Název diplomové práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Název diplomové práce IZOLACE A CHARAKTERIZACE BIOLOGICKY AKTIVNÍCH POLYSACHARIDŮ BUNĚČNÝCH STĚN KVASINEK Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, PhD. Vypracoval: Bc. Martin Radimecký Brno 2010

2 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Izolace a charakterizace biologicky aktivních polysacharidů buněčných stěn kvasinek, vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně, dne.. Podpis řešitele..

3 Poděkování: Chtěl bych tímto poděkovat Dr. Miloši Beranovi a Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D., za odbornou pomoc a cenné rady při zpracování této diplomové práce.

4 Abstrakt: Tato diplomová práce na téma - Izolace a charakterizace biologicky aktivních polysacharidů buněčných stěn kvasinek - se v literární části věnuje β-glukanům vyšších hub a kvasinek, kvasinkám využívaným v potravinářství (zejména pekařským a pivovarským kmenům Saccharomyces cerevisiae a také Torulopsis ethanolitolerans), submersní kultivaci kvasinek a metodám stanovení složek kvasničných buněčných stěn (aktivních polysacharidů, proteinů apod.). Buněčná stěna dává kvasinkové buňce tvar, má silnou a pevnou strukturu. Je tvořena z 80 % polysacharidy a to především polymery mannosy (mannoproteiny), polymery glukosy (β-glukany) a polymery N-acetylglukosaminu (chitinu). Izolací těchto složek pomocí autolýzy, následné hydrolýzy v ředěném roztoku alkalického louhu a spektrální NMR resp. FTIR analýzou bylo identifikováno zastoupení konkrétních polysacharidů. Klíčová slova: β-glukany, kvasinky, FTIR a NMR spektroskopie Abstract: This diploma thesis - Isolation and characterization of biologically active polysaccharides of the yeasts cell walls - focuses on the literary part of the β-glucans of higher fungi and yeasts, yeasts used by the food industry (especially baking, and brewing strains of Saccharomyces cerevisiae, and also Torulopsis ethanolitolerans), submerged cultivation of yeasts and methods of determination of their components (active polysaccharides, proteins, etc.). Cell wall gives the yeast cell form, it has strong and solid structure. Polysaccharides constitute about 80 % of its composition and in particular mannose polymers (mannoproteins), glucose polymers (β-glucans) and N-acetylglucosamine polymers (chitin). Representation of specific polysaccharides was identified by autolysis with subsequent washing in alkali and NMR respectively FTIR spectroscopy. Key words: β-glucans, yeasts, FTIR and NMR spectroscopy

5 OBSAH: 1 ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Biologicky aktivní polysacharidy hub Chitin Glykogen β-glukany vyšších hub a kvasinek Lentinan Pleuran Grifolan Schizofyllan a SSG Skleroglukan Krestin a PSP (polysacharidpeptid) Pachyman Beta-glukan I Zymosan Kurdlan Mannanoligosacharidy (MOS) Imunomodulační funkce β-glukanů Kvasinky Morfologie Cytologie: Saccharomyces cerevisiae Pivovarské kvasinky Pekařské droždí Kvasničný kmen Torulopsis ethanolitolerans Výhody použití kvasničného kmene Torulopsis ethanolitolerans oproti klasické kvasničné biomase Saccharomyces cerevisiae: Kultivace vyšších hub Submerzní kultivace Způsob kontinuální kultivace kvasinek Torulopsis ethanolitolerans Kultivační zařízení Živné půdy Sterilizace živných půd a vzduchu: Sterilizace živného média a zařízení: Kontinuální sterilizace teplem:

6 Sterilizace média filtrací: Sterilizace bioreaktorů: Sterilizace vzduchu: Stanovení polysacharidů izolovaných z buněčných stěn kvasinek Stanovení mannanu a glykogenu Stanovení β-glukanů Nukleární magnetická rezonance (NMR) FTIR spektometrie CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODY Použité vzorky kvasnic Příprava kvasničné biomasy Torulopsis ethanolitolerans Příprava sedimentů kvasničných autolyzátů a β-glukanů Autolýza kvasničného mléka Torulopsis ethanolitolerans s přečištěním produktu alkalickou hydrolýzou Autolýza pekařských kvasnic s přečištěním produktu alkalickou hydrolýzou Izolace β-glukanů ze sušených pivovarských kvasnic alkalickou hydrolýzou Charakterizace získaných kvasničných produktů 13NMR spektometrií Charakterizace získaných kvasničných produktů FTIR spektometrií Stanovení α- a β-glukanů v izolovaných frakcích Stanovení sušiny, bílkovin a popele VÝSLEDKY A DISKUZE Charakterizace získaných produktů 13 NMR spektometrií Analýza 13 C NMR spekter izolovaných vzorků Charakterizace získaných produktů FTIR spektometrií Analýza FTIR spekter izolovaných vzorků ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK

7 1 ÚVOD Nejběžnějším zdrojem β-(1,3/1,6)-d-glukanů jsou (kromě hub a plísní) buněčné stěny pekařských a pivovarských kvasnic Saccharomyces cerevisiae. Hlavní složkou β-glukanů ze stěn sacharomycet je mírně větvený β-(1,3)-d-glukan s vysokou molekulární hmotností (DP kolem 1500, molekulová hmotnost ca 240 kda), s obsahem kolem 3 % větvení β-(1,6). Je to standardní partikulární kvasničný β-glukan. Struktura glukanů závisí na zdroji a způsobu jejich izolace. Přírodní β-glukany jsou charakterizovány primární strukturou, typem vazeb, rozpustností, stupněm větvení, molekulární hmotností, nábojem polymeru, konformací v roztoku (jednoduchá a trojitá šroubovice, náhodná smyčková konformace). Tyto vlastnosti významně ovlivňují biologickou aktivivtu β-glukanů. Glukany izolované z kvasinek mají oproti ostatním glukanům několik základních výhod jsou levnější, jejich zdroj je lépe definovatelný a mají větší biologickou aktivitu. Β-glukany bývají zařazovány mezi tzv. modifikátory biologické odpovědi (biological response modifiers, BRMs), které aktivují odpověď organismu na infekční či nádorové onemocnění. Imunostimulační aktivita je spojena s tříhelixovou konformací základního β-1,3 glukanového řetězce, větvení v pozici β-1,6 biologické účinky ještě zvyšuje. Β-glukany stimulují všechny základní typy imunitních buněk, především pak makrofágy, neutrofily a NK buňky. Aktivace těchto buněk následně spouští kaskádu metabolických dějů, které jsou nezbytné k udžení optimální činnosti imunitních reakcí. V minulosti bylo vyvinuto již mnoho metod pro izolaci a čištění β-glukanů. Většina z nich je založena na extrakci pomocí horkých alkalických hydroxidů, kyselin nebo jejich kombinací. Rozpouští se v nich bílkoviny i některé polysacharidické frakce. Zbývající nerozpustný zbytek je často označován jako glukan droždí. Za účelem zachování původní struktury glukanu je nutné zajištění minimální degradace řetězce, při vysoké čistotě produktu. Zdokonalování izolačních postupů k získání produktů s co možná úzce vymezeným chemickým složením, a využití moderních metod fyzikálně-chemické analýzy k jejich spolehlivé identifikaci, by mělo postupně vyřešit problém heterogenity a nestandardnosti různých přírodních β-glukanů. Přírodní původ z různých zdrojů, polymerní charakter, způsoby izolace, nerozpustnost nebo omezená rozpustnost preparátů, jejichž frakcionace je pak nereálná, to vše vede k tomu, že každý preparát β-glukanu, zejména partikulárního, je nutně 7

