In vitro testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství. Mgr. Jana Horáková

Transkript

1 In vitro testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství Mgr. Jana Horáková

2 Proces tkáňového inženýrství 1. Návrh nosiče Seznámení se s problematikou dané tkáně/orgánu Návrh nosiče pro danou aplikaci 2. Příprava a charakterizace nosiče 5. Klinické testy Klinické testy Klinická praxe 4. Testování in vivo Testování in vivo 3. Testování in vitro Cytotoxicita nosiče Testy adheze a proliferace, migrace Testy buněčné de/diferenciace Preklinické testy

3 Hemokompatibilita nosiče Implantabilní ZP testování interakcí materiálu s krví Ovlivnění hemolýzy, koagulace, interakce s trombocyty

4 Hemokompatibilita nosiče ISO Biologické hodnocení zdravotnických prostředků Výběr zkoušek na interakce s krví 5 kategorií zkoušek: 1. Trombóza (procento okluze, mi, SEM) 2. Koagulace (PTT, koagulační fa) 3. Destičky (počet, agregace, specifické markery) 4. Hematologie (hemolýza, dif) 5. Systém komplementu

5 Hemokompatibilita nosiče

6 Hemokompatibilita nosiče

7 Cytotoxicita ISO Biologické hodnocení zdravotnických prostředků Zkouška na cytotoxicitu in vitro 3 kategorie zkoušek: extrakt/přímý styk/nepřímý styk posouzení poškození buněk morfologickými prostředky měření poškození buněk měření růstu buněk měření specifických aspektů buněčného metabolismu

8 Cytotoxicita Positivní kontrola materiál vyvolávající reprodukovatelnou cytotoxickou odezvu (PUR, fenol) Slepý vzorek extrakční činidlo bez vzorku Negativní kontrola materiál, který nevyvolává cytotoxickou odezvu (HMWPE) Extrakční činidlo kultivační médium se sérem, fyziologický roztok Podmínky extrakce dle povahy a účelu použití ZP (24 h, 37 C)

9 Cytotoxicita nosiče II Kontaktní cytotoxicita vložení testovaného materiálu do kultivační jamky s buňkami sledování morfologie buněk v blízkosti zkoumaného materiálu = Zkouška přímým stykem Nontoxic Cytotoxic

10 Cytotoxicita nosiče II Zkouška nepřímým stykem: Zkouška difúzí agarem

11 Cytotoxicita Zkouška na cytotoxicitu příjmem neutrální červeně Zkouška na cytotoxicitu MTT/XTT 1. den: nasazení buněk do 96-jamkových destiček (1x10 4 buněk/jamku) inkubace 24 hodin 2. den: mikroskopická kontrola buněk, odsátí kultivačního média přidání extraktů (alespoň 4 koncentrace, positivní, negativní kontroly, médium slepý vzorek) 3. den: mikroskopická kontrola buněk, odsátí média/extraktů přidání 50 μl MTT 2h inkubace odsátí, přidání 100 μl IPA měření při 570 a 650 nm Analýza dat: Viabilita (%)= 100 OD 570e /OD 570b OD 570e střední hodnota změřené absorbance extraktů OD 570b střední hodnota změřené absorbance slepých vzorků

12 Metabolické testy MTT, MTS, XTT, WST Nepřímá kvantifikace buněk měření jejich metabolické aktivity

13 Metabolické testy MTT MTS one step MTT XTT WST (Water soluble tetrazolium salts)

14

15 Absorbance Cytotoxicita nosiče Výluhy tkáňového nosiče v polárním a nepolárním rozpouštědle přidání do média při kultivaci buněk Koncentrační řada výluhů měření buněčné viability nejčastěji po 24-hodinové inkubaci stanovení cytotoxické koncentrace 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

16 Cytotoxicita

17 Kultivace buněk na testovaném materiálu Viz praktická cvičení MTI Nasazení buněk na testovaný materiál sledování buněčné adheze a proliferace Doba kultivace, intervaly testování, počet buněk Statická vs dynamická kultivace Metody: Metabolické testy Fluorescenční mikroskopie Kvantifikace DNA Elektronová mikroskopie

18 Statická vs dynamická kultivace

19 Dynamická kultivace

20 Bioreaktory

21 Dynamická kultivace tubulárních vzorků

22 Fluorescenční mikroskopie Barvení buněčných struktur: Jádra PI, DAPI, Hoechst Cytoplasma fluorescein Specifické barvení fokální adheze (vinkulin, tallin), specifické buněčné receptory

23 Fluorescenční mikroskopie Kvantifikace počet buněk na ploše (zorné pole/počítací Gundersonovo okénko) po obarvení buněčných jader Spreading míra rozprostření buňky na materiálu vypovídá o buněčné adhezi

24 LIVE/DEAD assay Rozlišení živých a mrtvých buněk: mrtvé buňky se barví červeně (PI/ethidium pronikne poškozenou membránou do jádra buňky), živé buňky se barví zeleně (neporušená membrána PI se nedostane do jádra; calcein)

25 Elektronová mikroskopie Kvalitativní (semikvantitativní) hodnocení Sledování buněčné adheze po nasazení buněk na materiál (v řádu několika hodin) Proliferace buněk po povrchu scaffoldu během kultivace vytvoření monolayeru buněk

