Enzymatická imunoanalýza pro kvantitativní měření hladiny C-peptidu v lidských klinických vzorcích

Transkript

1 C-peptide K Enzymatická imunoanalýza pro kvantitativní měření hladiny C-peptidu v lidských klinických vzorcích. TECHNICKÁ PODPORA A ZÁKAZNICKÝ SERVIS Se všemi dotazy se, prosím, obraťte na místní pobočku nebo distributora společnosti DakoCytomation. Výrobce: DakoCytomation Ltd Denmark House Angel Drove Ely Cambridgeshire, CB7 4ET Velká Británie Telefon: Fax: C-peptide březen CZ ( )

2 1 POUŽITÍ DakoCytomation C-peptide je ELISA systém (ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay) pro kvantitativní hodnocení hladiny C-peptidu v lidském séru a plazmě. 2 SOUHRNNÉ INFORMACE C-peptid je tvořen jako vedlejší produkt při tvorbě inzulínu pankreatickými ß buňkami. Proinzulín je proteolyticky štěpen, čímž vzniká ekvimolární množství zralého inzulínu a C-peptidu, které jsou následně secernovány do portálního oběhu. Nazývá se C-peptid, protože v molekule proinzulínu spojuje A a B řetězec inzulínu. C-peptid tvoří jednoduchý řetězece 31 aminokyselin (mol. hm. 3020D) a na rozdíl od inzulínu nemá žádnou známou fyziologickou funkci. Hladiny C-peptidu v periferním oběhu jsou vyšší a méně kolísají než hladiny inzulínu, protože C-peptid má delší cirkulační poločas než inzulín (2 5 násobně). Proto mohou plazmatické hladiny C-peptidu odrážet pankreatickou sekreci inzulínu spolehlivěji než hladina inzulínu samotného. 1 Měření hladiny C-peptidu má následující klinické využití: Hodnocení reziduální funkce ß buněk u pacientů léčených inzulínem a rozlišení mezi diabetem typu I a II. Zvláštní význam má jeho měření při rozhodnutí o indikaci inzulínové terapie u diabetu typu II. 2. Diagnóza falešné hypoglykémie. Neoprávněná aplikace inzulínu způsobuje zvýšenou hladinu inzulínu za nepřítomnosti elevace koncentrace C-peptidu. 3. Diagnóza inzulinomu, zvláště u pacientů léčených inzulínem. Měření C-peptidu se používá u inzulín supresních testů u euglykemických pacientů se suspektním inzulinomem. Zvýšené hladiny C-peptidu u těchto testů indikují inzulinom. 4. Marker reziduální pankreatické tkáně po pankreatektomii. V případě inzulinomu může být měření C-peptidu použito k detekci metastáz a odpovědi na terapii. Může sloužit rovněž k monitorování prospívání transplantovaných buněk Langerhansových ostrůvků nebo pankreatu. Až dosud bylo rutinní měření hladiny C-peptidu možné jen za použití radioimunoanalýzy, i když v literatuře byly popsány i HPLC metody. 2 DakoCytomation C-peptid je enzymatická imunoanalýza pro kvantitativní stanovení C-peptidu. 3 PRINCIP TESTU DakoCytomation C-peptid je metoda ELISA založená na dvou monoklonálních protilátkách. Současná inkubace vzorku s enzymem značenou protilátkou na mikrotitrační destičce potažené specifickou protilátkou proti C-peptidu tvoří komplex. V dalším kroku se vymyje nenavázaná enzymem značená protilátka. Detekce navázaných konjugátů je prováděna pomocí reakce se substrátem, 3,3',5,5'- tetramethylbenzidinu (TMB). Reakce je zastavena přidáním kyseliny, aby byl získán cílový spektrofotometricky odečitatelný kolorimetrický produkt. Odečtení kalibrátorů se známou hladinou C- peptidu umožňuje konstrukci kalibrační křivky, pomocí které lze stanovit hladiny C-peptidu v testovaných vzorcích. Princip analýzy je zobrazen níže na obr. 1. 1/14