8 heterogenní. I když v řadě případů heterogenita β-glukanu z hlediska velikosti molekuly, větvení a krystalické nebo amorfní struktury zásadním způsobem nemění účinky β-glukanu in vivo, pro seriózní farmakologický výzkum i pro schvalovací řízení je to značnou komplikací. 8

9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Biologicky aktivní polysacharidy hub Vyšší houby jsou zatím neprobádaným zdrojem léčivých látek. U mnoha druhů vyšších hub však již byly zjištěny léčivé vlastnosti. Jednou ze skupin látek s léčivými účinky jsou polysacharidy, a to zejména glukany a heteroglukany. Tyto látky tvoří většinou buněčnou stěnu plodnic a mycelia. Hlívy (Pleurotus spp.) obsahují glukan Pleuran, houževnatec jedlý (Lentinus edodes) Lentinan, klanolístka (Schizophyllum commune) Schizofyllan. U lesklokorky lesklé (Ganodema lucidum) byl zjištěn β-d-glukan označovaný jako Gl-1. V outkovce pestré (Trametes versicolor) jsou obsaženy 2 polysacharidy, a to Krestin a PSP (polysacharidpeptid). Korálovec (Grifola frondosa) obsahuje glukan Grifon, pekařské a pivovarské kvasinky Saccharomyces cerevisiae obsahují Zymosan (NOVÁK, 2007). Již dlouhou dobu se lidé snaží učinit z hub zemědělskou plodinou srovnatelného významu, jako jsou obilniny, zelenina nebo ovoce (GARIBOVÁ, 1985). Vyšší houby, kvasinky a plísně produkují velké množství extra- a intracelulárních polysacharidů. Zejména β-glukany patří mezi nejvíce probádané účinné látky hub, ale také kvasinek a bakterií. V poslední době se studium glukanů zaměřuje na brazilský žampión (Agaricus brasiliensis). Experimenty in vitro i klinické pokusy prokázaly, že konzumací plodnic bazidiomycet lze předcházet onkogenezi, dále byla prokázána protinádorová aktivita houbových glukanů. Glukany působily preventivně proti vzniku metastáz. Mechanismus působení glukanů ještě není přesně znám, ale je nepochybné, že polysacharidy z hub neatakují rakovinné buňky přímo, ale aktivují imunitní systém (VELÍŠEK, 2002). Buněčná stěna většiny hub je složená z chitinu, glykoproteinů a β-glukanů. Biologicky aktivní látky jsou obsaženy v plodnicích, myceliu i kultivačním mediu. Hlavními zdroji glukanů jsou též kvasinky (zejména v Evropě a USA), obiloviny (Kanada) a mořské řasy (Francie). Důvody jsou víceméně tradiční, částečně dané větší dostupností jednotlivých zdrojů. Na Dálném východě se využívá hub jako lidového léčiva. Ve východní asijské medicíně má velmi dlouhou tradici konzumace různých léčivých hub (shiitake, maitake, reishi ad.). O houževnatci jedlém (Lentinus edodes) neboli shiitake, pomáhající uchovávat lidské zdraví, psal už čínský lékař z období dynastie Ming. V 80. letech byly v Japonsku po dlouholetém zkoumání biologických 9

10 efektů, zejména protinádorových účinků těchto hub, jako hlavní příčiny nespecifické imunomodulace zjištěny β-glukany. Lentinan se tam od té doby používá jako lék proti rakovině. Počátky tohoto výzkumu jsou spojeny se jménem Goro Chihary z University v Kawasaki, který izoloval β-glukan z houby shiitake (Lentinula edodes), nazval jej lentinan (NOVÁK, 2007). Obr. 1: Vzorec houbového β-glukanu (VELÍŠEK, 2002) Kanada zase hledá možnosti jak komerčně využít vedlejší produkty vznikající při přípravě mouky. Většina výzkumů se však stále přiklání ke glukanům izolovaným z droždí. V 70. letech 20. století byl znovu nalezen širokou veřejností žampión mandlový (Agaricus brasiliensis). Ví se o něm ze spisů dávné říše Inků, kde byl připravován jako oblíbená pochoutka. Dnes lze houbu v přírodě nalézt jen na malém území v Brazílii a to v okolí malé vesnice Piedade u Sao Paula. Momentálně je žampión mandlový pěstovaný pouze odborníky a nadále intenzivně zkoumán. Tato houba s exotickou chutí obsahuje významné léčivé látky - především β-d-glukany, které mají odlišnou účinnost od ostatních houbových glukanů. Podařilo se prokázat, že výtažky z tohoto žampionu zabránily vývoji virů pronikajících do tkání u pokusných zvířat. Jejich účinnost je zaměřená proti řadě solidních (pevných) nádorů (prostaty, hltanu, vaječníků, jater, plic, prsu, žaludku). Aplikací výtažků ze sušených plodnic se několikanásobně zvýšila aktivita specializovaných lymfocytů ( Výskyt β-glukanů v dalších druzích hub je momentálně ve fázi zkoumání. Uvádí se, že výraznější procento zastoupení β-glukanů by mohlo být obsaženo např. v kukmáku sklepním (Volvariella volvacea), rosolovce bílé (Tremella alba) či rosolovce 10

11 řasotvorné (Tremella fuciformis). Lichenin je polysacharid lišejníku islandského (Cetraria islandica acharius). Rozpouští se v horké vodě a po chemické stránce je to lineární glukan podobný celulóze, složený ze β-d-glukósových jednotek ( Chitin Chitin je v přírodě druhou nejčastěji se vyskytující organickou sloučeninou, hned za celulosou. Je základní stavební složkou schránek (exoskeletu) korýšů, hmyzu a dalších bezobratlých živočichů. Obsahují jej též řasy, houby, kvasinky a bakterie. Obvykle je asociován s bílkovinami (VELÍŠEK, 2002). Obr. 2: Chitin (VELÍŠEK, 2002) Chitin je homopolymer β-(1,4) vázaných N-acetyl-D-glukosaminových jednotek (PAMPLONA, 2004; VOET, 2005; VODRÁŽKA, 2007). Společně s chitosanem má široké uplatnění v průmyslu a medicíně. Ve stěně kvasinek se krom jiného nachází glukosamin. Zhruba 10 % jeho podílu se vyskytuje ve formě chitinu, nevětveného polyglykanu. Chitin je obsažen převážně v jizvách, které vznikají ve stěnách kvasinek jako následek oddělení nových buněk. Komerční chitin se získává především z odpadních produktů vzniklých při zpracování mořských živočichů. V potravinářství se používá jako emulgátor (pro margaríny), stabilizátor emulzí, zahušťovadlo (zvýšení viskozity), stabilizátor pěn, želírující činidlo. Své uplatnění nachází též ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu (VELÍŠEK, 2002; JANDEROVÁ a BENDOVÁ, 1999). 11

