Možnosti klinické aplikace lipofosfonoxinů

Transkript

1 Možnosti klinické aplikace lipofosfonoxinů Bogdanová K. 1, Večeřová R. 1, Rejman D. 2, Gallo J. 3, Voborná I. 4, Morozova J. 4, Kolář M. 1 1 Ústav mikrobiologie LF UP a FN Olomouc 2 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR v.v.i. 3 Ortopedická klinika LF UP a FN Olomouc 4 Klinika zubního lékařství LF UP a FN Olomouc 1

2 Lipofosfonoxiny(LPPOs) Fig. 1 Fig. 2 At the IOCB Prague, novel substances that have bactericidal effect on both Gram-positive and negative bacteria due to disruption of the cytoplasmic membrane termed Lipophosphonoxins (LPPO) have recently been discovered. Advantages of LPPOs are 1) modular structure allowing for systematical structure-activity relationship study 2) excellent chemical and biochemical stability, and 3) simplicity of synthesis. The general structure of lipophosphonoxins consists of four modules: (i) a nucleoside module, (ii) an iminosugar module, (iii) a hydrophobic module (lipophilic alkyl chain), and (iv) a phosphonate linker module that holds together modules (i)-(iii) (Fig. 1). It was demonstrated that 1 st generation LPPOs were bactericidal against various Gram-positive species, including multi-resistant strains like vancomycin-resistant Enterococcus faecalis. The minimum inhibitory concentration (MIC) values of the best inhibitors were in the 1 12 mg/l range while their cytotoxic concentrations against human cell lines were significantly above this range. According to the study of MOA, second generation of LPPOs has been designed and synthesized providing compounds with broadened spectrum of activity against several clinically relevant Gram-negative bacteria(escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). 2

3 Oblasti s možnou aplikací LPPOs Infekce kloubních náhrad Kostní cement obohacený LPPOs Hydrogely obohacené LPPOs Kožní infekce Nanotextilie s navázaným LPPOs Endodontické infekce Účinek LPPOs na infekci kořenového systému zubu 3

4 Kostní cement obohacený LPPOs Kostní cement jako ATB nosič ve formě spaceru/kuliček 1970 Buchholz a Engelbrecht 1979 Klemm Hsieh P.H. et al. J Bone Joint Surg Am. 86(9), ,

5 Antibiotika přidávaná do kostního cementu Antibiotic Antibiotic Dose/Cement Amount (Simplex ) Comments AMINOGLYCOSIDES Tobramycin 0.5 grams/40 grams 3 grams/40 grams (Palacos )* High water solubility; heat stability; bactericidal at low concentrations; effective against some gentamicin resistant pseudomonal species Gentamicin VANCOMYCIN grams/40 grams grams/60 grams 3 grams/40 grams (Palacos ) High water solubility; heat stability; bactericidal at low concentrations; Vancomycin 2-8 grams/40 grams Elution characteristics similar to tobramycin; no significant activity against gram negative bacteria PENICILLINS Ticarcillin 6-13 grams/40 grams 7 grams/40 grams (Palacos ) Not recommended due to a large ratio of powdered antibiotic to cement causes difficulties in maintaining bead coherency; high sensitivity Nafcillin 4-8 grams/40 grams 6 grams/40 grams (Palacos ) reactions CEPHALOSPORINS Cefalothin 1 gram/40 grams Diminished heat stability compared to aminoglycosides; increased incidence of allergic reactions; Cefazolin 4-8 grams/40 grams 4-8 grams/60 grams Cefotaxime 4-8 grams/40 grams 6 grams/40 grams (Palacos ) Cefamandole 2 grams/40 grams 6 grams/40 grams (Palacos ) OTHER Erythromycin 6 grams/40 grams (Palacos ) Alternative for penicillin allergic patients; bacteriostatic agent Clindamycin 4-8 grams/40 grams 6 grams/40 grams (Palacos ) Effective in treatment of infection in patients with poor vascular supply to the extremities; effective in mixed infections with anaerobic organisms Dostupné z: 5

6 Problematika ATB-obohacených kostních cementů při primoimplantaci Selekce rezistentních bakteriálních kmenů Alergické reakce Toxicita antibiotik Jaké antibiotikum Snížení mechanických vlastností cementu Cena 6

7 Kostní cement a LPPOs experimentální část Zábrana vzniku biofilmu na povrchu PMMA Průnik do vytvořeného bakteriálního biofilmu 7