3 Obr. 1: Princip analýzy DakoCytomation C-peptid Monoklonální protilátka proti C-peptidu Substrát C-peptide C-peptide C-peptid Konjugát anti-cpeptid/hrp Barva 4 DEFINICE Následující symboly a definice, použité ve zprávě o výrobku, jsou v souladu s normami ISO 15223, ISO 7000 a EN 980. N Kód výrobku a katalogové číslo Viz návod k použití Lze použít pro <n> testů Výrobce In vitro diagnostický zdravotnický prostředek Použitelné do Číslo šarže Teplotní rozmezí uchovávání od - do Přidejte vodu 5 DODANÁ ČINIDLA 96 Každý kit obsahuje dostatek materiálu k provedení 96 vyšetření. Datum expirace je vyznačeno na vnějším obalu kitu. 5.1 DAKOCYTOMATION C-PEPTID TEST OBSAHUJE Návod k použití. Jednu mikrotitrační destičku o 96 mikrojamkách, tvořenou 12 stripy po 8 mikrojamkách potažených myší monoklonální protilátkou proti C-peptidu. Uzavíratelný plastikový sáček pro uchování nepoužitých mikrojamek. Po jedné lahvičce následujících činidel: 5 ml kalibrátoru 1: Proteinová matrix s antimikrobiální látkou. 2/14

4 Kalibrátory 2 5 (lyofilizované): Syntetický C-peptid v proteinové matrix s antimikrobiální látkou. Analýza je kalibrována pomocí mezinárodního referenčního činidla IRR 84/510 a výsledné hodnoty jsou vyjádřeny jak v ng/ml, tak v SI jednotkách (pmol/l) (vypočítané pomocí molekulární hmotnosti C-peptidu, 3020D). Přesné hodnoty v obou jednotkách jsou uvedeny v Listu hodnot přiloženému k výrobku a musejí být vždy použity ke kalibraci analýzy. Přibližné hodnoty jsou následující: Kalibrátor ng/ml pmol/l 0 0 0, ,5 ml koncentrovaného konjugátu: Monoklonální protilátka proti C-peptidu kojugovaná s křenovou peroxidázou (HRP) v organickém pufrovaném roztoku obsahujícím protein, anorganické soli, červené barvivo a antimikrobiální látku. 10 ml rozpouštědla konjugátu Organický pufrovaný roztok obsahující anorganické soli, protein a antimikrobiální látku. 28 ml koncentrovaného promývacího pufru (X15) Organický pufrovaný roztok obsahující detergent, anorganické soli a antimikrobiální látku. 13 ml substrátu : substrát je tvořen stabilizovaným peroxidem a 3,3-5,5 - tetrametylbenzidinem. TMB je podle literatury považován za nekarcinogenní. Přesto však používejte osobní ochranné pomůcky, abyste zabránili přímé expozici. 13 ml zastavovacího roztoku 0,46 mol/l kyselina sírová. 5.2 ROZPOUŠTĚNÍ, SKLADOVÁNÍ A OPAKOVANÉ POUŽITÍ SOUČÁSTÍ KITU DakoCytomation C-peptid umožňuje testování až 86 sérií vzorků v období 8 týdnů. K zajištění optimálních funkčních charakteristik kitu je důležité, aby byly všechny rozpuštěné a nevyužité součásti kitu skladovány podle následujících pokynů Jamky mikrotitrační destičky potažené monoklonální protilátkou - Otevřete obal destičky naříznutím podél švu. Odlomte požadované množství mikrotitračních stripů a umístěte je do rámu. Používejte pouze kompletní stripy. Nepoužité mikrojamky vložte do uzavíratelného plastikového sáčku spolu s desikační látkou, pečlivě sáček uzavřete a skladujte při teplotě 2 8 C. Pokud jsou při skladování mikrojamek dodrženy doporučené postupy, mohou být používány po dobu až 8 týdnů od prvního otevření Kalibrátor 1 Připravený pro okamžité použití. Nepoužitý kalibrátor 1 skladujte při teplotě 2 8 C. Kalibrátor 1 může být při dodržení skladovacích podmínek používán po dobu až 8 týdnů od prvního otevření. 3/14

