Nejnovější techniky a metody v oblasti reprodukčních biotechnologií zhodnocení jejich přínosu a slabých stránek

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE Nejnovější techniky a metody v oblasti reprodukčních biotechnologií zhodnocení jejich přínosu a slabých stránek Bakalářská práce Hana Palánová Vedoucí práce: RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph. D. Brno 2017

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Hana Palánová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biologie a botaniky Nejnovější techniky v oblasti reprodukčních biotechnologií zhodnocení jejich přínosu a slabých stránek Ekologická a evoluční biologie Biologie a chemie se zaměřením na vzdělávání RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph. D.. Akademický rok: 2016/2017 Počet stran: 61 Klíčová slova: neplodnost, in vitro fertilizace, intracytoplazmatická injekce spermie, stimulace ovarií, kryokonzervace, PICSI

3 Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree Programme: Field of Study: Supervisor: Hana Palánová Faculty of Science, Masaryk University Department of Botany and Zoology Recent Techniques and Methods in Reproductive Biotechnologies - Evaluation of their Benefits and Weaknesses Ecological and Evolutionary Biology Biology and Chemistry with View to Education RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph.D.. Academic Year: 2016/2017 Number of Pages: 61 Keywords: infertility, in vitro fertilization, intracytoplasmic sperm injection, ovarian stimulation, cryopreservation, PICSI

4 Abstrakt Cílem této bakalářské práce je posoudit přínosy, ale také rizika metod asistované reprodukce. K nejpoužívanějším metodám patří in vitro fertilizace a intracytoplazmatická injekce spermie. Tyto postupy však nesou rizika spojená s ovariální stimulací kvůli možnosti vzniku ovariálního hyperstimulačního syndromu. Dalšími komplikacemi mohou být předčasný porod, nízká porodní hmotnost či vícečetná těhotenství. Tyto komplikace mohou být spjaty s chromozomálními abnormalitami spermií. Výběr spermií ještě před intracytoplazmatickou injekcí spermie má své výhody. Technika PICSI umožňuje na základě vazby s kyselinou hyaluronovou výběr spermií zralých bez chromozomálních abnormalit a proto se jeví jako efektivnější v porovnání s ICSI. Nejmodernější metodou konzervace je virtifikace. Jejím přínosem je větší úspěšnost přežití gamet a embryí. Abstract The aim of this bachelor thesis is to assess the benefits and risks of assisted reproduction techniques. The most widely used methods include in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. However, these procedures carry risks associated with ovarian stimulation because there is a possibility of developing ovarian hyperstimulation syndrome. Other complications can be premature birth, low birth weight and multiple pregnancy. These complications can be associated with sperm chromosomal abnormalities. Selection of sperm before intracytoplasmic sperm injection has advantages. PICSI technique allows by binding to hyaluronic acid selection of mature sperms without chromosomal abnormalities, and therefore PICSI seems to be more efficient compared to ICSI. The most moder method of preservation is vitrification. Its benefit is greater success in survival of gametes and embryos.

5

6

7 Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat vedoucí mé práce RNDr. Heleně Nejezchlebové, Ph.D., za její cenné rady, připomínky, motivující a odborné vedení při zpracování bakalářské práce. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci zpracovala samostatně a vyznačila v ní všechny prameny, které jsem použila při jejím zpracování. Brno Podpis

8 OBSAH Úvod Neplodnost Neplodnost ženy Neplodnost muže Asistovaná reprodukce Metody asistované reprodukce Vývoj metod asistované reprodukce IVF a ICSI Vliv psychiky na úspěšnost metod asistované reprodukce Index fragmentace DNA spermií Narušení děložní sliznice Vrozené vady spojené s ICSI Komplexní screening chromozomů Vliv vyššího věku matky na úspěšnost IVF Embryonální růstové parametry Vliv životního stylu na výsledky IVF Životní styl Vliv konzumace masa, ryb, ovoce, zeleniny, tuků a celozrnných výrobků na IVF/ICSI Objem trofoblastu a placentárního řečiště Vliv časových intervalů mezi procesy předcházející IVF na úspěch IVF/ICSI Vliv přenosu embryí na vícečetná těhotenství Den přenosu embrya a jeho vliv na porodní hmotnost, poměr chlapců a děvčat, počet jednovaječných dvojčat a počet mimoděložních těhotenství... 23

9 4 Stimulace ovariální činnosti Preparáty využívající se k ovariální stimulaci Agonisté a antagonisté gonadotropin releasing hormonu Stimulační protokoly při léčbě IVF/ICSI Stimulace ovarií dvěma různými typy gonadotropinů Vliv krevní skupiny na stimulaci ovarií u pacientů se sníženou ovariální rezervou AMH jako ukazatel ovariální rezervy Prediktory pro nízkou a vysokou ovariální odpověď při aplikaci GnRH antagonisty Úspěšnost intrauterinní inseminace v závislosti na typu stimulace vaječníků Kvalita embrya po ovariální stimulaci u pacientek s nízkou ovariální odpovědí Kryokonzervace Kryoembryotransfer Vitrifikace Social freezing Kryokonzervace spermatu a jeho analýza před léčbou Hodgkinovy choroby 38 6 Metody výběru spermií pro oplození PICSI Diskuze Závěr Seznam zkratek Seznam obrázků Seznam použité literatury Seznam internetových zdrojů:... 60

10 Úvod Pro svoji bakalářskou práci jsem si zvolila téma Nejnovější techniky a metody v oblasti reprodukčních biotechnologií. V dnešní době se počet neplodných párů stále zvyšuje, proto jde o velmi aktuální téma. Nejedná se pouze o problém medicínský, ale také ekonomický a psychosociální. Pro pacienty je neplodnost často velmi stresující situací, zvláště v případě neúspěchu léčby, proto je nutné zabývat se možnostmi léčby neplodnosti a pro kadý pár zvažovat využití nejvhodnější metody. Cílem literární rešerše je: 1. analyzovat faktory, které plodnost ovlivňují; 2. prozkoumat nové možnosti v léčbě neplodnosti; 3. popsat inovace mikromanipulačních a kryokonzervačních metod. Bakalářská práce bude věnována příčinám neplodnosti u mužů i žen, protože poznání těchto příčin je důležité z hlediska léčby. Dále se budu zabývat metodami asistované reprodukce a jejich vývoji. Zabývat se budu také výběrem vhodného stimulačního protokolu, protože metodám léčby předchází. Zvolení vhodného stimulačního protokolu ovlivňuje výsledky léčby neplodnosti. Budu se věnovat výhodám a nevýhodám některých stimulačních protokolů a možnosti zjištění ovariální rezervy pomocí antimulleriánského hormonu. Hlouběji se budu věnovat metodám in vitro fertilizace a intracytoplazmatické injekci spermie, popsání vlivu různých činitelů na úspěšnost těchto metod. Mezi tyto faktory patří například životní styl, věk matky, psychika, preimplantační genetický screening a další. Budu se také zajímat jaký vliv má IVF či ICSI na výskyt vrozených vad u dětí počatých pomocí ICSI či IVF a výskyt vícečetných těhotenství. Dále se zaměřím na kryokonzervaci oocytů, spermatu, embryí nejnovější technikou zvanou vitrifikace a následný kryoembryotransfer. S tímto souvisí také pojem social freezing, což je mražení vajíček ze společenských důvodů. Nakonec se budu zabývat možnostmi výběru spermie pro intracytoplazmatickou injekci spermie, a to zejména metodě založené na vazbě zralé spermie k hyaluroanu (PISCI) 10

11 1 Neplodnost Neplodnost je dle Světové zdravotnické organizace (WHO) definována jako stav, kdy při nechráněném pohlavním styku během jednoho roku, nedojde k otěhotnění. Naďová et al. (2012) shrnuli, že ženy se na neplodnosti podílejí přibližně ze %, muži se podílejí asi ze 40 %. Pouze z přibližně 20 % je neplodnost způsobena kombinací příčin u mužů i žen. Neplodnost můžeme rozdělit na primární a sekundární. Primární neplodnost znamená, že žena ještě nebyla těhotná, sekundární neplodnost, že žena nemůže znovu otěhotnět. 1.1 Neplodnost ženy Naďová et al. (2012) ve své práci uvádějí, že mezi příčiny neplodnosti patří jak poruchy pohlavních orgánů, tak psychické či jiné extragenitální příčiny. Mezi nejčastější patří hypotalamo hypofyzární příčiny, ovariální příčiny (cysty, nádory vaječníků, dysgeneze gonád a další), tubární příčiny (endometrióza, zápaly a adheze vejcovodů a další), cervikální příčiny (zápaly, cervikální faktor, imunita, nepravidelnost krčku a další), uterinní příčiny (chyby tvaru a polohy, nádory, poškození endometria), vaginální příčiny, extragenitální příčiny (drogy, nikotin, alkohol a další), psychické a jiné příčiny. 1.2 Neplodnost muže Dle Naďové et al. (2012) je neplodnost u muže způsobena poruchami funkce semeníků, genetickými anomáliemi, primárním a sekundárním hypogonadizmem, poruchami ejakulace a vyprazdňování semene, poruchami libida, erekce a dalšími příčinami. 2 Asistovaná reprodukce Řežábek (2014) sumarizoval cíle asistované reprodukce a její metody. Cílem tohoto oboru je léčba neplodnosti. Tento obor pracuje s vajíčky, spermiemi a embryi mimo tělo muže a ženy. 2.1 Metody asistované reprodukce 1. Arteficiální inseminace (AI) do pohlavního ústrojí ženy jsou vneseny spermie a to do pochvy nebo na děložní hrdlo, obvykle se však provádí intrauterinní inseminace spermie jsou přeneseny do dělohy. Zdrojem 11