12 Chitin je ve vodě je nerozpustný a poměrně odolný vůči chemickým činidlům. Rozkládá se pouze bakteriálními enzymy chitinasami, enzymem lysozymem a koncentrovanými kyselinami (HOZA, KRAMÁŘOVÁ, 2005). Alkalickou hydrolýzou chitinu vzniká chitosan. Chitosan obsahuje 5-25 % N-acetyl-glukosaminových a % glukosaminových jednotek. Je také jako chitin nestravitelný, avšak výrazněji snižuje hladinu cholesterolu v krevním séru a v játrech. Chitosan, diacetylovaná forma chitinu, se používá k výrobě přípravků na snížení hmotnosti (ČOPÍKOVÁ, 2005). Chitosan se částečně rozpouští v kyselém prostředí, tedy i v žaludeční šťávě, jeho volné primární aminoskupiny se protonizují a vzniklá látka dává takto obměněnému chitosanu vlastnosti blízké cholestyraminu. Cholestyramin (styrendivinyl-benzenový kopolymer) váže jako neresorbovatelný anex v tenkém střevě žlučové kyseliny (těm se přisuzuje karcinogenní účinky na tlusté střevo). Narušuje jejich enterohepatální oběh a snižuje tak hladinu cholesterolu v plazmě (OPLETAL, 1993). Chitin a další složky kvasničných stěn (beztvaré složité cukry glukany a mannany) ve svých molekulách obsahují značné množství vazebných míst pro kovy, které se mohou v houbové vláknině uvolňovat anebo pevně vázat (LEPŠOVÁ, 2001). Houby jsou pro člověka jen částečně stravitelné, protože lidský organismus není zcela schopen štěpit právě chitin (HOZA a spol., 2005) Glykogen Glykogen se skládá z molekul D-glukosy spojených glykosidickými vazbami α-(1,4) a α-(1,6), je tedy α-glukanem. Na každých 8 až 12 glukosylových zbytků jsou vazbou α-(1,6) vázány postranní řetězce dalších α-(1,4) glukanů podobně jako v amylopektinu škrobu. Glykogen je však více větvená a strukturně více kompaktní molekula. Tento vysoce větvený polymer glukosy je uložen zejména ve svalech a játrech živočišných buněk, ale je též obsažen ve vyšších houbách, plísních, kvasinkách a bakteriích (VELÍŠEK, 2002; KODÍČEK, 2007). Glykogen je hlavní zásobní látka v kvasinkové buňce. Je obsažen v cytoplazmě i v jádře zejména ve formě dispergovaných granulí o velikosti nm, avšak bývá také přítomen v rozpustné formě (VRANÁ, 1986). Akumuluje se hlavně při přechodu buněk do stacionární fáze nebo při nevyváženém růstu, kdy má buňka k dispozici zdroje uhlíku, ale nedostatečný přísun dusíkatých zdrojů či kyslíku (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). 12

13 2.1.3 β-glukany vyšších hub a kvasinek Polysacharidy nazývané β-glukany, také β-(1,3/1,4)-d-glukany nebo β-glukany se smíšenými vazbami (dříve také licheny) patří mezi heteroglukany. Nacházejí se v buněčných stěnách vyšších rostlin a ve větším množství v semenech některých rostlin. Příbuzné polymery, které se také nazývají β-glukany nebo β-(1,3/1,6)-d-glukany nebo β-glukany se smíšenými vazbami, syntetizují vyšší houby, plísně a kvasinky. Na β-glukany se v malém množství váží arabinosylové nebo xylosové zbytky. Relativní molekulová hmotnost β-glukanů se podle původu pohybuje v širokých mezích od desítek do tisíců kda (VELÍŠEK, 2002). Fibrilární β-(1,3)-glukan vytváří v kvasinkové buňce vnitřní vrstvu buněčné stěny, přilehlou k plasmatické membráně, amorfní β-(1,6)-glukan převládá ve střední části stěny. Oba polymery lze při izolaci odlišit podle jejich rozpustnosti v alkáliích a kyselinách. β-(1,3)-glukan je rozpustný v alkáliích, interaguje však s chitinem a poté se stává zcela nerozpustným. Ve stárnoucích buňkách chitinu přibývá, zastoupení nerozpustné formy tudíž roste také. β-(1,6)-glukan je rozpustný pouze v kyselinách (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). Zajímavým zdrojem glukanů je i houba housenice čínská (Cordyceps sinensis). Netypická houba Sečuanu, Tibetu a Himalájí parazituje na larvách můry Hepialus armoricanus patřící do čeledi hrotnokřídlecovitých (Hepialidae). Vyhovují ji nadmořské výšky m, což je spojeno s trvale nižšími teplotami, řídkým vzduchem a četnými srážkami. Sušina housenice čínské obsahuje až 16 % β-glukanu. Mycelium obsahuje β-(1,3),(1,4)-d-glukan ( Agaricus blazei (himematsutake nebo též Cogumelo de Sol) je žampion vyskytující se v Brazílii. Často je používána pouze zkratka ABM (CAMELINI et al, 2005). Vědecké studie prokázaly, že ve 100 g žampiónu brazilském je obsaženo asi 43 mg β-glukanů. Byla též potvrzena antikarcinogenní aktivita této houby (experimenty in vitro) (JABLONSKÝ, 2005). Obsah β-glukanů ve 100 g sušiny pečárky dvouvýtrusé (Agaricus bisporus) bývá okolo 20 mg, avšak ve směsi sušených tzv. pravých hřibů až v rozmezí mg a v pěstované hlívě ústřičné kolem 1600 mg. Obsah β-glukanů se významně snižuje tepelnou úpravou (např. grilováním až na 67 %), hydratací sušených hub i zmrazováním na 88 % (KALAČ, 2008). 13

14 Lentinan Lentinan se nachází v houževnatci jedlém (Lentinus edodes), známém jako shiitake nebo též xianggu. Houževnatec pochází z Japonska, zde i v ostatních zemích jihovýchodní Asie se pěstuje již více než 2000 let. Patří mezi nejprozkoumanější a nejvýznamnější houby, které obsahují β-glukany. Molekulární vzorec lentinanu je (C 6 H 10 O 5 )n. Skládá se z β-(1,3)-d-glukanové kostry s β-(1,6)-glukanovými postranními řetězci. Molekulová hmotnost lentinanu je přibliţně 500 kda, stupeň větvení je 2/5 a terciární struktura lentinanu je pravotočivý trojnásobný helix. Ve 100 g sušiny shiitake je obsaženo 220 mg β-glukanu ( Izolace nerozpustného skeletálního β-glukanu shiitake je založena na alkalické hydrolýze. Nerozpustný zbytek obsahuje β-(1,3/1,6)-d-glukan s chitinem a malé množství nerozložené bílkoviny. Pomocí strukturální analýzy s použitím metylační analýzy a enzymu β-1,3-glukanázy lze popsat strukturu tohoto glukanu (často bývá heterogenní) (SHIDA et al., 1981). Celá řada čínských patentů (CN , CN nebo CN ) popisuje výrobu lentinanu rozpustného β-glukanu Pleuran Je β-glukan izolovaný z hlívy ústřičné (Pleurotus ostreatus), má rozvětvenou strukturu skládající se z hlavního řetězce tvořeného β-d-glukopyranosovými jednotkami vázanými vazbami 1,3. Ve 100 g sušiny hub rodu Pleurotus spp. je obsaženo až 414 mg β-glukanu. Hlíva patří do skupiny hub saprofytujících na dřevu (dřevokazné houby), je to u nás nejběžněji pěstovaná houba (GARIBOVOVÁ, 1985). V Číně se ročně vypěstuje více než 85 % celosvětové produkce hlívy ústřičné. Pěstuje se již od počátku našeho století, ale velkovýroba byla zahájena až v šedesátých letech minulého století, nejprve v Číně a Americe, později v dalších zemích (Maďarsko aj.) (KOPÁČOVÁ, 2009). Mnoho patentů popisuje izolaci nerozpustného skeletálního β-glukanu pleuranu z plodnic hlívy ústřičné (např. CZ293310, WO , CS274918,WO a několik dalších). Postupy jednotlivých bývají podobné alkalická hydrolýza, filtrace, promývání, dehydratace organickým rozpouštědlem, vakuové sušení či lyofilizace. 14