5 5.2.3 Kalibrátory 2 5 / / / Lyofilizované kalibrátory rozpusťte v 1 ml čerstvé destilované nebo deionizované vody. Po rozpuštění zátky odstraňte. Před použitím nechte roztoky po dobu minut při pokojové teplotě a lehce je zamíchejte. Rozpuštěné kalibrátory rozdělte na alikvotní části a skladujte ve vertikální poloze po dobu až pěti dnů při teplotě 2 8 C nebo až 8 týdnů při teplotě 20 C Koncentrát konjugátu a ředidlo konjugátu / Pro zředění smíchejte koncentrovaný kojugát (2,5 ml) s ředidlem konjugátu (10 ml). Toto množství postačuje pro 96 mikrojamek. Před použitím jemně zamíchejte. Konjugát v pracovní koncentraci skladujte při teplotě 2 8 C po dobu až 8 týdnů Koncentrovaný promývací pufr Dodává se 15x koncentrovaný. Promývací pufr o pracovní koncetraci připravte smícháním 1 dílu promývacího pufru se 14 díly čerstvé deionizované nebo destilované vody. Na 96 mikrojamek rozřeďte 28 ml koncentrovaného promývacího pufru s 392 ml deionizované nebo destilované vody. Získáte celkem 420 ml roztoku. Pracovní koncentraci promývacího pufru připravte podle potřeby v den použití. Nespotřebovaný koncentrát skladujte při teplotě 2-8 C. Nespotřebovaný pracovní roztok promývacího pufru neuchovávejte pro další použití (viz kapitola ) Roztok substrátu Připraveno k okamžitému použití. Nepoužitý substrát skladujte při teplotě 2 8 C a chraňte před světlem Zastavovací roztok Připraven k okamžitému použití. Nepoužité činidlo skladujte při teplotě 2 8 C. 6 DALŠÍ ČINIDLA 6.1 ČINIDLA Čerstvá deionizovaná nebo destilovaná voda k rozpuštění kalibrátorů 2 5 a přípravě pracovní koncentrace promývacího pufru. 6.2 PŘÍSLUŠENSTVÍ Následující produkty jsou určeny k použití se systémem DakoCytomation C-peptid. Pro získání dalších informací kontaktujte místní pobočku nebo distributora produktů společnosti DakoCytomation. Diabetes Immunoassay Control Set (kód No. S6247) slouží jako třístupňová kontrola používaná u imunoanalýz souvisejících s diabetem. 4/14

6 7 VYBAVENÍ Potřebné vybavení: Přesné pipety a jednorázové špičky nebo regulovatelné vícekanálové pipety a špičky k přenášení 25µL 250µL. Korýtka na činidla tvaru V. Stopky. Čistý savý papír (na který se mohou vyklepávat mikrotitrační jamky). Odměrný válec o objemu 500 ml. Třepačka mikrotitračních destiček. Pro získání informací o vhodnosti třepačky mikrotitračních destiček kontaktujte místní pobočku nebo distributora produktů společnosti DakoCytomation. Automatická promývačka destiček (volitelně) nebo jiné vhodné vybavení k promytí 8 mikrotitračních stripů (oddíl ). Spektrofotometr nebo čtečka destiček EIA schopná číst destičky s 96 mikrojamkami a stripy po 8 mikrojamkách při absorbanci 450 nm, s referenční vlnovou délkou nm. (Volitelné, oddíl 10.3, Odečítání výsledků testů). Pro tuto analýzu jsou k dispozici Poznámky k používání platné pro otevřené automatizované systémy. Kontaktujte místní pobočku společnosti DakoCytomation nebo svého distributora. 8 UPOZORNĚNÍ In vitro diagnostikum. Každá osoba provádějící analýzu za použití tohoto produktu musí být vyškolena v jeho použití a musí mít zkušenosti s laboratorními postupy. 8.1 BEZPEČNOSTNÍ UPOZORNĚNÍ Zastavovacím roztokem je kyselina sírová o koncentraci 0,46 mol/l. Používejte ochranné oděvy a brýle k zamezení kontaktu s kůží a očima Klinické vzorky mohou obsahovat infekční agens, např. virus hepatitidy B a HIV. Se všemi vzorky, kalibrátory, kontrolami a materiály, které s nimi přijdou do kontaktu, by mělo být nakládano jako s potenciálně infekčními Ujistěte se, že všechny řezné ranky, odřeniny a kožní léze jsou vhodně chráněny a udělejte všechna opatření, abyste zabránili autoinokulaci nebo kontaktu se sliznicemi V určeném pracovním prostoru nejezte, nepijte, nekuřte, nepřipravujte ani neskladujte potraviny a neaplikujte kosmetické připravky Nepipetujte ústy Při manipulaci s klinickými vzorky používejte jednorázové rukavice a po skončení práce s potenciálně infekčním materiálem si vždy umyjte ruce Veškeré klinické vzorky a činidla zlikvidujte v souladu s místními předpisy. 5/14

