MINICAP HEMOGLOBIN(E) MINICAP. Ref Ref. 2227* 2018/07

Transkript

1 MINICAP HEMOGLOBIN(E) Ref Ref. 2227* MINICAP 2018/07

2 MINICAP HEMOGLOBIN(E) S PŘÍSTROJEM MINICAP ZAMÝŠLENÝ ÚČEL Sada MINICAP HEMOGLOBIN(E) je navržena pro oddělení normálních hemoglobinů (A, F a A2) a pro detekci většiny variant hemoglobinu (zejména S, C, E nebo D) elektroforézou se systémem MINICAP v alkalickém tlumivém roztoku (ph 9,4). MINICAP provádí všechny sekvence automaticky pro získání kompletního profilu hemoglobinu pro kvalitativní nebo kvantitativní analýzu hemoglobinů. Zkouška se provádí s hemolyzovanými, sedimentovanými, odstředěnými nebo propranými červenými krvinkami z krevních vzorků odebraných do zkumavek potažených EDTA draselným jako antikoagulantem. Proprané červené krvinky nejsou pro provedení analýzy nezbytné. Pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Hemoglobin je komplexní molekula složená ze dvou párů polypeptidových řetězců. Každý řetězec je připojen k hem-chelátovému komplexu protoporfyrinu s dvojmocným Fe. Hem je u všech hemoglobinů stejný. Typ hemoglobinu je určen proteinovou částí, zvanou globin. Polypeptidové řetězce alfa, beta, gama a delta tvoří normální lidské hemoglobiny : hemoglobin A... = α 2 β 2 hemoglobin A2... = α 2 δ 2 fetální hemoglobin F... = α 2 γ 2 Alfa řetězec je totožný u všech těchto tří hemoglobinů. Prostorová struktura hemoglobinu a ostatní molekulové vlastnosti (jako u všech ostatních bílkovin) závisí na prostorovém uspořádání a sekvenci aminokyselin, které tyto řetězce tvoří. Substituce aminokyselin mutací je zodpovědná za tvoření variant hemoglobinu, které mají různý povrchový náboj a následně rozdílnou pohyblivost v elektroforetickém poli, jež rovněž závisí na ph a iontové síle tlumivého roztoku. Výsledné kvalitativní (nebo strukturální) abnormality se nazývají hemoglobinopatie (9, 10, 13). Snížená syntéza jednoho z hemoglobinových řetězců vede ke kvantitativním (nebo regulačním) abnormalitám zvaným talasemie. Elektroforéza hemoglobinu je zavedená technika běžně používaná v klinických laboratořích pro vyšetření vzorků pro zjištění hemoglobinových abnormalit (1, 2, 3, 4, 12). Systém MINICAP byl vyvinut ke kompletní automatizaci s rychlým dělením a přijatelným rozlišením. Tuto techniku lze z mnoha hledisek zařadit mezi klasickou zónovou elektroforézu a kapalinovou chromatografii (8, 11). Systém MINICAP používá princip kapilární elektroforézy ve volném roztoku. Elektricky nabité molekuly jsou děleny podle elektroforetické pohyblivosti v alkalickém tlumivém roztoku o určitém ph. Dělení je rovněž závislé na ph elektrolytu a elektroosmotickém toku (5). Systém MINICAP má 2 kapiláry v paralelním zapojení, což umožňuje 2 paralelní analýzy pro kvantifikaci hemoglobinu. Ředění vzorku hemolyzačním roztokem je připraveno a nastříknuto aspirací na anodovém konci kapiláry. Potom následuje vysokonapěťové dělení bílkovin a přímá detekce hemoglobinů při 415 nm na katodovém konci kapiláry. Před každou analýzou jsou kapiláry promývány promývacím roztokem a promytím tlumivém roztokem připraveny k další analýze. Hemogobiny jsou rozdělené v křemenných kapilárách a jsou přímo detekovány a specificky detekovány při absorbanci vlnové délky 415 nm, která je pro ně specifická. Výsledné elektroforeogramy jsou vizuálně vyhodnocovány z hlediska abnormalit. Přímá detekce poskytuje přesnou kvantifikaci individuální hemoglobinové frakce se zvláštním zájmem např. o hemoglobin A2 při diagnostikování ß-talasemie. Vysoké rozlišení této metody by mělo navíc umožnit identifikaci variant hemoglobinu, zejména oddělení hemoglobinů S od D a E od C. Kvantifikace hemoglobinu A2 se může také provádět za přítomnosti hemoglobinu E. m tlumivého roztoku s alkalickým ph se detekují normální a abnormální hemoglobiny (nebo varianty) v následujícím pořadí od katody k anodě : δa 2 (varianta A2), C, A2/O-Arab, E, S, D, G-Filadelfie, F, A, Hope, Bart, J, N-Baltimore a H. Nezobrazení karbonanhydrázy na záznamech z elektroforézy hemoglobinů umožní identifikovat variantu A2 v této migrační zóně. ČINIDLA A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ MINICAP HEMOGLOBIN(E) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽkY kat. Č kat. Č. 2227* Tlumivý roztok (připravený k použití) 2 lahviček, 250 ml každá 6 lahviček, 250 ml každá Hemolyzační roztok (připravený k použití) 1 lahvička, 225 ml 3 lahviček, 225 ml každá Promývací roztok (zásobní roztok) 1 lahvička, 25 ml 3 lahviček, 25 ml každá Reagenční nádobky 1 balení po 125 kusech 3 balení po 125 kusech v každém Filtry 3 filtry 3 filtry Kontejnery na použité nádobky 4 kontejnery 12 kontejnerů Štítky s čárovými kódy pro hemolyzační roztok 5 listů po 4 štítcích 15 listů po 4 štítcích * SADA MINICAP HEMOGLOBIN(E) MAXI-KIT Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. VAROVÁNÍ : nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik SEBIA NÁVOD - Czech