8 LPPO 2. a 3. generace zábrana tvorby biofilmu Cement (Palacos) santibiotikem (0,5 g GEN/10 g cementu) Cement (Palacos) bez antibiotika (kontrola růstu) Cement (Palacos) s LPPO druhé generace - 0,5 g DR-6944/10 g cementu Cement (Palacos) s LPPO druhé generace - 0,5 g DR-6997/10 g cementu Cement (Palacos) s LPPO třetí generace 0,5 g DR-6488/10 g cementu Referenční bakteriální kmeny: Enterococcus fecalis CCM 4224 Staphylococcus aureus CCM 4223 Escherichia coli CCM 3954 Pseudomonas aeruginosa CMM 3955 Referenční bakteriální kmen spozitivní produkcí biofilmu a ica operonem: Staphylococcus epidermidis CCM hodinové působení 8

9 E. fecalis E. coli S. epidermidis P. aeruginosa S. aureus ATB K

10 Počty bakterií (CFU/mL) narostlých na MH agarechpo sonifikacivýlisků kultivovaných 24 hodin spříslušným bakteriálním kmenem. Stanoveno semikvantitativně. Cement bez Cement GEN DR-6997 DR-6944 DR-6448 ATB EnterococcusfecalisCCM Escherichia coliccm Staphylococcus epidermidisccm Pseudomonas aeruginosaccm Staphylococcus aureus CCM

11 LPPOs2. a 3. generace průnik do vytvořeného biofilmu Testované bakteriální kmeny Referenční bakteriální kmeny: Escherichia coli CCM 3954 Referenční bakteriální kmen s pozitivní produkcí biofilmu a ica operonem: Staphylococcus epidermidisccm h a 24h biofilm DR-6944, DR-6997 a DR-6488 MBC, 10xMBC VAN; COL Čistý PMMA - Palacos 11

12 Počty bakterií uvolněných z24 a 4 hodinového biofilmupo kultivaci sdr-6994, DR-6997, DR-6448 a kolistinem + kontrola (čistý cement). Hodnocení provedeno semikvantitativněkultivací na MH agaru. Koncentrace testovaných látek (LPPO, COL a VAN) jsou uvedeny v mg/l DR-6944 DR-6997 DR-6448 COL ,5 5 Čistý cement Escherichia coli hod Escherichia coli hod CFU/mL Staphylococcus epidermidis hod Staphylococcus epidermidis hod DR-6944 DR-6997 DR-6448 VAN Čistý cement CFU/mL 12

13 Hydrogelyobohacené o LPPOs Hydrogely Biokompatibilní, biodegradabilní Scaffoldy Nosiče (růstové faktory, chondrocyty, antibiotika,.) HA (kyselina hyaluronová), chitosan, agaróza+fibrin, collagen, PLA (kyselina polymléčná) 13

14 Hydrogel a LPPOs experimentální část Hydrogel želatiny v koncentraci 0.5 g/20 g Hydrogel methylcellulosy v koncentraci 2% DR-7026 DR-7030 pozitivní kontrola gentamicin DR-7026 DR-7030 pozitivní kontrola gentamicin 0.05 g/10 g 0.15 g/10 g 0.05 g/10 g 0.15 g/10 g 0.03 g/10 g 0.05 g/10 g 0.15 g/10 g 0.05 g/10 g 0.15 g/10 g 0.03 g/10 g Hydrogelželatiny a hydrogelmetylcelulózys LPPOs2. generace Aplikace na povrch kultivační půdy Referenční bakteriální kmeny: Staphylococcus epidermidisccm 7221 (kontrolní kmen pro produkci biofilmu, icaoperon) EscherichiacoliCCM 3954 Pseudomonasaeruginosa CCM 3955 Staphylococcus aureus CCM 4223 Enterococcus faecalis CCM

15 Staphylococcus aureus 4223 Pseudomonas aeruginosa 3955 Escherichia coli 3954 Staphylococcus epidermidis 7221 Hydrogel želatiny 15

16 Kožní infekce a LPPOs Nanotextilie Podobné struktuře MB hmoty Biodegradabilní Krytí ran průnik vzduchu odtok exudátu zábrana průniku bakterií Velký povrch Nosič podpůrných látek antibiotika hemostatika Nanovlákna Tkáňové inženýrství rekonstrukce kostí, kůže, svalů, nervové tkáně Horáková J., Kožní kryty, prezentace, urce/content/0/13_ko%c5%ben%c3%ad%20kryty.p df 16

