Laboratoř analýzy biologických materiálů

Transkript

1 VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Ústav biochemie a mikrobiologie Laboratoř analýzy biologických materiálů Ing. Jan Lipov, Ph.D., Ing. Zdenek Knejzlík, Ph.D., Ing. Eva Jablonská Vysokoškolský učební text pro posluchače Vysoké školy chemicko-technologické v Praze PRAHA 2014

2 Poděkování. Tvorba studijního textu Laboratoř analýzy biologických materiálů byla podpořena projektem CZ.2.17/3.1.00/36021 Implementace nových metod ve výuce biochemie a forenzní analýzy. kolektiv autorů, Praha 2014

3 OBSAH 1. ÚVOD 1 2. BEZPEČNOST PRÁCE 2 3. ISOLACE DNA A JEJÍ ANALÝZA Metodika isolace DNA ve forenzní 4 analýze Isolace DNA pomocí nosiče 4 Chelex Isolace DNA pomocí silikátového nosiče Isolace DNA fenolchloroformovou extrakční metodou Isolace DNA technologií FTA Isolace DNA z náročných biologických 8 vzorků Isolace DNA ze spermatu Isolace DNA z vlasů Isolace DNA ze zubů a kostí Elektroforesa DNA Kvantifikace DNA Polymerasová řetězová reakce Složky PCR směsi Průběh PCR reakce Kvantitativní PCR Forensní analýza DNA PROTOKOLY 33 7 PROTOKOL 1: ISOLACE GENOMOVÉ DNA FENOL- CHLOROFORMOVOU EXTRAKCÍ PROTOKOL 2: ISOLACE GENOMOVÉ DNA S POUŽITÍM NOSIČE CHELEX 100 PROTOKOL 3: ISOLACE DNA POMOCÍ KOMERČNÍ SOURAVY QIAAMP DNA ISOLATION MINIKIT

4 PROTOKOL 4: DEMONSTRACE ANALÝZY RFLP VZORKŮ Z MÍSTA ČINU A PODEZŘELÝCH OSOB. 45 PROTOKOL 5: ELEKTROFORESA DNA V AGAROSOVÉM GELU PROTOKOL 6: ZJIŠTĚNÍ DÉLKY LOKUSU APOB V CHROMOSOMÁLNÍ DNA PROTOKOL 7: DEMONSTRACE ANALÝZY VNTR VZORKŮ Z MÍSTA ČINU A PODEZŘELÝCH OSOB PROTOKOL 8: DEMONSTRACE VLIVU KONCENTRACE NA VÝSLEDNÉM C T PŘI KVANTITATIVNÍM PCR PROTOKOL 9: KVANTIFIKACE AUTOSOMÁLNÍ A Y- CHROMOSOMÁLNÍ DNA POMOCÍ KOMERČNÍ SOUPRAVY PLEXOR HY PROTOKOL 10: MULTIPLEX AMPLIFIKACE STR LOKUSŮ Z ISOLOVANÉ CHROMOSOMÁLNÍ DNA POMOCÍ KOMERČNÍ SOUPRAVY POWERPLEX

5 1. ÚVOD Forensní biologii lze definovat jako aplikaci biologických věd při prosazování zákona. V mnoha případech je zjednodušována na analýzu DNA, ale ve skutečnosti v sobě zahrnuje i kategorie jako např. forensní botanika, entomologie, antropologie, ornitologie a řadu dalších. Z hlediska frekvence využití se v průběhu času toto odvětví rovněž vyvíjelo, ještě v 70. letech byla forensní biologií míněna především sérologie, tedy identifikace a individualizace na základě určení krevní skupiny. V současnosti je primárním odvětvím biologické identifikace analýza a profilace DNA, i když nelze zapomínat ani na analýzu krve, slin, moči a dalších tělních tekutin. Cílem praktika "Laboratoř analýzy biologických materiálů" je z časových důvodů výhradně seznámení frekventantů s analýzou DNA, tj. s její isolací, kvantifikací a konečně tvorbou DNA profilu

6 2. BEZPEČNOST PRÁCE Dodržování zásad správné laboratorní praxe je v dnešní době klíčovou součástí standardních laboratorních postupů. Hlavními složkami správné laboratorní praxe jsou dodržování veškerých laboratorních postupů a jejich monitoring: Ty také významně zohledňují dodržování zásad bezpečné práce z důvodu ochrany zdraví pracovníka a ostatních osob na pracovišti a současně také dopad vykonávané práce na životní prostředí. často i zákonem postulovaných postupů a norem pro bezpečnou práci. Postupy jsou založeny na neustálém hierarchickém systému kontroly a zodpovědnosti jednotlivých osob. Cílem je snižovat veškerá rizika při práci v laboratoři na minimum. Existuje celá řada doporučení a zásad jak těmto rizikům předcházet, dále pak, pokud dojde k nehodě, jak je řešit. V následujícím odstavci je zjednodušeně uvedeny zásady bezpečné práce v laboratoři a postupy pro řešení mimořádných událostí: Základní povinnosti posluchače: Podrobit se úvodnímu školení bezpečnosti práce a požární ochrany. V laboratoři se pohybovat takovým způsobem, aby se zamezilo možným poškozením zařízení nebo zranění přítomných osob. Dodržovat určené postupy určené pedagogickým pracovníkem. Při práci používat určené (doporučené) ochranné pracovní pomůcky (pláště, rukavice, brýle, štítky...) a ochranná zařízení. Dodržovat stanovené pracovní postupy a používat při práci určené ochranné pracovní prostředky a ochranná zařízení. Respektovat zákaz kouření, pití a konzumace potravin v laboratoři. Pedagogům neodkladně oznámit poranění nebo úraz, a pokud to zdravotní stav dovolí, účastnit se vyšetření příčiny a okolností vzniku školního úrazu. Neodkladně nahlásit závady na přístrojích, a to zejména ty, které by mohly ohrozit bezpečnost práce. Základní zásady bezpečné práce v laboratoři: Vlasy si upravit tak, aby bylo zabráněno jejich kontaktu s chemickými látkami, biologickým materiálem, otevřeným ohněm nebo pohybujícími se přístrojovými prvky V případě znečištění povrchu těla (ruce atd..) je nutno místo rychle opláchnout tekoucí vodou a pak důkladně omýt mýdlem a teplou vodou. Z očí je nutné vymývat chemikálii proudem tekoucí studené vody, okamžitě odstranit všechny zasažené části oděvu. Vyvarovat se neodborného zásahu. V případě manipulace s látkami skladovaných v otevřených nádobách je nutno udržovat ústí nádob odvrácené od sebe i jiných osob. Látky, které jsou zdraví škodlivé nebo těkavé se nesmí pipetovat ústy a jejich odpad musí skladován ve speciálních označených nádobách. Poškozené skleněné a porcelánové nádobí ihned likvidovat do zvláštních nádob. Odpadní rozpouštědla, kyseliny a zásady je nutno dávat do zvláštních nádob. Nevylévat je do výlevky