12 spermií může být manžel, tzv. AIH (artificial insemination from husband), nebo dárce, tzv. AID (arteficial insemination from donor). 2. IVF ET in vitro fertilizace a embryotransfer. Do dělohy je přeneseno embryo, které vzniká kultivací odebraných oocytů se spermiemi. Využívá se zejména při neprůchodnosti vejcovodů. Obrázek 1: In vitro fertilizace znázorňující odběr vajíček punkcí ovariálních folikulů, jejich kultivaci se spermiemi, vývoj vzniklého embrya a transfer embrya do dělohy (URL 1). 3. Kryokonzervace gamet a embryí ty mohou být dlouhodobě skladovány před léčbou neplodnosti. Buňky se zmrazují obvykle na teplotu 196 C. Buňky jsou při zmrazování obklopeny roztokem s tzv. kryoprotektivy, které chrání buňky před poškozením. 4. Kryoembryotransfer transfer rozmražených embryí. 5. Mikromanipulace operace na vajíčku či embryu. Využívají se speciální nástroje. Může být například vyjmuta buňka z embrya a další úkony. Příkladem mikromanipulace je ICSI intracytoplasmatic sperm injection, spermie je vpravena přímo do vajíčka. 12

13 Obrázek 2: Intracytoplazmatická injekce spermie, při které je spermie vpravena přímo do vajíčka (URL 2). 6. Programy darování gamet a embryí využívají toho, že je možné oddělit zárodečné buňky od těla člověka. 2.2 Vývoj metod asistované reprodukce První dítě ze zkumavky v České republice a bývalé východní Evropě se narodilo 4. listopadu 1982, přičemž byla využita metody GIFT, jejíž podstatou je přenos gamet do vejcovodu (Žáková et al. 2012). První porod s využitím metody IVF v České republice se uskutečnil 29. října O 7 let později v roce 1991 byly poprvé zmraženy spermie, další rok byla zahájena kryokonzervace embryí. Do roku 2000 bylo zavedeno dárcovství spermií, metoda ICSI, dárcovství oocytů a embryí, metody pro získávání spermií z nadvarlete MESA a varlete TESE. V roce 2001 se začala vykonávat preimplantační genetická diagnostika (PGD). V roce 2007 zaznamenala velký posun kryokonzervace, byla zahájena metoda rychlého zmrazení tzv. vitrifikace. Roku 2010 byla na pracovišti v Brně poprvé provedena metoda PICSI. Tato metoda využívá schopnosti zralých spermií vázat se k hyaluronanovému hydrogelu, protože receptor nutný pro tuto vazbu nese pouze hlavička spermie. Takto je možná selekce pouze zralých spermií, u kterých byl prokázán nižší výskyt chromozomálních anomálií. 3 IVF a ICSI Dvořák et al. (1990) popsali in vitro fertilizaci (IVF) jako metodu, při které je vajíčko oplozeno, kultivováno a vzniklé embryo je přeneseno do dělohy. 13

14 Okolo roku 1878 byla poprvé oplozována savčí vajíčka a první transfer embrya byl proveden v roce Jednalo se o králičí embryo. Tento transfer byl úspěšný, samice porodila šest mláďat. Původně se tato metoda používala pro tubární faktor sterility, později se IVF ET začala užívat v situacích idiopatické sterility, sterility imunologického původu, endometriozy a sterility z andrologických příčin. Při této metodě se oocyty získají punkcí zralého folikulu a aspirací folikulární tekutiny. Velmi důležité je ve spojení v IVF ET také stimulace ovarií, protože umožňuje růst více než jednoho folikulu a tím se zvýší pravděpodobnost získání většího počtu oocytů. Tématu ovariální stimulace je věnována kapitola 4 této bakalářské práce. Intracytoplazmatickou injekci spermií (ICSI) shrnul ve své práci Řežábek (2014) jako metodu, při které je jedna spermie injekcí vpravena do vajíčka. Tato metoda je nejlépe působící léčbou mužské neplodnosti, pokud se v jejich ejakulátu vyskytuje malé množství spermií. Jako jehla se využívá skleněná kapilára. 3.1 Vliv psychiky na úspěšnost metod asistované reprodukce Nezdar při početí dítěte je velmi stresující situací pro ženu i muže. Stále je diskutován vliv stresu a psychiky na úspěch léčby neplodnosti. Tuto studii jsem vybrala, protože se nezabývá pouze vlivem stresu na výsledky asistované reprodukce, ale také vlivem psychické odolnosti, což Hermann et al. (2011) popsali jako schopnost odolávat a adaptovat se na stresové situace. Výzkum vlivu psychické odolnosti na úspěšnost prvního cyklu IVF/ICSI probíhal v letech (Ďurašková et al. 2014). Výzkumu se účastnily ženy mladší 35 let, rozumějící českému jazyku a ženy, které podstoupily cyklus bez darování oocytů. Základem pro tento výzkum bylo vyplnění dvou dotazníků dotazník životní spokojenosti a COPE Inventory. U druhého dotazníku se jedná o tzv. copingové strategie, což jsou způsoby chování, pomocí nichž lze zvládat stresové situace. V tomto dotazníku byly zkoumány tři strategie: akceptace, pozitivní interpretace a vyhledávání emocionální sociální podpory. Následně bylo u žen podstupujících tento výzkum zjišťováno klinické těhotenství. Dotazník životní spokojenosti vyplnilo 103 žen, klinické těhotenství bylo potvrzeno u 52 žen. Dotazník týkající se copingových strategií vyplnilo 82 žen, klinické těhotenství bylo potvrzeno 14

15 u 36 žen. Ve výsledku nebyl statisticky významný rozdíl v životní spokojenosti mezi ženami, které otěhotněly a těmi, které neotěhotněly. Statisticky významný rozdíl se objevil u copingové strategie Vyhledávání emociální sociální podpory. Ženy, které otěhotněly, více využívaly této strategie. Csemiczky et al. (2000) došli k závěru, že u neplodných žen se větší míře vyskytuje pocit viny, nepřátelství, ale nižší míra somatické úzkosti a nepřímé agrese. Objevili také rozdíl v hladině prolaktinu během celého menstruačního cyklu mezi plodnými a neplodnými ženami. Hladinu prolaktinu, která byla vyšší u neplodných žen, může zvyšovat právě stres. Podobné výsledky byly zjištěny i v dřívějších studiích (Harlow et al. 1996, Demyttenaere et al. 1994). 3.2 Index fragmentace DNA spermií Účelem výzkumu bylo zjištění souvislosti mezi indexem fragmentace DNA spermií (DFI), který se používá pro hodnocení integrity chromatinu spermií, a výsledky těhotenství po in vitro fertilizaci nebo intracytoplazmatické injekci spermií (Zhang et al. 2014). Zjišťování hodnoty DFI bylo založeno na testování struktury chromatinu spermií (SCSA). Výsledky této metaanalýzy byly porovnávány na základě biochemického těhotenství, klinického těhotenství a potratů. Metaanalýza zahrnovala 20 článků. Na základě výsledků bylo zjištěno, že páry s hodnotou DFI nižší než je mezní hodnota DFI (27 %), snáze otěhotní. Evenson et Wixon (2006) zjistili, že u neplodných párů podstupujících IVF bylo snazší dosáhnout těhotenství, pokud je DFI nižší než 30 %. Collins et al. (2008) však pozitivní roli integrity DNA spermií na výsledky IVF či ICSI nepotvrdili. Jiang et al. (2016) zjistili, že index fragmentace DNA spermií je rizikovým faktorem pro selhání oplození. Osman et al. (2015) ve své metaanalýze shrnuli, že partnerky mužů s nízkou fragmentací DNA, mají signifikantně vyšší porodnost. Dar et al. (2013) pozorovali vyšší počet potratů u skupiny s fragmentací DNA spermií vyšší než 50 %. Tento rozdíl však nebyl statisticky významný. Jiang et al. (2016) dospěli k výsledkům, které se shodují s ostatními studiemi v negativní korelaci vyšší hodnoty DFI s nižšími počty oplození, nižší kvalitou embrya, nižšími počty klinických těhotenství a živě narozených dětí. 15

16 3.3 Narušení děložní sliznice Implantace je limitujícím krokem pro IVF či ICSI. (Mahran et al. 2015) Narušení endometria je postup, který zvyšuje počty implantací při IVF či ICSI. Prozatím ale není jasné, jakým mechanismem ke zvýšení počtu dochází. První studie zabývající se touto problematikou byla provedena v roce 2003 (Barash et al. 2003). Karmizade et al. (2010) prováděli studii, která nepotvrzuje zlepšení výsledků IVF/ICSI po narušení endometria. Všechny ostatní studie se shodují na zlepšení výsledků IVF/ICSI s využitím tohoto postupu (Kumbak et al. 2014, Narvekar et al. 2010, Potdar et al. 2012). Nastri et al.(2012) publikovali metaanalýzu, v níž hlásí, že narušení děložní sliznice může zvýšit počty klinických těhotenství a živě narozených dětí. Dain et al. (2014) nepozorovali žádný efekt narušení endometria na počty živě narozených a počty klinických těhotenství. Ke stejnému výsledku došli i Dunne et. Taylor (2014). Mahran et al. (2015) provedli studii, která zkoumala vliv narušení děložní sliznice, prováděná pomocí pipelle biopsy katetru, na počet implantací a živě narozených dětí. Tato studie probíhala v letech a zahrnovala 400 pacientek. Těchto 400 pacientek bylo rozděleno do dvou skupin v první skupině pacientky podstoupili narušení endometria, které bylo provedeno mezi dnem cyklu. Druhá skupina byla kontrolní. U první skupiny byla míra implantací a počty živě narozených vyšší než u kontrolní skupiny (22,4 % vs. 18,7 % a 67 % vs. 28 %). Stejně tak počet klinických těhotenství byl vyšší u první skupiny (73,5 % vs. 35,5 %), míra potratů byla u této skupiny naopak výrazně nižší. Shahrokh Tehraninejad et al. (2016) zkoumali efekt narušení endometria na výsledky embryotransferu zmražených embryí. Studie se zúčastnilo 120 pacientek mladších 40 let, u kterých již nejméně dva cykly IVF/ICSI selhaly. Pacientky byly náhodně rozděleny do dvou skupin skupina s narušením endometria a kontrolní skupina. Mezi oběma skupinami nebyl významný rozdíl v počtu klinických těhotenství (35 % ve skupině s narušením endometria a 33,3 % v kontrolní skupině). Počty živě narozených dětí a počty potratů byly v obou skupinách podobné. 3.4 Vrozené vady spojené s ICSI V letech probíhal v Egyptě výzkum zaměřený na porovnání vrozených anomálií dětí u 739 žen, které otěhotněly po ICSI a 843 žen, které otěhotněly spontánně 16