17 Nanotextilies LPPOs experimentální část Stanovení antibakteriální aktivity agarovou difúzní metodou (ISO Textil fabrics Determiation of Antimicrobial activity) Stanovení pomocí modifikace absorbčnímetody (JIS1902/ISO20743 Textiles Determination of antibacterial activity of antibacterial finished products) Horáková J., Kožní kryty, prezentace,

18 Agarová difúzní metoda Testované vzorky Vzorek LPPO Vzorek LPPO + Bavlna Testované kmeny Enterococcus fecalis CCM 4224 Staphylococcus aureus CCM 4223 Escherichia coli CCM 3954 Pseudomonas aeruginosa CMM 3955 Candida albicans ATCC

19 Enterococcus fecalisccm 4224 Staphylococc usaureus CCM 3953 Escherichia coli CCM 3954 Pseudomonas aeruginosa CMM 3955 Candida albicans Inhibiční zóna (mm) LPPO - LPPO + bavlna Růst pod vzorkem Inhibiční zóna (mm) Růst pod vzorkem Inhibiční zóna (mm) Růst pod vzorkem 0 ne 0 ne 0 ano 0 ne 1 ne 0 ano 0 ne 0 ne 0 ano 0 ne 0 ne 0 ano 0 ano 0 ano 0 ano 19

20 Absorpční metoda Testované kmeny bakterií: S. aureus CCM 3953 E. coliccm 3954 Testované vzorky Vzorek LPPO Vzorek LPPO + Bavlna 20

21 S. aureus počet cfu/vzorek % redukce cfu E. coli počet cfu/vzorek % redukce cfu bavlna 8450 lppo lppo ,95 bavlna lppo lppo ,99 Vzorek LPPO+ redukuje počet živých bakterií oproti vzorku LPPO- o 99,9%. 21

22 Účinek LPPOs na infekci kořenového systému zubu Mikrobiom dutiny ústní 1000 druhů mikroorganismů biofilm Kořenový systém zubu endodontický biofilm E. faecalis S. aureus. Ošetření kořenových kanálků mechanické vyčištění chemické vyčistění NaClO; chlorhexidine, EDTA, Lugolův roztok, hermetické uzavření Problematika Nedostatečné odstranění biofilmu Chemická iritace tkáně nekróza Přežívání bakterií S. intermedius Prevotella sp., Porphyromonas sp. sometimes-after-using-anesthesia-little-pain-can-be-felt-does-root-canallinghurt-so-much#mtwwa 22

23 Účinek LPPOs na infekci kořenového systému zubu experimentální část Upravené zuby (kravské) Ukotvení v pryskyřici Zalití umělými slinami Sterilizace (121 C; 6 kpa; 2h) Testované látky LPPOs DR-6487 MBC; 10x MBC Corsodyl(chlorhexidine) 0,001% chlorhexidine Bakteriální kmen Stapyhlococcus epidermidisccm 7221 biofilm produkující referenční kmen s ica operonem 23

24 Zábrana tvorby biofilmu Odsátí slin Proplach kanálku FR Aplikace BHI + 0,25% glukózy testované látky (LPPOs, Chlorhexidine) kontroly (růstu/sterility) Kultivace (24h; 35 C) Vyočkováníobsahu zubního kanálku na MH agar hodnoceno semikvantitativně Testovaní vytvořeného biofilmu Proplach kanálku FR Aplikace BHI Sonikace v ultrazvukové lázni 2 min + vortex Vyočkování obsahu zubního kanálku na MH agar hodnoceno semikvantitativně 24

25 Bakteriální růst S. epidermidisna HM agarech (planktonní bakterie v médiu v kořenovém kanálku/bakterie v případném biofilmu) Testovaný vzorek/kontrola Počet bakterií před sonifikací CFU/mL (planktonní buňky) Počet bakterií po sonifikacicfu/ml (z biofilmu) DR ,25 mg/l DR ,5 mg/l Corsodyl 1% Negativní kontrola Pozitivní kontrola x x

26 Závěr Antibakteriální potenciál LPPOsbyl prokázán v rámci všech provedených testování Infekce kloubních náhrad Kožní infekce Endodontické infekce LPPO působí na planktonní i biofilmovéformy bakteriálních buněk 26

27 Děkuji za pozornost 27