3 1. TLUMIVÝ ROZTOk Příprava Tlumicí roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Tlumivý roztok k analýze hemoglobinů v systému MINICAP. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Tlumivý roztok skladujte v chladničce (2 až 8 C). Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky tlumivého roztoku. Neskladujte dlouhodobě při pokojové teplotě nebo v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. NEMRAZIT. DŮLEŽITÉ : Při skladování při 2-8 C a před použitím je nutné nechat roztok vytemperovat na pokojovou teplotu. Pro plnou lahvičku to znamená dobu nejméně 3 hodiny. Pokud není tento pokyn dodržován, mohou být ovlivněny výsledky. VAROVÁNÍ : Nepředehřívejte tlumicí roztok v horké vodě. Po otevření lahvičky s roztokem a jejím vložení do systému MINICAP je roztok stabilní při pokojové teplotě (15 až 30 C) nejméně 1 měsíc (akumulovaný čas). Po každém použití musí být tlumivý roztok nutně ihned uložen do chladničky (2 až 8 C), pak je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky s tlumivým roztokem. DŮLEŽITÉ : Akumulovaný čas skladování tlumivého roztoku při pokojové teplotě nesmí překročit 1 měsíc. Doba 1 měsíce zahrnuje i dobu potřebnou pro temperování tlumivého roztoku na pokojovou teplotu. Zředěný tlumivý roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 2. HEMOLYZAČNÍ ROZTOk Příprava Hemolyzační roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok ph 8.7 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro ředění a hemolýzu červených krvinek. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Hemolyzační roztok skladujte v chladničce (2 až 8 C). Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky hemolyzačního roztoku. Neskladujte při pokojové teplotě nebo v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. NEMRAZIT. Hemolyzační roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. DŮLEŽITÉ : Po každém použití lahvičku s hemolyzačním roztokem ihned uzavřete a uložte do chladničky. POZNÁMKA : Hemolyzační roztok může mít více nebo méně žlutooranžové zbarvení bez jakýchkoli nežádoucích vlivů na jeho vlastnosti. 3. PROMÝVACÍ ROZTOk Příprava Lahvička zásobního promývacího roztoku může být zředěna až na 250 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. K promývání kapilár před a po elektroforéze hemoglobinu. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby na promývací se roztok se doporučuje vymýt otvor nádoby a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřených nádobách. Zásobní promývací roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíců. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. 4. REAGENČNÍ NÁDOBkY Nádobky na jedno použití pro přípravu biologických vzorků pro analýzu s použitím automatizovaného nástroje. Umístění nádobek MINICAP na automatický podávací systém. Jedna reakční nádobka je určena k analýze 2 vzorků séra. VAROVÁNÍ : Po použití je třeba si s reakčními nádobkami obsahujícími biologické vzorky počínat se zvýšenou opatrností. Jakmile je analýza dokončena, reakční nádobky je nutné zlikvidovat spolu s biologickým odpadem a NIKDY se nesmí používat znovu. Skladování Před použitím skladujte reakční nádobky v jejich uzavřeném obalu na čistém a suchém místě a při teplotě v rozmezí 2 a 30 C. 5. FILTRY Filtry na jedno použití k filtraci tlumivého roztoku pro analýzu, pracovního promývacího roztoku a destilované vody (používají se k vyplachování kapilár). DŮLEŽITÉ : Při výměně soupravy systematicky vyměňte všechny filtry. Při manipulaci a instalaci filtrů noste čisté rukavice. Našroubujte jeden filtr na konektor umístěný na konci každé zkumavky ponořené do lahviček s tlumivým roztokem, promývacím roztokem nebo s deionizovanou vodou. Při vkládání filtrů do systému MINICAP opláchněte konektory a zkumavky destilovanou nebo deionizovanou vodou. Skladování Filtry skladujte v originálních, utěsněných obalech, na suchém místě, při pokojové teplotě nebo v chladničce. 6. kontejnery NA POUŽITÉ NÁDOBkY Kontejnery slouží k automatickému sběru použitých reagenčních nádobek v systému MINICAP. Umístění v systému MINICAP v místě zamýšleného použití. VAROVÁNÍ : S kontejnery obsahujícími reagenční nádobky s biologickými vzorky se musí nakládat s opatrností

4 7. ŠTÍTkY S ČÁROVÝMI kódy PRO HEMOLYZAČNÍ ROZTOk Štítky pro identifikaci zkumavek obsahujících hemolyzační roztok (HEMOLYZAČNÍ ROZTOK HEMOGLOBIN(E)). POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. kontrolní ROZTOk NORMAL 2 CONTROL Složení Kontrolní roztok Normal 2 Control (SEBIA, kat. č. 4778) se získává ze zásobních normálních lidských krevních vzorků. Roztok je ve stabilizované lyofilní formě. Zamýšlený účel Kontrolní roztok Normal 2 Control je zamýšlený jako migrační kontrola před spuštěním nové sekvence analýzy a pro kontrolu jakosti kvantifikace lidského hemoglobinu A2 elektroforézou se systémem MINICAP HEMOGLOBIN(E). Nařeďte každou lahvičku s roztokem Normal 2 Control přesným objemem destilované nebo deionizované vody, jak je uvedeno v příbalovém letáku roztoku Normal 2 Control. Nechte 30 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Migrační kontrola : Roztok Normal 2 Control lze používat následovně : naneste naředěný roztok Normal 2 Control do mikrozkumavky, uřízněte víčko mikrozkumavky, umístněte mikrozkumavku, uloženou v nové hemolyzační zkumavce, která slouží jako podpora (a je označená štítkem se stejným čárovým kódem jako roztok Normal 2 Control), do pozice č. 28 na otočném autosampleru systému MINICAP (pozice pro "kontrolu"), nalijte 5 ml hemolyzačního roztoku MINICAP HEMOGLOBIN(E) do hemolyzační zkumavky (označené štítkem se stejným čárovým kódem hemolyzačního roztoku), bez vzduchových bublin a umístěte ji do pozice č. 27 v otočném autosampleru (pozice "ředicího roztoku / roztoku") (pokud zkumavka nebo hemolyzační roztok chybí, zobrazí se zpráva). DŮLEŽITÉ : Ověřte, že se nevytvořila žádný pěna dřív, než vložíte zkumavku do otočného autosampleru. zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP. zavřete dvířka systému MINICAP a analýza se automaticky zahájí. v okně, které se objeví na obrazovce, vyberte pro provedení číslo analýzy Normal 2 Control podle následujících označení a ověřte : - 1 analýza Normal 2 Control před spuštěním nové sekvence analýzy, - 2 analýzy po výměně lahvičky s analyzačním tlumivým roztokem (dokonce i když má stejné číslo šarže) nebo změně techniky, po sekvenci čištění kapiláry roztokem CAPICLEAN, po aktualizaci softwaru nebo po aktivaci kapilár, - 3 analýzy při prvním použití programu analýzy "HEMOGLOBIN(E)" s přístrojem MINICAP nebo po dlouhém odstavení (více