7 8.1.8 Bezpečnostní list je profesionálním uživatelům k dispozici na vyžádání. 8.2 TECHNICKÁ UPOZORNĚNÍ Žádná ze součástí systému nesmí být použita po uplynutí data expirace vytištěného na štítku. Nemíchejte různé šarže činidel Výsledek testu bude nepříznivě ovlivněn, pokud budou činidla nesprávně naředěna, modifikována nebo skladována za jiných podmínek, než je uvedeno v oddílu Zamezte kontaminaci činidel Zajistěte, aby nedošlo ke zkřížené kontaminaci mezi jednotlivými mikrojamkami. Je nezbytně nutné, aby monoklonální protilátka s navázaným enzymem nekontaminovala činidla nebo další vybavení. Pro rozdělování konjugátu používejte zvláštní pipetu a dbejte na to, aby nedošlo ke kontaktu s okrajem jamky nebo k jejímu potřísnění Konjugát zaschlý na okrajích mikrojamek může nepříznivě ovlivnit výsledek testu Všechno vybavení včetně promývaček a nástrojů k manipulaci s roztoky musí být prosto mikrobiální kontaminace, správně kalibrováno a udržováno podle instrukcí výrobce Nespotřebovaný pracovní roztok promývacího pufru neuchovávejte pro další použití. Pokud se nádoby na promývací pufr nepoužívají, je třeba je vymýt deionizovanou nebo destilovanou vodou a nechat vyschnout Mikrojamky nemohou být použity opakovaně Substát zbarvený modře ještě před aplikací do mikrojamek, nepoužívejte Chraňte substrát před světlem Doporučujeme, aby byly vzorky vyšetřovány duplicitně, dokud nedojte k zaběhnutí procesu analýzy Výsledky testů by měly být interpretovány v souvislosti s dostupnými epidemiologickými studiemi, klinickým stavem pacienta a dalšími diagnostickými postupy. 9 ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ Systém DakoCytomation C-peptid je určen pro použití s lidským sérem a plazmou. 9.1 SÉRUM Krev odebírejte venepunkcí do zkumavek bez dalších aditiv, nechejte ji zkoagulovat a pak oddělte sérum od buněk pomocí centrifugace. Vzorky je možné skladovat až 3 dny při teplotě 2 8 C nebo až 28 dnů při teplotě 20 C. Pokud je to nezbytné, alikvotně vzorky rozdělte, abyste zabránili opakovanému zmražování a rozmražování. Nerozmrazujte vzorky při teplotě vyšší než je teplota okolí. 9.2 PLAZMA Krev odebírejte venepunkcí do zkumavek obsahujících heparin nebo EDTA jako antikoagulační činidlo. Krev centrifugujte, oddělte plazmatickou frakci a skladujte po dobu až 3 dnů při teplotě 2 8 C nebo po dobu až 28 dnů při teplotě 20 C. Pokud je to nezbytné, alikvotně vzorky rozdělte, abyste zabránili opakovanému zmražování a rozmražování. Nerozmrazujte vzorky při teplotě vyšší než je teplota okolí. 6/14