17 (kontrolní skupina). (Bassiouny et al. 2013) Byl sledován výskyt vrozených anomálií, vícečetného těhotenství, předčasných porodů, císařských řezů a výsledky u narozených dětí. Počet vad, které byly zjištěny ultrazvukem, bylo 14 ve skupině žen, které otěhotněly po ICSI, v kontrolní skupině 13. Vyšetření novorozenců ukázalo, že ve skupině s využitím ICSI se vyskytlo 20 anomálií, v kontrolní skupině 16. U skupiny s využitím ICSI se častěji vyskytovala dvojčata (12,7 % vs. 1,3 % v kontrolní skupině) i trojčata. S ICSI byla spojená také větší míra předčasných porodů (3,8 %), císařských řezů (74,1 %) a novorozeneckých úmrtí (10,4 %). Rozdíl byl statisticky významný. Ve výskytu vrozených vad nebyl podstatný rozdíl mezi oběma skupinami. Malizia et al. (2012) prováděli retrospektivní kohortní studii, ve které analyzovali 5433 narozených dětí po ICSI 21,7 % byla dvojčata a 1,5 % trojčata. Farhi et al. (2013) ve své studii pozorovali významně zvýšené riziko malformací po ART. 3.5 Komplexní screening chromozomů I když v asistované reprodukci došlo k velkému pokroku, většina IVF cyklů nevede k narození dítěte. (Chen et al. 2015) Hlavním důvodem je aneuploidie embrya, které je přeneseno do těla. Jedná se o abnormalitu v embryu, zvláště u žen ve vyšším věku nebo u žen, u kterých implantace vícekrát selhala, vícekrát potratily, ale také u mladých žen. Vedlo to k názoru, že by embryo mělo být testováno na abnormality chromozomů ještě před transferem do těla. Byl objeven preimplantační genetický screening (PGS). Nejvíce používanou metodou pro screening aneuploidií byla metoda FISH (fluorescenční in situ hybridizace). Tato metoda ale nevedla ke zvýšení porodnosti po IVF. Největší omezení spočívá totiž v tom, že touto metodou lze posuzovat jen určitý počet chromozomů v PGS. Tento problém vyřešil komplexní screening chromozomů (CCS), protože testuje celou chromozomovou sadu. Ve výsledku 6 studií prokázalo statisticky významné zvýšení počtu klinických těhotenství díky CCS (Forman et al. 2012, Keltz et al. 2013, Schoolcraft et al. 2013, Greco et al. 2014, Lukaszuk et al a Wang et al. 2014). Forman et al. (2012), Keltz et al. (2013), Schoolcraft et al. (2013), Greco et al. (2014) a Lukaszuk et al. (2014) pozorovali statisticky významné zvýšení počtu trvajících těhotenství u skupiny s CCS. Scott et al. (2013) srovnávali také počet živě narozených dětí, který byl statisticky významně vyšší u skupiny s CCS. V dalších třech studiích (Forman et al. 17

18 2012, Greco et al. 2014, Schoolcraft et al. 2010), které hodnotily počty živě narozených dětí, nebyl pozorován statisticky významný rozdíl mezi skupinou s CCS a kontrolní skupinou. V jedné studii (Forman et al. 2013) byl také zjištěn statisticky významný nižší počet vícečetných těhotenství u skupiny s CCS. 3.6 Vliv vyššího věku matky na úspěšnost IVF Věk matky vyšší než 37 let je příčinou poměrně nízké úspěšnosti IVF. (Lee et al. 2015) U matek ve vyšším věku je totiž velké riziko vzniku aneuploidního embrya. Tento výzkum měl ukázat, zda je vyšší úspěšnost implantací s využitím PGS. Výzkumu se zúčastnily ženy ve věku let. Byly porovnávány výsledky IVF s přenosem čerstvých embryí, IVF s přenosem zmrazených embryí (FET) bez PGS a s PGS (přenos pouze euploidních embryí). Bylo zjištěno, že počet implantací, při kterých se přenášela pouze euploidní embrya byl vyšší (50,9 %) než u transferu čerstvých embryí (23,8 %) a transferu zmrazených embryí bez PGS (25,4 %). I počet živě narozených byl u cyklů s PGS prokazatelně vyšší (45,5 %) než u transferu čerstvých (15,8 %) a transferu zmrazených embryí bez PGS (19,0 %). Díky PGS je tedy možné posoudit embryo z hlediska chromozomálních abnormalit a umožňuje vybrat euploidní embryo, které má vyšší úspěšnost implantace. Yan et al. (2012) rozdělili pacientky do čtyř skupin podle věku (21 30, 31 35, 36 40, více než 40 let). Bylo zjištěno, že počty biochemických a klinických těhotenství byly významně nižší a počet potratů významně vyšší ve skupinách s vyšším věkem pacientky. Nebyl zjištěn rozdíl v kvalitě embryí mezi skupinami. Ve skupině pacientek s věkem vyšším než 40 let byl počet klinických těhotenství 19 % a počet potratů 36 %. Počet potratů ve skupině pacientek let starých byl 20 %, u pacientek ve věku let 13 % a v nejmladší skupině 9 %. Xiong et al. (2015) sledovali vyšší počet potratů u starších žen ve srovnání s mladšími. S rostoucím věkem matky se ale snižoval počet předčasných porodů. Nelson et Lawlor (2011) zjistili, že starší ženy mají nižší riziko malé porodní váhy svých dětí než ženy mladší. 18

19 3.7 Embryonální růstové parametry Počet narozených dětí po využití asistované reprodukce je v evropských zemích 0,5 4,9 % a tento počet se stále zvyšuje. (Eindhoven et al. 2014) Byl prokázán vztah mezi měřením temeno kostrční délky (CRL) na konci prvního trimestru těhotenství a rizikem předčasného porodu a malou porodní váhou. Dále byly objeveny asociace mezi CRL v prvním trimestru a faktory jako jsou mateřský věk, etnika, kouření, používání kyseliny listové jako doplňku a další. Velkým pokrokem bylo zavedení 3D ultrazvuku. Jeho dostupnost se posunula z druhého a třetího trimestru do prvního trimestru těhotenství. Cílem studie bylo zkoumání asociace IVF/ICSI léčby s embryonálními růstovými parametry měřenými pomocí CRL a EV (embryonální objem) a odhad hmotnosti plodu a porodní váhy. Ke zjištění asociace mezi IVF/ICSI a embryonálním růstem byl použit model lineární smíšené analýzy. Do analýzy bylo zařazeno 146 žen, zahrnujících 58 IVF/ICSI těhotenství, 26 z nich otěhotnělo pomocí IVF a 32 pomocí IVF a ICSI. Neobjevily se žádné významné rozdíly mezi IVF a ICSI těhotenstvím. U 46 těhotných žen bylo přeneseno jedno embryo, u dalších 11 byla přenesena 2 embrya, u jedné nebyl zjištěn počet přenášených embryí. Všechny ženy, které podstoupily IVF/ICSI léčbu používaly ještě před početím kyselinu listovou, u žen, které otěhotněly spontánně, to bylo pouze 71,8 %. Kouření se vyskytovalo u 6,9 % žen v IVF/ICSI skupině, ve skupině se spontánním těhotenstvím u 23,9 %. Užívání alkoholu se objevilo u 22,4 % žen v IVF/ICSI skupině a ve skupině se spontánním těhotenstvím u 53,4 % žen. Aby bylo možné měřit CRL a EV, gestační věk musí být nejméně 6 týdnů a nejvíce 8 9 týdnů (EV) a 7 12 týdnů (CRL). Při měření CRL postačuje vidět temeno a kostrč, končetiny nemusí být plně zobrazeny na snímku. Při měření EV musí být na snímku zachycen celý embryonální objem, zahrnující všechny končetiny a kvalita snímku musí být dostatečná. V 6 týdnech gestačního věku je embryo velmi malé a kvalita snímku není často dostatečná pro změření EV. Ve 12 týdnech gestačního věku, je embryo někdy tak velké, aby se vešlo na snímek celé. Úspěšnost měření CRL byla 90,9 % a úspěšnost měření EV byla 58,8 %. Úspěšnost měření se u IVF/ICSI a spontánního těhotenství nelišila. Nebyl prokázán žádný vztah mezi způsobem početí a odhadovanou hmotností plodu a porodní hmotností. 19

20 3.8 Vliv životního stylu na výsledky IVF Špatný životní styl ovlivňuje zdraví včetně vlivu na produkci oocytů, oplození, těhotenství a potrat. (Firns et al. 2015) Studie zkoumá vliv kouření, konzumace alkoholu, ovoce a zeleniny na výsledky IVF léčby. Jedná se o velmi rozsáhlou a jednu z posledních studií vlivu životního stylu na výsledky léčby asistované reprodukce. Původní údaje byly získány od 351 párů, které podstupují IVF. Oocyty byly při studii oplozovány metodou IVF či ICSI. Embrya byla hodnocena na stupnici od 1 do 4. 1 embryo s nejnižší kvalitou 4 nejkvalitnější embryo. Embrya s nejvyšší kvalitou byla vybrána pro transfer. Těhotenství bylo určeno pozitivním β hcg těhotenským testem 16 dní po přenosu embrya Životní styl 1. Kouření cigaret může snížit plodnost, způsobit zpožděné početí, vyšší riziko potratu, také může způsobit nepravidelný menstruační cyklus a má vliv na nástup menopauzy. U mužů studie prokázala snížení hustoty spermií a omezení jejich pohyblivosti. Bylo zjištěno, že kouření způsobuje pokles hustoty spermatu o 15,3 %, pokles počtu spermií o 17,5 % a snížení počtu pohyblivých spermií o 16,6 %. Ve výsledku nebyl významný rozdíl v průměrném počtu oocytů u kuřáků, bývalých kuřáků a nekuřáků, ale bylo zjištěno, že produkce vajíček se snižuje spolu se zvýšením bazální hodnoty FSH a ta se zdála být vyšší u dlouholetých kuřáků. Výsledky také ukázaly, že počty oplození nebyly ovlivněny ženským kouřením. Kouření u mužů má statisticky významný vliv na potrat v prvním trimestru. 2. Konzumace alkoholu u žen byla spojena se sníženou plodností. Nebyl ale prokázán významný rozdíl v počtu potratů a mimoděložních těhotenství mezi menšími a většími konzumenty alkoholu. Studie z roku 1998 prokázala, že ženy, které konzumují více než 7 alkoholických nápojů týdně, potřebují delší dobu k otěhotnění. Také ženy, které konzumují více než 5 alkoholických nápojů týdně, častěji potratí. Muži, kteří denně konzumují alkohol, mají nižší kvalitu spermatu. Prozatím není zcela jasný přímý vztah mezi konzumací alkoholu na výsledky IVF. Naopak bylo pozorováno, že konzumace alkoholu u mužů má pozitivní vliv na počty oplození. 20