než 1 týden). Výsledky jsou potom automaticky vyhodnoceny softwarem pro analýzu dat. DŮLEŽITÉ : Frakce hemoglobinu A v roztoku Normal 2 Control musí vykazovat minimální optickou hustotu (optical density) (OD) 0,10. Při nižší hodnotě nedojde ke správnému opětovnému vycentrování záznamu z elektroforézy. Při analýze vzorků může být identifikace frakcí hemoglobinů,, Hb F, 2 a Hb C a také při stanovení migrační zóny dalších variant nemožná nebo špatná (viz odstavec ANALÝZA VÝSLEDKU). DŮLEŽITÉ : Pro nejlepší použití roztoku Normal 2 Control je nutné použít jeden štítek s čárovým kódem pro identifikaci hemolyzační zkumavky, jež drží mikrozkumavku obsahující roztok 2 Control (před použitím odřízněte víčko mikrozkumavky). Po instalaci zařízení MINICAP, během první sekvence analýzy vzorku krve, se objeví červený varovný signál, pokud není v jednom vzorku přítomný hemoglobin A (a není možné znovu vycentrovat záznam z elektroforézy, viz odstavec «Analýzy výsledku»). Pak se doporučuje analyzovat vzorek krve s hemoglobinem A na dotyčné kapiláře a opět analyzovat vzorek bez hemoglobinu A umístěním do pozice odpovídající kapiláře, která již detekovala hemoglobin A. kontrola kvality : Roztok Normal 2 Control lze používat jako normální lidskou krev. Po přípravě použijte přímo roztok Normal 2 Control jako vzorek krve pro analýzu nebo jako migrační kontrolu (v pozici č. 28 na otočném autosampleru, viz předchozí odstavec). Automaticky se naředí hemolyzačním roztokem. Doporučuje se zařadit jednu analýzu roztoku Normal 2 Control. Získané hodnoty musí být v rozsahu poskytnutém pro každou šarži roztoku 2 Control. DŮLEŽITÉ : Pro nejlepší použití roztoku Normal 2 Control, umístěného na otočném autosampleru v pozicích č. 1 až 26, je nutné použít jeden štítek s čárovým kódem pro identifikaci hemolyzační zkumavky, jež drží mikrozkumavku obsahující roztok 2 Control (před použitím odřízněte víčko mikrozkumavky). Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Před přípravou skladujte lyofilizovaný roztok Normal 2 Control v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data expirace vyznačeného na krabici nebo na štítku lahvičky. Připravený roztok Normal 2 Control skladujte při 2-8 C. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace jej použijte během jednoho týdne. Po analýze roztoku Normal 2 Control systémem MINICAP (jako migrační kontrolu nebo kontrolu kvality), kontrolu neprodleně uskladněte při 2-8 C

5 Připravený roztok může být rovněž zmražen (v alikvotních podílech) a uložen při teplotě - 20 C po dobu nejvýše 6 měsíců. DŮLEŽITÉ : Po uložení při 2-8 C nebo při - 20 C, homogenizujte připravený roztok Normal 2 Control před analýzou v systému MINICAP. POZNÁMKA : Pro nejlepší použití se systémem MINICAP se doporučuje nalít do mikrozkumavek před zmražením alikvotní podíl roztoku. Před použitím uložte rozmražený roztok Normal 2 Control při 2-8 C a použijte jej během jednoho dne. Roztok nezmrazujte a rozmrazujte více než 15krát. POZNÁMKA : Během přepravy může být lyofilizovaný roztok Normal 2 Control uchováván bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. VAROVÁNÍ : Žádná zkušební metoda nemůže poskytnout absolutní důkaz o nepřítomnosti HIV, hepatitidy B nebo C a dalších infekčních činitelů. S roztokem Normal 2 Control je nutné zacházet jako s nebezpečným biologickým materiálem. Tato kontrola je negativní na základě zkoušky schválené FDA nebo ekvivalentním regulatorním orgánem EU : - proti povrchovému antigenu hepatitidy B ; - na protilátky k HCV ; - na protilátky k HIV1 a HIV2. 2. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA K vyplachování kapilár v automatickém systému MINICAP, SEBIA, pro elektroforézu. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0,45 μm) a s vodivostí nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální funkci přidejte roztok CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička o objemu 5 ml) do destilované nebo deionizované vody nebo použijte přímo roztok CAPIprotect* připravený k použití (SEBIA, KAT. Č : 2 nádoby o objemu 5 L destilované vody s CLEAN PROTECT). DŮLEŽITÉ : Vyplachovací kontejner je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. * POZNÁMKA : Řešení CAPIprotect lze také použít k rozředění zásobního promývacího roztoku. Pak v takovém případě může zředěný promývací roztok vykazovat přechodnou, více či méně žlutou barvu bez jakýchkoliv negativních účinků na jeho výkon. 3. CAPICLEAN Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (SEBIA, kat. č. 2058, 25 ml) obsahuje : proteolytické enzymy, povrchově aktivní láky a přídavné látky, nezbytné pro optimální provedení, v neškodných koncentracích. K čištění vzorkovací sondy v automatickém systému MINICAP, SEBIA, pro kapilární elektroforézu, během čisticí sekvence CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ : Čisticí sekvenci CAPICLEAN spouštějte minimálně jednou týdně a maximálně jednou denně nebo po každých 500 analýzách, pokud se provádí méně než jedna týdně. Viz návod k CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku CAPICLEAN v přístroji MINICAP je nutné použít jeden čárový kód určený pro označení zkumavky, která obsahuje naředěný roztok CAPICLEAN. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Roztok CAPICLEAN skladujte v chladničce (2-8 C). Stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky. NEMRAZIT. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se shromáždit pouze supernatant. Pro pozdější použití skladujte zkumavku s naředěným roztokem při teplotě 2-8 C. Musí se použít během jednoho dne. 4. ROZTOk CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % roztoku chloridu (koncentrovaného) do 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Pro čištění vzorkovací sondy systému MINICAP (týdenní údržba pro odstranění proteinů nasorbovaných na sondu ze vzorku). Viz návod k systému SEBIA MINICAP. Aplikujte do hemolyzační zkumavky 2 ml zředěného dříve připraveného chlorovaného roztoku. Umístěte zkumavku (se stejným čárovým kódem jako roztok chlornanu sodného) na otočný autosampler přístroje MINICAP. Novou reagenční nádobku umístněte na automatický podávací systém nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). Zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP. Zavřete dvířka systému MINICAP a čistící sekvence se zahájí automaticky. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku chlornanu sodného v přístroji MINICAP je nutné použít jeden čárový kód určený k označení zkumavky, která obsahuje roztok. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při pokojové teplotě. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 5. PROMÝVACÍ ROZTOk CAPILLARYS / MINICAP Příprava Každá lahvička promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat č. 2052, 2 lahvičky, 75 ml) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou na 750 ml. Pro systém MINICAP je vhodné naředit pouze 25 ml zásobního roztoku destilovanou nebo deionizovanou vodou na 250 ml. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph

6 Pro promývání kapilár systému MINICAP. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby na promývací se roztok se doporučuje vymýt otvor nádoby a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřených nádobách. Zásobní promývací roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíců. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. 6. FYZIOLOGICkÝ ROZTOk Příprava Připravte roztok 0,15 M (0,9 g/dl) NaCl, v destilované nebo deionizované vodě. Je-li to nutné, properte červené krvinky před skladováním při - 70 / - 80 C. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Fyziologický roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zneškodněte po třech měsících nebo pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Pro skladování po delší dobu přidejte azid sodný, 0,1 g/dl. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém MINICAP, SEBIA, kat. č Otočný autosampler dodávaný se systémem MINICAP. 3. Sada nádob dodávaná se systémem MINICAP : promývací nádobka (na destilovanou či deionizovanou vodu) a nádobka na odpad. 4. Reagenční nádobky MINICAP / 125 (3), SEBIA, kat. č Víčka na kontejnery na použité nádobky činidel, SEBIA (12 kusů), kat. č : víka na uzavírání kontejnerů s použitými nádobkami. 6. Hemolyzační zkumavky (o průměru 8 až 16 mm a délce 50 až 100 mm). VZORkY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu jsou doporučeny čerstvě antikoagulované vzorky plné krve odebrané do zkumavek s obsahem EDTA draselného jako antikoagulantu. Nepoužívejte antikoagulanty obsahující jodoacetát. Odběr krve musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky je možno skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu sedmi dní. Pro delší skladování mohou být vzorky zmražené na - 70 / - 80 C do 8 hodin po odběru po proprání červených krvinek podle následujícího postupu : Centrifugujte krev s antikoagulačním činidlem pro získání červených krvinek, odlijte plasmu, červené krvinky (RBC) properte 2krát 10násobkem fyziologického roztoku (centrifugujte po každém proprání) ; odlijte přebytečné množství fyziologického roztoku z povrchu červených krvinek a před zmražením je promíchejte na vortexovém míchadle. Vzorky zmražené krve jsou stálé maximálně 3 měsíce při - 70 / - 80 C. DŮLEŽITÉ : Nejlepší je skladovat vzorky krve při - 80 C. Neskladujte je při - 20 C (viz BIBLIOGRAFIE, J. Bardakdjian-Michau et al, 2003). POZNÁMKA : vzorky by neměly být skladovány při pokojové teplotě! U vzorků skladovaných při 2 až 8 C může docházet k postupnému rozkladu hemoglobinů (Hb). Když je vzorek krve skladován déle než 7 dní při 2-8 C : slabé frakce, odpovídající methemoglobinu, se objeví v migrační zóně Hb S, pokud je přítomný Hb C, frakce odpovídající rozloženému Hb C se objeví blíže k anodě než 2, se kterým neinterferuje (zóna Z(E), viz tabulku v odstavci "Vyhodnocení"), pokud je přítomný Hb O-Arab, frakce odpovídající rozloženému Hb O-Arab se objeví v migrační zóně Hb S (zóna Z(S), viz tabulku v odstavci "Vyhodnocení"), pokud je přítomný Hb E, frakce odpovídající rozloženému Hb E se objeví v zóně Z(D) (viz tabulku v odstavci "Vyhodnocení"), pokud je přítomný Hb S, frakce odpovídající rozloženému Hb S se objeví v migrační zóně Hb F (zóna Z(F), viz tabulku v odstavci "Vyhodnocení"), pokud je přítomný, frakce odpovídající rozloženému ("frakce stárnutí" ) se objeví blíže anodě (zóna Z11, viz tabulku v odstavci "Vyhodnocení"), pokud je přítomný Hb F (ve vzorcích krve novorozenců), frakce se objeví v migrační zóně (zóna Z(A), viz tabulku v odstavci "Vyhodnocení") během rozkladu vzorku. Pokud je skladován více než 10 dní, jsou pozorovatelné viskózní agregáty v červených krvinkách, je nezbytné je před analýzou odstranit