7 Stručné základy první pomoci První pomoc je nutné poskytnout rychle, všechny školní úrazy je nutno hlásit příslušnému pedagogovi, který poskytne první pomoc a podle potřeby zařídí lékařské ošetření. V případě pořezání se přiloží sterilní obvaz nebo náplast, při silném krvácení tlakový nebo škrticí obvaz a následně zajistit lékařské ošetření. Při popálení je nutné místo chladit tekoucí vodou nebo ledem přes krycí obraz (popřípadě čistou folii) a zajistit lékařské ošetření. Při poleptání roztoky kyselin nebo louhů je nutné poškozené místo chladnou tekoucí vodou. V případě potřeby neutralizovat kyselinu 2% NaHCO 3 a zásadu 2% CH 3 COOH. Při požití toxické látky - NEvyvolávat zvracení v PŘÍPADĚ bezvědomí, po požití kyselin nebo zásad. - zvracení má smysl vyvolávat, pokud je postižená osoba při vědomí a k požití látky došlo maximálně před dvěma hodinami u kapalin nebo čtyřmi u látek pevných. Následně obsah žaludku zředit suspensí s aktivním uhlím a následný transport k lékaři,. Při nadýchání toxických látek je nutné vynést postiženou osobu na čerstvý vzduch, rychle odstranit zamořený oděva a okamžitě zajistit lékařskou pomoc. Při vniknutí agresivní látky do oka je nutné zahájit jeho intenzivní výplach vodou (přibližně 15 min.), následně pak zajistit lékařské ošetření. Pozor, postižené oko se nesmí mnout. Při poranění elektrickým proudem je nutné vyprostit postiženého z dosahu el. proudu (vypnutím přívodu el.proudu, odsunutím vodiče, odtažením postiženého z dosahu el.proudu isolovaným předmětem). V případě. že postižený nedýchá provést kontrolu průchodnosti dýchacích cest (zvratky, zapadlý jazyk) popř. zavést ihned umělé dýchání a případně nepřímou masáž srdce. Je-li postižená osoba při vědomí, je nutné dopravit k lékaři, protože při úrazu el. proudem může dojít k šoku popřípadě i poruše srdečního rytmu i několik hodin po úrazu. kontakty hasičský záchranný sbor 150 nebo 112 Policie ČR tísňové volání 158 Zdravotní záchranná služba

8 3. ISOLACE DNA A JEJÍ ANALÝZA 3.1. Metodika isolace DNA ve forensní analýze Isolace DNA je klíčovým krokem v přiřazení specifického profilu přítomné DNA, v obecné rovině lze isolaci DNA ve forensních oborech přiřadit dva klíčové cíle. V první řadě jde o to isolovat DNA v dostatečném množství umožňující její plánovanou analýzu, tento cíl je obzvláště aktuální, jestliže dostupnost nebo množství konkrétního vzorku jsou limitující. Druhým, neméně důležitým cílem, je isolovat DNA v dostatečně čistém stavu. Uvědomíme-li si, jaká může být reálná povaha vzorku (např. krevní stopy v půdě, na zdi, na textilii apod.), je zřejmé, že k dosažení tohoto cíle musí být použito specifických postupů. V praxi je dostupných mnoho metod pro isolaci DNA. V zásadě nelze uvést nějakou universální metodu, to jakou si zvolíme, závisí na mnoha okolnostech, jako jsou např. množství a povaha vzorku, požadovaný čas isolace DNA, akceptovatelná cena isolace DNA a v některých případech i použitelnost metody pro její automatizaci. Je nutné opět upozornit, že čistě z analytického hlediska jsou nejpodstatnější výše zmíněné dva faktory, tj. množství a čistota DNA. Svou významnou úlohu hraje také fakt, že současným trendem v rutinních laboratořích je opouštění postupů využívajících toxické sloučeniny (např. fenol, chloroform). Důležitým faktorem je také technická vybavenost laboratoře a zejména zkušenost odborného personálu. Isolaci DNA lze obecně rozdělit na následující tři kroky: i. Porušení buněčné membrány, což vede k buněčné lysi. ii. Denaturace proteinů, která je v některých případech částečnou precipitací. iii. Separace DNA od denaturovaných proteinů a dalších buněčných složek Isolace DNA pomocí nosiče Chelex 100 Isolace DNA s použitím nosiče byla první metodou užívanou pro isolaci DNA ve forensní analýze. Podstatou tohoto nosiče je matrice složená z kopolymeru styrenu a divinylbenzenu, na kterou je kovalentně imobilizována kyselina iminodioctová. Disociovaná kyselina iminodioctová má vysokou afinitu pro polyvalentní ionty (např. Ca 2+, Mg 2+, Cd 2+, Ni 2+ ), jejichž přítomnost ve vzorku DNA může v některých případech negativně interferovat s výsledkem PCR. Isolace DNA pomocí Chelex 100 je velmi jednoduchá, buněčná suspense je resuspendována v 5 % roztoku Chelex 100 v přítomnosti proteinasy K a inkubována min při 56 C, kdy je tato proteasa ještě vysoce aktivní. Proteinasa K ve vzorku DNA nespecificky štěpí nežádoucí kontaminující proteiny, které mohou vytvářet vysoce stabilní komplexy s DNA nebo mnoha dalšími různými způsoby inhibovat PCR. Je nutno zmínit, že odstranění hořečnatých iontů ze vzorku DNA nosičem Chelex 100 vede ke zvýšení její stability, neboť ionty Mg 2+ jsou nutným faktorem pro aktivitu přítomných nukleas

9 Po skončení inkubace vzorku při 56 C následuje jeho povaření po dobu 8 10 min, což zaručí, že jsou všechny buňky kompletně desintegrovány (lysovány). Při teplotě 100 C dochází také u většiny proteinů k jejich denaturaci, která je často doprovázena tvorbou precipitátu, který je následně odstraněn centrifugací na dno mikrozkumavky. Výsledný čirý supernatant obsahuje genomovou a mitochondriální DNA, které mohou být použity pro většinu aplikací PCR. Vzhledem k tomu, že je vodná suspense Chelex 100 alkalická s hodnotou ph v rozmezí 9 11, je při těchto podmínkách obdržena jednořetězcová DNA. Hlavní výhodou této metody je její rychlost, při jejím rutinním provedení netrvá isolace DNA déle než hodinu. Je taktéž velmi jednoduchá a podstatné je, že je isolace DNA po celou dobu prováděna pouze v jedné mikrozkumavce. Tento fakt výrazně snižuje riziko kontaminace vzorku cizorodou DNA, ke které může dojít v případě transferu supernatantu do nových mikrozkumavek. Tento způsob isolace je levnou alternativou k ostaním metodám, přičemž je použitelná pro extrakci DNA z vetšiny vzorků, se kterými se setkáme ve forensní laboratoři. Na druhou stranu je nutné podoktnout, že DNA obdržená touto metodou obsahuje relativně vysoké množství nečistot, přesto je však její čistota dostačujcí pro většinu následných aplikací. V současnosti se od isolace DNA pomocí nosiče Chelex 100 již upouští, ale tato metoda je výbornou technikou levné nevalidované isolace DNA. Schematické znázornění isolace chromosomální DNA pomocí nosiče Chelex