21 3. Konzumace ovoce a zeleniny výsledky ukázaly, že konzumace ovoce a zeleniny u mužů má pozitivní vliv na počty oplození. Ovoce a zelenina obsahují antioxidanty, které ochraňují spermie před poškozením reaktivními formami kyslíku, což má za následek zvýšení jejich počtu. Kaya et al. (2016) na základě svého výzkumu posoudili, že redukce rizikových faktorů životního stylu (kouření, nízké či vysoké BMI, stres, konzumace alkoholu) zlepšuje výsledky léčby pomocí ART. 3.9 Vliv konzumace masa, ryb, ovoce, zeleniny, tuků a celozrnných výrobků na IVF/ICSI Výživa ovlivňuje plodnost mužů i žen, proto je cílem této studie zjistit asociaci mezi dodržováním obecných výživových pravidel u párů, kteří podstupují IVF/ICSI léčbu a šancí na probíhající těhotenství. (Twigt et al. 2012) Studie se zaměřila na příjem 6 hlavních potravinových skupin ovoce, zelenina, maso, ryby, celozrnné produkty, tuky. Páry vyplnily dotazníky, z nichž byly kromě stravovacích návyků extrahovány informace o věku, hmotnosti, kouření, konzumaci alkoholu, cvičení a další. Po proběhnuté IVF/ICSI léčbě bylo sledováno dosažené těhotenství na základě srdeční akce plodu zhruba 10 týdnů po přenosu embrya. Ze 199 párů, které podstoupily svůj první cyklus IVF/ICSI do 6 měsíců po konzultaci 35 % otěhotnělo, 62 % neotěhotnělo, u 3 % pacientek nebyl zjištěn výsledek léčby. Ženy, u kterých se nepodařilo dosáhnout těhotenství, byly častěji kuřačky, ale také méně konzumovaly celozrnné pečivo, méně ovoce a také méně ryb. Míra příjmu tuků a zeleniny byla u obou skupin téměř stejná. U mužů, jejímž partnerkám se nepodařilo otěhotnět, byla pozorována vyšší konzumace celozrnného pečiva a nižší konzumace ryb. Tito muži byli častěji kuřáci. Tato studie tedy ukazuje vztah mezi zdravým životním stylem a probíhajícím těhotenstvím u pacientů podstupujících IVF/ICSI Objem trofoblastu a placentárního řečiště Díky asistované reprodukci se rodí až 4 % dětí. (Rifouna et al. 2014) Výsledek těhotenství do určité míry souvisí s funkcemi placenty. Haavaldsen et al. (2012) popsali rozdíly mezi placentami u spontánního těhotenství a těhotenství po ART. Po ART byla zvýšena hmotnost placenty a také poměr hmotnosti placenty a hmotnosti plodu. Další studie však tento rozdíl nepozorovaly. (Jauniaux et al. 1990, Daniel et al. 1999). Daniel 21

22 et al. (1999) a Joy et al. (2012) prokázali zvýšenou tloušťku placenty u žen podstupujících ART. Zhang et al. (2011) zjistili zvýšenou tloušťku placentární bariéry u ART, která znesnadňuje výměnu mezi matkou a plodem. Avšak další studie (Jauniaux et al. 1990, Daniel et al. 1999) neprokázaly rozdíl mezi histopatologickými rysy placenty u těhotenství po ART a spontánně dosaženým těhotenstvím. Tato studie ale předpokládá, že placentární růst a/nebo objem placentárního řečiště (PBVV) je ovlivněn IVF či IVF/ICSI a porovnává objem trofoblastu (TV) a PBVV v raném těhotenství mezi IVF či IVF/ICSI a spontánním těhotenstvím. Využívá k tomu trojrozměrnou virtuální realitu a 3D ultrazvuk. Studie se zúčastnilo 154 těhotných žen, 84 z nich otěhotnělo spontánně, 70 žen po IVF či IVF/ICSI. Objem trofoblastu byl stanoven v desátém týdnu těhotenství pomocí transvaginální sondy a PBVV bylo měřeno v dvanáctém týdnu těhotenství. U spontánně dosaženého těhotenství a u IVF či IVF/ICSI nebyl zjištěn rozdíl u TV a PBVV. Podle studie se IVF či IVF/ICSI nezdá být spojena s abnormální placentou. Také nebyl zjištěn rozdíl v PBVV či v TV mezi převodem čerstvých nebo zmražených embryí. Počet dětí, které se narodily předčasně nebo s nízkou porodní hmotností, byl příliš malý, aby se mohlo hovořit o korelaci s PBVV či TV Vliv časových intervalů mezi procesy předcházející IVF na úspěch IVF/ICSI Studie byla prováděna od ledna 2008 do prosince (Nouri et al. 2015) Ženy, které se studie zúčastnily, byly mladší než 42 let s pravidelnými menstruačními cykly každých dní, bazální hladina FSH < 12 mlu/ml třetí den menstruačního cyklu. Studie se zúčastnilo 410 žen. Přenos embrya byl proveden třetí až pátý den po odběru oocytů. ELT (embryo loading time) byl definován jako časový interval mezi začátkem proplachování transferovaného katetru kultivačním roztokem a koncem zavedení embrya do katetru. ELT byl měřen stopkami. Katetr byl vložen do děložní dutiny, postupoval jí s cílem umístění embrya, následovalo otočení o 45 a odstranění katetru, což bylo definováno jako konec časového intervalu mezi ELT a transferem embrya. Byly použity dva typy katetrů měkký a tuhý katetr. Měkký katetr byl použit u 74 žen, tuhý katetr v 336 případech. Oba typy katetrů byly stejně úspěšné v podmínkách přenosu embrya při prvním pokusu. Poté byl zkoumán počet probíhajících těhotenství (OPR) a počet živě narozených dětí (LBR). OPR byl definován tlukotem srdce embrya 22

23 v pátém týdnu po transferu embrya. Ve výsledku OPR použitím měkkého katetru byl vyšší než s použitím tuhého katetru. LBR byl také vyšší při použití měkkého katetru (34,7 %), na rozdíl od tuhého katetru (21,6 %). Rozdíl byl statisticky významný. OPR a LBR se významně nelišil v době trvání ELT a TIEL ET (časový interval mezi ELT a transferem embrya) Rychlost přenosu embrya není rozhodující pro úspěch IVF/ICSI. Abou-Setta et al. (2007) prokázali, že při použití měkkého katetru je počet těhotenství významně vyšší než při použití tuhého katetru. Matorras et al. (2004) změřili časový interval mezi zavedením embrya do katetru a jeho transferem do dělohy v 450 cyklech. Bylo zjištěno, že čím delší je čas mezi zavedením a transferem embrya, tím nižší je počet těhotenství i implantací Vliv přenosu embryí na vícečetná těhotenství Podle nejnovějších zpráv o ART je v Evropě asi 13 % těhotenství po kryotransferu vícečetných. (Regalado et al. 2014) Cílem této studie bylo analyzovat vliv dvoupostupných přenosů samostatných zmražených embryí (esfet) oproti přenosu dvou zmražených embryí najednou (DFET) na počet vícečetných těhotenství u žen mladších 38 let, které neotěhotněly při přenosu čerstvého embrya. Studie probíhala od ledna 2010 do června Pacientky byly rozděleny do tří skupin: DFET první kryotransfer dvou embryí, csfet jediný kryotransfer samostatného embrya a esfet transfery samostatných embryí. Všechny pacientky byly stimulovány, aby bylo dosaženo vícečetného vývoje folikulů. Počty implantací byly podobné ve všech skupinách. Rozdíly v počtu klinických těhotenství mezi skupinou DFET a esfet nebyly statisticky významné, ale byly statisticky významné mezi skupinami DFET a csfet (38,1 % vs. 21,7 %) a mezi skupinami csfet a esfet (21,7 % vs. 43,3 %). Počet potratů byl u všech skupin podobný. Počet vícečetných těhotenství se významně lišil mezi skupinami DFET a esfet (32,5 % vs. 0 %). Studie prokázala, že počty vícečetných těhotenství mohou být významně sníženy zaváděním jednotlivých embryí bez nepříznivého vlivu na úspěšnost léčby Den přenosu embrya a jeho vliv na porodní hmotnost, poměr chlapců a děvčat, počet jednovaječných dvojčat a počet mimoděložních těhotenství Možnosti léčby neplodnosti rostou a výsledky těchto metod se zlepšují. (Sotiroska et al. 2015) Velmi ale záleží na věku pacientky. S rostoucím věkem se 23