7 Příprava vzorků Nechte červené krvinky sedimentovat několik hodin při 2 8 C nebo centrifugujte vzorek plné krve pro získání červených krvinek. Opatrně odlijte co největší objem plasmy (u vzorků odebraných do heparinu odlijte viskózní agregáty z prostoru mezi plasmou a červenými krvinkami). Míchejte (na vortexu) po dobu 5 sekund. DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte vzorky krve, které obsahují více než 3 mm zbytkové plasmy nad červenými krvinkami ; když jsou ve zkumavce více než 3 mm plasmy, může být analýza ovlivněna. Zvláštní případy : Analýza vzorků bez jakéhokoli nebo 2 (tyto vzorky jsou perfektně kvantifikovány, ale neidentifikovány zónami). Pro identifikaci frakcí hemoglobinu ve vzorku bez jakéhokoli hemoglobinu A nebo A2, se doporučuje připravit tento vzorek podle následujícího postupu : - v mikrozkumavce smíchejte jeden díl (80 µl) červených krvinek analyzovaného vzorku s jedním dílem (80 µl) roztoku Normal 2 Control. - míchejte (na vortexu) po dobu 5 sekund. - uřízněte víčko mikrozkumavky, - dejte mikrozkumavku do nové hemolyzační zkumavky, která se používá jako podpora, do otočného autosampleru systému MINICAP. - proveďte analýzu tohoto vzorku standardním postupem jako s běžným vzorkem krve. Výsledky jsou potom automaticky vyhodnoceny softwarem pro analýzu dat. DŮLEŽITÉ : Pro vzorek bez jakéhokoli nebo 2, připraveného podle tohoto postupu, umožní výsledek získaný ze smíchaného vzorku pravděpodobnou identifikaci variant v důsledku umístění frakcí hemoglobinů v odpovídajících identifikačních zónách. Neoznamujte poměrnou kvantifikaci z výsledků smíšeného vzorku. Poměrná kvantifikace hemoglobinů by měla provedena za použití počátečního, nesmíšeného vzorku (bez jakéhokoli ředění kontrolní krve). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte celý vzorek krve nebo nesedimentované vzorky krve. Vyvarujte se starých, nevhodně skladovaných vzorků krve ; automatická hemolýza vzorků se může porušit viskózními agregáty v červených krvinkách. Pak mohou produkty rozkladu (jako artefakty) ovlivnit záznam z elektroforézy. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP Systém MINICAP je multiparametrické zařízení, určené k analýze hemoglobinů v paralelních kapilárách. Zkouška hemoglobinů používá pro analýzu vzorků 2 kapiláry. Sekvence automatizovaných kroků je následující : načtení čárového kódu zkumavek se vzorkem (až 26 zkumavek) a kódu otočného autosampleru ; hemolýza a naředění vzorku z primárních zkumavek (bez plasmy) do reagenčních nádobek ; promytí kapilár ; nastříknutí hemolyzovaných vzorků ; dělení hemoglobinů a jejich přímá detekce v kapilárách. Manuální kroky zahrnují : vložení otevřených zkumavek se vzorkem do otočného autosampleru v pozicích 1 až 26 ; vložení zkumavky s hemolyzačním roztokem do otočného autosampleru do pozice 27 ; vložení roztoku Normal 2 Control do otočného autosampleru do pozice 28 ; vložní otočného autosampleru do zařízení MINICAP ; odstranění zkumavek se vzorky po analýze ; odstranění a uzavření kontejnerů s použitými nádobkami. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. I. PŘÍPRAVA ANALÝZY MINICAP 1. Zapněte přístroj MINICAP a počítač. 2. Aby se přístroj spustil, umístněte alespoň jednu novou reagenční nádobku do automatického podávacího systému nádobek MINICAP (pokud není nádobka přítomna, zobrazí se zpráva). 3. Nastavte program a přístroj se automaticky spustí. 4. Sada MINICAP HEMOGLOBIN(E) slouží k provádění analýz podle programu "HEMOGLOBIN(E)" na zařízení MINICAP. Pro volbu programu analýzy "HEMOGLOBIN(E)" a umístnění lahvičky s tlumivým roztokem MINICAP HEMOGLOBIN(E) v pozici "B2 v zařízení si přečtěte pozorně návod k obsluze zařízení MINICAP a postupujte dle pokynů zobrazených na obrazovce. 5. Novou reagenční nádobku umístněte do automatického podávacího systému nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). 6. Nový kontejner na použité nádobky umístněte na zařízení MINICAP do míst určených k tomuto účelu. 7. Zkontrolujte hladinu náplně reagenčních nádobek a pokud je to nutné, doplňte činidlo a vyprázdněte odpadní nádobu. V okně "Kontrola hladiny činidel", aktualizujte software posunutím tlačítek kurzoru

8 8. Otočný autosampler má 28 pozic pro umístnění zkumavek se vzorkem : Umístněte až 26 otevřených zkumavek se vzorkem bez jakékoli plasmy do otočného autosampleru (pozice č. 1 až 16). Čárový kód každé zkumavky musí být vidět v otvorech na otočném autosampleru. Nalijte hemolyzační roztok MINICAP HEMOGLOBIN(E) do hemolyzační zkumavky označené štítkem s čárovým kódem hemolyzačního roztoku, aniž by došlo ke vniknutí vzduchových bublin : 2 ml pro analýzu 1 nebo 2 vzorků, 5 ml pro analýzu 8 vzorků. Dejte tuto zkumavku do pozice č. 27 na rotačním autosampleru (poloha "Diluent / Solution"). DŮLEŽITÉ : Ověřte, že se nevytvořila žádný pěna dřív, než vložíte zkumavku do otočného autosampleru. Umístěte roztok Normal 2 Control do pozice č. 28 na otočném autosampleru (pozice pro "kontrolu") a pro provedení vyberte číslo analýzy Normal 2 Control podle dříve popsaných indikací, viz odstavec "Normal 2 Control", část "Migrační kontrola". DŮLEŽITÉ : Pokud chybí zkumavka v pozicích č. 1 až 26 (zkumavky se vzorkem), v pozici č. 27 (zkumavka s hemolyzačním roztokem) a v pozici č. 28 (zkumavka s kontrolní krví), analýzu nelze spustit a zobrazí se zpráva. POZNÁMKA : Pro použití kontrolní krve je nutné použít specifický čárový kód. 9. Zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP. 10. Zavřete dvířka systému MINICAP, analýza se automaticky spustí. 11. Po skončení analýzy vyjměte otočný autosampler a s analyzovanými zkumavkami se vzorky. 12. Pokud je to nutné, opatrně vyjměte kontejner obsahující použité reagenční nádobky, pevně jej uzavřete odpovídajícím uzávěrem a vyhoďte jej. VAROVÁNÍ : S kontejnery obsahujícími reagenční nádobky s biologickými vzorky se musí nakládat s opatrností. ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků 1. Čárové kódy jak na zkumavce se vzorkem tak na otočném autosampleru jsou načteny. 2. Vzorky jsou naředěny hemolyzačním roztokem a vzorkovací sonda je po každém vzorku opláchnuta. 3. Kapiláry jsou promyty. 4. Zředěné vzorky jsou nastříknuty do kapilár. 5. Migrace probíhá za konstantního napětí po dobu asi 8 minut a teplota se ovládá Peltiérovým jevem. 