Regulace homeostázy železa u dětí.

Transkript

1 Univerzita Palackého v Olomouci Lékařská fakulta Regulace homeostázy železa u dětí. MUDr. Jiří Houda Dětská klinika při LF a FN Olomouc Školitel: doc. MUDr. Dagmar Pospíšilová, Ph.D. Studijní program: Pediatrie 2014

2 Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Regulace homeostázy železa u dětí vypracoval pod vedením školitele samostatně za použití v práci uvedených pramenů a literatury. Dále prohlašuji, že tato disertační práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Datum Podpis

3 Rád bych tuto práci věnoval památce své matky, která mne vždy v mé práci podporovala a mému otci, který jí byl ke konci její těžké nemoci velkou oporou.

4 Poděkování Chtěl bych poděkovat své rodině a přátelům za podporu a trpělivost po celou dobu mého studia. Dále bych rád poděkoval své školitelce doc. MUDr. Dagmar Pospíšilové, Ph.D., přednostovi olomoucké dětské kliniky prof. MUDr. Vladimírovi Mihálovi, CSc., MUDr. Zbyňkovi Novákovi za odborné vedení a cenné připomínky ke klinické a teoretické části dizertace. Dále bych rád poděkoval výzkumnému týmu Ústavu molekulární a translační medicíny v Olomouci, zejména doc. MUDr. Mariánu Hajdúchovi Ph.D., MUDr. Josefovi Srovnalovi, Ph.D., MUDr. Petrovi Džubákovi, Ph.D., Mgr. Dušanovi Holubovi a dalším kolegům.

5 Obsah Obsah. Úvod. 1 Cíle práce. 2 Teoretická část Výskyt železa a jeho význam pro člověka Obsah železa v lidském organizmu Úloha železa v lidském organizmu Potřeba železa pro lidský organizmus Zdroje železa Cirkulace železa a mechanizmy jeho řízení Regulace železa na úrovni organizmu Regulace železa na buněčné úrovni Patologické stavy při porušení homeostázy železa Deficit železa Přetížení železem Vyšetření metabolizmu železa Panel základních laboratorních vyšetření Experimentální metody Metabolizmus železa u nádorových onemocnění Nové terapeutické možnosti ovlivnění metabolizmu železa Agonisté hepcidinu Antagonisté hepcidinu Shrnutí teoretické části. 40 Experimentální část Měření hladiny hepcidinu u dětských pacientů s nespecifickými střevními záněty pomocí ELISA metody Pacienti a metody Výsledky měření hladiny hepcidinu metodou ELISA Diskuze a závěr Měření hladiny hepcidinu u pacientů se vzácnými typy anémií metodou kapalinové chromatografie - hmotnostní spektrometrie Pacienti a metody i -

6 Obsah 2.2 Výsledky měření Diskuze a závěr. 60 Literatura. 62 Přílohy. 73 Příloha 1 74 Příloha 2 79 Příloha Příloha Příloha Příloha Příloha Příloha ii -

7 Úvod. Železo (lat. Ferrum, Fe) je pro lidský organizmus esenciálním prvkem. Účastní se řady chemických procesů důležitých pro funkci tkání a orgánů. Nejdůležitější vlastností železa je schopnost vázat kyslík potřebný pro aerobní metabolizmus. Nedostatek Fe, stejně jako jeho nadbytek vede k poškození organizmu. Rovnováha Fe je proto přísně kontrolována komplexními regulačními mechanizmy, které reagují na aktuální potřeby organizmu a kompenzují nedostatek Fe i jeho nadbytek. V případě některých patologických stavů může být tato rovnováha výrazněji narušena. Je-li železa nedostatek, rozvíjí se stav označovaný jako sideropenie, jejímž důsledkem je mimo jiné anémie z nedostatku železa, nejčastější typ anémie u dětí i dospělých. V případě, že je železa v organizmu dostatek, není však dostupné pro krvetvorné buňky, rozvijí se anémie chronických chorob. Dojde-li k překročení prahu ukládání železa do zásob, dochází k tzv. přetížení organizmu železem. U člověka není vyvinutý mechanizmus aktivního vylučování Fe z organizmu. Nadbytečné železo je ukládáno do tkání a orgánů, kde pak způsobuje jejich toxické poškození vznikem volných kyslíkových radikálů. V posledních několika letech bylo objeveno několik molekulárně genetických mechanizmů podílejících se na řízení metabolizmu železa. Tyto poznatky přispěly k pochopení patofyziologie řady onemocnění u člověka jako jsou různé typy anémií, hemochromatózy, apod. Výsledkem výzkumu metabolizmu Fe jsou nové diagnostické a terapeutické postupy, které pomohou přispět k léčbě i některých dnes obtížně léčitelných onemocnění

8 Cíle práce. Cílem dizertační práce byla analýza vybraných biomarkerů metabolizmus železa v lidském organizmu na podkladě dosud známých poznatků o řízení homeostázy tohoto prvku. Dalším cílem bylo zhodnocení možností praktického využití dvou v současnosti nejpoužívanějších laboratorních metod k měření hladiny hepcidinu a definování přínosu těchto měření v diagnostice některých hematologických poruch u dětských pacientů. Specifikace cílů: Stanovení hladiny hepcidinu imunochemickou metodou ELISA z krevních vzorků u dětí s nespecifickými střevními záněty. Zavedení proteomické metody k měření hladiny hepcidinu. Statistické srovnání výsledků měření těchto metod se zdravou populací. Definování vztahu mezi hladinou hepcidinu a hladinami markerů metabolizmu železa měřených rutinními laboratorními metodami. Definování vlivu zánětlivého procesu na metabolizmus železa. Definování vlivu erytropoézy na metabolizmus železa

9 Teoretická část Teoretická část. 1. Výskyt železa a jeho význam pro člověka. Železo je nejčastějším prvkem planety Země. Největší množství je uloženo v zemském jádře. V zemské kůře je čtvrtým nejčastějším prvkem. Patří do chemické skupiny kovů (měď, kobalt, nikl, zinek a další). Nachází se běžně v přírodě v neživé formě (rudy) a v biologické formě (jako součást enzymů, bílkovin obsahujících hem, a dalších). Je základním stavebním prvkem všech živých organismů. Lidské tělo patří mezi nejvyvinutější formy života naší planety a i pro něj je železo esenciálním stopovým prvkem. 1.1 Obsah železa v lidském organizmu. Množství železa v organizmu zdravého dítěte narozeného v termínu je asi 75 mg/kg t. hm. Větší část tohoto množství dítě získává v průběhu 3. trimestru během těhotenství. Zásoby Fe získané během těhotenství jsou velice rychle spotřebovány v prvních měsících života a to především z důvodu rychlého růstu dětského organizmu. Vysoké nároky na metabolizmus Fe klesají u mužů po skončení období dospívání. Množství železa zdravého dospělého muže je asi 50 mg/kg. U žen po období dospívání klesá množství železa v organizmu do období klimaktéria na asi 35 mg/kg. Železo je u člověka vázáno zejména na hemové bílkoviny, malá část je součástí enzymů. Hladina železa v krevní plasmě je u zdravých dospělých mužů asi 8-10 µg/l. Většina plasmatického železa je spotřebována v kostní dřeni, která využívá železo k tvorbě erytrocytů (erytropoéze). Menší část slouží k syntéze enzymů, jejichž součástí je železo a zbytek nevyužitého množství železa je uloženo ve formě zásob [1]. Nejvíce Fe je obsaženo v erytrocytech ve vazbě na hemoglobin (65%), dále v zásobní formě v játrech ve vazbě na feritin a hemosiderin (25%) a v kosterní svalovině ve vazbě na myoglobin (6%) (viz Tab. 1) [1]