26 Yarrow et al. BMC Biotechnology :21 Testy buněčné migrace

27 Testování buněčné diferenciace Důležité sledování při kultivaci kmenových buněk ovlivnění jejich diferenciace růstovými faktory, mechanickými signály Některé buněčné linie dediferencují (chondorcyty) sledování jejich fenotypu Využití metod molekulární biologie detekce syntézy RNA pro dané proteiny (RT PCR), detekce proteinů (ELISA, IFL)

28 Kvantifikace DNA Nejpřesnější stanovení počtu buněk Izolace DNA (lýza buněk, odstranění proteinů, precipitace DNA ethanolem, rozpuštění DNA ve vodě nebo v pufru) 1. krok při práci s NK 2 typy izolace: 1. Fenol-chloroformová extrakce: standard, spolehlivé, levné x zdlouhavé, pracné 2. Adsorpční metoda vazba DNA na silikátovou kolonku

29 Izolace DNA pevné tkáně či rostlinné buňky nutno mechanicky rozrušit (homogenizátory) detergenty lýza buněk a denaturace proteinů (např. Triton X-100) EDTA, diethylpyrokarbonát (DEPC) aj. potlačení aktivity nukleáz přítomných ve vzorku odstranění druhé nežádoucí NK v závislosti na izolovaném typu (RNáza A, DNáza I)

30 lýza buněk Fenol-chloroformová extrakce přídavek směsi fenol:chloroform (1:1) denaturace proteinů a rozpouštění tuků centrifugace oddělení spodní organické fáze (fenol +chloroform), mezifáze (denaturované proteiny, zbytky buněk) a horní vodné fáze s rozpuštěnými NK pro dokonalé odstranění proteinů nutno extrakci opakovat, v závěrečném kroku přidat pouze chloroform (odstranění stopového množství fenolu z vodné fáze) vysrážení NK z vodné fáze přídavkem chlazeného 100% EtOH, zamražení na -80 C (30 60 min.) centrifugace odstranění supernatantu odsolení sedimentu (vysrážené NK) pomocí 70% EtOH vysušení sedimentu získaná NK se rozpustí v TE pufru (Tris-EDTA, ph 8) nebo deionizované vodě

31

32 Adsorpce NK na silikátový povrch adsorpce NK na silikátový povrch kolony v přítomnosti chaotropních solí (jodid sodný, ionty guanidinu) závisí na koncentraci solí a ph prostředí uvolnění NK z kolony přídavkem vody nebo pufru s vysokou iontovou silou, který neobsahuje chaotropní soli této moderní techniky se využívá ve většině dostupných komerčních souprav pro rutinní izolace plazmidů, DNA a RNA

33

34 Kvantifikace DNA 1) Spektrofotometrie konjugované elektrony heterocyklických bází NK specificky absorbují UVzáření v rozmezí 230 až 320 nm s absorpčním maximem při 260 nm hodnota absorbance při 260 nm se využívá k výpočtu koncentrace NK Pro správné určení koncentrace NK na základě absorbance při 260 nm je nezbytná čistota vzorku! posouzení čistoty vzorku na základě poměru absorbancí A 260 /A 280 pro čistý vzorek NK se výsledné hodnoty poměru nacházejí v rozmezí 1,8-2,0

35 Kvantifikace DNA Spektrofotometrie absorpce DNA při 260 nm (čistota DNA- poměr 260/280 nm) - Malá senzitivita - Nulová specifita - Velké množství vzorku

36 Kvantifikace DNA 2. PicoGreen assay: izolace DNA spektrofluorimetrické stanovení množství DNA

37 Polymerase chain reaction (Polymerázová řetězcová reakce) Namnožení specifického úseku DNA Analýza genu Genová exprese (RT PCR) Kvantifikace DNA (qpcr) 3 kroky (několikrát opakovány): 1. Denaturace rozpletení ds DNA ss DNA 2. Annealing Nasednutí primerů na specifická místa ss DNA 3. Polymerace syntéza DNA (termostabilní DNA polymeráza) PCR

38

39 PCR - obvykle x opakování, trvání 2 4 hodiny - amplifikace teoreticky geometrickou řadou po 30 opakováních 2 30 (107 mil.) kopií - účinnost ale pouze cca 80% - v 1.cyklu: vzniká řetězec nespecifické délky (syntéza ukončena při změně teploty) - v dalších cyklech: vznikají řetězce specifické délky, odpovídají vzdálenosti vymezené nasednutím primerů

40

41 Termocycler

42 RT PCR Sledování exprese genu na úrovni mrna přepis do DNA pomocí reverzní transkripce (RT) c DNA

43 Detekce specifických proteinů Imunofluorescenční/imunohistochemické barvení Elektroforéza Western blot

44 Elektroforéza Princip: dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí

45 Princip separace - pentózofosfátová kostra všech nukleových kyselin nese při neutrálním ph stejně velký záporný náboj fragmenty ve stejnosměrném elektrickém poli migrují ke kladné elektrodě (+) - anodě a rychlost této migrace je závislá výhradně na jejich velikosti. kratší fragmenty putují rychleji a urazí větší vzdálenost než fragmenty delší - gel tvoří síťovitou strukturu s póry, brzdí pohyb NK

46 Horizontální elektroforéza Agarózový gel Nanášení vzorků

47 SDS elektroforéza ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate, dodecylsíran sodný) SDS denaturuje proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj

48 Detekce - elektroforéza Barvení DNA - ethidium bromid

49 Western blot 1. Elektroforéza rozdělení proteinů, např. SDS- PAGE 2. blotting přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)

50 Užitečné odkazy QFI uhsi