Vybavení mikrobiologické laboratoře, bezpečnost práce a osobní hygiena

Transkript

1 Hygiena a bezpečnost v mikrobiologii doc. Dr. Ing. Petra Patáková Náplň předmětu: Zaměření na dodržování principů hygieny a bezpečnosti práce v laboratořích různého typu v potravinářském a farmaceutickém průmyslu Systémy řízení jakosti a dodržování zásad zdravého rozumu při práci HACCP, SVP, SLP, SDP, ISO normy, akreditace laboratoří. Možnosti výskytu patogenů v potravinách a vodě, jejich stanovení, zabránění růstu, odběr vzorků, třídění mikroorganismů, práce s GMO Vybavení mikrobiologické laboratoře, bezpečnost práce a osobní hygiena Rozdělení mikroorganismů podle nebezpečnosti do 4 kategorií Vybavení podle kategorie laboratoře příklady Obecné zásady práce v laboratoři Mikrobiologické riziko: Osobní ochrana pracovníků pláště praní, vyvářka Základní hygienická pravidla Pravidla pro zvládání nehod Riziko vzniku aerosolu a vzdušné kontaminace sporami Laboratorní praxe práce s očkovací jehlou, zákaz pipetování ústy, homogenizace a míchání Práce s patogeny, likvidace mikrobiologického odpadu Co udělat před opuštěním laboratoře Zásady první pomoci Chemické riziko: Značení a uchovávání chemikálií Práce s karcinogenními nebo radiaktivními látkami Strukturovaný přístup k posuzování rizika při práci Vážení toxických a nebezpečných látek Nakládání s odpady Proces akreditace mikrobiologické laboratoře, legislativní normy Český institut pro akreditaci - Metodické pokyny pro akreditaci zahrnují: Pracovníky - (kvalifikace,zkušenosti,školení) Prostředí - prostory (oddělené,minimalizace kontaminace,zkřížená kontaminace,..) - monitorování (stěry,usazovací destičky,..) - hygiena (program čištění,prašnost,oblečení..) Validace zkušebních metod - (měla by odrážet skutečné zkušební podmínky,předem určené množství znečišťujících organismů) Nejistoty měření - Zařízení - údržba (pravidelné čištění a sterilace,záznamy,..) - kalibrace a verifikace výkonu Reagencie a kultury - reagencie (ověření vhodnosti každé dávky,doba životnosti,..) - vlastní připravovaná media (skladovací podmínky,..)

2 - média k přímému použití (jakostní specifikace od výrobce) - označování štítky (konc.,skladovací podm.,datum přípravy a spotřeby,..) Referenční materiály - (validace metod,kalibrace zařízení,srovnávání,..) Referenční kultury - (uznané národní sbírky,nutné kontroly čistoty,skladování,..) Správná laboratorní praxe Definice a rozsah působnosti Zásady správné laboratorní praxe: Organizace a procovníci zkušebního pracoviště Plán zajišťování jakosti Pracoviště Přístroje, materiály, činidla Zkušební systémy Zkoušené a referenční látky Standardní operační postupy (SOP) Provedení studie Dokumentace výsledků studie Archivace záznamů a materiálů ASLAB Středisko pro posuzování způsobilosti laboratoří- orypractice.htm