24 snižuje ovariální rezerva a chyby spojené s meiotickým vřeténkem rostou. Cílem studie bylo porovnat reprodukční výsledky mezi transferem embrya ve stádiu rýhování a transferem blastocysty u dvou věkových skupin pacientek. V této studii bylo analyzováno celkem 1400 ICSI cyklů. Pacientky byly na základě věku rozděleny do dvou skupin stáří méně než 36 let (skupina I), stáří 36 nebo více let (skupina II). Každá skupina byla dále rozdělena do dvou podskupin podle dne přenosu embrya den třetí a pátý. Výsledky by měly poskytnout informace pro vhodný den transferu embrya. U každé pacientky byla přenesena 1 3 embrya. Ve skupině I nebyl významný rozdíl v počtu oplodnění mezi oběma podskupinami. Ani kvalita a počet těhotenství se mezi těmito dvěma podskupinami příliš nelišil. Významný rozdíl byl v počtu implantací mezi přenosem 3. (32,6 %) či 5. (38,9 %) den. Vyskytl se i vyšší počet potratů v prvním i druhém trimestru u pacientek s přenosem embrya třetí den. V této podskupině se narodilo 447 dětí, z nich 250 bylo chlapců (56 %) a 197 děvčat (44 %). Narodilo se 40 % dvojčat a 3,3 % trojčat. V druhé podskupině (přenos embrya 5. den) se narodilo 234 dětí 133 chlapců (57 %) a 101 děvčat (43 %). Jednovaječných dvojčat se narodilo 0,5 % ve skupině s přenosem embrya 3. den a 2,9 % u skupiny s přenosem 5. den. Ve skupině II nebyl žádný významný rozdíl v počtu implantací mezi oběma podskupinami, ale míra klinických těhotenství byla výrazně vyšší v podskupině s přenosem embrya pátý den. U podskupiny s přenosem embrya třetí den se narodilo 53% děvčat a 47 % chlapců, zatímco v druhé podskupině byl poměr 44 % děvčat a 56 % chlapců. Studie ukázala nejvyšší počet klinických těhotenství u skupin s přenosem embrya pátý den (57 % skupina I, 48 % skupina II). U pacientek mladších 36 let byla zjištěna vysoká míra vícečetných těhotenství. U skupin s transferem embrya třetí den se vyskytla vyšší míra potratů. Přenos embrya pátý den vedlo k narození vyššího procenta chlapců (57 % - skupina I a 56 % skupina II). Mezi oběma skupinami nebyl významný rozdíl v porodních hmotnostech. Maxwell et al. (2015) srovnávali gestační věk a porodní váhu při transferu embrya 3. a 5. /6. den. 421 pacientek podstoupily transfer embrya 3. den, 1893 pacientek 5. či 6. den. Nebyla prokázána významná korelace mezi gestačním věkem při porodu a dnem transferu embrya. Také nebyla prokázána korelace mezi dnem transferu a porodní hmotností. 24

25 Zhang et al. (2016) ve své metaanalýze shrnuli také rizika vzniku mimoděložního těhotenství při transferu embrya třetí a pátý den. Všech 23 studií metaanalýzy prokázalo nižší riziko vzniku mimoděložního těhotenství při transferu embrya pátý den. 4 Stimulace ovariální činnosti Na začátku menstruačního cyklu se ve vaječnících tvoří více folikulů, ale pouze jeden začne dozrávat k ovulaci kolem 5. dne cyklu. (Dvořák et al. 1990) Ostatní z těchto folikulů degenerují. Stimulací ovarií se zvyšuje počet folikulů, které se dostatečně vyvíjejí. Tím roste naděje na získání většího počtu oocytů. Nevýhodou stimulace je zvýšení finanční náročnosti léčby, možnost vzniku ovariálních cyst, krvácení z prasklé cysty a další. 4.1 Preparáty využívající se k ovariální stimulaci Ke stimulaci se používají dvě skupiny preparátů: 1. Klomifencitrát (CC) pět dnů se podává mg klomifencitrátu, první dávka se užívá druhý až pátý den cyklu. Lidský menopauzální gonadotropin (hmg) počátek stimulace je třetí či čtvrtý den cyklu. Choriový gonadotropin (hcg) aplikace ovlivňuje dozrávání folikulu a zralost oocytu. 2. Folikulostimulační hormon (FSH) Gonadotropní spouštěcí hormon (GnRH) Kromě zde uvedených stimulací se používají také kombinace: 1. CC + hcg 2. CC + hmg + hcg 3. hmg + hcg 4. FSH + hcg 5. FSH + hmg + hcg 6. hmg + GnRH 25

26 4.2 Agonisté a antagonisté gonadotropin releasing hormonu Aplikace agonistů gonadotropin releasing hormonu (GnRH) se zahajuje obvykle pět dní před menstruací. (Rob et al. 2008) Podává se např. nafarelin (Synarel výrobce: Piramal Healthcare UK Limited, Morpeth, Velká Británie, Pfizer Service Company BVBA, Zaventem, Belgie), goserelin (Zoladex výrobce: AstraZeneca UK Limited, Macclesfield, Cheshire, Velká Británie), triptorelin (Diphereline výrobce: Ipsen Pharma Biotech, Signes, Francie, Decapeptyl výrobce: Ferring GmbH, Kiel, Německo) a další. Hormon je aplikován do podání hcg k indukci ovulace. Léky jsou podávány až do podání hcg, proto mluvíme o dlouhém protokolu. U tohoto protokolu dochází zpočátku k vzestupu tvorby FSH a LH asi na 4 dny (flare up fenomen), to způsobí zástavu tvorby gonadotropinů během jejich dalších aplikací. Antagonisté GnRH zastaví výdej FSH a LH z hypofýzy hned. Podávání antagonistů GnRH se ukončí při aplikaci hcg. Léky jsou podávány až od okamžiku, kdy lze předpokládat, že LH peak reak reálně hrozí (typicky při dominantním folikulu o průměru 12 až 14 mm), proto mluvíme o krátkém protokolu. Jako antagonisté GnRH se aplikují např. ganirelix (Orgalutran výrobce: Organon (Ireland) Ltd., P.O. Box 2857, Drynam Road, Swords, Co. Dublin, Irsko, N.V. Organon, Kloosterstraat 6, Postbus 20, 5340 BH Oss, Nizozemsko), cetrolexix (Cetrotide výrobce: Merck Serono Europe Ltd.) a další. 4.3 Stimulační protokoly při léčbě IVF/ICSI Vhodný výběr stimulačního protokolu při léčbě neplodnosti je stále otevřeným a zkoumaným tématem, protože zásadně ovlivňuje výsledky léčby, a to z hlediska počtu získaných oocytů, oplození, počtu implantací, klinických těhotenství a také počtu narozených dětí. Ke stimulaci vaječníků při IVF/ICSI cyklech u pacientek různých věkových skupin se využívá krátký protokol s antagonisty GnRH (gonadotropin releasing hormone) a dlouhý protokol s agonisty GnRH. (Xing et al. 2015) Každá skupina byla dle věku pacientek rozdělena do čtyř skupin méně než 31 let, let, let, více než 40 let. Dlouhý protokol je podáván uprostřed luteální fáze předchozího cyklu, krátký protokol je podáván na začátku menstruačního cyklu a pokračuje až do podání hcg (choriový gonadotropin). Cílem této studie bylo porovnat tyto dva protokoly vzhledem k výsledkům IVF/ICSI u pacientů různých věkových skupin. Pacientky s dlouhým 26

27 protokolem obdržely 1,0 1,3 mg triptorelinu v polovině luteální fáze předcházejícího cyklu. Odebírání oocytů bylo provedeno transvaginálně hodin po injekci hcg. V krátkém protokolu byl triptorelin podán 3. den menstruačního cyklu. Klinické těhotenství bylo diagnostikováno jako přítomnost gestačního váčku pomocí vaginálního ultrazvuku. Potrat byl definován jako ztráta těhotenství před 28. týdnem. Skupina s dlouhým protokolem měla vyšší úspěch v počtu těhotenství ve všech věkových skupinách: 52,76 %, 44,33 %, 36,15 % a 13,33 % v uvedeném pořadí. Počty těhotenství ve skupině s krátkým protokolem 33,33 %, 24,58 %, 22,49 % a 8,72 %. U obou skupin se počet těhotenství snížil s rostoucím věkem. Celková dávka gonadotropinu byla vyšší při dlouhém stimulačním protokolu pro všechny věkové kategorie. S rostoucím věkem bylo spotřebováno více gonadotropinu. Doba trvání stimulace byla taktéž delší v této skupině, ale s rostoucím věkem byla doba neměnná. Stejně tak byl u této skupiny vyšší počet získaných oocytů, se zvyšujícím se věkem se jejich počet snižoval. Mezi oběma skupinami nebyly velké rozdíly v počtu potratů. Studie ukázala, že bez ohledu na věk pacienta, dlouhodobý stimulační protokol byl lepší z hlediska získaných oocytů, počtu implantací a klinických těhotenství. Boza et al.(2016) ve své studii také srovnávali efektivitu stimulace pomocí protokolu s agonisty GnRH a antagonisty GnRH. Primárním kritériem efektivity byl počet klinických těhotenství. Studie se zúčastnilo 244 pacientek. U 135 z nich byl ke stimulaci využit protokol s agonisty GnRH, u zbylých 109 byl využit protokol s antagonisty GnRH. Počet implantací byl významně vyšší u skupiny s agonisty GnRH. Počet oplození a počet klinických těhotenství byl také vyšší u této skupiny, výsledek však nebyl statisticky významný. Daya et al. (2000) ve své metanalýze shrnují větší efektivitu dlouhého protokolu v počtu získaných oocytů i dosažených těhotenství oproti krátkému protokolu. Tyto výsledky se neshodují s druhou metanalýzou (Hughes et al. 1992), která neprokázala rozdíl mezi těmito dvěma protokoly. Pilehvari et al. (2016) ve své studii srovnávali výsledky asistované reprodukce při použití stimulačního protokolu s agonisty GnRH a protokolu s nízkými dávkami lidského menopauzálního gonadotropinu. Některé studie však nepovažují tento protokol za příliš efektivní (Davar et al. 2010, Ozcan et al. 2014, Mansour et al. 2003). Při tomto 27

28 protokolu je podáván klomifencitrát nebo letrozol následovaný lidským menopauzálním gonadotropinem. Tato studie zahrnovala 77 pacientek starších 40 let, u kterých běžnými stimulačními protokoly byly získány méně než 3 oocyty. Pacientky byly rozděleny do dvou skupin. Jedna skupina byla stimulována nízkými dávkami lidského choriového gonadotropinu, druhá skupina standardním protokolem s agonisty GnRH. Studie neprokázala statisticky významný rozdíl v počtu získaných oocytů, oplození ani počtu dosažených těhotenství mezi oběma skupinami Stimulace ovarií dvěma různými typy gonadotropinů Studie, která byla provedena v letech v polském Lublinu, se zabývá vlivem ovariální stimulace s použitím lidských a rekombinantních gonadotropinů. (Wdowiak et Bojar, 2015) Studie se zúčastnilo 221 žen ve věku od 25 do 35 let s BMI v rozmezí od 17 do 30 kg/m 2, u kterých byla provedena ICSI a u nichž embrya dosáhla stádia blastocysty. Stimulační protokol byl krátký. Hladiny FSH, LH a AMH (antimülleriánský hormon) byly měřeny 3. den cyklu předcházející ovulaci ještě před podáním léčiv. Hladina estradiolu v den podání rekombinantního choriového gonadotropinu (rhcg). Ovariální rezerva byla kromě jiného hodnocena na základě gonadotropinů (FSH a LH) a hladiny AMH. Ženám byly náhodně podávány dva typy FSH lidský, získaný z moči žen po menopauze (hfsh). Tento typ byl použit u 115 žen. Druhým typem byl rekombinantní FSH (rfsh), který byl použit u 106 žen. Následně všechny ženy dostaly injekci 250 µg rhcg. Růst embryí při kultivaci byl monitorován a v desetiminutových intervalech byly získávány jejich obrázky. Těhotenství bylo dosaženo u 77 žen, z nichž 42 bylo stimulováno hfsh a 35 pomocí rfsh. 144 žen neotěhotnělo, 73 z nich bylo stimulováno pomocí hfsh a 71 žen pomocí rfsh. Průměrné hladiny FSH a LH změřené před podáváním léčiv byly vyšší u žen, které neotěhotněly. Naopak hladiny AMH a estradiolu byly vyšší u žen, které otěhotněly. Druh použitého gonadotropinu ovlivňuje dynamiku vývoje embrya, vývojové fáze byly dříve pozorovány u žen stimulovaných pomocí rfsh. Nebyl nalezen statisticky významný rozdíl v počtu těhotenství mezi těmito dvěma skupinami. 28