10 Isolace DNA pomocí silikátového nosiče V prvním kroku této metody je prováděna desintegrace buněčného materiálu v roztoku obsahujícím detergent současně s proteinasou K. Nejpoužívanějšími detergenty jsou dodecylsíran sodný (SDS), Tween 20, Triton X-100 a Nonidet P-40, které solubilizují některé části buněčných membrán. Po takto provedené buněčné desintegraci následuje přídavek tzv. chaotropních solí jako jsou guanidin thiokyanát nebo chlorid sodný do výsledné koncentrace 6 M. Při vysoké koncentraci chaotropních činidel dochází k porušení terciární a sekundární struktury proteinů v důsledku oslabení interakcí zprostředkovaných vodíkovými můstky, Van der Waalsovými a hydrofobními interakcemi v rámci molekuly proteinu. Výsledkem je snížení rozpustnosti proteinů, jejich precipitát může být odstraněn centrifugací nebo filtrací. Nízká rozpustnost proteinů v přítomnosti koncentrovaných roztoků chaotropních činidel je způsobena zejména jejich dehydratací v důsledku nízké aktivity molekul vody. Současné komerční isolační soupravy (kity) využívají právě tento princip tzv. vysolování. Další podstatná role chaotropních činidel spočívá v jejich positivním efektu vazby DNA na silikátové nebo skleněné nosiče. Po odmytí (eluci) kontaminujících buněčných složek je DNA eluována z povrchu silikátového nosiče vodou nebo pufrem s mírně alkalickým ph. Tato metoda je velmi robustní vůči povaze většiny vzorků ve forensní analýze, výhodou je také možnost její plné automatizace. Isolovaná DNA je méně fragmentována než v případě použití nosiče Chelex 100, isolovaná DNA je dvouřetězcová a obdržené vzorky isolované DNA také vykazují mnohem vyšší čistotu. Vazba DNA na silikátový nosič v přítomnosti chaotropních činidel - 6 -

11 Isolace DNA fenol-chloroformovou extrakční metodou Isolace DNA s použitím chloroformu a bazického roztoku fenolu byla v minulosti používána zejména v oblasti molekulární biologie. Její rozšíření do oblasti forensní analýzy započalo až v polovině 90 let minulého století, a to zejména z důvodu toxicity fenolu. V současnosti je tato metoda používána ve forensních laboratořích pro isolaci DNA ze vzorků půdy a kostí. Buněčná lyse je prováděna podobným způsobem jako u předcházejícího postupu. K buněčnému lyzátu je následně přidána směs fenolu a chloroformu. Celá směs je pak intensivně protřepána a centrifugována, což vede k oddělení dvou fází: spodní organickou a horní vodnou. Na přechodu fází se po jejich oddělení nachází blanka (povlak) precipitovaných proteinů. Ve spodní organické fázi (obsahující směs fenolu a chloroformu) jsou extrahovány látky hydrofobního charakteru, jako jsou například lipidy. V horní vodní fázi se nachází DNA se zbytkovými proteiny. Po odebrání horní vodné fáze se v některých případech provádí opětovná extrakce zbytkového fenolu samotným chloroformem. DNA je z vodné fáze dále nejčastěji precipitována 70% ethanolem a isolována v tomto stavu precipitátu pomocí centrifugace nebo filtrace. Tato metoda poskytuje DNA o relativně vysoké čistotě, ale má několik nedostatků. V průběhu isolace DNA je její roztok v některých krocích přemisťován do nových mikrozkumavek, což zvyšuje riziko její kontaminace cizorodou DNA. Jedná se také o metodu náročnou na množství jednotkových operací Isolace DNA technologií FTA Postup FTA je patentově chráněnou technologií skladování a rychlé isolace DNA (angl. Fast Technology for Analysis of nucleic acids), která byla vyvinuta v 80. letech minulého století za účelem dlouhodobého skladování vzorků DNA při laboratorní teplotě. Podstatou této metody je aplikace slabé base, jemného detergentu nebo kyseliny močové (její soli) na celulosovou membránu, nejčastěji o průměru 2 3 mm. Na takto ošetřenou celulosovou membránu (filtr, terčík) se aplikuje vzorek obsahující DNA. Tato metoda je vhodná zejména pro isolaci DNA ze slin (resp. suspense epithelu) nebo krve. Buňky z těchto preparátů jsou přirozeně zadrženy na filtru, na jehož povrchu a vnitřku současně dochází k jejich lysi. Terčíky se následně intensivně promyjí za účelem odstranění buněčných kontaminant. Jestliže je membrána po této operaci náležitě vysušena a v suchu skladována, potom je vzorek extrahované DNA dlouhodobě stabilní a vykazuje vysokou odolnost vůči poškození UV světlem nebo potenciální mikrobiální kontaminaci. Výhodou tohoto způsobu imobilizace DNA je také to, že pro skladování vzorků není zapotřebí mrazicí box, a také isolace v jedné zkumavce. Terčíky s obsahem DNA o velikosti cca 2 mm lze pak přímo dodat do PCR směsi

12 3.2. Isolace DNA z náročných biologických vzorků V některých případech se ve forensní analýze můžeme setkat s biologickými vzorky, jejichž fyzikálně chemické vlastnosti mohou výrazně komplikovat isolaci DNA. V takových případech je nutné rutinní metody isolace DNA z běžných vzorků (např. krev, sliny) částečně modifikovat Isolace DNA ze spermatu Určení DNA profilu jedince původce spermatu je ve forensní analýze velice častým případem. Spermie má relativně komplikovanou strukturu, přičemž chromosomální DNA se nachází v její hlavičce. Hlavička spermie obsahuje na svém obvodu relativně silnou ochrannou vrstvu, tzv. akrosom, která je bohatá na bílkoviny obsahující vysoké množství cysteinových zbytků. Ty jsou zodpovědné za tvorbu mezimolekulárních disulfidových vazeb mezi proteiny. Proteinasa K, která je velice často používána pro deproteinaci vzorků, není schopna takto prokřížené proteiny účinně štěpit. Na druhou stranu její schopnost štěpit tyto akrosomální proteiny se výrazně zvýší v přítomnosti vysokého obsahu redukčních látek (např. dithiotreitol DTT). Velice častým případem a současně komplikací vzorků spermatu je nežádoucí přítomnost epitheliálních buněk jiné další osoby (např. vaginální výtěr). Směsný vzorek DNA s sebou nese podstatně vyšší nároky na analýzu, proto je účelné kontaminující zdroj DNA odstranit. V tomto případě je naopak vyšší resistence spermií k působení proteinasy K výhodou, lze jí využít při tzv. diferenciální lysi, při které jsou epitheliální buňky lysovány detergentem v přítomnosti proteinasy K za podmínek, při kterých ještě nedochází k lysi spermií. Intaktní spermie jsou v následných krocích intenzivně promyty a dále použity pro isolaci DNA za redukujících podmínek Isolace DNA z vlasů Jestliže vzorek vlasu obsahuje vlasový kořínek, který je bohatým zdrojem DNA, může být z něho DNA isolována standardními postupy. Jeden vlasový kořínek může obsahovat až 500 ng DNA, která může být za použití vhodných postupů téměř kvantitativně isolována. Vlas bez vlasového kořínku neobsahuje téměř žádný buněčný materiál na jeho povrchu. Je složen zejména z keratinu, který vytváří jeho základní matrici. V této keratinové matrici se pak nachází vzduch, stopy kovů a pigmentové komponenty, které jsou odvozeny z částí buněk. Vlas bez kořínku tedy obsahuje dostatečné množství DNA, ale ta je zakomponována v jeho poměrně rezistentní keratinové struktuře. Isolovat DNA z vlasu je velmi obtížné a v mnoha případech poskytují dostupné postupy pouze vzorky pro analýzu mitochondriální DNA, která má ve srovnání s chromosomální DNA mnohem menší velikost. Keratinová matrice je velmi bohatá na disulfidové můstky a v prvním kroku je nutné vlas mechanicky desintegrovat (rozmělnit) a disulfidové můstky v keratinové matrici odstranit pomocí redukčních činidel pro následné použití proteinasy K. Uvolněná DNA z vlasu pak může být snadno purifikována s použitím chaotropních činidel (přes silikátový nosič) nebo - 8 -