3 Možnost výskytu patogenních mikroorganismů v potravinářském a farmaceutickém průmyslu Přenos nákazy potravinami 1. přenos lidských nákaz (pracovníci v potravinářském průmyslu) 2. přenos požitím potravin z produktů nemocných zvířat (zoonosy) 3. otravy z potravin (toxiny v potravinách) 1. lidské nákazy přenos - znečištěnýma rukama, mouchy, voda znečištěná fekálními mikroby zdroj - nemocný člověk nebo nosič nemoci : břišní tyf, paratyf B, bacilární úplavice, akutní průjmová onemocnění průjmová onemocnění virového původu, virová hepatitida (žloutenka) typu A amébová úplavice, cholera Původci onemocnění, typické znaky a nejčastější výskyt 2. zoonosy přenos - dotykem zvířete, fekálně orálním způsobem, vzduchem, alimentárně (z masa, mléka, vajec) nákazy s přírodní ohniskovostí - zvířata jsou rezervoárem infekčních agens a sama nejsou nemocná nemoci: salmonelózy, kampylobakteriosa, listeriosa, yersiniosy, toxoplasmosa, tularemie teniosy tasemnice, tuberkulosa, jiné mykobakteriosy Původci onemocnění, typické znaky a nejčastější výskyt 3.alimentární intoxikace otravy z potravin toxiny se tvoří buď v potravinách nebo v zažívacím traktu nepřenosné z člověka na člověka stafylokoková enterotoxikosa, botulismus, intoxikace Clostridium perfringens typu A intoxikace Bacillus cereus, intoxikace Vibrio parahaemolyticus Původci onemocnění, typické znaky a nejčastější výskyt Mykotoxiny Toxinogenní plísně (350 druhů) mykotoxikosy Plesnivé potraviny Primární infekce cereálie, olejniny, ovoce, zelenina Sekundární infekce hotové produkty Výskyt a charakterizace nejčastějších typů mykotoxinů Možnosti dekontaminace Imunologické účinky MO- spor Velikost spor senná rýma, astma, alveolitis Imunologická rizika při práci s enzymy Cizí protein protilátka Porucha imunitního systému přecitlivělost Reakce dýchacího traktu (senná rýma, astma, alveolitis), reakce dalších sliznic (oční, ústní dutina, trávicí trakt), reakce kůže Práce s enzymy

4 Odběr vzorků pro mikrobiologická stanovení, statistické vyhodnocení výsledků Odběr vzorků 1. senzorické hodnocení (výrobky bez odchylek, podezřelé výrobky, zkažené výrobky) 2. množství vzorku 3. způsob odběru vzorku 4. značení a plombování a dokumentace 5. transport do laboratoře 6. zpracování vzorků 7. dekontaminace obalů 8. zřeďování vzorků (fyziologický roztok s peptonem) (resuscitace) stanovení Odběr sypkých, tuhých nebo zmražených vzorků Odběr konzerv pro posuzování hermetičnosti obalu (několik způsobů) Vyhodnocení výsledků Standardní (klasické) metody mikrobiologického rozboru 1. Resuscitace (neselektivní pomnožení) 2. Pomnožení v tekutém selektivním médiu 3. Kultivace na agarovém selektivně diagnostickém médiu 4. Výběr charakteristických kolonií 5. Identifikace izolovaných mikroorganismů biochemickými testy 6. Serologické testy Stanovení virů v potravinách a vodě Tkáňové kultury Linie opičích buněk- tvorba plaků Mikroskopické pozorování Elektronový mikroskop, možné rozpoznání Norwalk virů, falešně negativní výsledky Imunostanovení Vhodné pro vysoké konc.virů Stanovení RNA- RT-PCR Interference se složkami potravin 1) Imunoelektronová mikroskopie Protilátky na mikroskopickém sklíčku 2) Imuno RT-PCR Ependorfky potažené protilátkami

5 Stanovení celkového počtu mikroorganismů (TPC, APC, MPN stanovení..), indikátorové mikroorganismy Deskové (plotnové) metody (SPC - standard plate count, APC - aerobic plate count) zalévání do pevných půd (anaerobní MO) roztěr na povrch pevných půd (aerobní MO, kvasinky a plísně) složení půdy, kultivační podmínky, stupeň ředění ( kolonií na misku - celkový počet bakterií, speciální bakterie, 5-50 plísně) Vyhodnocení výsledků Stanovení skupin MO- mezofilní, psychrofilní, kyselinotvorné, proteolytické, lipolytické, slizotvorné, halofilní, osmotolerantní MPN stanovení zjišťovnání počtu buněk z růstu v tekutých půdách Provedení MPN testu Odečet z tabulek Indikátory mikrobiologické kvality počet původně přítomných MO, aplikace GMP, specifikace surovin Indikátorové MO přítomné a detekovatelné ve všech posuzovaných potravinách růst a počet nepřímo úměrný kvalitě posuzované potraviny snadno detekovatelné, počitatelné a rozlišitelné od jiných MO zjistitelné během krátké doby růst by neměl být ovlivňován složením potraviny Indikátory přítomnosti patogenních MO a toxinů Indikátorové MO snadné a rychlé stanovení, rozlišitelné, vždy přítomné spolu s patogeny, růstové požadavky a rychlost shodné s patogeny, nepřítomné není-li přítomen patogen Indikátory fekálního znečištění specificky střevní MO, výskyt ve fekáliích velmi hojný, odolnost k prostředí, detekovatelné i v malých množstvích fekální koliformní bakterie, E.coli, (enterokoky) Metabolity - aflatoxiny v zrnech, alkalická fosfataza v pasterovaném mléce Skupiny MO nejvíce ovlivňující kvalitu surovin a potravin 1) Mezofilní aerobní a fakultativně anaerobní bakterie 2) Kvasinky a plísně 3) Sporotvorné bakterie 4) Psychrotrofní bakterie 5) Kyselinotvorné MO 6) Lipolytické 7) Slizotvorné 8) Halofilní a osmofilní