10 Teoretická část Tab. 1 Přehled množství železa vázaného na jednotlivé biomolekuly u dospělého člověka a jeho dvoj/trojmocné formy. (Upraveno dle: Fauci AS, Braunwald E, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J, editors. Harrison's Principles of Internal Medicine. 17th ed. New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division; 2008). 1.2 Úloha železa v lidském organizmu. Nejdůležitější biologickou vlastností železa je jeho schopnost vázat kyslík (O 2 ). V průběhu evoluce se tato schopnost vyvinula do podoby krevní cirkulace, kde železo ve vazbě na hemoglobin (Hb) slouží jako distributor O 2 do živých tkání. Železo je ale rovněž součástí různých enzymů, které využívají jeho oxido-redukčního potenciálu v metabolizmu mnoha látek Vazebná schopnost železa pro kyslík. Železo je vázáno na dvě hlavní molekuly: na hemoglobin a myoglobin, které souhrnně nazýváme hemoproteiny. Hemoglobin se skládá z bílkovinné složky globinu a porfyrinového kruhu hemu. Bílkovinu hemoglobinu tvoří tetramer složený ze čtyř globinových podjednotek. Každá podjednotka obsahuje jednu molekulu hemu. Na jednu molekulu hemu je navázán jeden atom železa. Bílkovinná složka hemoglobinu se mění v průběhu života, obsah železa se však nemění. V embryonálním období organizmus vytváří embryonální typ hemoglobinu (HbE) tvořený dvěma alfa řetězci se dvěma epsilon řetězci (HbE Gower 2) nebo dvěma zeta a dvěma delta řetězci (HbE Gower 1). Ve fetálním období je hemoglobin složen ze dvou alfa-globinových řetězců a dvou gama-globinových řetězců (HbF). V dospělosti nacházíme tzv. dospělý typ (HbA) složený ze dvou alfa a dvou beta řetězců (96 %), dále - 4 -

11 Teoretická část HbA2 složený ze dvou alfa a dvou delta řetězců (2 3%) a v malém množství se může u zdravých dospělých vyskytovat i fetální typ HbF (< 2 %) [2]. Schopnosti Fe vázat kyslík je využito i ve svalové tkáni, jejíž aktivita je vysoce náročná na energii a tedy na aerobní chemické procesy. Železo je ve svalovině vázáno na myoglobin. Myoglobin je tvořen bílkovinnou složkou globinem tvořící jeden řetězec. Na molekulu globinu je navázána jedna molekula hemu, která váže jeden atom Fe 2+. Jedna molekula myoglobinu může navázat pouze jednu molekulu O 2. Podle množství myoglobinu a tedy železa rozlišujeme různě intenzivní červené zabarvení příčně pruhované svaloviny a tím svalovinu intenzívně pracující od méně aktivní svalové tkáně [3] Oxido-redukční potenciál železa. Železo je vázáno na řadu enzymů: cytochromy a, b, c, sukcinát dehydrogenázu, cytochrom c oxidázu, cytochrom P450, katalázy, myeloperoxidázy a další. Jeho funkcí v bílkovinách může být vazba kyslíku, přenosu elektronů, funkce zásobní a funkce katalytická. Ve vazbě na bílkoviny je Fe rovněž transportováno jako biologicky aktivní železo. Je důležité pro kontrolu acido-bazické rovnováhy i u oxidativního stresu, kde převážně pomáhá eliminovat toxické volné kyslíkové radikály. Tvorba radikálů je však nutná např. k tvorbě nukleotidů, hlavní složky buněčné DNA. Železo je součástí enzymu ribonukleotid reduktázy, který katalyzuje přeměnu ribonukleotidů na deoxyribonukleotidy [4]. 1.3 Potřeba železa pro lidský organizmus. Potřeba železa v lidském organizmu se vyvíjí v průběhu života. Liší se v jednotlivých věkových skupinách a rozdíl se projevuje i mezi pohlavími. Potřeby v kojeneckém věku jsou jiné než u starších dětí, dospívajících a dospělých lidí. Novorozenci využívají zásob, které si v průběhu posledního trimestru těhotenství organizmus vytvořil. Období kojenecké a období dospívání je spjato s intenzivním růstem, který je charakterizován mimo jiné také zvýšenou spotřebou železa. Rovněž těhotenství a laktace jsou velice náročné na spotřebu železa. Přehled potřeby lidského organizmu v závislosti na věku a pohlaví je zobrazen v Tab. 2. Růst organizmu je tedy závislý na přísunu železa z vnějšího prostředí

12 Teoretická část Tab. 2 Přehled denní potřeby železa lidského organismu (m - měsíce, r - roky). (Upraveno dle: Food and Nutrition Board, Institute of Medicine National Academy of Sciences Dietary Reference Intakes, 2000, 2002, reprinted with permission. Courtesy of the National Academy Press, Washington, DC). 1.4 Zdroje železa. Železo se vyskytuje v potravinách živočišného i rostlinného původu. V každé z nich se však vyskytuje v jiné formě a lidský organizmus jej dokáže zpracovat s odlišným efektem. Ve stravě je železo vázáno buď na bílkoviny obsahující hem, proto jej nazýváme hemové železo (představuje asi 40% obsahu stravy). Železo vázané na jiné molekuly nazýváme nehemové železo (asi 60% obsahu stravy). V rostlinné stravě je železo součástí různých nehemových bílkovin a enzymů Rostlinná strava. Koncentrace železa v rostlinné stravě je poměrně vysoká. Pro lidský organizmus je však důležitější jeho dostupnost, tzn. jaké množství z celkového obsahu železa dané potraviny je organizmus schopný vstřebat. Rostlinná tkáň obsahuje výhradně nehemové železo (viz Tab. 3). Rostlinná strava obsahuje látky, které vstřebávání železa různě ovlivňují a tím mění jeho dostupnost. Železo je v rostlinné tkáni vázáno převážně na fytáty. Fytáty obecně svou schopností vázat Fe snižují jeho uvolňování z rostlinné stravy během zažívání. Dalším faktorem negativně ovlivňujícím vstřebávání je obsah polyfenolů (např. v čaji, kávě, červeném víně) a taninů. Jeden šálek čaje (~ 200 ml) sníží absorpci - 6 -