6. Hemoglobiny se detekují přímo, skenováním při 415 nm a na obrazovce systému se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA : Tyto automatizované kroky jsou popsány pro první dvě analyzované zkumavky se vzorky. Záznamy z elektroforézy se objeví asi za 20 minut po spuštění analýzy. Pro následující zkumavky se vzorky se první dva kroky (čtení čárového kódu a hemolýza vzorků krve), provádí během analýzy předchozích dvou vzorků. II. ANALÝZA VÝSLEDkU Na konci analýzy se automaticky provede poměrná kvantifikace jednotlivých frakcí hemoglobinu a mohou se analyzovat profily ; frakce hemoglobinů, Hb F, 2 a Hb C jsou identifikovány automaticky ; frakce je vycentrována uprostřed okna revize. Výsledné elektroforeogramy jsou vizuálně vyhodnocovány z hlediska abnormalit. Elektroforetické typy jsou zbarvené : - tyrkysově, když odpovídá počet frakcí / píků, které jsou pro postup nakonfigurovány jako výchozí (např. 2 frakce pro postup HEMOGLOBIN(E)), - růžově, když neodpovídá počet frakcí / píků, které jsou pro postup nakonfigurovány jako výchozí. U postupu HEMOGLOBIN(E) je pík Hb F oranžový (identifikovaný jako HbF nebo varianta"), když není znám pacientův věk, a modrý (identifikovaný jako Hb"), když je pacientův věk znám a frakce / pík je nižší než 2 %. Možné pozice různých variant hemoglobinů (identifikovaných v zónách nazvaných Z1 až Z15) se zobrazí na obrazovce systému a ukáží se na lístku s výsledky. Tabulka v odstavci "Vyhodnocení" ukazuje známé varianty, které mohou být přítomné v každé odpovídající zóně. Když software identifikuje frakci hemoglobinu v určené zóně, jméno této zóny se zarámečkuje. Záznamy se automaticky upraví s ohledem na usnadnění interpretace frakce : - když nejsou na záznamu z elektroforézy detekovány frakce a/nebo 2, zobrazí se žlutý výstražný signál, pro nastavení se použije pozice frakce ze dvou předchozích záznamů získaných na téže kapiláře, pak není frakce identifikována (kromě detekce Hb C : v tomto případě jsou frakce 2 a Hb C identifikovány) ; - když je na záznamu elektroforézy detekován Hb F a není detekován, nezobrazí se žlutý výstražný signál a pro nastavení se použije pozice frakce Hb F - frakce Hb F, a/nebo 2 jsou identifikovány ; - když není možné toto nastavení provést, zobrazí se červený výstražný signál a frakce Hb F a 2 identifikovány nejsou (kontaktujte společnost SEBIA) ; - když je optická hustota (OD) v elektroforetickém záznamu kontroly migrace nedostatečná (získaný roztokem Normal 2 Control, označený štítkem s čárovým kódem a analyzován v pozici č. 28 na otočném autosampleru), zobrazí se varovná správa s cílem zvážit nebo odstranit tuto analýzu při určování pozice frakce. Potom se objeví fialový varovný signál v revizním okénku a frakce a 2 nejsou určeny. Ve všech případech se ani na obrazovce systému ani na výtisku z tiskárny neobjeví žádné migrační zóny (Z1 až Z15). Na záznamu elektroforézy se křivky frakcí 2 a Hb C vypočítají a překreslí upravené hodnoty s úpravou (přizpůsobené) jsou navrstveny přes původní křivku. Tato obrazovka umožní kvantifikaci frakce 2, pokud je ve vzorku přítomný Hb C. VAROVÁNÍ : V některých případech (homozygotního) hemoglobinu C nebo při výskytu technického problému nemusí hemoglobiny A2 a C vyhovovat ; množství těchto frakcí je potom podhodnoceno. Doporučuje se kvantifikovat frakci 2 jinou technikou. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. III. UkONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé sekvence analýzy musí operátor zahájit postup "stand by" (přepnutí do pohotovostního režimu) nebo "shut down" (vypnutí) systému MINICAP, aby se kapiláry uložily v optimálních podmínkách. DŮLEŽITÉ : Novou reagenční nádobku umístěte na automatický podávací systém nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB MINICAP automaticky kontroluje přítomnost činidel. DŮLEŽITÉ : Dodržujte pokyny pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části

9 V případě nezbytného provedení jednoho z následujících úkonů bude zobrazena zpráva : vložte novou lahvičku s tlumivým roztokem a/nebo ; naplňte nádobu pracovním promývacím roztokem a/nebo ; naplňte nádobu filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k vyplachování kapilár a/nebo ; vyprázdněte kontejner s odpadem. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik. DŮLEŽITÉ : Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. kontrola kvality Po výměně čísla šarže analyzačního tlumivého roztoku nebo změně techniky, po sekvenci čištění kapiláry roztokem CAPICLEAN a před spuštěním nové sekvence analýzy, je nezbytné spustit dvě sekvence analýz s roztokem Normal 2 Control, SEBIA, kat. č (viz odstavec POTŘEBNÁ ČINIDLA NEOBSAŽENÁ V BALENÍ). Rovněž se doporučuje začlenit do každé analýzy vzorků zkušební kontrolní krev (např. vzorek krve obsahující hemoglobiny A, F, C a S, např. roztok FSC Control, SEBIA, kat. č. 4792, nebo normální vzorek krve, roztok Normal 2 Control, SEBIA, kat. č nebo roztok Pathological 2 Control, SEBIA, kat. č. 4779). VÝSLEDkY Hodnoty Přímá detekce při 415 nm v kapilárách dává relativní koncentrace (procentuální hodnoty) pro jednotlivé zóny hemoglobinů. Referenční hodnoty hlavních elektroforetických zón hemoglobinu v systému MINICAP byly stanoveny na základě zdravé populace 113 dospělých osob (mužů i žen), jejichž hodnoty hemoglobinu (stanovené pomocí HPLC) byly normální : hemoglobin A : v intervalu mezi 96,8 a 97,8 % hemoglobin F : < 0.5 % (*) hemoglobin A2 : v intervalu mezi 2,2 a 3,2 % (*) Viz Interference a omezení Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní prahové hodnoty. POZNÁMKA : Normální hodnoty byly stanoveny použitím standardních parametrů softwaru (vyhlazení 0 a automatické kvantifikace frakcí hemoglobinu programem analýzy HEMOGLOBIN(E)). VAROVÁNÍ : Normální (referenční) hodnoty se musí použít pouze, pokud varianty hemoglobinu chybí. Vyhodnocení Viz ZÁZNAMY Z ELEKTROFORÉZY, obrázky Různé migrační zóny variant hemoglobinů (nazvaných Z1 