15 Grifolan Grifolan, který je extrahován z houby zvané Grifola frondosa (trsnatec lupenitý, též maitake), stimuluje produkci cytokinů z makrofágů. Je vlastně β-glukanem s molekulovou hmotností 4, daltonů (OKAZAKI et al., 1995). Skládá se z β-(1,3)-d-glukanové kostry s β-(1,6)-glukanovými postranními řetězci. Molekulová hmotnost grifolanu je přibližně 500 kda, stupeň větvení je 1/3 a terciární struktura je trojnásobný helix. Maitake se v Japonsku trvale používá jako doplněk stravy v dávkováních 3-7 gramů 3-5 krát denně s přesvědčením o jejích preventivních a imunostimulačních účincích. Indikuje se též u osob s rakovinou nebo jako podpora organismu při chemoterapeutické léčbě ( Schizofyllan a SSG Jsou biologicky aktivní látky, β-glukany klánolístky obecné (Schizophyllum commune). Schizophyllan a SSG obsahují β-(1,3)-d-glukanové kostry s β-(1,6)- glukanovými postranními řetězci, mají terciární strukturu trojnásobného helixu. Stupeň větvení schizophyllanu je 1/3. V Japonsku se používá při léčbě leukémie a k prevenci nádorových onemocnění, zejména v oblastech, kde za 2. světové války explodovaly jaderné nálože (FERENČÍK, 2002) Ganopoly Ganopoly jsou β-glukany Ganodermy lucidum (lesklokorka lesklá, reishi či ling zhi). Čínští léčitelé používají tuto kouzelnou rostlinu již více jak 2000 let. Soudobé výzkumy potvrzují pozitivní účinky Ganodermy na lidské zdraví. Reishi má protizánětlivé, protialergické, protivirové, protirakovinné účinky a dokáže stimulovat imunitu. K terapeutickým účelům se nejčastěji používá červená varianta reishi. Lesklokorka se vyskytuje především na mrtvých větvích listnatých stromů. Vyskytuje se v oblastech Asie, Jižní Ameriky, Evropy a Severní Ameriky. Nejpodstatnějšší farmakologický význam mají vlastnosti polysacharidů. A to zejména β-d-glukanů. Některé z nich jsou kovalentně spojeny s peptidy. Byly u nich prokázány účinky na zvyšování odolnosti organismu a ničení volných radikálů. Také napomáhají k tvorbě buněk typu B, produkujících protilátky. Zvyšují počty makrofágů napomáhajících správné funkci leukocytů. Vykazují také podíl na zdokonalování syntézy nukleových kyselin (KWIECINSKI, 1999). 15

16 Skleroglukan Skleroglukan je kapsulární polysacharid produkovaný některými nižšími houbami rodu Sclerotium - např. hlízečka hlíznatá (Sclerotinum glucanicum). Je tvořen lineárním řetězcem složeným z β-(1,3) vázaných D-glukosových zbytků s postranními glukosovými zbytky vázanými vazbou β-(1,6). Jako průmyslový zdroj slouží i S. roefsii. Rody Sclerotinia, Stromatinia, Botrytis a Corticium, které produkují polysacharidy podobné skleroglukanu, mohou být dalšími zdroji. Příbuzné polysacharidy jsou také složkami buněčných stěn a zásobními polysacharidy vyšších hub a kvasinek (VELÍŠEK, 2002). Skleroglukan je dobře rozpustný ve vodě. Disperze mají vysokou viskozitu, jsou stabilní v širokém spektru hodnot ph a za vyšších teplot. Disperze o koncentracích vyšších než 1,5 % tvoří gely (VELÍŠEK, 2002) Krestin a PSP (polysacharidpeptid) Jsou polysacharidy obsažené v outkovce pestré (Coriolus versicolor). Tato houba je především v Japonsku známá pod svým druhým názvem yunzhi. Účinná složka mycelia je β-glukan s prokázanými pozitivními účinky na lidské zdraví (JABLONSKÝ, 2005) Pachyman Pachyman je hlavním polysacharidem pórnatky kokosové (Poria cocos), houby rostoucí na kořenech některých borovic v nejteplejších oblastech Číny, Japonska a Jižní Ameriky (kde z ní místní indiáni připravovali zvláštní druh chleba) (PRAGON, 2009). Tento polysacharid je lineární β-(1,3)-d-glukan (DING, 2001) Beta-glukan I Beta-glukan I (označovaný zkratkou AAG) je β-glukan izolovaný z Auricularie auricula judae (bolcovitka bezová neboli Jidášovo ucho) (ZHAOCHENG et al., 2000). Mezi komerčně nejvíce využívané houby s dokumentovanými léčivými účinky dále patří Hericium erinaceus (korálovec ježovitý), Flammulina velutipes (penízovka sametonohá) a Agaricus blazei (žampión brazilský). V Japonsku byl Hericium erinaceus léta uznávanou léčivou houbou, která pomáhala s obtížemi trávicího ústrojí ( 16

17 Zymosan Zymosan je směsí polysacharidů, izolovaný ze stěn kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Tento nerozpustný komplex obsahuje β-glukan, mannan a bílkovinu. Byl především zkoumán v Americe a také Evropě, předmětem pozorování byly zejména jeho imunomodulační účinky. Hlubším zkoumáním zymosanu se detekovala primární účinná složka - β-glukan. Mnohé významné práce v této problematice provedl Nicholas R. DiLuzio z University v New Orleans (NOVÁK, 2007). Od roku 1940 existuje na trhu i lék s názvem Zymosan (KOPÁČOVÁ, 2009). Kvasničný β-glukan je schopný absorbovat mykotoxiny (zearalenon, aflatoxin B1, deoxynivalenol, ochratoxin A, patulin), pravděpodobně prostřednictvím vodíkových můstků a van der Waalsových sil. Tento efekt β-glukanů je významný zejména u hospodářských zvířat. Doplňkem stravy obsahující β-glukany, mohou být sušené pivovarské kvasnice, veřejnosti již dobře známé jako Pangamin (NOVÁK, 2007) Kurdlan Kurdlan je nerozpustný mikrobiální exopolymer složený téměř výhradně z β-(1,3)-glukosidických vazeb. Jednou z jedinečných vlastností je, že ve vodné suspenzi může být kurdlan tepelně indukován k výrobě odolných gelů, které se po opětovném zahřátí již nevrátí do kapalného skupenství (HARADA et al., 1968). To upoutalo pozornost potravinářského průmyslu. Kromě toho je kurdlan (β-glukan) dobře znám ve vědecké komunitě, pro své imunostimulační účinky. Kurdlan byl objeven v roce 1966 profesorem Haradou a spolupracovníky, byl pojmenován díky své schopnosti srazit se při zahřátí. V této době, Harada a jeho kolegové pracovali na identifikaci organismů schopných využit petrochemických materiálů a izolovaných z Alcaligenes faecalis var.myxogenes 10C3 z půdy. U tohoto organismu bylo zjištěno, že může růst na médiu obsahujícím 10 % ethylenglykolu jako jediný zdroj uhlíku (HARADA et al., 1968) a že produkuje nový β-(1,3)-glukan, který obsahuje asi 10% kyseliny jantarové a který byl pojmenován jantaroglukan. Harada a kol. byli také schopni odvodit spontálního mutanta, který produkuje hlavně vodou nerozpustný neutrální polysacharid β-(1,3)- glukan, který neobsahoval jantaroglukan. Vědci z Takeda Chemical Industries Ltd (Osaka, Japonsko) sehráli průkopnickou roli v oblasti výzkumu i vývoje kurdlanu. Již v roce 1989 bylo schváleno prodávání kurdlanu pro potravinářské využití v Koreji, Tchaj-wanu a Japonsku. Po získání povolení v prosinci Pod obchodním názvem PureglucanTM byla 17