8 10 POSTUP TESTU PŘED PROVÁDĚNÍM TESTU SI, PROSÍM PROSTUDUJTE ODDÍL 8.2, TECHNICKÁ OPATŘENÍ OBECNÉ POZNÁMKY Zajistěte, aby při každé analýze byly dodrženy stejné reakční časy a činidla byla přidávána ve stejné posloupnosti Do reakčního korýtka pipetujte jen tolik roztoku, kolik je nezbytné pro každou analýzu. Přebytečná činidla po použití nevracejte zpět do původní láhve POSTUP ANALÝZY POZNÁMKA: Protokol analýzy vyžaduje použití třepačky mikrotitračních destiček. Pro získání informací o vyhovujících třepačkách kontaktujte místní pobočku nebo distributora společnosti DakoCytomation Přidání kalibrátoru, vzorku a kontrolního činidla Umístěte potřebný počet mikrotitračních stripů do držáku mikrojamek, podle počtu potřebných stanovení. Do mikrojamek napipetujte 25 µl kalibrátoru, vzorku nebo kontrolního činidla. Pro kalibrátory použijte duplikované mikrojamky. Umístění vzorku každého pacienta na mikrotitrační destičce musí být zaznamenáno Přidání konjugátu Po aplikaci všech kalibrátorů, vzorků a kontrol přidejte 100 µl konjugátu do každé mikrojamky. Zamezte zkřížené kontaminaci mezi jednotlivými mikrojamkami První inkubace Umístěte mikrotitrační destičku do třepačky a inkubujte za třepání při teplotě C po dobu 60 minut Promývání mikrojamek Mikrojamky promývejte promývacím pufrem o pracovní koncentraci (oddíl 5.2.5). Promývací technika je pro výsledek testu rozhodující a měla by být provedena tak, aby bylo zajištěno úplné naplnění (s minimálně 250 µl promývacího pufru o pracovní koncentraci) a vyprázdnění mikrojamek. Nezbytné jsou tři promývací cykly, buď za použití manuální nebo automatické promývací techniky. Manuální promývání Pokud promýváte mikrojamky manuálně, odsajte nebo vyklepejte obsah mikrojamek a za použití čerstvě připraveného promývacího pufru zajistěte kompletní zaplnění a vyprázdnění mikrojamek. Mezi každým promýváním odklepejte všechen přebytečný promývací pufr z obrácených mikrojamek na čistý savý papír. Celý proces zopakujte dvakrát, mezi jednotlivými kroky destičku otočte, abyste začali z opačné strany (celkem 3 promývací cykly). Účinnost manuálního promývání je dále zajištěna, pokud je promývací pufr aplikován pod takovým úhlem, aby vytvořil v mikrojamkách vír. Po závěrečném promytí destičku otočte a oklepejte na savý papír, aby došlo k odstranění posledních zbytků promývacího pufru. Automatické promývání Automatické promývačky naprogramujte na provedení tří cyklů. Namáčecí kroky nejsou potřebné. Promývačky musejí být správně kalibrovány, aby bylo zajištěno úplné naplnění a vyprázdnění mikrojamek během každého promývání. Po závěrečném promytí destičku otočte a oklepejte na savý papír, aby byly odstraněny poslední zbytky promývacího pufru. 7/14

9 Přidání substrátu a druhá inkubace Přidejte 100 µl roztoku substrátu do každé mikrojamky. Umístěte mikrotitrační destičku do třepačky a třepejte po dobu 10 minut při teplotě C. Poznamka: Pokud používáte čtečku destiček s maximem absorbance 2,2 AU, snižte dobu inkubace substrátu na 7 minut Zastavení reakce Do každé mikrojamky přidejte 100 µl zastavovacího roztoku tak, aby byl dodržen u každého stripu tentýž časový interval, jak je popsáno v oddílu Zajistěte důkladné promíchání obsahu jamek ODEČÍTÁNÍ VÝSLEDKŮ TESTU FOTOMETRICKÉ ODEČÍTÁNÍ Fotometrické odečtení mikrotitrační destičky musí být provedeno do 30 minut od aplikace zastavovacího roztoku. Do odečtení chraňte destičku před světlem. Promíchejte obsah mikrojamek a odečtěte absorbanci u každé jamky za použití vhodného spektrofotometru nebo EIA čtečky destiček při 450 nm. Ujistěte se, že dna mikrojamek jsou před odečtením čistá, a zkontrolujte, zda se v nich nenachází cizí materiál. Čtečka by měla být před odečtením destičky kalibrována na vzduch (tj bez destičky v zařízení). Pokud spektrofotometr umožňuje použití referenční vlnové délky ( nm), mělo by být provedeno čtení obou vlnových délek, protože to vyloučí každý možný nesoulad způsobený odchylkami, jako např. nečistotou nebo skvrnami na optickém povrchu mikrojamek SOUHRNNÉ INFORMACE O PROTOKOLU ANALÝZY DAKOCYTOMATION C-PEPTID Zajistěte, aby všechna činidla dosáhla před použitím pokojové teploty (15 30 C). Přidejte 25 µl vzorku nebo kalibrátoru Přidejte 100 µl konjugátu Promyjte (3x) Inkubujte po dobu 60 minut za stálého třepání při teplotě C Přidejte 100 µl substrátu Přidejte 100 µl zastavovacího roztoku Inkubujte po dobu 10 minut za stálého třepání při teplotě C Odečtěte absorbanci při 450 nm 8/14

