Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové"

Květa Hrušková
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 PCR v diagnostice Lymeské boreliózy Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové

2 obtížná Diagnostika lymeské boreliózy klinický obraz velmi rozmanitý anamnestické údaje (přisátí klíštěte ~ 60 %) laboratorní l b í - nejednoznačnost laboratorních nálezů ů elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA), western blot, imunofluorescenční analýza, PCR, CSF - vyšetření leukocytů (pleocytóza, zejm. mononukleáry), celkové bílkoviny (, někdy gamaglobuliny) někdy norm. nález

elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA), western blot, imunofluorescenční analýza, PCR, CSF

3 Molekulárně biologické metody (PCR) výhody rychlost, citlivost, specifita, možnost vyšetření v jakémkoliv materiálu úskalí úklí preanalytická fáze výběr pacientů, materiálů a jejich načasování, podmínky transportu apod. příprava vzorků, izolace, uchování DNA výběr primerů, validace metody kontrola kvality y( (VKK, EHK)

pacientů, materiálů a jejich načasování, podmínky transportu apod.

4 Preanalytická fáze výběr pacientů dif. dg. akutní LB - genom. DNA ve vyšších konc. chronická LB stopová množství genom. DNA (doplnit o detekci plazmidové DNA) záchytnost y??? výběr materiálů, načasování odběru materiály krev, likvor, moč, synoviální tekutina, tkáň, vzorky kůže z EM apod. X klíště volba materiálu dle příznaků, stádia a doby onem. transport v chladu (nemrazit!!!) vysoká teplota snižuje procento pozitivity, hemolytické materiály inhibicí

?? výběr materiálů, načasování odběru materiály krev, likvor, moč, synoviální tekutina, tkáň, vzorky kůže z EM apod.

5 Materiály krev k nízká senzitivita boreliémie pouze krátkodobá, přechodná, pouze v období diseminovaného onem. (EM, neuroborelióza, karditidy) plazma (10) X sérum (20) X plná krev (100 spirochet/ml) - Mouritsen et al., Am.J.Clin.Pathol., 1996 CSF neuroborelióza nepřímá závislost na délce trvání onem. do 2 týdnů PCR pozit. u 50 % X více než 2 týdny pouze u 13 % - Lebech et al., Mol. Diagn., 2000 možnost adheze ke tkáním nízká senzitivita v pozdních stádiích, význam PCR pouze v časných stádiích

, 1996 CSF neuroborelióza nepřímá závislost na délce trvání onem. do 2 týdnů PCR pozit.

6 močč Materiály nižší senzitivita, nereprodukovatelnost neodebírat 1. proud ranní moče centrifugace při g (při g všechny moče negat.) Bergmann et al., J. Clin. Microbiol., 2002 synoviální tekutina artritida vyšší procento pozitivit závislost na antibiotické terapii po léčbě negat. PCR v synoviální tekutině, ale možnost detekce BB v synoviální membráně Priem et al., Ann. Rheum. Dis., 1998

7 Materiály kůže kožní manifestace vysoká senzitivita léze EM - 36 až 88 % pac. s chron. atrofickou akrodermatitidou 54 až 100 % uchování v transportním, t kultivačním č médiu po 24 hod. migrace spirochét do média izolace DNA z kůže, ale i z média klíště výpovědní hodnota??? pozitivní nález nemusí znamenat nákazu (doba přisátí klíštěte odstranění do 24 hod. riziko rozvoje LB velmi nízké) význam pro epidemiologické a jiné vědecké studie

migrace spirochét do média izolace DNA z kůže, ale i z média klíště výpovědní hodnota?

8 Izolace co nejdříve (zamrazit max. 3 měsíce) porovnání 3 izolací Exner et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2003 fenol-chloroformová extrakce, QIAamp DNA kity (OIAGEN), automatická izolace na přístroji MagNA Pure (mg. partikule) stejná citlivost u vzorků krve, CSF, synov. tekutiny X moč horší citlivost u QIAamp DNA kitu ÚKBD porovnání 2 izolací QIAamp DNA Mini Kit, MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III srovnatelná citlivost CSF, plazma, moč, synoviální tekutina atd. centrifugace max. otáčky sediment uchování DNA 2 až 8 C ( teplota - citlivost)

partikule) stejná citlivost u vzorků krve, CSF, synov.

