zajišťující snížení rizika kontaminace, poté bylo vloženo do spektrofotometru. Při práci se používají speciální UVprůchozí špičky na pipety, které umožňují přesné měření absorbance UV záření o vlnové délce nm. Absorbance jednotlivých vzorků byla měřena několikrát vždy za střídavého měření slepého vzorku (blanc), což byla sterilní RNázy prostá voda. Poté byla u každého vzorku RNA naměřená hodnota koncentrace v ng/µl přepočtena na jednotky µl/µg RNA a dopočítáno množství vody v µl, které je nutno přidat k RNA, aby byl celkový objem požadovaný pro následující reakci 8 µl. (Tab. 4) Tab. 4: Stanovení koncentrace RNA Ø ng/µl µl/µg RNA µl H 2 O 1) 0h kont. 1h 676,9 1,5 6,5 2) 1 h intakt. K 604,6 1,7 6,3 3) 1h intak.gr24 591,3 1,7 6,3 4) 1h dekap. K 390,8 2,6 5,4 5) 1h dekap. GR24 311,0 3,2 4,8 6) 0h kont. 6h 647,1 1,5 6,5 7) 6h intakt. K 618,1 1,6 6,4 8) 6h intakt. GR24 456,8 2,2 5,8 9) 6h dekap. K 440,3 2,3 5,7 10) 6h dekap. GR24 408,3 2,4 5,6 37

38 3.3.4 Semikvantitativí PCR Reverzní transkripce K přepisu na cdna prostřednictvím reverzní transkripce byla použita RNA izolovaná v předchozích krocích. Pro práci byl použit kit Enhanced Avian HS RT-PCR 100 (Sigma, USA). Reverzní transkripce probíhá ve dvou fázích. Hlavním krokem 1. fáze je denaturace sekundární struktury RNA, na jejíž polyadenylový konec je posléze navázán úsek 23 deoxytymidinových jednotek speciální kotvou. Úsek 23 deoxytymidinových jednotek - oligo (dt) 23 slouží jako primer pro následné dosyntetizování řetězce ve 2. fázi. Přepis původního řetězce RNA na cdna byl uskutečněn působením enzymu reverzní transkiptázy, která byla získána z viru ptačí myeloblastózy (AMV-RT). 1. fáze Do mikrozkumavky s jednotlivými vzorky izolované RNA, která obsahovala 1 µg celkové RNA, bylo přidáno vždy takové množství vody (PCR reagent, Sigma, USA), aby celkový objem reakčního roztoku byl 8 µl, viz tab. 5. Poté byly přidány ostatní reakční komponenty uvedené v tabulce č. 5, výsledný objem reakční směsi činil 10 µl. Jednotlivé mikrozkumavky byly zvortexovány (MS2 Minishaker, IKA, USA) a krátce centrifugovány. Následně byly temperovány v termocycleru (Techne Progene FPROG02D, Techne, UK) za spuštění programu č. 1 po dobu 10 minut při teplotě 70 C, při které dochází k denaturaci sekundární struktury RNA a umožnění následného nasednutí primeru oligo (dt) 23. Tab. 5: Složení reakční směsi (1. fáze reverzní transkripce) reakční komponenty zásobní koncentrace výsledná koncentrace templátová RNA 0,1 µg/ µl voda ((PCR reagent, Sigma, USA) 8 dntp mix (Sigma, USA) 10 mm 500 µm 1 oligo (dt)23 (Sigma, USA) 0,5 µg/ µl 3,5 µm 1 objem (µl) 2. fáze Připravené vzorky byly umístěny na led, aby bylo zajištěno jejich zchlazení, a do každé mikrozkumavky byly pipetovány jednotlivé reakční komponenty 2. fáze reverzní transkripce, které jsou uvedeny v tabulce 6. Výsledný objem činil 20 µl. Následně byly 38