29 4.4 Vliv krevní skupiny na stimulaci ovarií u pacientů se sníženou ovariální rezervou Cílem této studie je zjistit, zda existuje souvislost mezi krevní skupinou a odpovědí vaječníků na stimulaci u pacientů se sníženou ovariální rezervou (DOR). (Pereira et al. 2015) Studie se zúčastnilo 2575 pacientů v období od května 2010 do července Z těchto pacientů bylo 2329 Rh + a 246 Rh -. Do studie byly zařazeny ženy se sérovou hladinou AMH 1 ng/ml. Hodnocení proběhlo primárně na základě počtu zralých oocytů. Rozložení krevních skupin u pacientů bylo 36,8 % (A), 6,56 % (AB), 17,3 % (B) a 39,3 % (0). Byla provedena ovariální stimulace s cílem maximalizovat folikulární reakci. Ve studii se vliv krevní skupiny na stimulaci ovarií u pacientů s DOR nepodařilo prokázat. 4.5 AMH jako ukazatel ovariální rezervy Pro zjištění ovariální rezervy byly vyvinuty různé testy, které by měly pomoci identifikovat ženy, které jsou náchylné k ovariálnímu hyperstimulačnímu syndromu (OHSS). (Knez et al. 2015) AMH je důležitým ukazatelem ovariální rezervy. Je vylučován granulozními buňkami vaječníků. Prokázáno je, že hodnota AMH v séru koreluje s počtem antrálních folikulů ve vaječníku. Cílem studie bylo zhodnotit schopnost předvídat reakci na ovariální stimulaci na základě hodnoty AMH. Ovariální stimulace byla prováděna pomocí GnRH agonisty a GnRH antagonisty. Studie se zúčastnilo 623 žen v období od ledna 2011 do prosince Ve studii byla také hodnocena schopnost AMH předpovědět nadměrné a slabé odpovědi vaječníků na stimulaci. Jako nadměrná odpověď bylo považováno více než 19 získaných oocytů či zrušení léčebného cyklu vlivem vysokého OHSS rizika. Slabá odpověď byla stanovena na méně než 4 oocyty. Studie potvrdila prognostickou schopnost AMH předpovídat odpověď vaječníků na stimulaci. Průměrný počet získaných oocytů byl 8,4 ± 6,6. Nadměrná odpověď byla pozorována u 46 žen (7,4 %) a slabá odpověď u 162 žen (26,0 %). U 217 žen byl ke stimulaci použit GnRH agonista. Podíl pacientů podstupujících tuto stimulaci byl srovnatelný napříč všemi ovariálními odpověďmi. Bylo zjištěno, že hodnota AMH predikující nadměrnou ovariální odpověď nebyla závislá na protokolu použitém ke stimulaci. Stejný výsledek byl pozorován i u slabé odpovědi. Studie potvrdila pouze malou korelaci věku s počtem získaných oocytů. 29

30 Sharkokh et al. (2016) ve své studii hodnotili jak koncentrace AMG, počet antrálních folikulů a hodnota FSH koreluje s počtem klinických těhotenství, živě narozených dětí a odpovědí ovarií na stimulaci u různých věkových skupin pacientek (20 32 let, let, let). AMH, AFC i FSH jako ukazatelé klinického těhotenství ve výsledku selhaly. Pouze ve skupině let se AFC ukázal jako významný ukazatel počtu klinických těhotenství. AFC byl u žen s klinickým těhotenstvím významně vyšší. Byla prokázána korelace mezi hodnotou AMH i počtem antrálních folikulů s počtem získaných oocytů. Tyto ukazatelé jsou schopny predikovat počet oocytů nezávisle na věku pacientky. Byla prokázána také korelace mezi věkem a počtem oocytů. Se zvyšujícím se věkem počet oocytů klesá. Pro FSH nebyla prokázána korelace s žádným výsledkem asistované reprodukce. Obrázek 3: Struktura antimülleriánského hormonu (upraveno dle URL 3). 4.6 Prediktory pro nízkou a vysokou ovariální odpověď při aplikaci GnRH antagonisty Velmi nízká i velmi vysoká ovariální odpověď na stimulaci je spojena s nižšími počty těhotenství. (Broekmans et al. 2014) Vysoká ovariální odpověď může zvýšit riziko vzniku ovariálního hyperstimulačního syndromu. V průběhu posledních deseti let byly navrženy různé způsoby predikce nízké odpovědi vaječníků. Jako nejlepší prediktory byly vybrány počet antrálních folikulů a bazální hodnota FSH. Nedávno k nim by přidán AMH. Při predikci vysoké odpovědi bylo zjištěno, že AMH a AFC mají podobnou citlivost. V těchto výzkumech byla stimulace provedena především aplikací GnRH agonisty. Cílem této studie bylo identifikovat prediktory pro nízkou 30

31 a vysokou ovariální odpověď při aplikaci GnRH antagonisty. Silná reakce byla definována jako zisk 18 oocytů nebo zrušení cyklu v důsledku vysoké ovariální odpovědi. Nízká odpověď byla definována jako zisk méně než šesti vajíček či zrušení cyklu pro nízkou ovariální odpověď. Studie zahrnovala dva výzkumy: 1. Engage posouzení počtu těhotných po jedné injekci 150 mg corifollitropinu α během prvního týdnu stimulace. Do výzkumu bylo zařazeno 1506 pacientek s průměrným věkem 31,5 let a průměrnou hmotností 68,6 kg. U 137 pacientek se vyskytla vysoká ovariální odpověď (18,3 %) a u 95 nízká (12,7 %). 2. Expect identifikace prognostických faktorů pro ovariální odpověď. Pacientky byly rozděleny do dvou skupin u první skupiny byl před stimulací použit hormonální přípravek, u druhé ne. Výzkum zahrnoval 408 pacientek s průměrným věkem 31,7 let a průměrnou hmotností 64,8 kg. 38 pacientek mělo vysokou ovariální odpověď (19,1 %) a 32 pacientek mělo nízkou ovariální odpověď (16,1 %). Společné prognostické faktory pro vysokou a nízkou ovariální odpověď byl věk, AFC, hladina bazálního sérového FSH a LH. 4.7 Úspěšnost intrauterinní inseminace v závislosti na typu stimulace vaječníků I když je intrauterinní inseminace (IUI) jednou z nejstarších metod asistované reprodukce, její význam je stále diskutován. (Gomez et al. 2013) Tato studie zkoumá úspěšnost opakovaných intrauterinních inseminací v závislosti na typu stimulace vaječníků. Studie se zúčastnilo 2180 pacientů, u kterých bylo provedeno 5346 cyklů IUI. Průměrný věk zúčastněných žen byl 34,1 let (19 45 let). V 433 případech byla inseminace provedena během přirozeného cyklu cyklů bylo stimulováno rekombinantním FSH, 596 cyklů klomifencitrátem, 194 pomocí FSH získaným z moči a 103 cyklů pomocí hmg (lidský menopauzální gonadotropin). Stimulace pomocí klomifencitrátu byla široce využívána před 30 lety vzhledem ke snadnosti podávání, nízkým nákladům a přijatelnou mírou úspěšnosti. Gonadotropní přípravky se vyvinuly od močových extraktů k rekombinantním preparátům. Téměř 30 let byl jediným dostupným gonadotropinem hmg připravený z moči žen po menopauze, který zahrnoval FSH a LH. Poté byly vyvinuty přečištěné močové přípravky FSH odstraněním LH z moči. 15 let před IVF bylo dosaženo produkce rekombinantního lidského FSH pomocí genového inženýrství. Celková míra otěhotnění byla 10,1 % 31

32 (538/5346). Nejnižší počet otěhotnění byl ve skupině stimulované klomifencitrátem. U ostatních typů stimulací se počty otěhotnění příliš nelišily. Hughes et al. (1997) ve své metaanalýze shrnuli pozitivní efekt stimulace pomocí gonadotropinu oproti jiným typům stimulací. Cantineau et al. (2007) potvrdili srovnatelné výsledky. Stimulace pomocí gonadotropinu vedla k vyšším počtům těhotenství oproti stimulaci klomifencitrátem. Ecochard et al. (2000) neprokázali žádný významný rozdíl v počtu těhotenství mezi stimulací klomifencitrátem a stimulací pomocí hmg. Liu et al. (2016) také zkoumali vliv různých typů ovariální stimulace (klomifencitrát, letrozol, hmg, klomifencitrát v kombinaci s hmg a letrozol v kombinaci s hmg) na výsledky IUI. Zahrnuto bylo 8893 cyklů IUI, z nichž 2591 bylo bez ovariální stimulace a 6302 bylo stimulovaných. V cyklech bez stimulace byl počet těhotenství 9,3 % a počet živě narozených dětí 7,6 %. Stimulace pomocí letrozolu v kombinaci s hmg vedlo k významně vyššímu počtu klinických těhotenství (16,8 %) a živě narozených dětí (12,2 %). Výsledky ostatních typů stimulace se příliš nelišily od výsledků přirozených cyklů. Stimulace pomocí hmg i v kombinaci s letrozolem či klomifencitrátem vedla k vyššímu počtu dvojčat než při přirozeném cyklu (7,4 % vs. 0 %). Stimulace pomocí klomifencitrátu a letrozolu vedla k nižšímu počtu živě narozených dětí než v přirozeném cyklu. Nejnižší počet živě narozených dětí byl při stimulaci letrozolem (5,1 %). Bylo prokázáno, že u ovulujících žen postupujících IUI ovariální stimulace pomocí klomifencitrátu, letrozolu, hmg a klomifencitrátu v kombinaci s hmg nezvyšuje počet těhotenství ani živě narozených dětí na rozdíl od stimulace pomocí letrozolu v kombinaci s hmg. U neovulujících žen je stimulace nezbytná, avšak nebyl prokázán statisticky významný rozdíl v počtu těhotenství ani živě narozených dětí mezi stimulačními protokoly. Při srovnání výsledků ovariální stimulace a IUI mezi ovulujícími a neovulujícími ženami pro každý stimulační protokol, počet těhotenství a živě narozených dětí byl u neovulujících žen vyšší. Pouze pro stimulaci pomocí klomifencitrátu a klomifencitrátu v kombinaci s hmg byl rozdíl statisticky významný. Rashidi et al. (2013) neprokázali statisticky významný rozdíl v počtu klinických těhotenství, vícečetných těhotenství, potratů, živě narozených dětí a počtu ovariálního 32