13 fenol-chloroformové extrakce. V některých případech se po aplikaci proteinasy K ke vzorku vlasu část hrubého extraktu používá přímo pro PCR analýzu. Vzorek vlasu lze také solubilizovat v hydroxidu sodném, ten způsobuje částečnou hydrolysu keratinu a jeho denaturaci. Po neutralizaci lze tento vzorek použít přímo pro analýzu DNA pomocí PCR nebo pro tyto účely může být ještě koncentrace DNA navýšena ultrafiltrační centrifugací. Protože je obsah DNA ve vlasu (bez kořínku) relativně nízký, jsou z něho obdržené vzorky DNA náchylné k markantní kontaminaci cizorodou DNA, jejíž zdroj se ve většině případů nachází na jeho povrchu. Proto se často před vlastní isolací se povrch vlasu dekontaminuje od těchto možných zdrojů. V praxi se používá více postupů, od nejjednoduššího oplachu destilovanou vodou nebo koncentrovaným ethanolem po diferenciální lysi v mírných detergentech (viz isolace DNA ze spermií) Isolace DNA ze zubů a kostí V některých případech úmrtí (teroristický útok, válka, nehoda, vražda) může mezi dobou smrti a nálezem neidentifikovaného těla uplynout relativně dlouhá doba, v průběhu které může dojít k rozkladu měkkých tkání. Ty pak většinou nemohou být použity jako zdroj genomové DNA z důvodu její fragmentace, která může být způsobena intracelulárními nukleasami nebo bakteriální kontaminací. V těchto případech se přistupuje k isolaci DNA ze tkání, které jsou více odolné k výše zmíněným pochodům. Jde zejména o kostní a zubní tkáň. V kostní tkáni jsou přítomny osteocyty obsahující buněčné jádro (tedy i DNA), které jsou zakomponovány v pevné kostní matrici. U zubu se v jeho dřeňové části nachází odontoblasty. Pevná matrice těchto tkání dostatečně chrání DNA před nepříznivými vlivy a ta po dlouhou dobu zůstává intaktní. Tento stabilizační jev není způsoben pouze prostou fyzikální bariérou matrice, ale přispívá k němu i chemická podstata zubní matrice, která je charakteristická vysokým obsahem hydroxyapatitu (Ca 5 (PO 4 ) 3 OH). Tento minerál s positivním povrchovým nábojem velmi ochotně váže molekuly DNA a zvyšuje jejich resistenci vůči působení nukleas. Významnou výhodou pevných tkání je i to, že je lze velmi účinně očistit agresivními činidly nebo mechanickým obroušením pro zabránění možné kontaminace cizorodou DNA. Pro odstranění nežádoucích zdrojů kontaminace z jejich povrchu se používá roztok chlornanu sodného, trypsinu nebo dlouhá exposice při vysoké intensitě UV záření. Po očištění (dekontaminaci) vzorku tvrdé tkáně je provedena jeho mechanická desintegrace drcením či mletím. Obdržený namletý materiál je dekalcifikován s použitím roztoku 0,5M EDTA (účinné chelatační činidlo), a to před vlastní buněčnou lysí nebo v jejím průběhu. Velmi často se u těchto vzorků používá isolace DNA pomocí silikátového nosiče nebo fenol-chloroformová extrakce

14 3.3. Elektroforesa DNA Molekula DNA obsahuje ionizovatelné funkční skupiny, které ji v závislosti na ph udávají specifické nábojové vlastnosti. V tomto ohledu je nejvýznamnější hydroxylový zbytek na atomu fosforu v rámci fosfodiesterové vazby, která formálně představuje poslední OH skupinu zbytku kyseliny fosforečné (H 3 PO 4, zbylé dvě se podílí na tvorbě fosfodiesterové vazby). Záporný náboj molekul DNA v okolí neutrálního ph je využíván pro jejich separaci pomocí elektroforesy v agarosovém gelu. Podstatou je fakt, že hodnota záporného náboje na jednotku délky (např. na jeden pár báze) je u různě dlouhých molekul stejná. Elektroforetická mobilita lineárních fragmentů DNA (rychlost putování) je tedy funkcí pouze jejich délky a hustoty agarosového gelu. Agarosa je lineární kopolymer D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Jejím zdrojem jsou mořské řasy, přičemž komerčně dostupná agarosa pro molekulární biologii může dále obsahovat polysacharidy, soli nebo proteiny. Množství těchto kontaminant se často může lišit i mezi jednotlivými šaržemi v rámci jednoho dodavatele a samozřejmě i mezi dodavateli. Tyto odlišnosti mohou negativně ovlivňovat separaci DNA v průběhu elektroforesy. V současnosti již dodavatelé (výrobci) jednotlivé parametry, které mohou ovlivnit průběh elektroforézy, validují. Na trhu jsou dostupné také různě modifikované formy agarosy (např. acetylovaná agarosa), které gelovatí při nižší teplotě bez výrazného ovlivnění pevnosti výsledného gelu (pevnost, tuhost). Tyto druhy agaros jsou používány zejména pro preparativní aplikace molekul DNA a pro štěpení molekul DNA přímo v gelu (in situ). V současnosti jsou dostupné také agarosy gelovatějící při nízké teplotě, které jsou určeny pro separaci krátkých fragmentů DNA ( bp), stále však tyto gely nedosahují kvality rozlišení elektroforézy v polyakrylamidovém gelu. Standardně se agarosový gel připravuje následovně: odvážená agarosa se rozpustí ve vroucím elektroforetickém pufru a po jejím rozpuštění je roztok nalit do příslušné elektroforetické nádoby se hřebínkem pro tvorbu jamek a ponechán ztuhnout. Ztuhnutá agarosa vytváří matrici gelu jehož výsledná hustota je závislá na koncentraci agarosy. Molekuly agarosy ve vroucím roztoku mají náhodné prostorové uspořádání, při jejich ochlazování dochází ke vzájemné dimerizaci molekul, která je doprovázena tvorbou helikálního uspořádání v místech jejich kontaktu. Při dalším poklesu teploty dochází k agregaci dimerů s dalšími dimery prostřednictvím těchto helikálních oblastí. Výsledkem je pak tvorba trojrozměrné sítě s velikostí pórů odpovídající množství přítomné agarosy. Pro maximální rozlišení agarosového gelu je v některých případech praktické dát inkubovat gel po jeho ztuhnutí ještě nejméně 30 min při 4 C. DNA se v tomto gelu při neutrálním až slabě alkalickém ph v přítomnosti elektrického pole pohybuje směrem k anodě (kladná elektroda). Rychlost její migrace je pak klíčovým elektroforetickým parametrem a je závislá na celé řadě faktorů