9 Výběr primerů neobvyklý genom BB lineární chromozom + různý počet lineárních a cirkulárních plazmidů (BB je mohou ztrácet ) škála Ag specifit výběr primerů (schopnost detekce DNA BB) G - transport a metabolizmus sacharidů J - translace, ribosomální struktura a biogeneze L - DNA replikace, rekombinace a oprava M biogeneze buněčného obalu, vnější membrány R hlavní funkce je pouze předpokládána U neznámá funkce

metabolizmus sacharidů J - translace, ribosomální struktura a biogeneze L - DNA replikace, rekombinace

10 - Borrelia burgdorferi B31 NC_001318, lineární dsdna, délka bp, 874 genů, 21 plazmidů (9 lineárních a 12 cirkulárních) - Borrelia afzelii PKo NC_008277, lineární dsdna, délka bp, 894 genů, 8 plazmidů (6 lineárních a 2 cirkulárních) - Borrelia garinii Pbi NC_006156, lineární dsdna, délka bp, 904 genů, 2 plazmidy (1 lineární a 1 cirkulární)

dsdna, délka 905 394 bp, 894 genů, 8 plazmidů (6 lineárních a 2 cirkulárních) - Borrelia

11 Výběr primerů 1. PCR 1989 (chromozomální gen) publikováno o mnoho sekvencí primerů rů z různých genů -chromozomální m oblast 5S/23S rrna, reca, flagellin - plazmidová oblast OspC, OspA komerční kity nejčastěji flagelin. gen (FlaB) př. QIAGEN, GeneProof, Dynex

12 Vývoj metody nested PCR Flagelinový gen rdna gen

13 Vývoj metody rt PCR Flagelinový gen HLA DQ QuantiFast + IC

14 Porovnání různých metod

15 Validace metody Detekce DNA BB a IC v jedné zkumavce - flagelinový gen, QuantiFast Pathogen + IC Specifita B.garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s., B.valaisiana Mez detekce 1 2 org. BB/ml, resp. 0,39 pg BB/ml Opakovatelnost CV = 1,35 % Mezilehlá přesnost CV = 1,35 % Kontrola kvality VKK, EHK

burgdorferi s.s., B.valaisiana Mez detekce 1 2 org. BB/ml, resp.

16 chybovost 1 řádu Kontrola kvality - VKK počet procenta 1 řád 65 90,3 mimo 1 řád 7 9,7 celkem 72 Pozitivní, negativní, inhibiční kontrola chybovost 1/2 řádu počet procenta 1/2 řádu 46 63,9 mimo 1/2 řádu 26 36,1 celkem 72

negativní, inhibiční kontrola chybovost 1/2 řádu počet

17 EHK - INSTAND e. V. Kontrola kvality mezilaboratorní porovnání (reprodukovatelnost) r lab. ověření metody (validace)

18 Soubor pacientů vyšetřených metodou rtpcr na přítomnost DNA Borrela burgdorferi sensu lato rok krev likvor punktát celkem /0 986/8 39/0 1428/ /0 852/9 56/2 1148/ /0 823/7 36/1 1064/8 celkem 848/0 2661/24 131/3 3640/27

celkem 2008 403/0 986/8 39/0 1428/8 2009 240/0 852/9 56/2

19 Závěr PCR není v dg. LB 100% negativní výsledky nevylučují onemocnění X pozitivní výsledky onemocnění potvrzují nutnost výběru pacientů, resp. načasování odběru, výběr biologického materiálu, dodržení preanalytické fáze v laboratoři udělat maximum (validní výsledky) klinická korelace PCR je neuspokojivá

onemocnění potvrzují nutnost výběru pacientů, resp.

20 Děkuji za pozornost.

Podobné dokumenty

WWW.DYNEX.CZ. diagnostiky LF a FN Hradec Králové

WWW.DYNEX.CZ. diagnostiky LF a FN Hradec Králové Možnosti a úskalí detekce DNA Borrelia burgdorferi sensu lato Bolehovská R., Plíšková L., Ústav klinické i ké biochemie i a diagnostiky LF a FN Hradec Králové obtížná Diagnostika lymeské boreliózy klinický