18 zahájena jeho distribuce na trhu v USA. Sloužil k lepšímu zpracování potravin, stabilizaci, jako zahušťovadlo nebo texturní modifikátor pro použití v potravinách. Žádné důkazy o toxicitě Pureglucanu nebyly pozorovány. Struktura: chemické i enzymatické analýzy potvrdily, že kurdlan je homopolymer D - glukózy spojený β-(1,3) vazbami (SAITO et al., 1968). Kurdlan má průměrný stupeň polymerace (DP) přibližně 450 a je nerozvětvený. Nakata et al. (1998) uvádí, že průměrná molekulová hmotnost kurdlanu v 0,3 M NaOH je v rozmezí 5, až 2, daltonů. Konformace v roztoku: mnoho pokusů zkoumání struktury kurdlanů bylo prováděno ve vodném prostředí. Byly zjištěny 3 druhy konformací rozpustného kurdlanu jednoduchá šroubovice, trojitá šroubovice a neuspořádaná konformace (tzv. cívka). Ogawa et al. (1972) zkoumal konformační chování kurdlanu v alkalickém roztoku měřením optické rotace rozptylu, vlastní viskozity a průtok birefringence. V nízké koncentraci hydroxidu sodného měl kurdlan spirálovitou ( správnou ) konformaci, ale významné konformační změny nastaly při koncentraci NaOH 0,19-0,24 M. V alkalickém roztoku 0,2 M NaOH je kurdlan kompletně rozpustný a nachází se v neuspořádané ( náhodné ) konformaci, ale po neutralizaci polymer přijímá konformaci správnou, která se skládá z jednoduchých a trojitých šroubovic. 13 C-NMR měření podporuje toto zjištění (SAITO et al., 1977). Zvýšená koncentrace soli posune bod přechodu z uspořádané do neuspořádané konformace do vyššího alkalického stupně (CHUAH et al., 1983). Obr. 3: Kurdlan (VELÍŠEK, 2002) 18

19 Tab. 1: Některé β-(1,3)-d-glukany s významnou protinádorovou aktivitou (VELÍŠEK, 2002) Název β-glukanu Zdroj Latinský název Český název pachynan Poria cocos pórnatka kokosová zymosan Saccharomyces cerevisiae kvasinka pivní lentinan Lentinus edodes houževnatec jedlý (shii-také) pleuran Pleurotus ostreatus hlíva ústřičná skleroglukan Sclerotium glucanicum hlízenka obecná tylopilan Tylopilus felleus hřib žlučník (podhřib žlučový) flammulin Flammulina velutipes penízovka sametonohá grifolan Grifola frondosa trsnatec lupenitý ganopoly Ganoderma lucidum lesklokorka lesklá schizofyllan Schizophyllum commune klanolístka obecná β-glukan I Auricularia auricula - judae bolcovitka bezová (ucho jidášovo) Mannanoligosacharidy (MOS) Původně se předpokládalo, že droždí obsahují přibližně 7,8 % MOS na základě zjištění Brady et al. (1994), že buněčné stěny Saccharomyces cerevisiae tvoří 25% sušiny a obsahují 31 % mannanu. Avšak na základě analýzy manózy obsahu kvasnic, byl obsah MOS zjištěn 5,2 %. Mannanoligosacharidy a další probiotika byly nedávno navrženy jako možné alternativy k antibiotikům u mladých prasat. Některé studie prokázaly, že MOS jsou stejně účinné jako ostatní antimikrobiální růstové doplňky stravy (DAVIS et al., 1999, PETTIGREW, 2000), zatímco jiné účinnost neprokázaly (CROMWELL et al. 1991, DAVIS et al., 2000). Mannanoligosacharidy (MOS) z buněčných stěn kvasinek byly zkoumány s ohledem na jejich hodnotu v imunitní modulaci (NEWMAN A NEWMAN, 2001; O'QUINN et al., 2001) a ve snížení kolonizace střevních patogenů (NEWMAN, 1994). Přestože výsledky byly poněkud nekonzistentní, některé výzkumy naznačují, že MOS mohou zvýšit růst výkonnosti u mladých prasat (DAVIS ET AL., 1999, PETTIGREW, 2000). Vzhledem k možnosti budoucího antibiotického omezení a potenciální výhody MOS, účinky sušených pivovarských kvasnic jako zdroje MOS je třeba dále zkoumat, nejen u prasat. Zda účinnost MOS je ovlivněna stravou okyselování není znám (WHITE et al., 2002). 19

20 2.1.5 Imunomodulační funkce β-glukanů Imunomodulační polysacharidy (zejména β-glukany), jsou dnes podrobovány velice intenzivním preklinickým a klinickým studiím prováděným v mnoha zemích světa. Imunostimulační aktivita je asociována s tříhelixovou konformací základního řetězce, přidání dalších postranních β-1,6 glykosidových řetězců potom biologické účinky zvyšuje. Řada studií však prokázala, že i když tyto fyzikálněchemické vlastnosti ovlivňují biologickou aktivitu glukanů, mnohem důležitější je jejich čistota. Četné práce identifikovaly jako imunomodulační aktivní složku β-1,3-glukan. Následně jiné studie potvrdily, že β-1,3-glukany (buď rozpustné nebo partikulární), vykazují imunostimulační vlastnosti, včetně antibakteriální a antitumorové aktivity. V této době jsou glukany považovány za jedny z nejvíce efektivních modifikátorů biologické odpovědi (VĚTVIČKA, 2007). Browder et al. popsal výrazný pokles septických onemocnění (u pacientů léčených β-glukanem se významně snížily infekce v organismu). U stejného typu glukanu bylo také prokázáno, že snížuje infekce stimulované resorpcí v kostní dřeni. Pozitivní účinky byly zjištěny u nemocných po kardiopulmonálním bypassu a inhibice antivirové aktivity byly možné nalézt u HIV infikovaných pacientů. Některé β-glukany jsou běžně používány u pacientů v tumorové immunoterapii. Kromě imunomodulačního efektu β-glukanů, bylo prokázáno, že také snižují hladinu cholesterolu u hypercholesterolemických pacientů. Různé druhy β-1,3-glukanů prokazatelně vytváří vazbu glukanových receptorů na monocytech, makrofázích, neutrofilech a NK buňkách (VĚTVIČKA, 2007). Další výhodou glukanů je skutečnost, že všechny dostatečně vyčištěné polysacharidické imunomodulátory se vyznačují velmi nízkou toxicitou (např. pro myš lentinan má LD 50 > 1600 mg/kg). Přes podrobné znalosti o činnosti mnoha glukanů, máme k dispozici omezené informace o mechanismech ústně podaných glukanů. Dokonce se tvrdilo, že perorálně podávané glukany nemají aktivitu vůbec žádnou. Teprve v poslední době se informace o mechanismu účinku perorálně podaných glukanů značně rozšířili (VĚTVIČKA, VĚTVIČKOVÁ, 2008). Omezený počet prací zabývajících se problémem přenosu glukanu přes gastrointestinální trakt hlavně zaměřit na to, že zářivky-označené glukanu může detekovány v buňkách izolovaných z různých tissues. Vazba β-glukanu na specifické receptory (buď CR3 nebo Dectin-1) aktivuje makrofágy. Aktivace spočívá v několika vzájemně propojených procesů, včetně větší chemokinese, chemotaxe, migrace 20