13 Teoretická část železa o %. V opačném případě pozitivně působí kyselina askorbová (vitamin C), která vstřebávání podporuje [5]. Tab. 3 Obsah železa v jednotlivých potravinách rostlinného původu a množství dle denní potřeby. *DV - denní potřeba (Upraveno dle: U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release 16. Nutrient Data Laboratory Home Page, Živočišná strava. Hlavní složkou živočišné stravy je hemové železo. Živočišná strava, jako např. červené maso, ryby a drůbež, obsahuje obecně velké množství svalové tkáně. Příčně pruhovaná svalovina kosterních svalů a svalovina srdeční obsahují molekuly sloužící k uskladňování kyslíku nutného pro energeticky náročnou funkci při svalové kontrakci. Jedná se hlavně o - 7 -

14 Teoretická část železo vázané na myoglobin, což je molekula podobná červenému krevnímu barvivu hemoglobinu. Živočišná strava v menší míře rovněž obsahuje hemové železo vázané na hemoglobin erytrocytů. Nehemové železo je obsaženo ve výrazně menší míře a je součástí hemosiderinu, feritinu, transferinu apod. (viz. Tab. 4) [6]. Tab. 4 Obsah železa v jednotlivých potravinách živočišného původu a množství dle denní potřeby. (Zdroj: U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release 16. Nutrient Data Laboratory Home Page, 2. Cirkulace železa a mechanizmy jeho řízení. Homeostáza, neboli rovnováha hladiny železa, je udržována z velké části recyklací starých (senescentních) erytrocytů pomocí buněk monocyto-makrofágového systému, kdy dochází postupně k opětovnému uvolnění železa do krevního oběhu. Při krvácení s minimálními ztrátami a při zvýšeném metabolizmu, je nedostatek Fe hrazen ze zásobního železa uloženého v játrech. Nedostatečné množství může být doplněno příjmem železa z běžné stravy. Přirozenou cestou vstřebávání železa je vstřebávání zažívacím traktem, kam se dostává v živočišných a rostlinných složkách denní stravy. Jeho obsah v jednotlivých potravinách se však může velice lišit a rovněž jeho schopnost vstřebání z jednotlivých složek stravy může být velmi rozdílná. Tyto rozdíly následně mohou vést až k nutričním - 8 -

15 Teoretická část deficitům u různých typů diet. Vstřebávání železa ze stravy je však ovlivněno i jinými faktory, z nichž mnohé byly objeveny teprve nedávno. Hladina železa je regulována na úrovni celého organizmu (erytropoézou, zánětem, nutričními deficity, apod.) a na úrovni buněčné, kde klíčovou roli hrají tzv. železo regulující proteiny (IRP, z angl. iron regulatory proteins) Cirkulace železa Absorpce železa. Přirozenou cestou lidského organizmu pro vstřebávání železa je zažívací trakt. Proces vstřebávání zahrnuje několik kroků, které se liší podle navázání železa na bílkoviny. Mezi orgány, které hrají klíčovou roli ve vstřebávání železa ze stravy, patří žaludek a tenké střevo, zejména duodenum. Především v těchto orgánech jsou podmínky pro absorpci železa ideální. Působí zde faktory jako nízké ph a redoxní potenciál a rovněž jsou zde ve sliznici v největší míře exprimovány proteiny nutné k přestupu železa ze zažívacího traktu do krevního oběhu. Ve vyspělých státech tvoří hemová forma Fe 10 15% živočišné stravy, zbytek tvoří nehemová forma Absorpce hemového železa. Hemové železo pochází z hemoglobinu, myoglobinu a dalších hemových proteinů, které se vyskytují v živočišné stravě. Kyselý obsah žaludku a žaludeční proteázy štěpí živočišnou tkáň a uvolňují hem z jeho vazby na proteiny. Vlivem redoxních reakcí je hemové železo oxidováno na hemin a tato molekula prostupuje do buněk sliznice duodena bez dalších modifikací. Pro hem byl nedávno identifikován transmembránový přenašeč, tzv. heme carrier protein 1 HCP1 [7]. V současné době se objevují studie popisující jeho roli více jako transportéra kyseliny listové [8]. Po přestupu hemového železa do intracelulárního prostoru enterocytu je porfyrinový kruh hemu enzymaticky rozštěpen pomocí hem-oxygenázy (HO) [9]. Tímto rozštěpením se uvolňuje železo vázané v tomto porfyrinovém kruhu do cytoplasmy. Následné kroky jsou společné hemovému i nehemovému železu. Malá část hemového železa může proniknout beze změny do krevního oběhu, kde je navázáno na hemopexin Absorpce nehemového železa

16 Teoretická část Nehemové železo je vázáno na organické molekuly jako jsou fytáty, oxalát, cukry, laktát a aminokyseliny. Důležitou roli při vstřebávání hraje dostupnost železa ze složek stravy, tedy jeho schopnost uvolnit se z vazeb na nehemové molekuly. Složení stravy má velký vliv na absorpci nehemového železa. Mateřské mléko je významným zdrojem nehemového železa. Z mateřského mléka se vstřebává více Fe (cca 50 % obsahu) než z běžné, i o Fe obohacené stravy (cca 4% obsahu) a z mléka kravského. Pro vstup do krevního oběhu jsou nezbytné enterocyty, které na svých membránách obsahují pro absorpci důležité molekuly. Na luminální membráně kartáčového lemu se nachází proteiny DMT1 (z angl. divalent metal transporter 1) a DCytB (z angl. duodenal cytochrome B) nutné pro vstup železa do intracelulárního prostoru. Na bazolaterální membráně se nachází membránový exportér Fe: feroportin, nezbytný pro výdej železa do krevního oběhu [10]. Absorpce nehemového Fe může být díky regulačním mechanizmům zvýšena až 10- krát. Na druhou stranu existují i látky, které vstřebávání nehemového železa ze stravy snižují [11]. Látky, které snižují absorpci nehemového Fe se vyskytují rovněž ve stravě a patří mezi ně sójové peptidy [12], bílkoviny kravského mléka, fytáty, vláknina, polyfenoly obsažené v zelenině, čaji, kávě a víně. Fosfáty a fosfoproteiny inhibují absorpci železa z vaječného žloutku a mléka. Vápenaté ionty rovněž inhibují vstřebávání železa a dalších kovových iontů ze zažívacího traktu. Vstřebávání Fe rovněž redukují látky snižující tvorbu žaludeční kyseliny a tím i ph žaludeční šťávy, např. blokátory protonové pumpy, opakovaný reflux zásadité pankreatické šťávy z duodena do žaludku, chronický zánět žaludeční sliznice s atrofií žláz tvořících kyselou žaludeční šťávu. Mezi nejběžnější látky zvyšující absorpci patří vitamín C (kyselina askorbová). Dále látky obsažené v mateřském mléce, látky vázající železo, např. organické kyseliny, aminokyseliny a cukry s keto- skupinou rovněž podporují vstřebávání nehemového železa. Pro lepší vstřebávání se doporučuje konzumace kyselých nápojů, např. džusů, ovocných šťáv, apod Absorpce nehemového železa na buněčné úrovni. Duodenální enterocyty hrají hlavní roli při vstupu železa z vnějšího prostředí do krevního oběhu. Hlavní procesy se odehrávají na membránách těchto buněk, apikální a bazolaterální. Na apikální membráně dochází nejprve k redukci železitého iontu (Fe 3+ ) na