33 hyperstimulačního protokolu mezi skupinami stimulovanými pomocí hmg v kombinaci s klomifencitrátem a rfsh v kombinaci s klomifencitrátem. Sun et al. (2016) ve své studii prokázali vyšší počet otěhotnění po intrauterinní inseminaci při stimulaci pomocí letrozolu společně s gonadotropinem oproti stimulaci samotným letrozolem. 4.8 Kvalita embrya po ovariální stimulaci u pacientek s nízkou ovariální odpovědí Tato studie byla provedena za účelem zhodnocení účinků kontrolované ovariální hyperstimulace na kvalitu embrya u mladých žen ve věku od 20 do 30 let. (Almog et al. 2014) Do studie bylo zahrnuto 39 mladých žen s nízkou ovariální odpovědí (zisk 5 a méně oocytů). Předpokládá se, že nižší šance na otěhotnění může být způsobena nejen sníženou ovariální rezervou z hlediska počtu oocytů, ale také z hlediska kvality oocytů. Cílem studie bylo srovnat kvalitu oocytů a embryí u pacientek s nízkou ovariální odpovědí s pacientkami s normální ovariální odpovědí ve stejném věku. Každá pacientka ve studijní skupině byla srovnávána se stejně starou pacientkou, která podstoupila IVF v důsledku mužské neplodnosti. Kvalita embrya byla určována na základě počtu buněk. Za kvalitní embryo byla považována embrya se 4 buňkami nebo 2. den se 6 8 buňkami, 3. den s fragmentací 0 20 %. Embryo s méně než třemi buňkami 3. den s fragmentací stupně 4 (45 %) bylo považováno za nekvalitní. Bylo zjištěno, že ženy s nízkou ovariální odpovědí mohou mít přiměřený počet kvalitních embryí ve srovnání s kontrolní skupinou, a proto výsledky počtu implantací a klinických těhotenství byly u obou skupin srovnatelné. Dokonce byl zjištěn vyšší počet oplození (87,2 % vs. 63,1 %) ve studijní skupině. 5 Kryokonzervace Kryokonzervaci ve své práci shrnuli Roztočil et al. (2011) jako uchování buněk zmrazením na teplotu 196 C, tedy na teplotu kapalného dusíku. Velmi důležitým bodem při kryokonzervaci je zmrazování a rozmrazování. Ochlazováním roztoků solí nejdříve vymrzá čistá voda jako čistý led, po dosažení eutektika struktura vznikající při současném tuhnutí dvou fází, směs vymrzá jako celek. Ochlazováním pod 0 C se zvyšuje koncentrace solí a rozpustných látek, mění se osmotický tlak a hrozí precipitace proteinů. Buňka je taktéž ohrožena mechanicky, protože v důsledku většího objemu 33

34 ledu než vody mohou jeho krystaly poničit buněčné membrány. K ochraně buněk se používají kryoprotektiva (dimetylsulfoxid, glycerol, sacharóza, propandiol), velmi pomalé zmrazování nebo naopak velmi rychlé zmrazení vitrifikace, která je v dnešní době dominantní. Zmrazování probíhá v pejetách, které se uchovávají v kryokontejnerech (kryobanky). Kryokonzervace spermatu dárcovské sperma nejprve je dárce vyšetřen a je provedeno sérologické vyšetření HIV. Získané sperma se zmrazí a nepoužívá se, po šesti měsících je dárce znovu testován na HIV protilátky. Při negativitě i druhého testu na HIV může být sperma použito. V České republice nesmí být jiné než kryokonzervované sperma použito. Dále se kryokonzervuje sperma mužů, kteří jsou léčeni cytostatiky, sperma manželů pacientky a sperma získané chirurgickým odběrem z varlete nebo nadvarlete (MESA, TESE). Kryokonzervace probíhá v roztoku s obsahem glycerolu. Pouze asi polovina spermií proces zmrazení a rozmrazení přežije. Rozmrazené sperma může být aplikováno na děložní hrdlo, do děložní dutiny nebo se uskuteční injekce spermie do oocytu. Kryokonzervace oocytů pomalé mražení probíhá v roztoku s propandiolem a sacharózou. Takto přežívá asi jen 20 % oocytů, které mohou být následně oplodněny. Kryokonzervace oocytů se provádí u žen před onkologickou léčbou, dále v případě nezískání spermií pro oplodnění v tentýž den jako oocyty. V jiných zemích je počet oocytů, které se oplozují, omezen a ostatní oocyty jsou zmrazeny. Po rozmrazení se oocyty oplozují in vitro, nejčastěji používaná metoda je ICSI. Kryokonzervace embryí probíhá v roztoku se sacharózou a propandiolem či dimetylsulfoxidem. Nejlepších výsledků je dosaženo kryokonzervací zygot. Po jejich rozmrazení je asi 80 % schopno se dále vyvíjet. Kryokonzervují se nadpočetná embrya a embrya, které nemohou být přenesena do dělohy v důsledku zdravotního stavu pacientky. Zygoty se po rozmrazení kultivují v inkubátoru, přenos do dělohy se provádí ve stáří dvou nebo tří dnů. 34

35 5.1 Kryoembryotransfer Kryoembryotramsfer (KET) je transfer embryí po jejich zmrazení a rozmrazení. Podmínkou uhnízdění embrya do děložní sliznice je sladění vývoje děložní sliznice s vývojem embrya. 1. Embryotransfer v přirozeném cyklu u žen, které mají pravidelný menstruační cyklus lze stanovit, kdy dochází k ovulaci. V tento den je proveden embryotransfer. Poté mohou být podávány hormony, které napomáhají uhnízdění embrya. 2. Embryotransfer v plně substituovaném cyklu v plně substituovaném cyklu se nejdříve ženě podávají estrogeny a poté estrogeny a gestageny. Estrogeny se podávají od druhého dne cyklu, poté se sleduje výška endometria, pokud je výška vyšší než 7 mm, navrhuje se přidání gestagenů na některý z následujících dní. Stáří embrya od oplození oocytů musí při rozmrazení odpovídat stáří endometria počítané od použití gestagenů. Po třech týdnech od počátku používání gestagenů je zjištěna hladina hcg, při pozitivním výsledku testu je kombinace estrogenů a gestagenů dále podávána. Pokud je test negativní, provede se kontrolní test a teprve při jeho negativním výsledku je ukončeno podávání estrogenů v kombinaci s gestageny. 5.2 Vitrifikace Vitrifikace v dnešní době převažuje nad pomalým mražením, protože jde o jednoduchou metodu, která nevyžaduje drahé vybavení ani velké množství vitrifikačního media (AL-Hasani et al. 2007, Kuwayama et al. 2005). Od prvního narození živého dítěte po vitrifikaci (Yoon et al. 2000) se výsledky vitrifikace značně zlepšily. Aflatoonian et al. (2010) dospěli k závěru, že v počtech otěhotnění dosahují čerstvá i vitrifikovaná embrya podobných výsledků. Hong et al. (1999) použili vitrifikaci při mražení vajíček s 90% úspěšností přežití. Liebermann et Tucker (2002) dosáhli vitrifikací přežití 80,6 % vajíček. Výrazné zvýšení počtu přežívajících vajíček bylo hlášeno při vitrifikaci oocytů v metafázi II metodou cryotop (vitrifikace v otevřeném systému) (Yoon et al. 2000). Kuwayama et al. (2005) popsali rozdíl mezi touto metodou a vitrifikací v uzavřeném systému (cryotip) a vyhodnotili cryotop jako 35

36 účinnější metodu pro mražení oocytů, embryí ve stádiu rýhování i embryí ve stádiu blastocysty. Antinory et al. (2007) srovnávali výsledky ART mezi zmraženými oocyty metodou cryotop a čerstvými oocyty. Počet klinických těhotenství po transferu embryí z nekonzervovaných oocytů byl 71 (28,6 %), počet živě narozených dětí byl 58 a počet potratů 13. Ze 463 zmražených oocytů přežilo 328 (99,4 %), 93 % z nich bylo úspěšně oplozených, počet těhotenství byl 32,5 %. V době sepsání studie byly narozeny 3 děti. Cobo et al. (2008) ve své studii také porovnávali výsledky ART mezi zmraženými oocyty metodou cryotop a čerstvými oocyty, oocyty však byly v tomto případě dárcovské. Počet oocytů, které rozmražení přežily, byl 96,7 %, 65,2 % pacientek otěhotnělo. V počtech oplození nebyl rozdíl mezi mraženými a čerstvými oocyty, kvalita embryí byla mezi skupinami také srovnatelná. Lidské spermatozoidy jsou velmi citlivé k osmóze způsobené kryoprotektanty (Isachenko et al. 2004a,b, 2012). Isachenko et al. (2005, 2011) tvrdili, že lidské spermie mohou být úspěšně vitrifikovány bez použití těchto látek. Chen et al. (2014) provedli vitrifikaci ve velmi malém objemu roztoku s malým počtem spermií bez použití kryoprotektantů metodou Cryotop. Část spermií mrazili také pomocí sacharózy, čerstvé spermie byly považovány za kontrolní skupinu. Výsledkem této studie bylo porovnání pohyblivosti, životaschopnosti spermií, míra poškození chromatinu a fragmentace DNA mezi skupinami. Mezi spermiemi mraženými bez kryoprotektantů a pomocí sacharózy nebyl statisticky významný rozdíl v pohyblivosti, avšak životaschopnost spermií byla statisticky vyšší v první skupině. Bylo prokázáno, že mražení oběma způsoby vede ke zvýšení poškození chromatinu a fragmentaci DNA spermií oproti čerstvým spermiím. Ve skupině bez kryoprotektantů však bylo toto poškození nižší než při mražení pomocí sacharózy. 5.3 Social freezing Jedná se o zmrazení pohlavních buněk ze společenských důvodů. (Petropanagos et al. 2015) Studie se zabývá zmražením oocytů jako ochrana proti poklesu plodnosti související s věkem. Zmražení oocytů probíhá velmi pomalu nebo naopak vitrifikací (ultrarychlé zmražení). Vitrifikace zahrnuje použití kryoprotektantů a ultrarychlé ochlazení, aby se zabránilo tvorbě ledových krystalů v buňkách oocytů. 36