21 makrofágů, degranulace vedoucí ke zvýšené expresi adhezivní molekul a adhezi k endotelu. Kromě toho, β-glukan spouští intracelulární procesy, charakterizované respiračním vzplanutím po fagocytózní invazi do buňky (tvorba reaktivních forem kyslíku a volných radikálů), zvýšení obsahu a činnosti hydrolytických enzymů, a signalizační procesy vedoucí k aktivaci jiných buněk a sekreci cytokinů (VĚTVIČKA, VĚTVIČKOVÁ, 2008). 2.2 Kvasinky Morfologie Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní organismy, náležící mezi houby (Fungi). Netvoří jednotnou taxonomickou skupinu. Tyto mikroskopické houby rostou převážně v koloniích vytvořených z jednotlivých buněk s průměrem 3 až 15 µm. Tvar buněk je dán rodovou příslušností, ale ovlivňuje ho do jisté míry i způsob kultivace. Teplotní rozmezí, ve kterém jsou kvasinky schopny růst, je v intervalu -2 až 48 C. Psychrofilní kvasinky se pomnožují při teplotách 2 až 20 C a patří sem druhy rodu Cryptococcus a Candida. Největší skupina kvasinek je mezofilní, to znamená, že jejich růst a rozmnožování probíhá od 0 do 48 C. Termofilní kvasinky se nemnoží pod 20 C a obvykle se jedná o potenciální patogeny pro člověka (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy, některé disacharidy a případně i trisacharidy na etanol a oxid uhličitý. Tvar buněk souvisí se způsobem vegetativního rozmnožování, jež se děje buď pučením, nebo dělením. Nejčastěji je tvar krátce elipsoidní, případně vejčitý až kulovitý. Některé rody tvoří dlouze protáhlé buňky (Candida tropicalis), vyskytuje se však i tvar citrónovitý (např. Kloeckera apiculata), trojúhelníkovitý (rod Trigonopsis) a válcovitý (rod Schizosaccharomyces). Avšak i v téže kultuře jednoho kmene kvasinek se vyskytuje určitá variabilita tvaru a velikosti buněk. Šířka buněk většiny kvasinek se pohybuje v rozmezí 3 6 µm (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Starší kultury kvasinek mívají buňky menších rozměrů. Kvasinky mohou růst v širokém spektru kyselého ph a až do 18 % etanolu. Mnoho jich roste v přítomnosti % sacharosy. Produkují též různá barviva od krémové, přes růžovou až k červené. Jedna z nejspolehlivějších prací týkající se systematiky kvasinek byla publikována roku 1984, editorem Kreger-van Rijem. V tomto svazku byl dřívější rod 21

22 Torulopsis transformován do rodu Candida a některé bývalé Saccharomyces do rodů Torulaspora a Zygosaccharomyces. Taxonomie 15 alimentárních rodů kvasinek je seřazena níže. Pro přesnou identifikaci alimentárních rodů kvasinek představili ve své knize Deak s Beuchatem excelentní zjednodušený klíč (JAY et al., 2005). Obr. 4: Životní cyklus Saccharomyces cerevisiae (JANDEROVÁ, 1999) Některé rody nebo kmeny kvasinek vytvářejí protáhlé buňky, které pučí pouze na pólech a zůstávají po pučení spojeny v dlouhá zaškrcovaná vlákna tzv. pseudomycelium. U kvasinek je známo také pohlavní rozmnožování spájením neboli konjugací. Existují jak druhy homotalické, tak heterotalické. V určitých místech pseudomycelia vznikají svazky kratších elipsoidních buněk blastospor. U některých rodů nebo kmenů kvasinek se vytváří tzv. pravé mycelium, tj. vlákno vznikající příčným dělením protáhlých buněk. Při dělení se zde, podobně jako u bakterií, tvoří z cytoplazmatické membrány prstencovitá vychlípenina, která prorůstá směrem do středu buňky, až dojde k rozdělení cytoplazmy a oddělení dvou jader. Na myceliu vznikají podobné svazky blastospor jako na pseudomyceliu. Tvorba pseudomycelia a pravého mycelia je charakteristická hlavně pro rody se silným aerobním metabolismem, např pro rody Endomycopsis a Sporobolomyces, ale i pro rod Candida. Vyskytuje se také často u tzv. R mutantů kvasinek (z angl. rough drsný), tj. mutantů, které tvoří drsné kolonie a mají většinou zvýšený aerobní metabolismus na úkor kvašení (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 22

23 Kvasinky vyžadují pro svůj růst vzdušný kyslík (obdobně jako plísně). Většina kvasinek patří mezi fakultativně anaerobní mikroorganismy, přičemž při anaerobní kultivaci vyžadují alespoň stopové množství kyslíku, nezbytné pro biosyntézu membránových komponentů ergosterolu, nenasycených mastných kyselin a kyseliny nikotinové. Schopnost těchto mikroorganismů měnit svůj metabolismus za anaerobních podmínek na fermentační a při silně omezeném růstu buněčné hmoty produkovat etanol a CO 2 zkvašováním cukrů. Kvasinky patřící do obligátních aerobů neobsahují enzym alkoholdehydrogenázu a tudíž nedováží etanol produkovat (KOCKOVÁ- KRATOCHVÍLOVÁ, 1990). Rozmnožování dělením, avšak bez tvorby mycelia, se vyskytuje u rodu Schizosaccharomyces. Po rozdělení se mateřská a dceřiná buňka od sebe vždy oddělí a ponechají si obdélníkový tvar se zakulacenými rohy. Přechodem mezi pučením a dělením je tzv. pučení na široké základně, při němž je pupen spojen širokým krčkem s mateřskou buňkou; při ukončení je krček uzavřen přepážkou. Pučení na široké základně je typické pro rod Saccharomyces, kde dochází k pučení téměř současně na obou pólech (tzv. bipolární pučení). Jiné kvasinky tvoří jednobuněčné exospory na tenkých stopkách zvaných sterigmata. Zralé spory jsou z těchto stopek odmršťovány pomocí zvláštního kapalinového mechanizmu, a proto dostaly název balistospory (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Polysacharidy jsou v kvasinkách zastoupeny především glukanem, mananem a glykogenem. Jejich obsah činí zhruba poloviny sušiny kvasinkové buňky. Glykogen jako zásobní látka je obsažen v cytoplazmě zejména ve formě dispergovaných granulí, avšak bývá také přítomen v rozpustné formě. Glukan a manan jsou integrálními složkami buněčné stěny kvasinek. Ve stěnách bývá lokalizován i polymerizovaný aminocukr chitin (VRANÁ, 1986) Cytologie: Vegetativní kvasinková buňka se skládá ze silné a pevné buněčné stěny, jemné cytoplazmatické membrány, cytoplazmy, jež obsahuje řadu membránových struktur a jádra, které je od cytoplazmy odděleno dvojitou jadernou membránou. Pohybové orgány, tj. bičíky, vegetativní buňky kvasinek nemají. Některé rody tvoří pohlavní spory, které však mají odlišné fyziologické vlastnosti od vlastností endospor bakterií (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 23