17 Teoretická část iont železnatý (Fe 2+ ). Tato chemická přeměna je katalyzována membránovým DCytB [13]. Následně prostupuje přes apikální membránu pomocí iontového kanálu DMT1 (rovněž používané zkratky Nramp2, DCT1, SLC11A2) (Obr. 1). Dvojmocné kovové ionty jsou přenášeny pomocí protonového symportu, při němž kyselé prostředí žaludeční natráveniny obsahující H + hraje klíčovou roli pro efektivitu přenosu [14]. Obr. 1 Absorpce železa na luminální membráně kartáčového lemu enterocytu. V intracelulárním prostoru enterocytů, jejichž životní cyklus trvá 3-4 dny, je dvojmocné železo navázáno na zásobní feritin a následně vyloučeno odumřelými buňkami ze zažívacího traktu. Tímto způsobem organizmus omezuje vstřebávání železa ze zažívacího traktu při stavech, kdy hladina železa v plasmě je v normě nebo je zvýšená. Nezásobní dvojmocné železo je aktivně přenášeno z enterocytu do krevního oběhu Přestup železa z enterocytu do krevního oběhu. Proces výdeje dvojmocného železa z intracelulárního prostoru enterocytu do krevního oběhu se odehrává na bazolaterální membráně enterocytu pomocí membránového transportéru feroportinu (Fpn, SLC40A1) [15-17]. Na bazolaterální membráně se rovněž nachází enzym hephaestin (HEPH), který po výstupu dvojmocného železa do extracelulárního prostoru oxiduje Fe 2+ na Fe 3+ (Obr. 2). Železo je schopné navázat se na transportní bílkovinu transferin (Tf) v krevním oběhu pouze v trojmocné formě

18 Teoretická část Transferinem je železo přenášeno krevním řečištěm k cílovým orgánům. Obr. 2 Výdej železa na bazolaterální membráně enterocytu do krevního oběhu. HPH - haephestin, FPN - feroportin Absorpce a výdej železa na úrovni makrofágu. Kostní dřeň dospělého člověka spotřebuje 96 % denní potřeby železa. Denně je v organizmu spotřebováváno asi 25 mg železa. Pouze 1 mg je denně přijímán ze zažívacího traktu. 24 mg tedy téměř celé množství je získáváno ze starých tzv. senescentních erytrocytů, které jsou odbourávány v monocyto-makrofágovém systému. Pouze malé množství denní potřeby je uvolněno ze zásob železa. Hlavním zdrojem železa pro erytropoézu jsou tedy erytrocyty. Na recyklaci železa se podílí především makrofágy. Makrofágy jsou buňky schopné fagocytózy. Na recyklaci se podílí hlavně makrofágy ve slezině. Jejich povrchové molekuly hrají klíčovou roli v příjmu a výdeji železa získaného z fagocytovaných erytrocytů. V organizmu rozlišujeme dva druhy makrofágů. První typ se nachází např. v plicích, kde makrofágy fagocytují erytrocyty, ale nemají schopnost uvolněné železo exportovat zpět do krevního oběhu. Druhý typ makrofágů se nachází hlavně v sinusech sleziny a jater a tyto buňky mají schopnost železo aktivně vylučovat zpět do oběhu. Proces fagocytózy nazýváme erytrofagocytóza. V makrofázích dochází k rozpadu erytrocytu a uvolnění hemoglobinu. Z něj se uvolňuje hem, jehož porfyrinový kruh štěpí enzym hemoxygenáza (HO), čímž se

19 Teoretická část uvolňuje Fe 2+. Železo uvolněné z vazby na hemoglobin je dále buďto vázáno na zásobní feritin nebo hemosiderin uvnitř makrofágu nebo je exportováno do krevního oběhu [11]. Uvolňování železa z makrofágu se děje v různém časovém období. V časné fázi, která se uskuteční během několika prvních hodin po erytrofagocytóze, dochází k okamžitému uvolnění železa do krevního oběhu. V pozdní fázi dochází k uvolňování zásobního železa na podkladě aktuálních potřeb organizmu. Železo je transportováno do extracelulárního prostředí pomocí feroportinu. Feroportin je membránový transportér identický s feroportinem na bazolaterální membráně enterocytů. Pro navázání Fe 2+ na transportní protein transferin je nutné Fe 2+ oxidovat na Fe 3+. Oxidace je katalyzována plasmatickým proteinem ceruloplasminem [18; 19]. Poté je Fe ve vazbě na transferin transportováno opět do kostní dřeně, kde může sloužit k tvorbě nových erytrocytů Transport železa krevním řečištěm Transferin. Hlavním transportním proteinem pro železo v krevním oběhu je transferin (Tf). Transferin je polypeptidový jednořetězcový β-globulin, který je tvořen převážně v játrech. Po internalizaci transferinu obsahujícího železo dochází k jeho recyklaci. Jeho biologický poločas je 8 10 dní. Transferin obsahuje 2 vazebná místa pro železo (Fe 3+ ). Apotransferin je molekula bez navázaného železa. Po obsazení obou vazebných míst má transferin 3,5-krát větší afinitu k transferinovému receptoru (TfR), než transferin s jedním navázaným iontem [11]. Normální hladina transferinu v plasmě je 2 3 g/l. Hladinu transferinu měříme pomocí vazebné kapacity pro železo. Produkce transferinu v játrech stoupá při snížení zásob železa v hepatocytech, a naopak při zvětšených jaterních zásobách produkce transferinu klesá. Na transferin jsou navázány asi 4 mg železa, avšak během 24 hodin je celkem transportováno více jak 30 mg. Více jak 80% takto vázaného železa je využito v kostní dřeni k tvorbě hemoglobinu pro erytrocyty. U zdravého jedince je celková vazebná kapacita transferinu obsazena pouze asi jen z jedné třetiny, zbytek slouží pro navázání přebytečných iontů železa Transferinový receptor

20 Teoretická část Rozlišujeme dva typy transferinového receptoru (TfR). TfR1 je tvořen homodimerem glykoproteinu spojeným disulfidickým můstkem o velikosti asi 190 kda. Je tvořen extracelulární doménou, jednoduchou transmembránovou částí a krátkou cytoplasmatickou komponentou. Každý homodimer může vázat až dvě molekuly transferinu. TfR2 je ze 45% homologní s extracelulární částí TfR1. Tento receptor má menší afinitu k transferinu než TfR1 a nachází se převážně v jaterních buňkách a v erytroidních prekurzorech [20]. Největší množství TfR1 se nachází v normoblastech kostní dřeně, kde je receptorů na buňku a kde dochází k vychytávání železa pro tvorbu hemoglobinu. V dalších fázích vývoje erytrocytu již počet receptorů klesá. Při odbourávání TfR dochází k jeho uvolňování do krevního oběhu. Ve formě stfr je dnes možné ho měřit rutinními metodami. Hladina stfr odpovídá aktivitě erytropoézy a požadavkům organizmu na železo pro tvorbu erytrocytů. Po navázání transferinu na TfR dochází k endocytóze komplexu a k tvorbě endocytických vezikul. Poté dochází k okyselení ph uvnitř endosomu a železo se přesouvá do intracelulárního prostoru, kde se začíná uvolňovat z vazby na transferin a prostupuje do cytoplasmy. Nejprve dojde k jeho redukci na Fe 2+ pomocí enzymu STEAP2 (z angl. six-transmembrane epithelial antigen of the prostate), a poté je exportování do cytosolu pomocí DMT1. Feritin a TfR následně migrují zpět k membráně buňky, kde je apotransferin uvolňován do krevního oběhu. Koloběhu transferinu na buněčné úrovni je znázorněn na obr