15 Složení a struktura agarosového gelu, elektroforéza DNA

16 Faktory ovlivňující elektroforetickou mobilitu DNA v agarosovém gelu Elektroforetická pohyblivost molekul DNA v agarosových gelech (na rozdíl od polyakrylamidového gelu) není významně ovlivněna složením DNA (zastoupením jednotlivých bází) nebo teplotou v rozmezí 4 30 C. Nejčastěji se elektroforéza provádí při pokojové teplotě, ale pokud jsou používány gely s obsahem agarosy nižší než 0,5 %, je vhodné provádět elektroforézu při 4 C pro uchování jejích dělících schopností. Je však celá řada faktorů, které na mobilitu vliv mají: Velikost molekuly DNA a hustota gelu. Lineární molekuly dvouřetězcové DNA v neutrálním až slabě alkalickém prostředí migrují ve stejnoměrném elektrickém poli skrz gelovou matrici rychlostí, jejíž hodnota je v nepřímé úměře k logaritmu jejich délky (počtu páru basí tj. molekulové hmotnosti). Tato závislost však neplatí v neomezeném intervalu, od určité velikosti dochází k intensivnějšímu zpomalení (migraci) v důsledku jejich intensivního frikčního brždění a dále z důvodu, že se také méně snadno proplétají jednotlivými póry gelu. Závislost elektroforetické pohyblivosti DNA na její délce a na hustotě agarosového gelu

17 Mobilita DNA je závislá na hustotě gelu, tj. je závislá také na koncentraci agarosy. Tuto závislost lze popsat následujícím vztahem: Hodnota retardačního koeficientu K r je závislá na vlastnostech gelu, velikosti a tvaru molekuly. Z této závislosti by mělo být patrné, že je možné účinně elektroforeticky rozlišit fragmenty DNA o různé délce vhodnou volbou hustoty gelu. V následující tabulce jsou ukázány dělící schopnosti různě koncentrovaných agarosových gelů. rozsah délek lineárních fragmentů koncentrace agarosy DNA, které lze účinně separovat [%(w/v)] [kbp] 0, , ,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,2-3 Konformace DNA. Kružnicová dvouřetězcová DNA může zaujmout různé konformační stavy, které jsou výsledkem vnitřního pnutí dvojhelixu (počet závitů), složení roztoku a také tvorbou multimerních forem v původním organismu. Vzhledem k tomu, že každá konformace DNA má jiné hydrodynamické vlastnosti a různé stupně volnosti, jejich mobilita se na agarosové elektroforéze liší. Jejich relativní mobilita (ve vzájemném srovnání) je zejména závislá na koncentraci agarosy v gelu, ale je také ovlivněna použitým napětím a iontovou silou elektroforetického pufru. Ve forensní praxi není analýza kružnicové DNA příliš běžná, je ale nutno mít na mysli, že za určitých podmínek může různé konformační stavy zaujímat i lineární DNA

18 Závislost pohyblivosti DNA v agarosovém gelu na její konformaci Použité napětí. Při nižších hodnotách napětí je migrace lineárních fragmentů DNA proporcionální k jeho hodnotě. Odlišné chování však vykazují dlouhé fragmenty DNA. Obecně platí, že rozlišení (separace) fragmentů DNA v průběhu elektroforézy v agarosovém gelu klesá se vzrůstajícím napětím. Pro obdržení dobrého rozlišení fragmentů DNA delších než 2 kbp je nutné provádět elektroforézu při napětí nižším než 5 V/cm (vzdálenost protilehlých elektrod). Směr elektrického pole. Molekuly DNA, které jsou delší než kbp migrují na agarosové elektroforéze s konstantním směrem elektrického pole stejnou rychlostí. Pokud se však orientace elektrického pole v průběhu elektroforézy periodicky mění, dochází ke změně směru migrace také molekul DNA. Vzhledem k tomu, že delší molekuly DNA potřebují delší čas pro změnu směru jejich migrace, lze tento způsob elektroforézy (tzv. PFGE, z angl.. Pulsed Field Gel Electrophoresis) použít pro separaci extrémně dlouhých molekul (do kbp). Přítomnost interkalačních činidel. V praxi se často do agarosového gelu přidává ethidium bromid, který je používán pro detekci DNA po ukončení elektroforézy. Tato interkalační látka po vazbě na lineární DNA snižuje její mobilitu přibližně o 15 %. Důvodem

19 je to, že po jeho vmezeření (interkalaci) mezi báze dochází k prodloužení molekuly DNA a zároveň ke zvýšení její rigidity. Je nutné upozornit, že ethidium bromid je silný karcinogen a musí se s ním pracovat velmi opatrně. Všechny jeho roztoky musí být před vylitím náležitě dekontaminovány nejčastěji aktivním uhlím nebo přídavkem chlornanu sodného (aktivní látka přípravku SAVO). Složení elektroforetického pufru. Elektroforetická mobilita DNA je ovlivněna složením a iontovou silou pufru, ve které je prováděna. V nepřítomnosti jakýchkoli solí (např. destilovaná voda) je vodivost příliš nízká a DNA migruje velmi pomalu. Naopak v případě vysoké iontové síly pufru dochází z důvodu vysoké vodivosti k intensivnímu zahřívání, což vede k tání gelu a denaturaci DNA. V praxi se používá více druhů pufrů pro elektroforézu dvouřetězcové DNA za nativních podmínek. Označení pufru Pracovní koncentrace Koncentrovaný roztok 0,04 M Tris-acetát TAE 0,001 M EDTA 50 x (Tris-acetátový pufr) ph 8,0 TPE (Tris-fosfátový pufr) TBE (Tris-borátový pufr) alkalický 0,09 M Tris-fosfát 0,002 M EDTA ph 8,0 0,045 M Tris-borát 0,001 M EDTA ph 8,0 0,05 M NaOH 0,001 M EDTA ph silně basické 10 x 5 x 1 x V 5 x koncentrovaném TBE dochází při dlouhodobém skladování k tvorbě precipitátu, takový pufr není doporučeno používat. Z historických důvodů je TAE pufr stále nejpoužívanějším, přestože jeho pufrační kapacita je nízká. V TAE pufru v průběhu dlouhých časů elektroforézy dochází ke změně složení v jednotlivých elektrodových prostorech. Proto je v případě použití tohoto pufru doporučeno používat elektroforetické aparatury, které mají recirkulační jednotku pro homogenisaci celého objemu pufru v elektroforetické aparatuře. Náklady pro přípravu TPE a TBE pufru jsou ve srovnání s TAE o něco vyšší, ale mají podstatně vyšší pufrační aktivitu. Dvouřetězcové fragmenty DNA mají přibližně o 10 % vyšší mobilitu v přítomnosti TAE pufru ve srovnání s TBE a TPE, ale rozlišení je ve všech případech srovnatelné. Výjimkou je pouze superšroubovicová DNA, která se lépe dělí v TAE pufru. Pro elektroforézu jednořetězcové denaturované DNA se používá nejčastěji alkalický pufr (50 mm NaOH, 1 mm EDTA). V tomto případě nemůže být roztok agarosy připraven jejím varem přímo v tomto alkalickém roztoku z důvodu její hydrolysy. Prakticky se příprava