10 11 VÝPOČTY A VÝSLEDKY Výsledky vzorků pacientů jsou odečteny z kalibrační křivky konstruované manuálně nebo počítačem AUTOMATICKÉ VÝPOČTY Prostudujte manuál čtečky destiček. Získanou absorbanci zaneste do grafu proti koncentraci C-peptidu v použitém kalibrátoru. Při konstrukci kalibrační křivky, ze které jsou odečítány výsledky pacientů, je doporučeno použít 4 parametrů. Vzhledem k charakteru čtyřparametrické konstrukce může být nezbytné definovat hodnotu kalibrátoru 1 jako 0,001. Tím je zajištěn průběh křivky se zachycením všech dat. Pro získání dalších podrobností prosím kontaktujte místní pobočku nebo distributora společnosti DakoCytomation MANUALNÍ VÝPOČTY Výsledky mohou být počítány manuálně za použití grafického papíru. Zaneste koncentraci C-peptidu na osu x v lineárním měřítku proti hodnotě absorbance na ose y. Zkonstruujte kalibrační křivku a použijte ji ke stanovení koncentrace C-peptidu ve vzorcích pacientů TYPICKÁ KALIBRAČNÍ KŘIVKA Schéma 1: Typická kalibrační křivka C-peptidu (ng/ml) Absorbance (Au) Koncentrace C-peptidu (ng/ml) Poznamka: Tento graf je pouze ilustrační a neslouží ke stanovení výsledků. 9/14

11 11.4 ŘEDĚNÍ VYSOCE KONCENTROVANÝCH VZORKŮ Vzorky s očekávanou koncentrací C-peptidu vyšší než nejvyšší kalibrátor rozřeďte před analýzou kalibrátorem 1 v poměru 1:4 (v/v). 12 OMEZENÍ VÝKONNOSTI 12.1 INTERFERENCE Klinická hodnocení ukazují, že vysoké koncentrace lipidů nebo bilirubinu ve vzorcích neinterferují s analýzou C-peptidu. Nebyly zaznamenány žádné interference s revmatoidním faktorem ani s heterofilními protilátkami HEMOLÝZA Výrazně hemolytické vzorky pro analýzu nepoužívejte, protože mohou vést k nižším detekovaným hodnotám "HOOK EFEKT" ODPOVÍDAJÍCÍ VYSOKÝM DÁVKÁM U systému s dvoumístnou imunoanalýzou může být reakční křivka při extrémně vysoké analytické koncentraci obrácena. U analýzy C-peptidu se tento efekt projevuje při koncentraci C-peptidu vyšší než 120 ng/ml ( pmol/l) SÉRUM A PLAZMA Použita může být jak plazma, tak i sérum. Během klinického hodnocení nebyly nalezeny klinicky významné rozdíly při měření C-peptidu ve vzorcích séra a plazmy. Jako antikoagulační činidlo může být použit jak heparin, tak EDTA PROINZULÍN AND PROINZULÍNOVÉ KOMPLEXY I když molární koncentrace cirkulujícího C-peptidu až 50krát převyšují koncentraci proinzulínu, mohou vzorky se zvýšenou hladinou proinzulínu vést ke zvýšené detekované hladině C-peptidu (oddíl ). Přítomnost cirkulujících komplexů anti-inzulínových protilátek s proinzulínem mohou také interferovat s analýzou. V takových případech doporučujeme, aby byly hladiny C-peptidu měřeny po předchozí precipitaci polyetylenglykolem (PEG) LEDVINOVÁ NEDOSTATEČNOST Pacienti se závažnou ledvinovou nedostatečností mohou mít abnormálně vysoké hladiny C-peptidu, protože ledviny jsou hlavním místem jeho metabolizmu FORENZNÍ VYUŽITÍ Analýza C-peptidu neslouží k forenzním účelům a nebyla uznána platnou u postmortálních vzorků. 10/14