6 Procesní hygiena konstrukce ideálního závodu Umístění závodu, požadavky na okolí Péče o vnější okolí závodu Materiály pro vlastní stavbu závodu Požadavky na hrubou stavbu z hlediska údržby a možného průniku škůdců do závodu (hmyz, ptáci, hlodavci..) Zabezpečení vhodných pracovních podmínek pro zaměstnance ventilace, odhlučnění, světelné podmínky Technické vybavení, výrobní zařízení, příslušenství Kontrola škůdců Zabránění kontaminaci MO Prevence kontaminace močí hlodavců Zabránění finančních ztrát Snaha vyhnout se reklamacím Prevence materiálních škod (el. Izolace) Dodržování legislativních předpisů Nejrozšířenější škůdci Hlodavci Hmyz Ptáci roztoči Integrovaný systém ochrany, hubení škůdců

7 Procesní hygiena systémy sanitace, typy dezinfekčních prostředků, testování jejich účinnosti Zásady správného čištění, plán čištění a úklidu vnějších a vnitřních ploch Systémy čištění in situ CIP, WIP, SIP sanitace Volby vhodného čistícího prostředku a dezinfektantu Typy dezinfektantů: Kvartení amonné soli Chlorové sloučeniny Jodové sloučeniny Alkoholy Porovnání účinnosti jednotlivých dezinfektantů Možný vznik rezistence u některých MO Dezinfekční mýdla pro osobní hygienu Vznik nežádoucích vedlejších produktů dezinfekce Testování účinnosti dezinfekčních prostředků: Suspenzní test Nosičový test Dezinfekce prostor a vzduchu pomocí UV světla Biofilm předcházení jeho tvorby, metody odstraňování Zásady osobní hygieny, správné mytí rukou Sledování povrchové hygieny Otisková metoda Stěrová metoda Stanovení čistoty ovzduší Kategorie znečištění ovzduší Stanovení relativního znečištění, vnitřní zdroj znečištění

8 Odstraňování mikroorganismů z prostředí sterilizace, pasterace Přímá inaktivace mikrobů (sterilace) Fyzikální zákroky sterilace teplem - pasterace, praktická sterilace vliv vlhkosti, kyselosti a) kyselé potraviny - mikrorg. hynou při teplotě 60 až 100 o C nesporul. bakterie (Lactobacillus, Leuconostoc) kvasinky a plísně X Paecilomyces, Byssochlamys, Phialospora b) málo kyselé a nekyselé potraviny sporul. bakterie vliv výchozí koncentrace miroorg., doby po kterou teplota působí Termoinaktivační čáry jednotlivých MO Kinetika úhynu MO D-hodnota snížení původního množství MO na 1/10 -dn/dt = kn ln(1/10) = -kd sterilace odporovým topením, vysokofrekvenčním ohřevem radiokonzervace konzervace ultrazvukem chemosterilace konzervace kyslíkem - ozón konzervace ionizovaným stříbrem oligodynamicky sterilizace UV zářením Porovnání jednotlivých typů zásahů, posouzení jejich vhodnosti pro danou situaci Prediktivní mikrobiologie Odhad chování MO v dané potravině (ph, složení plynů, konzervační látky, a w ) Stanovení doby trvanlivosti Vytvoření matematického modelu růstu MO (produkce toxinů) v dané potravině Pathogen modeling program USDA Growth predictor & Perfringens predictor Forecast model