20 gelu provádí rozpuštěním agarosy v destilované vodě a po ochlazení jejího roztoku se přidá koncentrovaný roztok NaOH a EDTA Kvantifikace DNA Po extrakci DNA je důležitým krokem určení koncentrace DNA a též evaluace její kvality. Použití správného množství DNA v následné PCR rekci je kritické pro získání kvalitního DNA profilu. Obzvláště důležité je to v případě forensních vzorků, kdy je často těžko odhadnutelný stupeň zachování biologického materiálu. Množství DNA, které lze extrahovat ze vzorku, velmi závisí na typu materiálu. Každá jaderná buňka obsahuje přibližně 6 pg DNA. Krev obsahuje jaderných buněk (tedy nikoli erythrocytů) v jednom mililitru, sperma cca 65 milionů jaderných buněk na mililitr. Relativně rychlou a jednoduchou metodou pro odhad množství i kvality extrahované DNA je její vizualizace v agarosovém gelu po elektroforetické separaci a porovnáním se standardy délek DNA o známém množství. Nevýhodou je subjektivita a relativita kvantifikace, obzvláště v případě částečně degradované DNA, detekuje se celková DNA, tj. včetně např. DNA pocházející z mikrobiální kontaminace vzorku a nelze ji použít pro DNA extrahovanou pomocí metody Chelex, protože ta produkuje jednořetězcovou DNA, na kterou se neváží interkalační fluorescenční barvy, používané pro vizualizaci. Spektrofotometrie v UV světle využívá schopnosti basí DNA absorbovat světlo při 260 nm. Zpravidla se vzorek měří v rozsahu vlnových délek nm, aby bylo možno odhadnout i případnou kontaminaci cukry (maximální absorbance při 230 nm) a proteiny (280 nm). Pro odhad čistoty slouží kritérium poměru absorbancí při 260 a 280 nm, které je pro čistou DNA v rozsahu 1,8 2,0. Nevýhodou je obtížná kvantifikace v případě malých množství DNA (častý případ forensních vzorků), kvantifikace není specifická pro lidskou DNA a existuje mnoho interferujících činidel (např. barviva z oblečení). Pro získání koncentrace není třeba žádné standardní křivky, jedná se o metodu absolutní. Fluorescenční spektroskopie využívá stejných činidel, jaká jsou používána při vizualizaci DNA v agarosovém gelu, čili např. ethidium bromidu nebo DAPI (4,6-diamidino-2- fenylindol). Principu extrémního nárůstu fluorescence po interkalaci s DNA se využívá i pro kvantifikaci velmi malého množství DNA (např. PicoGreen je schopna detekovat 25 pg/ml, navýšení fluorescence po vazbě na DNA je 1000násobné). I u této kvantifikační metody však platí, že není specifická pro lidskou DNA a vyžaduje výhradně dvouřetězcovou DNA. V typickém uspořádání se tedy k roztoku DNA neznámé koncentrace přidá interkalační činidlo a po krátké inkubaci je změřena intensita fluorescence (nejčastěji v mikrotitrační destičce). Změřená hodnota je poté porovnána s hodnotami kalibrační křivky (závislosti intensity fluorescence na známé koncentraci standardní DNA), jedná se tedy opět o relativní kvantifikaci. Kvantifikační techniky založené na hybridizaci se používaly ve forensních vědách hlavně v minulosti. Extrahovaná DNA je aplikována na nylonovou membránu a poté vystavena roztoku oligonukleotidu, který specificky hybridizuje se zvoleným úsekem na cílové

21 DNA (často se používala repetice v D17S1). Tento oligonukleotid je možno značit mnoha způsoby (kolorimetricky, chemiluminiscenčně). Výsledek je získán porovnáním se sadou standardů o známé koncentraci. Výhodou této metody je specifita pro lidskou DNA, nevýhodou nízká citlivost a velká pracnost provedení. Kvantitativní PCR (qpcr) je slibnou technikou, umožňující měřit jak relativní, tak absolutní koncentraci DNA měřením fluorescence v průběhu polymerasové amplifikace. Ve forensních aplikacích se často používá, protože umožňuje např. stanovit koncentraci mužské DNA a současně celkové lidské DNA, resp. jejich amplifikovatelné množství (tedy takové, které bude využitelné pro reakce vedoucí k sestavení DNA profilu). Jedná se o metodu relativní, k získání číselného údaje koncentrace je třeba provést reakce i se sériově ředěnými roztoky standardní DNA. Tato technika je relativně rychlá a nenáročná na provedení Polymerasová řetězová reakce Polymerasová řetězová reakce (PCR) je v různých obměnách centrální technikou forensní analýzy DNA. Vyvinutí techniky specifické amplifikace vybrané oblasti DNA, umožňující vycházet i z extrémně malého množství templátové DNA, byla skutečným průlomem Složky PCR směsi V každé PCR reakci nesmí chybět následující komponenty: templátová DNA, nejméně dva oligonukleotidy (primery), termostabilní DNA-polymerasa, deoxyribonukleotidtrifosfáty (stavební kameny) a reakční pufr. Templátová, čili zdrojová DNA, jejíž část vymezená primery bude následně amplifikována, musí být do reakce přidána ve vhodném množství. Většina komerčních souprav vyžaduje pro optimální výsledek 0,5 2,5 ng extrahované DNA na reakci, což odpovídá kopiím haploidního lidského genomu (jedna kopie lidského genomu odpovídá cca 3 pg DNA). Většina profilování je ale možná i s menším množstvím templátu (i pod 100 pg), interpretace výsledků je pak ale komplikovanější. Není důležitá jen koncentrace DNA, ale též její čistota (absence složek inhibující enzymovou aktivitu DNApolymerasy) a integrita (z fragmentované DNA není možno amplifikovat potřebně dlouhé úseky, výsledkem je částečný profil, obsahující jen lokusy s menší délkou amplikonu). DNA-polymerasa (DNA-dependentní DNA-polymerasa, EC ) z termofilních bakterií je schopná uchovat si aktivitu i při teplotách blízkých 100 C. Dnes existuje mnoho komerčně dostupných polymeras, které se liší svou přesností (množstvím chybně zařazených nukleotidů) i procesivitou (počet inkorporovaných nukleotidů, než polymerasa odpadne od templátu), často se využívá tzv. hot start enzymu, tj. takového, který má v aktivním místě protilátku a jehož enzymatická aktivita je spuštěna až po prvním záhřevu na 95 C, tímto způsobem se brání degradaci primerů a tvorbě nespecifických produktů. Primery jsou krátké oligonukleotidy (obvykle bp), které definují amplifikovanou oblast tak, že jsou komplementární k jednomu (každý k jinému) řetězci dvouřetězcové