21 Teoretická část Obr. 3 Schéma cirkulace transferinu na buněčné úrovni Cílové orgány pro cirkulující železo Erytropoéza. Nejdůležitějším cílovým orgánem pro utilizaci železa je kostní dřeň. V kostní dřeni dochází k inkorporaci železa do krevního barviva hemoglobinu. Až 70% celkového množství železa v lidském organizmu je ve vazbě na hemoglobin. Normoblasty jsou erytroidní buňky kostní dřeně, které obsahují největší koncentraci transferinových receptorů a mají tedy největší spotřebu železa v lidském organizmu. Železo je erytroidními buňkami využíváno k tvorbě hemoglobinu. Hemoglobin je tvořen v mitochondriích. V těchto organelách dochází k inkorporaci železa do protoporfyrinu IX pomocí enzymu ferochelatázy. Snížená volná hladina hemu v cytoplasmě erytroidních prekurzorů zvyšuje vychytávání železa buňkou, při zvýšené hladině vychytávání železa klesá. V plasmě se v malém množství ( µg/l) vyskytuje i zásobní forma železa feritin. Hladina plasmatického feritinu se liší od hladiny tkáňového feritinu. Erytroidní prekurzory jsou schopny plasmatický feritin vychytávat přes dosud neidentifikovaný receptor, avšak u zdravého jedince je feritin pouze malým zdrojem železa pro vlastní erytropoézu. Celkem 80 90% železa v normoblastu je využito k tvorbě hemoglobinu. Zbytek je ukládán ve formě feritinu, který tvoří barvitelná granula. Normoblasty s pozitivními granuly jsou nazývány sideroblasty, po enukleaci siderocyty. U zdravých jedinců tvoří sideroblasty asi polovina všech normoblastů. Prstenčité sideroblasty nacházíme u onemocnění zvaného sideroblastická anémie a MDS RARS (z angl. myelodysplastic syndrome - refractory anemia with ringed sideroblasts) [20] Tvorba zásob železa. Železo je částečně ukládáno do zásob pro kompenzaci jeho zvýšené spotřeby. Ukládá se ve formě feritinu a hemosiderinu. Dvě třetiny zásobního železa se nacházejí v monocyto-makrofágovém systému a jedna třetina je v hepatocytech. Hlavní zásobní molekulou vážící železo je feritin. Feritin byl objeven českým fyziologem Vilémem Laufbergerem v roce 1937, který získal jeho krystalickou strukturu

22 Teoretická část z buněčné sušiny a následně popsal jeho roli. Feritin bez navázaného železa nazýváme apoferitin. Ten vytváří sférickou molekulu o průměru 13 nm a velikost kda. Vnitřní dutý prostor o průměru 6 nm komunikuje s vnějším prostředím pomocí 6 kanálů. Obal je tvořen 24 molekulami složenými ze dvou podjenotek podjednotky H (těžká) a podjednotky L (lehká). Funkce těchto podjenotek se liší. H podjednotka obsahuje enzym oxidující Fe 2+. Feritin obsahující větší množství těchto podjednotek je schopen rychleji přijímat železo. Feritin obsahující více L podjednotek je odolnější proti denaturaci. Jedna molekula feritinu pojme až 4500 iontů Fe 3+. Uvnitř mitochondrií se nachází feritin lišící se od ostatních forem. Má vyšší oxidázovou aktivitu a podobá se více feritinu z H podjenotek. Jeho funkce není zatím dostatečně popsána, ale předpokládá se, že je pro organizmus velice důležitý, jelikož je mezi živočišnými druhy a ve fylogenezi zachován téměř v identické podobě. Hemosiderin je považován za nekompletně degradovanou molekulu feritinu složenou z Fe, feritinových bílkovin a dalších buněčných složek. Je méně rozpustný než feritin a má větší poměr železa k proteinové složce než molekula feritinu. Je barvitelný Pruskou modří. Z fyziologického hlediska představuje hemosiderin stabilnější, ale méně dostupnou formu zásobního železa Eliminace železa z organizmu. V roce 1938 McCance a Widdowson [21] jako první prokázali, že člověk nemá na rozdíl od některých jiných živočichů efektivní mechanizmus na vylučování nadbytečného množství železa. Nadbytek železa se za fyziologických podmínek nevyskytuje. Onemocnění vedoucí k přetížení organizmu se často rozvíjejí pomalu a pouze v případě, že množství železa překročí schopnost využít železo např. v erytropoéze nebo že překročí schopnost uložit nadbytek železa do zásob. Mechanizmus eliminace nadbytečného železa spočívá ve ztrátě buněk, např. epiteliálních buněk gastrointestinálního traktu, epidermálních buněk kůže a u žen erytrocytech menstruační krvi. Denní ztráty zdravého dospělého muže a zdravé nemenstruující ženy představují přibližně 1 mg/den. Menstruující ženy ztrácí v průměru 0,006 mg/kg/den železa menstruační krví, u některých toto množství může být až 0,025 mg/kg/den. U těhotných žen je spotřeba železa až 3,5-krát větší než u zdravého muže. Močí je vyloučeno méně jak

23 Teoretická část 0,05 mg/den a to hlavně odloučenými buňkami. Nevýznamná část je vylučována do potu, asi 22,5 µg/l [22]. 2.2 Regulace železa na úrovni organizmu Regulace absorpce železa ze zažívacího traktu. V posledních letech bylo objeveno několik nových molekul, které hrají klíčovou roli v regulaci výdeje železa z intracelulárního prostoru a tím i hlavní roli v metabolizmu železa celého organizmu. Řízení absorpce je ovlivněno hlavně dvěma faktory, aktuálním obratem erytropoézy a množstvím zásobního železa. V případě nedostatečného množství zásobního železa v organizmu je absorpce ze zažívacího traktu zvýšena, naopak v případě zvýšených zásob železa dojde k útlumu vstřebávání ze zažívacího traktu. Absorpce železa může narůst až 10-krát. V případě zvýšené produkce červené krevní řady v kostní dřeni se rovněž zvyšuje absorpce železa ze zažívacího traktu. 2.3 Regulace železa na buněčné úrovni Hepcidin, feroportin a jejich role v metabolizmu železa Hepcidin. Již před více jak deseti lety dva nezávisle pracující výzkumné týmy [23; 24] identifikovaly hepcidin, který je klíčovým peptidem v metabolizmu železa. Je vylučován močí a syntetizován převážně v játrech. V menším množství je exprimován i v makrofázích, adipocytech [25], β-buňkami pankreatu [26] a řadou dalších tkání včetně srdce a mozku, avšak role zde tvořeného hepcidinu je zatím nejasná. Hepcidin je peptid složený z 25 aminokyselin (H Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr OH) a 4 disulfidických můstků (Cys1 Cys8, Cys3 Cys6, Cys2 Cys4 a Cys5 Cys7) (viz Obr. 4). Kódován je genem HAMP (z angl. hepcidin antimicrobial peptide) lokalizovaném na dlouhém raménku chromozómu 19 (19q13.1) [27]. Translací 0,4 kb úseku mrna pocházejícího z 3 exonů 2,5 kb úseku genu HAMP vzniká prekurzor hepcidinu pre- prohepcidin složený z 84 aminokyselin. Následně je z něj enzymaticky odštěpen prohepcidin složen z 64 aminokyselin. Poté je prohepcidin uvolněn do lumen