24 V buněčných stěnách hub jsou široce zastoupeny β-glukany (homopolymery glukózy). Jedním z důležitých zdrojů β-glukanů jsou buněčné stěny kvasinek, zejména pekařské a pivovarské kvasinky Saccharomyces cerevisiae (DIJKGRAAF, BUSSEY, 2002). Rozmnožování: Dle způsobu pohlavního rozmnožování se dělí kvasinky na ascomycety a basidiomycety. Deuteromycety jsou kvasinky, u kterých není pohlavní rozmnožování známo. Kvasinkové mikroorganismy jsou převážně jednobuněčné organismy rozmnožující se pučením. Některé kvasinky mohou za určitých podmínek vytvářet mycelium a poté existují ve vícebuněčné formě. Při růstu ve formě mycelia dochází k přehrádečnému dělení. Mezi kvasinky, které se rozmnožují tímto způsobem, patří rod Schizosaccharomyces (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). Kvasinky mají velký význam ve fermentačním průmyslu jako mikroorganismy používané k výrobě piva, vína, kvasnic a v potravinářském průmyslu při výrobě pekařských produktů. Na druhou stranu mohou být i škůdci masa, ryb, výrobků studené kuchyně, mléčných produktů a výrobků s vysokým obsahem cukru (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999) Buněčná stěna kvasinek Buněčná stěna kvasinek má silnou, pevnou strukturu, která dává buňce tvar a chrání ji před mechanickými vlivy a osmotickým šokem. Velkými póry stěny mohou volně procházet všechny sloučeniny kromě sloučenin vysokomolekulárních, jako jsou polysacharidy a bílkoviny. Buněčné stěny kvasinek jsou cca 70 nm tlusté a tvoří přibližně 20 % hmotnosti buňky. V elektronovém mikroskopu bylo zjištěno, že stěna nejdůležitějšího rodu kvasinek Saccharomyces je tvořena třemi vrstvami, jež zřejmě nejsou zcela nezávislé a liší se chemickým složením. Tři hlavní skupiny polysacharidů tvoří buněčné stěny kvasinek: polymery manózy kovalentně spojené s peptidy (mannoproteiny, cca 40 % buněčné stěny sušiny) polymery glukózy (β-glukany, cca 60 % buněčné stěny sušiny) polymery N-acetylglukosaminu (chitinu, cca 2 % z buněčné stěny sušiny) (KLIS et al., 2002) Polysacharidy představují 80 % sušiny stěny. Mají strukturu vláken, která tvoří hustou pevnou spleť. Tato spleť je vyplněna bílkovinami, které představují 6 až 10 % 24

25 sušiny stěny. Ve stěně kvasinek je také přítomno kolísavé, ale většinou malé množství lipidů a fosfolipidů, 3 až 10 % a dále fosforečnany, vázané esterovými vazbami na polysacharidy. Tyto fosfátové zbytky spolu se skupinami -COOH bílkovin dávají buňkám kvasinek negativní náboj (podobně negativní náboj mají i bakterie). Tento náboj ovlivňuje adsorpci látek z živného prostředí (např. barviv z melasy a sladiny, hořkých látek chmele atd.) (KLIS et al., 2002). Hlavní složkou stěnových polysacharidů kvasinek jsou β-glukany, které byly zjištěny ve všech stěnách dosud analyzovaných druhů kvasinek. Jejich stavební kameny tvoří glukosa. β-glukany mohou být rozděleny na dva podtypy dle povahy glykosidických vazeb: dlouhých řetězců cca b-1,3-d-glukózových jednotek, které představují asi 85 % z celkového obsahu β-glukanů buněčné stěny a krátký řetězec cca 150 b-1,6-d-glukóza jednotky, které zabírají cca 15 % (KLIS et al., 2002). U některých druhů kvasinek (např. Saccharomyces cerevisiae) jsou ve stěně přítomny ještě mannany a malé množství glukosaminu a chitinu (polysacharidu obsahujícího N acetylglukosamin). U S. cerevisiae je vnitřní vrstva stěny (sousedící s cytoplazmatickou membránou) složena z glukanu a bílkovin, pak následuje glukomannan s bílkovinami a na povrchu se nacházejí mannany s bílkovinami a malým množství lipidů. Složením vnější vrstvy stěny se ovlivňuje sedimentační schopnost kvasinek. Po ukončení kvašení u tzv. spodních pivovarských kvasinek totiž v této vrstvě obsah mannanů klesá a obsah bílkovin stoupá, což vede k flokulaci kvasinek a k jejich rychlému usazování (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Obr. 5: Schema buněčné stěny kvasinek (LIPOVOVÁ, 1997) 25

26 Na povrchu stěny kvasinek jsou patrné jizvy po pučení, které se v elektronovém mikroskopu jeví jako mírně vyvýšené prstence. Dají se barvit primulinem a následně pozorovat ve světelném mikroskopu fluorescenční technikou, neboť po odbarvení silně fluoreskují. Na jednom pólu každé buňky lze spatřit zvláštní jizvu, která zůstala v místě dřívějšího spojení buňky (vlastně pupenu) s mateřskou buňkou. Tato se nazývá jizva zrodu. Elispsoidní buňky Saccharomyces nepučí nikdy v místě, kde už předtím pučely, takže nám počet jizev současně určuje i stáří buňky. Počet jizev na jednotlivých buňkách kultury se pak na konci růstové fáze pohybuje od 9 do 43 (nejčastěji 15 až 24) (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Některé druhy kvasinek (hlavně příslušníci rodu Cryptococcus a někteří z rodů Lipomyces a Trichosporon) tvoří kolem svých buněk na povrchu stěn ještě polysacharidové obaly ve formě pouzder, která se barví jodem modře (KOCKOVÁ- KRATOCHVÍLOVÁ, 1990) Obr. 6: Stěna kvasinky Sccharomyces cerevisiae, preparát mrazově leptán (ŠILHÁNKOVÁ, 2002), 1 jizvy po pučení, 2 jizva zrodu, 3 lom stěny po mrazovém leptání. Buněčná stěna tvoří % hmotnosti kvasinkové buňky. Její složení se obvykle dělí na 5 frakcí: (1,3)-β-D-glukan, (1,6)-β-D-glukan, (1,3)-α-D-glukan, chitin a glykoproteiny. (1,3)-α-D-glukan v kvasinkách nenalezneme (např.u Saccharomyces cerevisiae a Candida albicans), ale je stanovován u celé řady dalších kmenů třídy Ascomycetes a Basidiomycetes, kde tvoří až 10 % hmotnosti buněčné stěny (NOVÁK, 2007). 26