9 Omezování kontaminace přídavek konzervačních látek, biologické zásahy Ochrana proti rozkladné činnosti mikroorganismů - konzervace potravin Nepřímá inaktivace mikrobů 1. vysušování prostředí 2. zahušťování 3. vymrazování vody - lyofilizace 4. proslazování 5. solení 6. chlazení a mrazení 7. odnímání kyslíku 8. chemoanabiosa - rafinované chemikálie 9. uzení 10. alkoholizace, okyselování (marinování) 11. přídavek antibiotik, fytoncidů 12. biologické zásahy (ethanolové kvašení, mléčné kvašení, proteolýza) Chemické konzervační látky 1. Organické kyseliny a estery ph< 5,5 Kys. octová a octany Kys. benzoová Kys. mléčná a laktáty Kys. propionová a propionáty Kys. sorbová 2. Dusitany 3. Sůl 4. Oxid siřičitý (volný nebo vázaný, antioxidační prostředek, antimikrobní působení) Mechanismus účinku jednotlivých konzervantů, typické použití Přírodní konzervační látky a systémy a) živočišného původu Laktoperoxidasový systém Laktoferin Avidin Lysozym b) rostlinného původu koření esenciální oleje (hřebíček, skořice, oregano, rozmarýn) cibule, česnek isothiokyanát (zelí, kapusta, křen, květák, brokolice..) fenoly a fenolové látky hydroxyskořicové kyseliny flavonoidy

10 Provozní analýza rizik Určení kategorie rizika analyzovaného potravinářského výrobku Klasifikace rizik A až F Kvantitativní metody analýzy rizika: Technika FMEA (Failure Modes and Effects Analysis): Analýza následků Analýza četností Posouzení spolehlivosti detekce Kvantifikace rizika číslo rizika Přehled nebezpečí u výrobku: Mikrobiologická nebezpečí Chemická nebezpečí Fyzikální nebezpečí Hodnocení nebezpečí Posouzení pravděpodobnosti vzniku daného nebezpečí na základě přiřazení pravděpodobnosti jednotlivým dílčím krokům Zavádění systému HACCP do mikrobiálních výrob HACCP - hazard analysis and critical control point 0) příprava na zpracování a zavedení HACCP popis potraviny a způsobu výroby, předpokládané použití dané potraviny, předpokládaní konzumenti, distribuce výrobků, HACCP tým, rozvaha rizik 1) Hazard analysis seznam kroků, při nichž hrozí riziko a popis preventivních akcí riziko - reálné, právní předpisy! a) rozpoznání rizik b) hodnocení rizik - pravděpodobnost výskytu, závažnost řídící strategie - prevence 2)Identifikace CCP kontrolní (řídící) bod - krok, proces, metoda, kterou lze řídit a tím snižovat nebo eliminovat riziko každé riziko alespoň jeden CCP 3)Ustanovení kritických hodnot pro každý CCP teplota, doba, vlhkost, ph 4) Monitorování CCP co se bude měřit, jak často, jakým způsobem, kdo za to bude zodpovědný 5) Korektivní zásahy, jestliže nastane odchylka od kritických hodnot postup oprav, záznám o chybě, rozhodnutí co udělat s výrobkem 6) Vedení záznamů a dokumentace HACCP systému Plán HACCP seznam lidí zodpovědných za HACCP a rozdělení zodpovědností popis produktu a jeho zamýšlené použití blokové schema výroby s vyzančením CCP zvýšení bezpečnosti produktu po přijetí HACCP rizika pro každý CCP a preventivní měření kritické hodnoty pro každý CCP

11 monitorování (co, kdy, kde, jak, kdo) korektivní zásahy způsob vedení záznamů postupy ověřování HACCP Záznamy při dodržování HACCP záznamy o monitorování jednotlivých CCP záznamy o korektivních akcích záznamy o ověřování Vysvětlení a zdůvodnění jednotlivých kroků 7) Verifikace HACCP plánu platnost a přesnost výsledků, validace metod, kalibrace přístrojů, audit HACCP plánu RASFF- Rapid Alert System for Food and Feed Hygiena krmiv Proč začátek potravinového řetězce u živočišných produktů Opatření a podmínky nutné pro kontrolu rizik a zajištění vhodnosti krmiv pro krmení zvířat s přihlédnutím k jejich uvažovanému užití Správná praxe při kontrole rizik v prvovýrobě krmiv Kontrola Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský (zapojen do RASFF)