24 Teoretická část endoplazmatického retikula, kde dochází k odštěpení 39 aminokyselin enzymem furinu podobné proproteinové konvertázy a zůstává peptid složený z 25 aminokyselin - hepcidin-25 pocházející z C konce prekurzoru [28]. Byly identifikovány i další formy hepcidinu složené z menšího množství aminokyselin, hepcidin-22 a hepcidin-20 [29]. Biologický význam pre-prohepcidinu nebyl prokázán [30]. U hepcidinu-20 byl in vitro prokázán antibakteriální a antifungální účinek v koncentracích 10ti násobně vyšších než je běžná hladina zdravých kontrol [24]. Struktura hepcidinu je mezidruhově poměrně jednotná. Lze tedy usuzovat, že mechanizmus řízení metabolizmus železa, na němž se hepcidin podílí, je efektivní a fylogeneticky výhodný [31]. Obr. 4 Struktura rozpuštěné formy hepcidinu-25 (upraveno dle: Původně oba objevitelské týmy určily hepcidinu roli v nespecifické imunitní odpovědi organizmu při obraně proti bakteriální infekci. Vzápětí byl na myším modelu objeven vztah hepcidinu k metabolismu železa [32] a ještě téhož roku byla blíže popsána jeho role regulátoru tohoto metabolismu [33]. Receptorem pro hepcidin byl identifikován rovněž klíčový protein feroportin Feroportin. Feroportin byl objeven v roce 2000 třemi nezávislými týmy, které jej identifikovaly jako transmembránový přenašeč železa nacházející se ve zvýšené míře na basolaterální straně enterocytů dudodena a na membráně makrofágů monocyto-makrofágového systému a Kuppferových buněk jater. V menší míře se pak nachází v plicních buňkách,

25 Teoretická část buňkách renálních tubulů a v erytrocytárních prekurzorech. Feroportin je kódován genem SLC40A1 (SLC11A3, 2q32). Je to jedinečný peptid s konzervativní strukturou společnou pro savce a jiné obratlovce a jediný doposud objevený specifický transmembránový exportér železa [34]. Prostřednictvím feroportinu je intracelulární železo přenášeno do krevního oběhu, avšak přesný mechanizmus přenosu není doposud objasněn. Byly popsány dvě formy feroportinu [35]. FPN1A (Feroportin 1A) obsahuje ve své struktuře 5 element senzitivní na hladinu železa a v buňkách s nedostatkem železa tlumí jeho syntézu. FPN1B (Feroportin 1B) tento 5` element neobsahuje. Nachází se především v duodenálních enterocytech, kde zajišťuje přenos železa z gastrointestinálního traktu (GIT) do krevního oběhu a jeho syntéza není tlumena nedostatkem železa Mechanizmus účinku hepcidinu a feroportinu. Po navázání hepcidinu na feroportin dochází k internalizaci komplexu a jeho inaktivaci v lysozomech buňky [36]. Hepcidin tedy působí tlumivě na vstřebávání železa ze zažívacího traktu a na výdej železa z makrofágů, čímž snižuje hladinu železa v krevním oběhu. V případě nedostatku železa dojde naopak k utlumení tvorby hepcidinu a ke zvýšenému uvolňování železa do krevního oběhu. Tímto mechanismem je udržována relativně stabilní rovnováha železa v organizmu (viz Obrázek 5). Obr. 2 Homeostáza železa v organizmu a řízení jeho cirkulace hepcidinem. Hepcidin je produkován v hepatocytech jater v odpovědi na stav železa v organizmu (stimulační signál, +) a aktivitu erytropoézy (tlumící signál, -). Hepcidin (černá čára) inhibuje transport železa z enterocytů duodena, makrofágu sleziny a hepatocytů jater ( ) a snižuje tak hladinu železa v plazmě. Patologické zvýšení produkce hepcidinu (v důsledku zánětu a inaktivačních mutací matriptázy-2, MT-2) vede k utlumení uvolňování železa z výše zmíněných buněčných kompartmentů a ke snížení jeho hladiny v plazmě, což vede

26 Teoretická část k rozvoji anémie. Naopak při patologickém snížení produkce hepcidinu (v důsledku zvýšených hladin erytroidních faktorů nebo při mutacích genů asociovaných s hemochromatózou) dochází ke zvýšení hladiny železa v plazmě a eventuálnímu rozvoji přetížení organizmu železem. (Upraveno dle: Ganz 2011 [37]). Byly popsány mutace feroportinu, které vedou k jeho inaktivaci a způsobují hromadění železa v makrofázích. Nejčastěji se jedná o autosomálně dominantně dědičné mutace a v důsledku vedou k rozvoji onemocnění nazvaného feroportinová nemoc [38] (viz níže). Naopak při mutacích, které vedou k rezistenci na hepcidin nebo které vedou k tvorbě neúčinného hepcidinu, dochází k chronickému přetěžování organizmu železem až k možnému rozvoji onemocnění podobnému hemochromatóze (viz níže) Faktory ovlivňující tvorbu hepcidinu. Hepcidin efektivně řídí distribuci železa v lidském organizmu. Regulací tvorby tohoto peptidu organizmus vyrovnává výkyvy v homeostáze železa způsobené vlivem vnějšího prostředí i vlivem různých genetických onemocnění. Faktory, které ovlivňují tvorbu hepcidin, působí na úrovni celého organizmu nebo na úrovni buňky. V posledních deseti letech bylo objasněno několik faktorů ovlivňujících tvorbu hepcidinu, z nichž některé působí stimulačně, jiné supresivně Regulace na úrovni celého organizmu. Produkce hepcidinu ovlivněná hladinou železa v krevním oběhu. Exprese hepcidinu je zpětně regulována hladinou železa v krevním oběhu, přičemž BMP/SMAD signální dráha je považována za hlavní regulační osu transkripce hepcidinu [39] v hepatocytech jater (Obr. 3). Na regulaci hladiny železa se také podílí membránový protein HFE (human hemochromatosis protein), který se kompetitivně váže na transferinový receptor [40; 41]. HFE je strukturálně podobná molekulám z třídy MHC třídy I. Role HFE u člověka není doposud plně objasněna, ale jeho nerovnováha vede k rozvoji dědičné poruchy akumulace železa, hemochromatózy typu I [42]. Studie na myších prokázaly, že HFE v buňkách gastrointestinálního traktu (GIT) neovlivňují kontrolu homeostázy za fyziologických podmínek [43]. Vazba HFE na TfR1 je inhibována při nadbytku holotransferinu, který vyvazuje HFE překrytím jeho vazebného