39 všechny mikrozkumavky vloženy do termocykleru nastaveného na program č. 2 a byly podrobeny 2. fázi reverzní transkripce, při které dochází k syntéze nového řetězce cdna pomocí enzymu reverzní transkriptázy při 45 C po dobu 50 minut. Tab. 6: Složení reakční směsi (2. fáze reverzní transkripce) reakční komponenty zásobní koncentrace výsledná koncentrace voda (PCR reagent, Sigma, USA) 6 pufr AMV-RT (Sigma, USA) 10x 1x 2 inhibitor RNázy (Sigma, USA) 20 U/ µl 1 U/ µl 1 AMV-RT (Sigma, USA) 20 U/ µl 1 U/ µl 1 objem (µl) Semikvantitativní polymerázová řetězová reakce (PCR) Druhým krokem po převedení RNA na cdna reverzní transkripcí byla vlastní PCR reakce, při které byla získaná cdna amplifikována za přítomnosti vybraných primerů pro geny PIN1 a DRM1, jako referenční gen byl v obou případech použit β-tubulin. Do mikrozkumavek byly napipetovány jednotlivé reakční komponenty, které jsou popsány v tabulce 7. Po zvortexování a stočení připravené směsi byl nakonec přidán i vzorek templátové DNA. Celkový objem v každé mikrozkumavce činil 50 µl. Tab. 7: Složení reakční směsi na PCR reakci reakční komponenty zásobní koncentrace výsledná koncentrace objem (µl) voda (PCR reagent, Sigma, USA) 34,5 5x Green GoTaq buffer (Promega, USA) 5x 1x 10 dimetylsulfoxid (Sigma, USA) 2 % obj. 1 dntp mix (Sigma, USA) 10 mm 200 µm 1 primer (+,-) 50 pm/µl 1 pm/µl 2 GoTaq DNA polymeráza (Promega, USA) 5 U/ µl 0,05 U/ µl 0,5 cdna 1 Mikrozkumavky s namíchanou směsí byly krátce stočeny a umístěny do termocykleru, kde proběhla vlastní PCR reakce o 3 hlavních krocích, které se liší teplotami, časem a počtem cyklů (tab. 8). 39

40 Tab. 8: Reakční podmínky PCR reakce fáze PCR teplota ( C) počet cyklů čas (s) počáteční denaturace denaturace annealing elongace závěrečná elongace Použité specifické primery (tab. 9) navržené přímo pro postup semikvantitativní PCR byly syntetizovány v Laboratoři funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecké fakulty Masarykovy Univerzity v Brně. Sekvence primerů byly navrhnuty na základě sekvencí příslušných genů uvedených v databázi GenBank, sekvence primeru pro referenční betatubulin byla převzata z (Die et al., 2010). Stanovení úrovně exprese obou genů bylo provedeno ve dvou opakováních, tudíž není uvedeno statistické vyhodnocení. Tab. 9: Sekvence primerů název genu sekvence velikost PsPIN1 F 5 -CCC TCA TGG TTC AAA TCG TT-3 PsPIN1 R 5 -TTG GAG TCA AAG AAA CAC CAG A bp PsDRM1 F 5 -AAC TCA CCA CCA CCC TCA AAG ATG-3 PsDRM1 R 5 -GAT GTA GAC ACG TGG CAG AAG ATG bp β-tubulin F 5 -GCT CCC AGC AGT ACA GGA CTC T-3 β-tubulin R 5 -TGG CAT CCC ACA TTT GTT GA-3 59 bp Elektroforéza a detekce genů Ověření přítomnosti vybraných genů ve vzorcích DNA bylo provedeno elektroforetickou separací na agarózovém gelu. Po namíchání 1,2 % agarózového gelu následovalo jeho zchlazení na 60 C a poté do něj bylo opatrně přidáno fluorescenční barvivo ethidium bromid (tab. 10). Tab. 10: Složení agarózového gelu chemikálie množství agaróza (Sigma, USA) 1,2 g 1xTAE pufr 100 ml ethidium bromid 1,2 µl 40