27 Mannoproteiny jsou zastoupeny ve střední vrstvě buněčné stěny, kde mají zřejmě v asociaci s glukany strukturní roli, ale především vytvářejí vnější vrstvu stěny (kartáčovitý vzhled). Způsobují ho mannosylové řetězce, buď kratší O-mannosylové proteiny, nebo delší N-mannosylové proteiny. Delší řetězce jsou zpravidla větvené, s α-1,6-vazbami v lineární části řetězce. Lineární část je tvořena tzv. core se 2 molekulami N-acetylglukosaminu a mannosylovými jednotkami a tzv. Vnějším řětězcem s asi 70 molekulami mannosy v této lineární části. Vnější řetězec je větven, ve větvení jsou obsaženy jednotky mannobiosy, mannotiosy a mannotetraosy s α-1,2 a α-1,3-vazbami (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). Mezi nimi β-1,3-glukany hrají roli ve skeletální struktuře buněčné stěny, zatímco D-mannany zastupují její povrchové antigeny. Mannany jsou postaveny na alfa-1,6 spojené polymannosylové páteři s bočními řetězci skládájících se z α-1,2 a α-1,3 spojených mannosylových jednotek. Stupně větvení a délky postranních řetězců jsou specifické pro jednotlivé kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae Druhy rodu Saccharomyces se vegetativně rozmnožují multilaterálním pučením. Buňky mají kulovitý nebo elipsoidní tvar. Jsou schopny zkvašovat několik cukrů, ale jen málo jich umí zkvašovat laktosu. Z cukrů tvoří alkohol a CO 2 (KOCKOVÁ- KRATOCHVÍLOVÁ, 1990; ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Saccharomyces cerevisiae je primárně heterotalický mikroorganismus, který se množí ve stabilním haploidním nebo diploidním stavu pučením buněk. V laboratoři však byly zjištěny kmeny, které jsou druhotně homotalické a množí se převážně jako stabilně diploidní buňky. Většina haploidních kmenů je buď sexualitního typu a, nebo alfa, který je podmíněn různými alelami komplexního genu. Na molekulární úrovni je sexualitní diferenciace buněk podmíněna přestavbou genetického materiálu transpozicí kontrolních elementů (KOCKOVÁ KRATOCHVÍLOVÁ, 1990). Sacharomyces cerevisiae patří mezi nejdůležitější druh kvasinek, který se uplatňuje při výrobě piva, vína a pekařského droždí. Zkvašuje glukosu, sacharosu, maltosu a rafinosu. Na kmeny používané k výrobě pekařského droždí a piva je kladen důraz na vyrovnanost, velikost buněk a stálost technologických vlastností. Pekařské droždí se připravuje aerobní fermentací okyselených melasových zápar (MONTVILLE, 2005). 27

28 Obr. 7: Saccharomyces cerevisiae (DEÁK, 2008) Pivovarské kvasinky Pivovarské kvasinky řadíme mezi jednobuněčné eukaryotické mikroorganizmy. Mají zpravidla oválný, řidčeji kulatý tvar, který se spolu s jejich velikostí mění v závislosti na kultivačních podmínkách. Buňky jsou 6 10 µm dlouhé a 5-8 µm široké s délkošířkovým poměrem mezi 1-2. Průměrný objem buněk se uvádí kolem 175 µm 3 a povrch 150 µm 2 (WEINFURTHER, 1963). Je kladen důraz na vyrovnanost tvaru a velikosti, které mohou ovlivňovat technologické vlastnosti kmene. Z tohoto důvodu byly vyselektovány kmeny s poruchou sporulační schopnosti, jakožto, spolu s pohlavním rozmnožováním, největšího zdroje proměnlivosti kultur eukaryotických organismů (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kvasinky se vegetativně množí multipolárním pučením. Tato vegetativní forma je diploidní. Při výrobě piva se používají tzv. svrchní a spodní pivovarské kvasinky. Svrchní pivovarské kvasinky odštěpují z rafinosy pouze fruktosu a zkvašují ji. Po proběhnutí kvašení jsou jejich buňky vynášeny na povrch fermentační kapaliny. Spodní pivovarské kvasinky naopak po prokvašení klesají ke dnu kvasné nádoby a zkvašují rafinosu úplně. Spodní kvašení probíhá při teplotě 6 10 C, což vyžaduje delší kvasnou dobu, při níž dochází k ještě většímu vyčeření mladiny usazením jemných kalů. Vzniklá piva mají po dokvašení delší trvanlivost než piva připravená svrchním kvašením. Spodní kvašení se používá hlavně v našich krajích a v některých dalších evropských státech. V Anglii se pro výrobu piva užívá svrchní kvašení (ŠILHÁNKOVÁ, 1995; ROSYPAL, 1981; MONTVILLE, 2005). 28

29 Při kvašení mladiny běžnou dávkou hustých kvasnic je v 1 ml přibližně 15 miliónů buněk a jejich celkový aktivní povrch pro látkovou výměnu tedy činí zhruba m 2. Tento povrch se při pomnožení buněk až čtyřnásobně zvětší. Buňky pivovarských kvasinek jsou obklopeny buněčnou stěnou, která určuje jejich tvar. Buněčná stěna představuje velmi složitý heterogenní polymerní systém, jehož základními stavebními kameny jsou mannan, glukan, proteiny a chitin. Mannan, který byl původně označován jako kvasničná guma, představuje bohatě větvený polymer mannosy, jehož základní řetězec je spojen α-d-(1,6)-vazbami, postranní řetězce α-(1,2) a α-(1,3)-vazbami. Součástí molekuly mannanu je také fosfát, jehož obsah však značně závisí na druhu a kmeni kvasinek a bývá proměnlivý i u téhož kmene v závoslosti na podmínkách růstu, izolačním postupu nebo aktivitě fosfatázy. U Saccharomyces carlsbergensis obsahuje mannan větší množství fosfátu než u Saccharomyces cerevisiae. Glukan, podle dřívějšího označení kvasničná celulosa, je heterogenní směsí dvou strukturně příbuzných β-glukanů, polymerů glukosy. Jde jednak o větvený β-1,3-glukan s nízkým podílem β-1,6-glukosidických vazeb a jednak ovysoce větvený β-1,6-glukan, obsahující poměrně malé množství β-1,3-glukosidických vazeb. Obsah glukanu a mannanu je v kvasinkové stěně zhruba stejný a představuje hlavní podíl její sušiny. Tab. 2: Některé hlavní složky sušiny pivovarských kvasnic podle BENDOVÉ a KAHLERA (1981) Rozprašovací sušárna Válcová sušárna Vlhkost (%) 6 4,7 Dusík (%) 7,2 7,9 Purinový dusík (%) - 0,4 Bílkoviny (%) 45 49,4 Lipidy (%) 1,5 2,6 Thiamin (µg/g) Riboflavin (µg/g) Niacin (µg/g) Pyridoxin (µg/g) Polysacharidy (%) - 30,7 Popel (%) 7 7,3 29