27 Teoretická část místa. Následně se HFE nenavázané na TfR1 váže na TfR2, kde je jeho vazba méně silná, ale v kombinaci s holotransferinem je vazba HFE na TfR2 posílena [44]. Celý komplex poté stimuluje expresi hepcidinu pomocí signální dráhy, která dosud zůstává předmětem dalšího bádání. Některé studie [41; 45] popisují ovlivnění BMP (z angl. bone morphogenetic proteins) kaskády a/nebo MAPK (s angl. mitogen-activated protein kinase) kaskády tímto komplexem. Výsledkem je útlum vstřebávání a uvolňování dalšího železa do krevního oběhu z enterocytů a buněk monocyto-makrofágového systému. Obr. 3 Schéma řízení exprese HAMP genu v hepatocytech. BMP6 po vazbě na BMP receptor (BMPR I-II) a membránový hemojuvelin (mhjv) stimuluje SMAD signální dráhu a expresi hepcidinu. Matriptáza-2 brání nadměrné expresi hepcidinu tím, že štěpí mhjv a vypíná tak BMP6/SMAD signální dráhu. Zvýšená hladina holotransferinu (Fe 3+ 2TF) stabilizuje transferinový receptor 2 (TfR2) a v komplexu s HFE zvyšuje expresi HAMP. Detaily přenosu tohoto signálu nejsou známé (v obrázku označené otazníkem). Tvorba hepcidinu ovlivněná množstvím železa uloženého v zásobách. Tvorba hepcidinu v hepatocytech je kromě ovlivnění cirkulujícím železem ovlivněna i množstvím železa uloženého v zásobách. Přesný mechanizmus však nebyl doposud plně

28 Teoretická část objasněn. Určitou roli v tomto procesu pravděpodobně hrají železo dependentní ligázy a prolyl hydroxylázy [46]. Tyto látky jsou železo dependentní a pravděpodobně hrají roli v regulačních mechanizmech ovlivněných hypoxií. Erytropoéza potlačuje tvorbu hepcidinu. Při produkci erytrocytů je železo spotřebováváno ve velkém množství a to při hemoglobinizaci, která probíhá již u erytrocytárních prekurzorů. Erytropoéza je téměř výhradně závislá na hladině železa v krevním oběhu vázaného na holotransferin [47]. Předpokládá se, že zvýšený obrat erytropoézy při krvácení nebo při zvýšeném působení erytropoetinu, tlumí tvorbu hepcidinu v játrech pomocí signálu, který vychází z kostní dřeně [48]. Tento tlumivý efekt se vyskytuje u onemocnění charakterizovaných zvýšenou, avšak neefektivní erytropoézou, kde často dochází k apoptóze erytrocytárních prekurzorů. Významně snížená hladina hepcidinu byla prokázána například u β-thalassemie [49; 50]. U tohoto onemocnění byla prokázána zvýšená hladina GDF-15 (z angl. growth differentiation factor 15) ze skupiny TGF-β (z angl. transforming growth factor β). GDF- 15 je syntetizován erythroidními prekurzory během zvýšeného buněčného stresu a apoptózy [51]. U anémie z krevních ztrát nebyla jeho zvýšená produkce prokázána [52]. Supresivní účinek GDF-15 na expresi hepcidinu byla experimentálně prokázána (viz níže). Hypoxie potlačuje tvorbu hepcidinu. Hypoxie snižuje hladinu hepcidinu, ale mechanizmus účinku není příliš znám. Ve studii, kde byli probandi vystaveni vysoké nadmořské výšce, došlo k rychlému poklesu hladiny hepcidinu a to před ostatními biochemickými změnami [53]. Regulační osa pravděpodobně zahrnuje HIF-1α (hypoxií indukovaný faktor 1 alfa), který je syntetizován játry. Zvýšena hladina HIF-1α pravděpodobně snižuje hladinu hepcidinu nepřímo [54]. U polycytémie ruské populace obyvatel Čuvačska byla zjištěna homozygotní mutace genu pro von Hippel Lindau protein (R200W) [55]. Tato mutace vedla ke stabilizaci HIF-1α. Následně byla indukována tvorba erytropoetinu a snížena tvorba hepcidinu. Na myším modelu bylo prokázáno, že vyřazení genů Vhl a Epo nevedlo k potlačení tvorby hepcidinu, ale po injekčním podání erytropoetinu byla jeho tvorba potlačena [56]. Erytropoetinem stimulovaná erytropoéza při hypoxii potlačuje produkci hepcidinu

29 Teoretická část pravděpodobně působením erytropoetinu v Epo-R signální dráze a regulací transkripčního faktoru C/EBPα [57]. Infekce a zánět zvyšují tvorbu hepcidinu. Tvorba zánětlivých mediátorů při infekcích a systémových zánětlivých onemocněních ovlivňuje syntézu hepcidinu na úrovni transkripce. IL-6 (interleukin 6), působící přes STAT-3 (signal transducer and activator of transcription 3) signální dráhu, je hlavním cytokinem ovlivňujícím produkci hepcidinu [36]. JAK/STAT signální dráha je aktivována zánětlivými cytokiny. STAT-3 obsahuje vazebnou část, která aktivuje promotor hepcidinu [58]. U člověka dochází po aplikaci IL-6 dochází ke zvýšení vylučované hladiny hepcidinu několikanásobně během 2 hodin po podání [59]. V laboratorních podmínkách byly zjištěny další cytokiny (např. IL-1, TNF-α), které mají vliv na tvorbu hepcidinu, jejich účinky u člověka však nebyly dosud potvrzeny [60; 61]. Tento mechanizmus působí jako obrana proti infekci způsobené snížením hladiny železa v krevním oběhu. Snížením dostupnosti železa pro mikroby naruší jejich látkovou výměnu a snižuje jejich schopnost dělení. Význam této nespecifické obrany člověka proti mikrobům je předmětem dalšího studia. Důsledkem snížení hladiny železa je jeho menší dostupnost pro erytropoézu. Při dlouhodobějším působení zánětlivé aktivity se rozvíjí anémie chronických chorob Ovlivnění syntézy hepcidinu na buněčné úrovni. Buňka sama je schopna reagovat na aktuální množství v ní obsaženého železa. Byl popsán mechanizmus, který umožňuje buňkám přijímat železo podle potřeby a zároveň se bránit proti jeho akumulaci a toxickému efektu. Část tohoto mechanizmu je vázána na úlohu transferinu a transferinového receptoru. Součástí mrna pro TfR jsou domény nazvané IRE (z angl. iron-responsive element) [62], na které se váží IRP proteiny (z angl. iron regulatory protein). IRE jsou nekódující úseky kličky mrna (UTR, z angl. untranslated region) kódující proteiny důležité pro řízení metabolismu železa (např. feritin L a feritin H, transferinový receptor, enzymy citrátového cyklu, feroportin a další). IRP (viz níže) se váží buď na 5` část UTR mrna a tím potlačují translaci proteinů nezbytných pro metabolizmus železa,