12 13 OČEKÁVANÉ HODNOTY Doporučujeme každé laboratoři, aby si stanovila vlastní referenční intervaly. Referenční intervaly se mohou mezi jednotlivými metodami významně lišit. Nepoužívejte referenční interval stanovený pro jinou metodu. 14 CHARAKTERISTIKY VÝKONNOSTI Údaje prezentované v tomto oddíle byly získány při nezávislých klinických hodnoceních a/nebo byly poskytnuty společností DakoCytomation Ltd PŘESNOST Přesnost v rámci analýzy (intra assay) Tři soubory vzorků pacientů pokrývajících rozsah analýzy byly testovány 24-krát na jedné destičce. Soubor n Průměr SD (ng/ml) Průměr SD (pmol/l) CV (%) ,55 0, ,3 2, ,6 0, ,3 3, ,2 0, ,0 3, Přesnost mezi analýzami (inter assay) Tři soubory vzorků pacientů pokrývající rozsah analýzy byly testovány 10 analýzami. Soubor n Průměr SD (ng/ml) Průměr SD (pmol/l) CV (%) ,77 0, ,4 4, ,4 0, ,0 1, ,1 0, ,8 3, Detekční limit (Citlivost) Detekční limit byl stanoven při 2 analýzách testováním 20 replikovaných vzorků nulového kalibrátoru. Průměrná získaná hodnota odpovídá 2,5 násobku standardní odchylky průměrného signálu kalibrátoru 1. Detekční limit: 0,09 ng/ml (30 pmol/l) 11/14

13 14.2 PŘESNOST Linearita Vzorky tří pacientů (plazma s přídavkem heparinu) s vysokou analytickou koncentrací byly ředěny kalibrátorem Výtěžnost Vzorek Faktor ředění Výsledek (ng/ml) Zjištěná/Očekávaná (%) 1 neředěný 1:2 1:4 2 neředěný 1:2 1:4 3 neředěný 1:2 1:4 Tři směsné vzorky plazmy s nízkou analytickou koncentrací byly obohaceny různými koncentracemi C-peptidu a výtěžnost byla vypočítána v procentech. 7,6 3,8 2,0 8,0 4,1 2,1 8,1 4,1 2, Dodaný C-peptid (ng/ml) Směsný vzorek 1 Směsný vzorek 1 + 1,9 Směsný vzorek 1 + 4,3 Směsný vzorek 1+ 7,8 Směsný vzorek 2 Směsný vzorek 2 + 1,9 Směsný vzorek 2 + 4,3 Směsný vzorek 2 + 7,8 Výsledek (ng/ml) 2,4 4,3 6,7 9,7 1,9 3,6 5,9 9,5 Výtěžnost (%) Směsný vzorek 3 Směsný vzorek 3 + 1,9 Směsný vzorek 3 + 4,3 Směsný vzorek 3 + 7,8 1,5 3,5 6,0 9, /14

14 Zkřížená reaktivita Specifičnost analýzy byla hodnocena sledováním zkřížené reaktivity se strukturálně podobnými peptidy a hormony. Zkřížená reaktivita (%) byla vypočítána z množství C-peptidu a množství zkříženého reaktantu vykazujícího při analýze stejný signál. Analýza Zkřížená reaktivita (%) Intaktní lidský proinzulín (biosyntetický) proinzulín rozštěpený mezi AK lidský inzulín * * Inzulín v koncentraci pmol/l byl pod detekčním limitem analýzy C-peptidu. Koncentrace intaktních nebo rozštěpených proinzulínů nalačno tvoří obvykle jen 1 2% koncentrace C-peptidu. Zkřížená reaktivita těchto molekul proto není klinicky signifikantní. 13/14

15 15 LITERATURA 1. Haibach H, Dix J & Shah J (1987). Homicide by insulin administration. Journal of Forensic Sciences, 32: 1, Heding LG (1975). Radioimmunological determination of human C-peptide in serum. Diabetologia, 11: Hanning I, Home PD & Alberti KGMM (1985). Measurement of free insulin concentrations: the influence of the timing of extraction of insulin antibodies. Diabetologia, 28: /14