22 templátové DNA. Ve forensní analýze je důležité, aby se primery párovaly v oblasti konzervovaných úseků DNA a umožnily tak amplifikaci libovolného vzorku lidské DNA a současně aby se nepárovaly s DNA jiných živočišných druhů. V případě multiplex PCR (tedy reakce, ve které je více párů primerů a vzniká tak více specifických produktů z jedné templátové DNA) je třeba při návrhu primerů brát v potaz i velikost produktů PCR reakce tak, aby je bylo možno efektivně oddělit a identifikovat. V závislosti na délce a obsahu G/C a A/T mají primery různou teplotu přisednutí (počítanou jako teplotu, která je v daném prostředí potřeba na přerušení vodíkových můstků a odtržení primeru od jeho templátu), většina primerů je navržena na teplotu přisednutí C. Primery mohou být navrženy ručně, nebo s využitím některého z dostupných programů, v případě komerčních identifikačních souprav jsou již primery součástí balení. Deoxyribonukleotid trifosfáty (dntp) jsou stavební kameny DNA, jejich přítomnost v reakci je nezbytná, aby měla polymerasa co přidávat při extensi primerů dle vzoru templátové DNA. Všechny dntp jsou v reakci obvykle přítomny ve stejné koncentraci (200 µm). Reakční pufr udržuje optimální ph, iontovou sílu a ionty potřebné pro enzymovou aktivitu (Mg 2+ ) Průběh PCR reakce Amplifikace DNA probíhá v cyklech, přičemž každý z nich má tři kroky: denaturaci, přisednutí primerů a extensi (prodloužení primerů dle templátu ve směru 5 3 ). Při denaturaci je teplota reakční směsi zvýšena na 95 C, což způsobí rozpad dvouřetězcové templátové DNA na dvě jednořetězcové molekuly. Teplota je poté snížena cca na 60 C (v závislosti na teplotě přisednutí přítomných primerů) a primery se párují vodíkovými můstky ke komplementárnímu úseku na templátové DNA (primery jsou v molárním přebytku proti templátu, takže znovusložení dvou jednořetězců zpět je méně pravděpodobné). Po hybridizaci primerů je teplota zvýšena na 72 C (nebo jinou, optimální teplotu použité polymerasy) a začíná přidávání nukleotidů ke 3 konci primeru podle templátu (rychlost přidávání se může dramaticky lišit podle polymerasy, orientačně cca 30 basí za sekundu). Běžně se používá cca 30 cyklů, toto číslo lze zvýšit v případě extrémně malého množství templátové DNA (ovšem se zvýšeným rizikem vzniku nespecifických produktů). Vzhledem k tomu, že v každém kroku se zdvojnásobí počet molekul DNA, vznikne teoreticky z jediné templátové molekuly na konci 32. cyklu (doporučený program pro PowerPlex 16) cílových molekul. Přestože efektivita amplifikace není 100%, jedná se stále o velmi mocnou techniku, která ale stejně dobře dokáže amplifikovat kontaminující DNA, proto je třeba specializovaného vybavení a opatrnosti při přípravě PCR reakce (snížení rizika kontaminace). Ve forensní praxi je třeba brát v potaz též možnost, že na místě činu lze najít (odebrat, purifikovat, amplifikovat a následně profilovat) též DNA, která nemá s kriminálním činem nic společného a výsledky analýzy je tak třeba brát pouze jako jednu z indicií

23 Příklad programu teplotního cyklovače Jedním z nejčastějších problémů ve forensní praxi je inhibice PCR reakce složkou vzorku. Extrakce DNA neodstraní všechny kontaminanty a ty poté mohou inhibovat enzymovou aktivitu použité polymerasy, příkladem může být hem při isolaci z krve, žlučové kyseliny a komplexní polysacharidy při analýze fekálií, huminové kyseliny pocházející z půdy či močovina z moči. Pro běžně se vyskytující kontaminanty byly vyvinuty extrakční techniky, umožňující jejich odstranění, ale např. extrakce Chelexem velké množství inhibitorů neodstraní. Řešením může být buď naředění vzorku (sníží se koncentrace inhibitorů i templátové DNA, ale díky vysoké efektivitě amplifikace to nemusí být problém) nebo přidání hovězího sérového albuminu (BSA), který řadu inhibitorů jednoduše vyváže. A schématické znázornění polymerace dvouřetězcové DNA B závislost míry denaturace DNA (resp. zastoupení ssdna) na teplotě

24 Kvantitativní PCR Při tvorbě DNA profilu se analyzují produkty PCR reakce v jejich konečné podobě, tj. po cca 30 amplifikačních cyklech. Je však možno sledovat i tvorbu produktů v reálném čase (kvantitativní či real-time PCR), a to v zásadě dvěma základními technikami. První využívá již diskutovaného jevu zvýšení fluorescence interkalačního barviva v UV světle po navázání na dvouřetězcovou DNA, s tvorbou produktu se tedy zvyšuje fluorescence barvy (např. SYBR Green) přítomné v reakční směsi. Tato varianta qpcr je cenově nejpřijatelnější, umožňuje využití konvenčních primerů (nevyžaduje relativně drahé, fluorescenčně značené sondy) a umožňuje analýzu křivky tání, na druhou stranu se fluorescenční barva váže na jakoukoli dvouřetězcovou DNA (tedy i na kontaminující DNA např. z mikrobiální kontaminace) a nelze provádět porovnání hladiny dvou různých částí templátové DNA. Vazba fluorescenční barvy na dvouřetězcovou DNA

25 Druhá metoda (tzv. TaqMan) je založena na schopnosti DNA-polymerasy odbourávat oligonukleotidy od 5 konce. Kromě dvou primerů vymezujících amplifikovaný úsek se do reakce přidává též tzv. sonda, tj. oligonukleotid, specificky hybridizující uvnitř úseku vymezeného primery. Tento oligonukleotid je na 5 konci modifikován fluorescenční molekulou a na 3 konci tzv. zhášečem (existují látky, které potlačují fluorescenci molekul, jsou-li v dostatečné blízkosti, je to způsobeno odlišným způsobem relaxace excitovaného fluoroforu). V průběhu PCR reakce dochází k extensi primerů až k místu, kde polymerase překáží sonda. Polymerasa tuto sondu degraduje svou exonukleasovou aktivitou, čímž dojde k uvolnění fluoroforu a zhášeče do roztoku. Zhášeč se po uvolnění ocitne příliš daleko od fluoroforu (nedrží ho oligonukleotidový řetězec jako v případě nedegradované sondy) a fluorofor začne fluoreskovat opět tedy dochází s tvorbou produktu k nárůstu fluorescence. Kvantitativní PCR je velmi citlivá, v tomto provedení specifická pro lidskou DNA a není náročná na provedení. Schéma průběhu jednoho polymeračního cyklu kvantitativního PCR s použitím TaqMan sondy

26 Během prvních cyklů PCR se množství amplikonů takřka zdvojnásobuje. Množství amplikonů tedy roste exponenciálně úměrně k počátečnímu množství templátu ve vzorku. Následuje lineární fáze amplifikace a v určitém okamžiku se začnou vyčerpávat nukleotidy, primery, a nebo začne být DNA-polymerasa méně aktivní v důsledku opakovaného zahřívání. Růst množství produktů se v tomto okamžiku dále zpomalí, výsledkem je tzv. plató efekt a množství amplikonů vzniklých v každém cyklu již není úměrné množství templátu. Jinými slovy, každý amplikon v reakci dosáhne dříve či později maximální možné koncentrace (vzhledem k citlivosti detektoru pro jeho fluorescenci). Klíčem k určení původního množství templátové DNA ve vzorku je tedy vyhodnocení počáteční fáze qpcr reakce před dosažením oblasti plata. K tomu právě slouží kontinuální monitorování fluorescence v průběhu reakce. Na počátku reakce zůstává signál fluorescence na úrovni pozadí a její vzrůst není detekovatelný (cca cykly 1-18 na obrázku), ačkoli množství PCR produktu vzrůstá exponenciálně. V nějaký okamžik se v reakci nahromadí tolik produktu, že jeho fluorescence je již detekovatelná. Cyklus, ve kterém tento jev nastane, se označuje Cq (quantification cycle) nebo C T.(threshold cycle). Protože tento cyklus nastává vždy v exponenciální fázi, kde není žádná složka reakce limitována, může být použit (na základě standardních křivek) pro výpočet počátečního množství templátové DNA v reakci. Je-li na počátku v reakci mnoho templátové DNA, stačí relativně málo cyklů na to, aby se namnožilo dost produktu, jehož fluorescence vzroste nad stanovenou úroveň pozadí (threshold, obvykle 10x fluorescence pozadí). Naopak u malého množství vstupní DNA musí proběhnout více cyklů k dosažení požadované úrovně fluorescence. Amplifikační křivka qpcr, tedy závislost fluorescence vzorku na amplifikačním cyklu