30 Teoretická část nebo se váží na 3` část UTR, čímž mrna stabilizují [63; 64] a translace může proběhnout. Byly popsány dva typy IRP1 a IRP2. Jsou si strukturálně podobné, ale každý je regulován jiným způsobem. Pro IRP1 je charakteristická akonitázová aktivita, která klesá při nedostatku železa a tím se zvyšuje afinita IRP1 k mrna např. TfR [65]. Zvýší se stabilita celé TfR mrna vedoucí ke zvýšení syntézy receptoru. IRP2 se nachází v buňkách v menší míře. U toho proteinu dochází k jeho degradaci závislé na množství železa. Mechanizmus jeho působení ještě není kompletně objasněn. Obsahuje exon bohatý na cystein, který je považován za spouštěč oxidace, ubikvitinace a proteasomální degradace závislá na hladině železa. V případě nedostatku železa nedochází k odbourávání IRP2 pomocí buněčných proteáz [66], jeho hladina se zvyšuje a tím i jeho vazba na mrna. Některé publikace však tuto teorii zpochybňují [67; 68]. Byly identifikovány další látky ovlivňující degradaci IRP2, např. hem [69], 2-oxoglutarát dependentní oxygenázy [67]. Na úrovni buňky byla vedle JAK/STAT signální dráhy popsána dráha BMP/Smad, která reguluje expresi hepcidinu. Tato kaskáda je považována za hlavní regulační osu transkripce hepcidinu [39]. Ovlivňuje metabolismus železa hlavně svým působením v játrech na úrovni hepatocytu. BMP je skupina molekul regulujících několik důležitých procesů jako embryogenezi, tvorbu a remodelaci kostí a hojení tkání. Zdrojem BMP by v játrech mohly být buňky intersticia a stelární buňky. Hlavní roli hraje BMP6, ale v menší míře působí stimulačně na tvorbu hepcidinu i ostatní typy BMP2, 4, 5, 7, 9 [70]. Receptory pro BMP jsou dva typy serin/threonin kináz. Receptory typu I se nazývají Alk2 a Alk3 (z angl. activin receptor-like kinase) [71], receptory II typu ActIIA (z angl. activin receptor typ IIA) a BMPRII (z abl. bone morphogenetic protein receptor II) [70]. Interakce BMP s jejich receptory vede k aktivaci receptorových kináz, následné fosforylaci komplexu SMAD1/5/8-SMAD4 (z angl. small mothers against decapentaplegic), který je translokován do jádra, kde aktivuje promotor HAMP genu (z angl. hepcidin antimicrobial peptide). BMP6 jako ligand v kombinaci se svým koreceptorem hemojuvelinem (HJV), glykosylfosfastidylinositolem ukotveným membránovým proteinem, spouští transkripci hepcidinu [39; 72]. Při mutaci HJV dochází k rozvoji juvenilní hemochromatózy, onemocnění z přetížení organismu železem. Matriptáza-2 (MT-2, TMPRSS6, z angl. transmembrane protease serine 6) a neogenin

31 Teoretická část jsou další molekuly, které ovlivňují syntézu hepcidinu a modulují tvorbu hemojuvelinu na povrchu membrán buněk [73; 74]. Při nedostatku železa v organizmu je výskyt TMPRSS6 na membráně buněk zvýšen [73]. Tento enzym patří mezi hlavní negativní transkripční faktory pro hepcidin. Svou aktivitou snižuje výskyt HJV na plazmatické membráně [75]. Byla zjištěna bodová mutace Ala736Val v genu pro TMPRSS6, která in vitro ovlivňila expresi hepcidinu a její výskyt se potvrdil i v italské populaci [76]. Zvýšena exprese TMPRSS6 byla zjištěna u hypoxie [77; 78], akutního alimentárního nedostatku železa [79] a po injekční aplikaci BMP6 [80]. 3. Patologické stavy při porušení homeostázy železa. Patologické stavy způsobené nerovnováhou metabolizmu železa jsou jedny z nejčastějších onemocnění člověka. Jejich projevy se nejčastěji rozvíjí velice pomalu a často mohou způsobovat jen malé potíže. U pacientů trpících jiným primárním onemocněním může velice výrazně snižovat kvalitu života. Proto je důležité porozumět metabolizmu železa a tato onemocnění léčit. Nerovnováha se projevuje v obou směrech, tzn. při nedostatku (deficitu), tak při jeho nadbytku. 3.1 Deficit železa. Protože se železo nejvíce podílí na tvorbě erytrocytů, projevuje se jeho nedostatek železa v lidském organizmu nejčastěji anémií. Anémie je chorobný stav charakterizovaný sníženou hladinou hemoglobinu ve vztahu k věku, pohlaví a rase. Jelikož je železo naprosto nezbytné k tvorbě hemoglobinu, jeho nedostatečný přísun do erytroblastů vede ke snížení produkce erytrocytů Sideropenická anémie. Nejstarší onemocnění spjaté s nedostatkem železa je chloróza, dříve rovněž nazývané onemocnění panen. Postihovalo adolescentní dívky a projevovalo se bolestmi hlavy, palpitacemi, ztrátou chuti k jídlu a zvýšenou únavou. Vyskytovalo se do 20. let dvacátého století [81]. Thomas Sydenham v druhé polovině 17. století řadil toto onemocnění mezi hysterické poruchy a léčil jej pilulkami se sulfátem železa a stejným způsobem bylo léčeno i o 150 let později Blaudem. Dnes by toto onemocnění spadalo do skupiny sideropenická anémie (SA, IDA z angl. iron deficiency anemia), ale již se v takové míře nevyskytuje. Anémie z nedostatku železa je nejčastějším typem anémie u dětí. Nejvíce se

32 Teoretická část na snížení hladiny Fe podílí nedostatečný příjem železa stravou. Důležitá je skladba stravy s dostatečným obsahem živočišné složky, ale důležitou roli hrají i faktory podílející se na vlastním vstřebávání. Nedostatek železa může způsobit rovněž zvýšená potřeba železa např. v období rychlého růstu organizmu a v těhotenství (Tab. 5). U žen v produktivním věku dochází k fyziologickým ztrátám železa menstruační krví. Zdravé ženy tak mohou ztrácet až 80 mg železa během jednoho menstruačního cyklu. Konečné množství takto eliminovaného železa je pro každou ženu jiné a liší se i mezi jednotlivými regiony. Hormonální antikoncepce redukuje množství menstruačního krvácení a naopak nitroděložní tělíska krvácení zvětšují. Pří dárcovství krve dárce přichází o přibližně 250 mg železa na jednu transfuzní jednotku. Bylo zjištěno, že u části dárců dochází při frekvenci 5 darování za rok ke snížení zásobního železa. Proto se pacientům, kteří darují krev více jak 1 2-krát ročně, doporučuje přidat substituční preparáty železa. Krevní odběry během vyšetření u lékaře mohou být důležitou příčinou úbytku zásobního železa, především u malých dětí, chronicky nemocných a hospitalizovaných pacientů. Pacienti hospitalizovaní na jednotkách intenzivní péče ztrácí až 4-krát větší množství železa než pacienti na standardních odděleních. Nutná vyšetření tak ještě prohlubují deficit železa a rozvíjející se anémii, která často chronická onemocnění doprovází