až Z15) se zobrazí na obrazovce systému a ukáží se na lístku s výsledky. Přejížděním kurzoru myši přes jméno zóny se zobrazí informace o ikoně obsahující možné varianty hemoglobinu, které by mohly být v této zóně vidět. Maximální pozice určuje migrační zónu každé frakce. Viz tabulku ukazující možné varianty umístění v každé zóně. 1. Abnormality kvalitativního stanovení: hemoglobinopatie Většina hemoglobinopatií vzniká v důsledku mutační substituce jedné aminokyseliny v jednom ze čtyř typů polypeptidových řetězců (1, 2, 4, 9, 12). Klinický význam takových změn závisí na ovlivněném typu a pořadí aminokyselin (13). U klinicky významných onemocnění jsou ovlivněny řetězce alfa nebo beta. Bylo popsáno více než 1400 variant hemoglobinů u dospělých jedinců (6, 14). První studované a nejčastěji se vyskytující abnormální hemoglobiny mají změněný celkový elektrický náboj, což umožňuje snadnou detekci elektroforézou. Existuje pět hlavních abnormálních hemoglobinů, které si zaslouží zvláštní klinický zájem : S, C, E, O-Arab a D. Sada MINICAP HEMOGLOBIN(E) je určena k identifikaci hemoglobinopatií a talasemií. Hemoglobin S Hemoglobin S se vyskytuje nejčastěji. Důvodem je vyměnění jedné kyseliny glutamové (kyselá aminokyselina č. 6) ß-řetězcem valinu (neutrální aminokyselina) : při srovnání s má vyšší isoelektrický bod a při analýze ph je jeho celkový negativní náboj nižší. Jeho elektroforetická pohyblivost v kapiláře je proto zvýšená a tento hemoglobin je rychlejší než frakce A. Při metodě v alkalickém tlumivém roztoku MINICAP HEMOGLOBIN(E) se hemoglobin S pohybuje mezi frakcemi A a A2 a vedle 2. Hemoglobin C Jedna kyselina glutamová ß-řetězce je nahrazen lysinem (alkalická aminokyselina č. 6) : má silně sníženou pohyblivost. Při srovnání s má vyšší isoelektrický bod a při analýze ph je jeho celkový negativní náboj nižší. Jeho elektroforetická pohyblivost v kapiláře je proto zvýšená a tento hemoglobin je rychlejší než frakce A, která umožní jeho oddělení. Hemoglobiny C, E a O-Arab nejsou na záznamu z elektroforézy překryty a snadno se identifikují. Hemoglobin E Jedna kyselina glutamová ß-řetězce (č. 26) je nahrazena lysinem. Při metodě MINICAP HEMOGLOBIN(E) se hemoglobin E pohybuje směrem k anodě za hemoglobin A2 a je od něj zcela oddělen. Pak, pokud je přítomný hemoglobin E, může se frakce A2 měřit pro stanovení ß-talasemie

10 Hemoglobin O-Arab Jedna kyselina glutamová ß-řetězce (č. 121) je nahrazena lysinem. Při metodě MINICAP HEMOGLOBIN(E) se hemoglobin O-Arab pohybuje přesně jako hemoglobin A2. V takovém případě není možné kvantifikovat hemoglobin A2. Pokud je této frakce > 9 %, je třeba zvážit možnost příromnosti hemoglobinu O-Arab. Všimněte si, že Hb O-Arab se pohybuje odděleně od hemoglobinů C a E. Hemoglobin D (Los Angeles) Jedna kyselina glutamová ß-řetězce (č. 121) je nahrazena glutaminem. Při metodě MINICAP HEMOGLOBIN(E) se hemoglobin D (zvaný D-Punjab, D-Los Angeles, D-Chicago nebo D-Portugal) pohybuje za hemoglobinem S, tato vlastnost umožňuje odlišit hemoglobiny S a D. 2. Kvantitativní abnormality : talasemie Talasemie představují docela různorodou skupinu genetických poruch, charakterizovaných snížením tvorby jednoho typu polypeptidových řetězců. Molekulový mechanismus tohoto snížení již byl úplně popsán. Existují dva typy syndromů talasemie : Alfa-talasemie Jsou charakterizovány snížením syntézy a-řetězců a následně ovlivňují syntézu všech normálních hemoglobinů. Nadměrná syntéza ß- a g-řetězců ve vztahu k a-řetězcům tvoří tetramery bez jakýchkoli a-řetězců : hemoglobin Bart = γ 4, hemoglobin H = ß 4. Hemoglobin H má nízký isoelektrický bod, při metodě MINICAP HEMOGLOBIN(E) se pohybuje blíž k anodě než hemoglobin A (a může se objevit v jedné nebo více frakcích). Beta-talasemie Jsou charakterizovány snížením syntézy ß-řetězců. Je ovlivněna pouze syntéza hemoglobinu A. Proto se zvýší procentuální výskyt hemoglobinu F a A2 vzhledem k hemoglobinu A. Při metodě MINICAP HEMOGLOBIN(E) umožní hodnoty získané pro různé normální frakce hemoglobinu detekovat beta-talasemie. 3. Zvláštní případy Pokud není hemoglobin A ve vzorku, může být pozorována frakce v jeho migrační zóně. Tato frakce může být acetylovaný hemoglobin F, který představuje okolo 15 až 25 % hemoglobinu F. Systém MINICAP může identifikovat tento acetylovaný hemoglobin odděleně od hemoglobinu A bez jakékoli pochybnosti. Pokud se malá frakce (asi 0,5 až 3 %) pohybuje mezi hemoglobiny F a δa 2 (varianta A2), je podezření na variantu hemoglobinu A2. Procentuální hodnoty normálního hemoglobinu A2 a varianty jsou pro heterozygotní pacienty přibližně stejné. Pokud se stanoví varianta hemoglobinu A2 (δa 2 nebo jakákoli jiná varanta A2), doporučuje se přidat její procentuální hodnotu k hemoglobinu A2 pro lepší diagnostikování beta-talasemie. Některé varianty hemoglobinu (např. Hb Camperdown nebo Hb Okayama) se pohybují blízko u a nemohou být odděleny od tohoto hemoglobinu. Některé varianty hemoglobinu (např. Hb Porto-Alegre nebo rozložený Hb S) se pohybují blízko u Hb F a nemohou být od něj odděleny. Slabé frakce hemoglobinu, které se pohybují v zóně Z12 se občas kvantifikují nepřesně (např. příliš asymetrický Hb Bart). Je proto nezbytné smazat automatickou kvantifikaci a potom je kvantifikujte manuálně. Při postupu MINICAP HEMOGLOBIN(E) u diabetických pacientů se zvýšenou hodnotou HbA 1c (nad 10 %) byla pozorována malá frakce a nakonec identifikována jako vrchol v zóně Z10. Pokud se analyzují vzorky krve novorozenců, ze vzorků, které obsahující Hb F ve vyšších koncentracích, se může porušit, zvláště z důvodu přítomnosti rozloženého Hb F ve své migrační zóně. Procentuální hodnota, kterou ukáže software, může být nadhodnocena. Pokud jsou ve vzorcích krve navíc přítomny varianty