27 Typické provedení qpcr zahrnuje amplifikaci sériového ředění vzorku (někdy v multiplikátech). To umožňuje i u vzorku s neznámou koncentrací DNA určit efektivitu amplifikace. K určení koncentrace (absolutní kvantifikace) je nutno použít standardní přímku. Zpravidla je vytvořena tak, že je provedeno sériové naředění vzorku o známé koncentraci a s těmito vzorky je provedeno qpcr. Standardní přímka je poté závislost získaného C T na logaritmu startovacího množství templátu. Je-li tato křivka lineární (korelační koeficient R 2 > 0.985), lze přistoupit k hodnocení efektivity amplifikace. Ideálně použijeme-li např. desítkové ředění, měly by se hodnoty C T z takto ředěných templátů lišit o 3,32 (protože je-li 2 n =10, pak n=3,32). Jsou-li všechny křivky posunuty o stejnou hodnotu, standardní křivka bude lineární a její směrnice bude -3,32. Efektivita je pak počítána jako, akceptovatelné hodnoty jsou cca %. Existuje i kvantifikace relativní, používaná např. při sledování genové exprese (tedy ne ve forensních vědách), pracuje s tzv. komparativním C T, tedy srovnává C T dvou různých templátů. Závislost CT na ředění templátu qpcr (desítkové), lineární proložení i efektivita amplifikace jsou blízké ideálu Analýza křivky tání se zejména u provedení s interkalačním barvivem (SYBR Green) často používá po ukončení amplifikačních cyklů. Spočívá v ochlazení reakční směsi na cca 55 C a poté její pomalý záhřev na 95 C za současného měření fluorescence. Každá disociace významné subpopulace amplikonů v důsledku teplotou indukovaného odtržení dvou řetězců se projeví poklesem fluorescence reakční směsi (interkalační barva se nemá kam navázat a volně v roztoku má 1000x menší intensitu fluorescence), analýzou křivky tání lze tedy určit

28 -d(rfu)/dt počet různých produktů i odhadnout jejich velikost (nejlépe viditelné na závislosti poklesu fluorescence na teplotě). V extrémně přesné variantě tzv. HRM (z angl. High Resolution Melt, tedy tání s vysokým rozlišením) slouží tato analýza k odhalení bodových mutací (teplota tání pro pár A-T je jiná, než pro pár G-C). 600,00 500,00 400,00 300,00 vzorek NTC 200,00 100,00 0,00 55,00 65,00 75,00 85,00 95,00 105,00 Teplota ( C) Křivky tání vzorku s jedním majoritním produktem a netemplátové kontroly 3.6. Forensní analýza DNA V lidském genomu je cca genů, které tvoří zhruba 25 % genomu, 75 % DNA je tzv. extragenová DNA. Cca 50 % genomu je tvořeno repetitivní DNA. Co se týče diverzity, je důležité si uvědomit, že za 6 milionů let, které uplynuly ve vývoji druhu Homo sapiens a šimpanze (našeho nejbližšího zvířecího příbuzného) od společného předka, divergovaly naše genomy o pouhých cca 5% (jinými slovy 95 % genomu máme totožného jako šimpanzi). Za let historie druhu Homo sapiens jako takového došlo jen k drobné diverzifikaci genomu a tak 99,9% genomu mají všichni lidé stejný. Naštěstí existují v lidském genomu dobře charakterizované oblasti, které jsou dostatečně variabilní a staly se cílem forensní genetiky. Cílem analýzy DNA ve forensních oborech je většinou srovnání vzorků DNA a nalezení vysoce pravděpodobné shody nebo její vyloučení mezi porovnávanými vzorky. Lidský genom obsahuje proměnlivé oblasti, v takovém případě hovoříme o tzv. polymorfismu. Charakter těchto polymorfismů, stejně tak i jeho rozšíření, může být různý. Může se jednat malé sekvenční rozdíly (např. substituce nebo delece na úrovni několika nukleotidů) nebo

29 o rozsáhlejší strukturní změny. Polymorfismy se mohou nacházet kdekoliv v genomu tj. v genových, tak i mimogenových oblastech. Je nutné upozornit, že se pojem alela, která je definována jako forma genu, v posledních letech s intensivním rozvojem molekulárních metod analýzy a bioinformatiky mění (to platí i o definici pojmu genu ). Alelu lze tedy dnes definovat jako formu dané oblasti DNA, kterou sdílí aspoň jedno procento populace. Z výše řečeného, bychom neměli pojem alela pro mimogenové oblasti vůbec používat, což však není dodržováno. Lépe je hovořit o polymorfismu v lokusu (lokus je přesná pozice na chromosomu, ve které se vyskytuje příslušný gen nebo daná oblast DNA). Z hlediska výskytu polymorfismů dělíme lokusy následovně: i. Nepolymorfní lokusy jsou to nevariabilní oblasti DNA. Podstatou jejich konzervativnosti je silný selekční tlak jejich správné (precizní) biologické funkce. ii. Nízce až středně polymorfní lokusy v určité populaci (tj. geograficky vymezená skupina jedinců téhož druhu, např. Homo sapiens) se daný lokus nachází pouze v několika sekvenčních variantách. To je charakteristické především pro geny. iii. Vysoce polymorfní, nebo-li také multialelické lokusy se v populaci vyskytují v mnoha variantách (až řádově desítky forem). Tento jev je charakteristický zejména pro mimogenové oblasti DNA. Ve forensní praxi analýze se nejčastěji k identifikaci DNA využívají následující polymorfismy: i. VNTR minisatelity tandemové repetice s typickou délkou základního motivu párů nukleotidů (z angl. Variable Number of Tandem Repeats). Počet potenciálních alel je velmi vysoký, např. lokus MS1 má relativně krátkou repetici 9bp, ale vyskytuje se v rozsahu repeticí, tzn., existuje cca 2000 různých možných alel tohoto lokusu. VNTR se v minulosti hojně využívaly pro forensní práci, ale byly překonány. Hlavním důvodem je zejména požadavek na relativně velké množství nefragmentované DNA nutné k analýze, navíc interpretace VNTR profilů může být problematická. ii. STR mikrosatelity krátké tandemové repetice (z angl. Short Tandem Repeats) s typickou délkou základního motivu 2-7 nukleotidů, tento motiv se opakuje v určitém místě DNA a je obklopen nevariabilní sekvencí, na kterou je možno navrhnout primery (celková délka motivu je potom typicky bp). Pro profilování lidské DNA (HID Human IDentification) se využívá víceméně výhradně pouze STR s tetra- nebo nově pentanukleotidovou repeticí. Jednotlivé alely se označují číslem, vyjadřujícím počet opakování základního motivu. Některé alely nejsou tvořeny celým počtem opakování, tzn. existuje X úplných opakování a poté část X+1 opakování, takové alely označujeme jako tzv. mikrovarianty, značíme je počtem úplných opakování, následuje tečka a počet nukleotidů z následujícího neúplného motivu. Do forensní praxe byly zavedeny v polovině 90. let a jistě v ní ještě nějakou dobu setrvají, neboť dobře splňují základní požadavky forensního markeru: jejich amplifikace je robustní, lze je získat ze široké škály biologického materiálu, výsledky získané v různých