41 Po ztuhnutí gelu o rozměru 85x100 mm byl do nanášecích jamek pipetován předem připravený roztok 18 µl amplifikované DNA (PCR produkt) a 2 µl nanášecího pufru Blue/Orange 6x Loading Dye (Promega, USA). Následovala 1hodinová elektroforetická separace při napětí 70 V v prostředí tris-acetátového pufru 1xTAE, který byl namíchán ze zásobního roztoku 50xTAE. (tab. 11) Tab. 11: Složení roztoku trisacetátového pufru chemikálie Tris báze (Serva, USA) ledová kyselina octová (Lachema, ČR) Na 2 EDTA 500 mm/l, ph 8 (Lachema, ČR) destilovaná voda množství 242 g 571 ml 100 ml Doplnit na objem 1000 ml Po dokončení elektroforézy byla detekce přítomnosti výsledných amplifikovaných vzorků provedena prostřednictvím vizualizace na gelu pod UV zářením. K nasnímání gelu byl využit dokumentační systém GDS 7500 (UVP, USA) a program Grab IT 2,0 (UVP, USA). Nakonec byla u nasnímaných gelů intenzita fluorescence jednotlivých variant vyhodnocena prostřednictvím programu GelWorks 1D Intermediate (UVP, USA). 41

42 4 VÝSLEDKY 4.1 Stanovení růstových křivek Pro úplnost výsledků a popis růstových projevů souvisejících s působením rostlinného hormonu strigolaktonu u modelové rostliny hrachu setého (Pisum sativum L) cv. Vladan, která byla použita pro následné experimenty exprese a imunocytolokalizace PIN1, jsou zde uvedeny růstové charakteristiky axilárních pupenů 1. a 2. nodu, jejichž studium je součástí bakalářské práce Denisy Smigové (Smigová, 2012). Experiment popsaný v této práci ukázal, že u dekapitovaných rostlin, u kterých bylo provedeno ošetření 2. axilárního pupene 50 µmol/l roztokem GR24 a následná aplikace téhož roztoku každých 24 hod. po dobu 5 dnů, byl růst 2. pupenu mírně inhibován (obr. 11) oproti kontrolním rostlinám (obr. 12), kde byl aplikován roztok bez syntetického strigolaktonu GR24. U 1. pupenu naopak došlo ke zvýšení růstového potenciálu. Obr. 11: Růstová křivka varianta 50 µmol/l GR24 Obr. 12: Růstová křivka varianta Kontrola 42

43 4.2 Exprese genů Vlastní experimenty byly zaměřeny na studium vlivu strigolaktonu na polární transport auxinu v průběhu časné odezvy axilárních pupenů na dekapitaci resp. dekapitaci s aplikací syntetického strigolaktonu GR24. Pro srovnání byly použity hladiny exprese v době dekapitace a aplikace roztoku a dále intaktní rostliny s aplikací stejných roztoků. Vzhledem k tomu, že bylo popsáno, že strigolakton moduluje kapacitu transportu auxinů (Leyser, 2009; Prusinkiewicz et al., 2009) provedli jsme nejprve analýzu exprese PIN1 na transkripční úrovni. Protože jsme chtěli zjistit především krátkodobou změnu exprese PIN1 kódujícího vstupní přenašeč auxinu, izolovali jsme RNA z axilárních pupenů 0, 1 a 6 hodin po dekapitaci a aplikaci roztoku. Stanovení expresních hladin PIN1 bylo provedeno semikvantitativní RT PCR s použitím β-tubulinu jako referenčního genu. V experimentu byly použity 7denní rostliny hrachu, jejichž reakce na dekapitaci a ošetření je charakterizována růstovou křivkou uvedenou v kapitole 4.1 (Smigová, 2012). Exprese genu PIN % hodina 6. hodin 50 0 Intakt K Intakt GR24 Dekap K Dekap GR24 Obr. 13: Exprese genu PIN1 v pupenech hrachu jednotlivých experimentálních variant 43