12 Správná výrobní praxe SVP Doporučená literatura: Fusek M., Káš J., Ruml T.: Bioléčiva, skriptum VŠCHT Praha 2008 Výroba potravin, léků a potravinových doplňků Léčivá (účinná) látka originální léčivé přípravky a generické léky Léková forma Registrace léků Státní ústav pro kontrolu léčiv (SÚKL) na 5 let zákon č.79/1997 Sb. Šarže léků každá šarže označená a testovaná Požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv Aktuální Český lékopis 2009 (obsahuje i přesný překlad Evropského lékopisu 4.vyd. s 1. a2. doplňkem) International Pharmacopoeia WHO US Pharmacopoeia FDA (Food and Drug Administration) SVP ve výrobě léčivých látek Stanovení apyrogenity

13 ISO Normy ISO - International Organization for Standardization V ČR ČSN ISO Vydávání norem Český normalizační institut ISO9001:2000 požadavky na systém managementu jakosti (provádění certifikačních auditů) ISO9000 slovník pojmů z oblasti jakosti ISO15161 vytvoření a udržování efektivního systému jakosti v potrav.průmyslu (ČSN ISO Směrnice pro zavádění ISO 9001:2000 v potravinářském a nápojovém průmyslu) ISO22000 požadavky na systém HACCP Procesní přístup k řízení jakosti Proces činnost, která využívá zdroje a je řízena za účelem přeměny vstupů na výstupy Pochopení požadavků a jejich plnění Zvažování procesů z hlediska přidané hodnoty Výkonnost a efektivnost procesu Neustálé zlepšování procesu na základě objektivního měření Metodologie PDCA PDCA plan do control apply Plánuj Dělej Kontroluj Jednej Plánuj stanov cíle a procesy nezbytné k dosažení výsledků v souladu s požadavky zákazníka a s politikou organizace Dělej uplatňuj procesy Kontroluj monitoruj a měř procesy a produkty ve vztahu k politice, cílům a požadavkům na produkt, podávej zprávy o výsledcích Jednej prováděj opatření pro neustálé zlepšování výkonnosti procesu ČSN EN ISO Systémy environmentálního managementu Požadavky s návodem pro použití Environmentální aspekty výroby emise do ovzduší Úniky do vody, do půdy Využívání surovin a přírodních zdrojů Využívání energie Emitované energie odpady Vlastní audity dodavatelů BRC standard, EFSIS standard

14 Práce s GMO třídění GMO, legislativa Celkové riziko 1. Známé geny v jiném genetickém pozadí 2. Vznik nových genů 3. Pravděpodobnost, že produkt manipulace unikne kontrole 4. Závažnost případného ohrožení 5. Rozsah ohrožení Rozbor rizik Přímé a nepřímé účinky na: a) Člověka b) Zvířata a rostliny c) Možnost léčit onemocnění nebo zajistit účinnou profylaxi v důsledku vzniku rezistence k antibiotikům d) Usídlení a rozšíření GMO v životním prostředí e) Přirozeného přenosu vloženého genetického materiálu na jiné organismy Činnost při havarii GMO v zemědělství Bt a GR rostliny Výhody a nevýhody GMO v zemědělství, Food safety efekty Práce s transgenními rostlinami - laboratoř izolační skleník malé polní pokusy polní podmínky Legislativa o nakládání a práci s GMO v laboratoři a v průmyslu Značení potravin obsahujících GMO produkty Nakládání s GMO: 1) Uzavřené nakládání vznik GMO v laboratoři, laboratorní kultivace, pěstování nebo chov a nakládání s produkty GMO pro výzkumné účely v izolovaných kultivačních a laboratorních místnostech 2) Uvádění do životního prostředí - pokusné pěstování rostlin nebo chov zvířat v nechráněných podmínkách 3) Uvádění do oběhu běžné komerční pěstování GM rostlin nebo chov GM zvířat a výroba a prodej výrobků obsahujících GMO Ekologické zemědělství

15