37 Míra přežití oocytů po vitrifikaci a rozmrazení se pohybuje mezi %, počty oplození se pohybují mezi % a počet implantací je %. Podíl klinických těhotenství je 4,5 12 %. Tyto údaje jsou odvozeny z oocytů získaných od žen, které jsou mladší než 30 let. Počet klinických těhotenství klesá při vyšším věku matky v době zmražení. Zmražení vajíček je používáno už od roku 1990 u mladých žen s rakovinou, u nichž hrozí riziko neplodnosti po léčbě. Největší zdravotní riziko souvisí s nutností provést před zmražením ovariální stimulaci. Jedná se o hyperstimulační syndrom. Závažný hyperstimulační syndrom může způsobit krevní sraženiny, dušnost, bolesti břicha, dehydrataci a zvracení. Další rizika jsou spojená s IVF, které je prováděno po rozmrazení oocytů. Mezi tato rizika patří vícenásobné těhotenství, vysoký krevní tlak, předčasný porod a další. Ženy, které otěhotněly ve vyšším věku, jsou vystaveny riziku gestační diabetes (těhotenská cukrovka), preeklampsie, častější je také císařský řez a předčasný porod dítěte s nízkou porodní hmotností. Další nevýhodou je také finanční náročnost. Cobo et al. (2016) ve své studii zahrnující 1468 žen, které podstoupily zmražení vajíček ze společenských důvodů, prokázali 85 % přežití vajíček. U žen ve věku 35 let nebo mladších v době mražení vajíček, které měly zmražených 10 vajíček, byl počet živě narozených dětí 61 %. U žen ve věku 36 let a starších, taktéž s 10 vajíčky, byl počet živě narozených dětí pouze 30 %. Cobo et al. (2014) ve své studii srovnávali 804 těhotenství ze zmražených vajíček s 996 těhotenstvími z čerstvých vajíček. Nebyl nalezen žádný rozdíl v předčasných porodech, výskytu gestační diabetes, anemie či hypertenze. Mražení vajíček ze společenských důvodů má své výhody, ale i nevýhody. Přináší ženám více času k nalezení partnera a umožňuje jim oddálit mateřství do doby, než budou psychologicky, finančně i profesně připraveny na rodičovství (Goold et. Savulescu, 2009, Dondorp et. De Wert, 2009). Rizika přestavuje již zmíněný hyperstimulační syndrom, ale také infekce, intraperitoneální krvácení a ovariální torze (De Sutter et al. 2008, Grynberg 2013). Problémem však nejsou jen možné zdravotní obtíže, ale zejména se jedná o problém etický. 37

38 5.4 Kryokonzervace spermatu a jeho analýza před léčbou Hodgkinovy choroby Hodgkinova choroba je jedno z nejčastějších nádorových onemocnění u pacientů v reprodukčním věku. (Fitoussi et al. 2000) Terapeutický vývoj vedl k vysoké míře vyléčení, ale za cenu některých vedlejších účinků. Proto se profylaxe pozdějších účinků chemoterapie a radioterapie stala jedním z hlavních zájmů při léčbě Hodgkinovy choroby (HD). U mužů starších 16 let a mladších 50 let trpících HD a informovaných o sterilitě po léčbě HD byla vyhodnocována kvalita spermatu. Byly zkontrolovány spermiogramy pacientů, kteří podstoupili konzervaci spermatu před léčbou HD. Byla vyhodnocována koncentrace spermií, celkový počet spermií, pohyblivost a morfologie spermií. 94 mužů splnilo kritéria pro výzkum, jejich průměrný věk byl 27,5 let. 40 % z nich trpělo HD v I. stádiu, 38 % v II. stádiu, 15 % v III. stádiu a 4 % ve IV. stádiu. Polovina z nich již měla jedno či více dětí. Protože není zcela jasné, zda mají muži s HD abnormální sperma již před konzervací, cílem této studie bylo stanovit kvalitu spermií ještě před zmražením spermií a stanovit výsledky léčby neplodnosti s využitím rozmražených spermií. Druhotným cílem bylo zjistit, jestli se pacienti stali otci po skončení jejich léčby navzdory abnormálnímu spermatu. Téměř polovina pacientů měla abnormální sperma. Bylo zjištěno, že kvalita spermatu není závislá na stádiu onemocnění. 7 mužů požádalo o posouzení spermatu po skončení léčby. Žádný z nich neměl normální kritéria plodnosti (4 azospermie, 2 oligoastenozoospermie, 1 oligozoospermie). Ve výsledku se 18 mužů stalo otci celkem 29 dětí. 6 Metody výběru spermií pro oplození Běžně používané metody výběru spermií jsou založeny na jejich morfologii a motilitě (Azadi et al. 2014). Tyto metody ale nedokáží odhalit genetické poškození spermie. Proto jsou vyvíjeny další metody výběru založené na buněčných a molekulárních vlastnostech. Metodu IMSI (intracytoplazmatická morfologicky vybraná injekce spermie), která je založena na morfologickém stavu akrosomu, krčku, bičíku, jádra a mitochondrií (MSOME), vyvinuli v roce 2002 Bartoov et al. (Berkovitz et al. 2006). Další metoda výběru spermií je založena na vazbě spermie k hyaluronanu, který je přítomný v cumulus oophorus, nazývaná PICSI. Vazba je zprostředkována specifickým proteinem hlavičky spermie (Yudin et al. 1999, Cherr et al. 2011). Bylo prokázáno, že spermie vážící se k hyaluronanu, jsou zralé s normální morfologií hlavičky a intaktní DNA (Huszar et al. 2003). Hong et al. (2004) a Rijsdijk et Franken 38

39 (2007) vybrali spermie na základě jejich schopnosti projít cumulus oophorus. Dalším postupem pro výběr spermií je jejich vazba ke glykoproteinovému obalu vajíčka (Bastiaan et al. 2003, Franken et Oehninger, 2006). S použitím magneticky aktivovaného třídění buněk (MACS), které využívá specifické apoptotické markery, mohou být intaktní spermie separovány (Glander et Schaller, 1999). Fosfatidylserin (PS) je časný marker apoptózy (Said et al. 2006). Další možností testování spermií je hypo-osmotický test. Jedná se o funkční test spermií, který může být použit pro odlišení životaschopných a životaneschopných spermií (Check et al. 2001, Kordus et al. 2008). Zralé spermie mají elektrický náboj, který se nazývá zeta potenciál (Ishijima et al. 1999, Kirchhoff et Hale, 1996). Tento potenciál také umožňuje výběr vhodných spermií pro ICSI. Ze zmíněných metod je nejčastěji využívána PICSI, kterou se ve své práci dále zabývám. 6.1 PICSI PICSI je metoda, která napodobuje přirozený výběr zralých spermií bez fragmentace DNA uvnitř těla ženy. Spermie jsou při této metodě kultivovány v miskách s hyaluronanem (Saymé et al. 2013). Hutanu et al. (2015) ve své studii zkoumali, zda použití metody PICSI zvyšuje počty těhotenství. Do studie bylo zahrnuto 34 párů, v nichž muž trpěl oligospermií. Počty oplození se mezi PICSI a ICSI významně nelišily. Metoda PICSI však vedla k lepší kvalitě embryí. Počet klinických těhotenství byl 35,7 % (PICSI) a 30 % (ICSI). Amira et al. (2016) ve své studii, která zahrnovala 120 párů, srovnávali výběr spermií tradičním způsobem na základě morfologie a motility a metodou PICSI. Bylo zjištěno, že PICSI zvyšuje počty oplození a také kvalitu embryí. U pacientů s normozoospermií však toto zvýšení nebylo statisticky významné. Počet těhotenství byl při využití PICSI také vyšší. Parmegiani et al. (23), Ménézo et Nicollet (24), Worrilow et al. (25) také pozorovali pozitivní vliv výběru spermií metodou PICSI na počty oplození i těhotenství. Van Den Bergh et al. (2009) a Parmegiani et al. (2010) zjistili zlepšení kvality embrya při injekci spermie vybrané vazbou na hyaluronan. Majumdar et Majumdar (2013) nezjistili žádný rozdíl v počtech oplození, kvalitě embryí ani počtu klinických těhotenství mezi ICSI a PICSI skupinou u pacientů s nevysvětlenou neplodností. Ve skupině ICSI se však vyskytla vyšší míra potratů. 39

40 PICSI umožňuje výběr spermie zralé, bez chromozomálních abnormalit s neporušenou DNA, ale vliv na výsledky léčby neplodnosti z hlediska počtu oplození, implantací, těhotenství není zcela jasný, ale výběr spermie pomocí PICSI vede k získání kvalitnějších embryí než při konvenční ICSI. U pacientů s nevysvětlenou neplodností se PICSI nezdá být výhodnější než ICSI. Obrázek 4: Strukturní vzorec kyseliny hyaluronové (URL 4). Obrázek 5: Miska pro PICSI, ve které jsou spermie kultivovány s hyaluronanem (Žáková et al. 2012). 40