hemoglobinu (> 4 %, např. Hb S, Hb C, Hb E nebo Hb D-Punjab), které obsahují vysoké hladiny Hb F (> 60 %), je nutné provést doplňkové analýzy, aby se potvrdila přítomnost. Pro novorozence do věku 6-9 měsíců se doporučuje analyzovat různé vzorky krve (např. nabírané měsíčně), aby se ověřila koncentrace Hb F. To umožní ověřit snížení koncentrace Hb F a možnost přítomnosti variant. V případě nejistoty se doporučuje potvrzení provedením dodatečných studií a analyzováním vzorků krve rodičů. V případě vzorku krve s nízkou hladinou (< 10 %) a vysokou hladinou Hb S (například krevní vzorek od pacienta s transfuzí se srpkovitou nemocí nebo od pacienta s S beta-talasemií) se může frakce Hb S objevit posunutá ze zóny Z(S) do zóny Z(D). V takovém případě smíchejte vzorek s kontrolním roztokem Normal 2 Control podle postupu popsaném v odstavci "VZORKY PRO ANALÝZU", v části "Zvláštní případy", aby se ověřilo umístění varianty do migrační zóny Z(S). Je nezbytné analyzovat hematologický stav a provést doplňkové studie, aby se potvrdila přítomnost Hb S. Při analýze krevních vzorků od pacientů se srpkovitou anémií před transfúzí je možné pozorovat variaci frakce Hb S pro analýze některých pacientů v důsledku nehomogenity tohoto typu vzorku. Proto se před analýzou těchto typů krevních vzorků doporučuje provést homogenizaci. Příklady zvýšeného hemoglobinu F (Hb F) (kromě novorozenců) : - těhotenství, - pacienti se srpkovitou nemocí, starší 2 let, s léčbou Hydrea (hydroxyurea) a/nebo po transfuzi a/nebo přirozeně tvořící Hb F zvýšenou kompenzací, - pacienti starší 2 let, s HPFH (vrozené přetrvání fetálního hemoglobinu obsahujícího 20 až 40 % Hb F u heterozygotních pacientů), - pacienti starší 2 let, s leukémií (jakéhokoli typu), dědičnou hemolytickou anémií, diabetem, onemocněním štítné žlázy, hyperaktivitou kostní dřeně, mnohočetným myelomem, rakovinou s metastázemi. Pro podrobnější informace navštivte : Interference a omezení Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Nepoužívejte celý vzorek krve nebo nesedimentované vzorky krve. Nepoužívejte staré, nesprávně skladované vzorky krve, produkty rozkladu (nebo artefakty) po 7 denním skladování mohou ovlivnit záznam z elektroforézy. Po 10denním skladování se mohou objevit viskózní agregáty vytvořené z červených krvinek, které se musí před analýzou odstranit

11 Pokud je zjištěn abnormální hemoglobin, je nutné použít jiný způsob identifikace (např. elektroforézu globinových řetězců) nebo odeslat vzorky krve do specializované laboratoře. DŮLEŽITÉ : Pro doplnění výsledků je rovněž nutné analyzovat hematologický stav pacienta. Migrace variant hemoglobinu v blízkosti zahrnuje podhodnocení frakce a jeho variant a následné nadhodnocení frakce 2. Pro přesnou kvantifikaci 2 je nezbytné smazat oddělenou integraci obou variant a a kvantifikovat tyto frakce dohromady. Někteří homozygotní pacienti "S" přijímají léčbu "Hydrea" (hydroxyurea), která může vyvolat syntézu fetálního hemoglobinu. Při metodě MINICAP HEMOGLOBIN(E) se pohyblivost léčbou vyvolaného hemoglobinu F neliší od fyziologického hemoglobinu F. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé varianty hemoglobinu nebudou touto metodou detekovány. U pacientů s hyperleukocytózou může být rychlost migrace vzorku urychlena, což může způsobit posun profilu a vést k tomu, že nedojde k rozpoznání zón. Varianty hemoglobinu sledované při postupech 1c nebo HEMOGLOBIN(E) : V důsledku odlišného složení tlumicích roztoků 1c a HEMOGLOBIN(E) se může lišit elektroforetická mobilita některých variant hemoglobinu. Řešení problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu společnosti SEBIA. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : ÚDAJE O VÝkONU Výsledky získané metodou MINICAP HEMOGLOBIN(E) vykazují velmi dobrou reprodukovatelnost kvantitativní analýzy s průměrem CV % kolem 1,4 % pro každou složku hemoglobinů. Všechny elektroforeogramy byly také interpretovány vizuálně. Níže uvedené výsledky byly stanoveny použitím standardních parametrů softwaru MINICAP (vyhlazení 0 a automatická kvantifikace frakcí hemoglobinu programem analýzy HEMOGLOBIN(E)). Reprodukovatelnost mezi sekvencemi a jednotlivými analýzami Sedm (7) různých vzorků krve (normální krev A a E, krev B s Hb S, krve C a H s Hb F, krev F se zvýšeným 2 a krev G se složkami, F, S a C) se analyzovalo metodou MINICAP HEMOGLOBIN(E) ve 3 systémech MINICAP a dvěma šaržemi sad MINICAP HEMOGLOBIN(E). Každý vzorek byl měřen pětkrát na obou kapilárách každého systému MINICAP. Pro každý vzorek, každou složku hemoglobinu a každý systém MINICAP byly vypočteny průměr, SD a CV (n = 10). Tabulka ukazuje vypočítané hodnoty 7 testovaných vzorků, rozdělených na jednotlivé složky hemoglobinu, za použití 3 systémů MINICAP. Složka hemoglobinu Hb F Hb S 2 Hb C Vzorek krve A: č. systému 1 a č. šarže 2 č. systému 2 a č. šarže 1 č. systému 3 a č. šarže 1 PRŮMĚR (%) / / / SD / / / CV % / / / Vzorek krve B: č. systému 1 a č. šarže 2 č. systému 2 a č. šarže 1 č. systému 3 a č. šarže 1 PRŮMĚR (%) / / SD / / CV % / / Vzorek krve C: č. systému 1 a č. šarže 2 č. systému 2 a č. šarže 1 č. systému 3 a č. šarže 1 PRŮMĚR (%) / / SD / / CV % / / Vzorek krve E: č. systému 1 a č. šarže 2 č. systému 2 a č. šarže 1 č. systému 3 a č. šarže 1 PRŮMĚR (%) / / / SD / / / CV % / / / Vzorek krve F: č. systému 1 a č. šarže 2 č. systému 2 a č. šarže 1 č. systému 3 a č. šarže 1 PRŮMĚR (%) / / / SD / / / CV % / / / Vzorek krve G: č. systému 1 a č. šarže 2 č. systému 2 a č. šarže 1 č. systému 3 a č. šarže 1 PRŮMĚR (%) SD CV % Vzorek krve H: č. systému 1 a č. šarže 2 č. systému 2 a č. šarže 1 č. systému 3 a č. šarže 1 PRŮMĚR (%) / / SD / / CV % / / Žádné z opakování navíc nevykázalo falešně pozitivní nebo falešně negativní hodnoty