44 Úroveň exprese genu PIN1 byla porovnávána s referenčním genem pro β-tubulin a hladina exprese 100% byla nastavena dle exprese v čase 0, kdy byla provedena aplikace GR24 na pupen intaktní rostliny. U intaktní kontrolní varianty nedocházelo dle očekávání k žádné významné změně exprese PIN1 v obou časovych intervalech. Oproti tomu aplikace roztoku s 50 µm GR24 způsobila pokles o cca 30 %. Pokud rostliny dekapitujeme, můžeme po 1 hodině pozorovat nevýznamné snížení exprese, ale po 6 hodinách dojde k více než 100% nárůstu exprese PIN1. Dekapitace se současnou aplikací GR24 na pupen způsobila pouze malé zvýšení exprese jak po 1, tak po 6 hodinách po dekapitaci. Porovnáme-li expresi kontrolních a strigolaktonem ošetřených variant, pak u inktaktních rostlin po 1 i 6 hodinách syntetický analog strigolaktonu expresi mírně snižuje, ale u dekapitovaných rostlin aplikace GR24 po 1 hodině expresi zvyšuje a po 6 hodinách výrazně snižuje. Exprese genu DRM % hodina 6. hodin 20 0 Intakt K Intakt GR24 Dekap K Dekap GR24 Obr. 14: Exprese genu DRM1 v pupenech hrachu jednotlivých experimentálních variant Úroveň exprese genu DRM1 byla porovnávána s referenčním genem pro β-tubulin a hladina exprese 100% byla nastavena dle exprese v čase 0, kdy byl pupen intaktní rostliny ošetřen roztokem GR24. Jak graf zobrazuje, v případě intaktní kontroly došlo u 1hodinové i 6hodinové varianty k poklesu exprese DRM1, obdobný trend měla intaktní varianta ošetřená syntetickým strigolaktonem, ale pokles byl výraznější u 6hodinové varianty. Dekapitace způsobila u 1hodinové varianty kontrolní mírné navýšení exprese genu DRM1, zatímco u 44

45 6hodinové varianty pozorujeme pokles exprese tohoto genu až na 20%. V případě dekapitovaných rostlin je exprese snížena na cca 80% u 1hodinové varianty ošetřené srigolaktonem a u 6hodinové varianty je exprese v porovnání s úrovní exprese ostatních variant téměř neznatelná. 4.3 Imunocytolokalizace PIN1 proteinu Vzhledem k tomu, že zjištěné změny transkripční úrovně genů nemusí odrážet expresi proteinů, je nezbytné studovat expresi také na této urovni. Pro utvoření představy, jak je ovlivněn polární transport auxinu v axilárních pupenech po působení strigolaktonu, byla tedy provedena imunocytolokalizace auxinových výstupních přenašečů - PIN1 proteinů. Na mikrofotografiích, které byly vytvořeny na konfokálním laserovém skenovacím mikroskopu, jsou zobrazeny řezy středních částí jednotlivých pupenů, kde jsou viditelné různě intenzivní transportní dráhy auxinu s polarizovanými PIN1 proteiny. Imunolokalizace PIN1 proteinů byla provedena u pupenů všech vytvořených variant: 0hodinová kontrolní varianta odebraná z intakních rostlin ihned po ošetření aplikačním roztokem bez obsahu GR24. 1hodinová varianta dekapitované rostliny s 2. pupenem ošetřeným syntetickým analogem strigolaktonu GR24 a kontrolní ošetřené pouze aplikačním roztokem bez přídavku GR24, intaktní rostliny ošetřené GR24 a kontrolní (bez GR24). 6hodinová varianta dekapitovaná ošetřeřená a kontrolní, intaktní ošetřená a kontrolní, dlouhodobá varianta, u které ošetření aplikačním roztokem s obsahem resp. bez obsahu GR24 probíhalo po dobu 5 dnů. Z jednotlivých nasnímaných variant byly vybrány reprezentativní mikrofotografie nejméně z 10 pupenů s nejvyšší kvalitou a vypovídací hodnotou typické pro danou variantu. Následně byly vybrané snímky zobrazující jednotlivé varianty mezi sebou porovnány na základě intenzity a množství polarizace PIN1 proteinů v různých částech pupene, přičemž hlavní pozornost se soustředila zejména do oblasti pod apikálním meristémem pupene, listových primordií a u dlouhodobé varianty do oblasti viditelných cévních svazků a ke xylému přidružených buněk na bázi pupene. 45

46 Obr. 15: Imunohistochemická lokalizace PIN1 proteinu v 2. axilárním pupenu hrachu a: kontrola 0 hodin, b - e: 1 hodina, b-intaktní kontrolní rostliny bez GR24, c-intaktní rostliny, 50 µm GR24, d-dekapitované rostliny kontrola bez GR24, e-dekapitované rostliny, 50 µm GR24. Červeně signál imunolokalizace PIN1. Úsečka 100 µm. a b c d e 46