MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2014 BC. MARTIN KUČÍREK

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Polymorfismus v genu DGAT1 ve vztahu k marblingu u skotu Diplomová práce Vedoucí práce: Prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracoval: Bc. Martin Kučírek Brno 2014

3

4 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Polymorfismus v genu DGAT1 ve vztahu k marblingu u skotu vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

5 PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych rád poděkoval svému školiteli prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za věnovaný čas a cenné rady. Dále mé poděkování patří doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za pomoc se statistickým vyhodnocením výsledků mé práce, Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D. za odborné rady v laboratoři a Ing. Elišce Dračkové za zpracování vzorků do databáze. Také bych rád poděkoval Ing. Elišce Horecké, Ing. Čeňku Horeckému a Bc. Ing. Ondreji Škultétymu za jejich rady a pomoc v laboratoři. Práce byla podporována projektem NAZV č. QI91A055 (Stanovení asociací mezi genotypy pro gen leptin a jejich využití ke standardizaci tržní jakosti a zvyšování parametrů kvality masné produkce skotu s kombinovanou užitkovostí). Tato práce vznikla v rámci CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/ z Evropského fondu regionálního rozvoje.

6 ABSTRAKT Intramuskulární tuk vyskytující se ve svalu skotu je předpokladem kvalitního hovězího masa. Mramorování (marbling) má vliv na šťavnatost, křehkost a chuť masa. Selekce skotu na vyšší marbling s sebou přináší zvýšenou křehkost masa. Ta je ovlivněna celou řadou faktorů, mezi něž řadíme genetické pozadí, věk, výživu, pohlaví a také plemennou příslušnost zvířete. Cílem práce je provedení asociační analýzy dinukleotidového polymorfismu v genu DGAT1 (diacylglycerol acyltransferáza 1) s parametry kvality hovězího masa (intramuskulární tuk a marbling). Součástí práce je zpracování literatury k tématu asociací kandidátních genů, současný stav problematiky, význam a metody studia, geny ovlivňující ukládání a metabolismus intramuskulárního tuků u skotu. Dále role enzymu DGAT1 v biosyntéze triacylglycerolů a jeho fyziologická funkce (energetický metabolismus, metabolismus glukózy, lipoproteinů, vztah k ukládání tuku a obezitě). Ve studii byl nalezen signifikantní rozdíl v příspěvku alel na obsah IMT v mase testovaného vzorku skotu. Nicméně efekt alely Q je opačný než se očekával dle odborné literatury. Klíčová slova: skot, kvalita masa, marbling, DGAT1

7 ABSTRACT: Intramuscular fat occurring in the muscle of cattle is supposed to be prerequisite for high-quality beef. Marbling has effect on juiciness, tenderness and flavor of the meat. Selection of cattle at higher marbling score brings increased meat tenderness. It is influenced by many factors, among which we classify genetic background, age of animal, nutrition, sex and pedigree of animal. The aim is to perform association analysis beetween dinucleotide polymorphism in the gene DGAT1 (diacylglycerol acyltransferase 1) and the marbling score. Part of thesis is elaboration of literature, present state of the problem, genes affecting metabolism of intramuscular fat in cattle, the role of the enzyme DGAT1 in the biosynthesis of triacylglycerols and its physiological function (energy metabolism, glucose metabolism, relation to fat accumulation and obesity). In this study a singificant difference of allelic contribution to intermuscular fat content in tested samples was found. Nevertheless, effect of Q allele was reverse than observed in similar studies. Key words: cattle, quality of meat, marbling, DGAT1

8 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Kvalita hovězího masa Obecná charakteristika marblingu Makroskopický pohled na marbling Mikroskopický pohled na marbling Fyziologické hledisko marblingu Signalizace spojená s marblingem Energetický metabolismus Geny asociované s masnou produkcí Geny asociované s marblingem FABP TG Leptin DGAT Polymorfismus K232A v genu DGAT MATERIÁL A METODIKA Materiál Analyzované vzorky Použité přístroje Použité roztoky a další materiál Metodika PCR RFLP... 31

9 4.2.3 Agarózová elektroforéza Sekvenování Popis chemických analýz Matematicko-statistické zpracování dat Výpočet frekvencí alel a genotypů Hodnocení genetické rovnováhy dle Hardy-Weinbergova zákona Asociační analýza VÝSLEDKY A DISKUZE PCR RFLP Sekvenování Matematicko-statistické vyhodnocení Výpočet frekvencí alel a genotypů Test genetické rovnováhy populace dle Hardy-Weinbergova zákona Asociační analýza ZÁVĚR LITERATURA SEZNAM ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK... 63

10 1 ÚVOD Kvantitativní znaky (QT z anglického quantitative traits) jsou velmi významné pro hospodářství a mají nepopiratelný ekonomický význam. Tyto znaky se dají měřit, jsou vyjádřeny číselnou hodnotou, často bývají ovlivněny vnějším prostředím, mají kontinuální průběh, bývají vyobrazeny Gaussovou křivkou. Znaky jsou kódovány geny malého účinku, tzv. minor geny. Mezi kvantitativní znaky například řadíme množství tuku, mléka, plodnost, míru osvalení. Novodobé molekulární techniky umožnily přesné vyhledávání lokusů kvantitativních znaků. Využívají se metody chromozomových map, které se sestavují na základě příbuznosti organismů a na základě polymorfismů délky restrikčních fragmentů (RFLP). Jedná se o metodu využívající specifity restrikčních enzymů a Southernova přenosu. Takto byly zjištěny QT lokusy na konkrétních chromozomech laboratorních a zemědělských zvířat. Mezi sledovanými znaky jsou například podíl tuku u prasat, mléčná užitkovost a podíl uloženého intramuskulárního tuku u skotu. Ve své práci se věnuji tématu marblingu (mramorování) hovězího masa. Mramorované maso obsahuje různé množství intramuskulárního tuku, které vytváří uvnitř masa charakteristické tukové žilky. Obsah intramuskulárního tuku v kosterním svalstvu u skotu je dán geneticky. Plemena angus, shorthorn a wagyū jsou známa svým vysokým marbling skóre. 9

11 2 CÍL PRÁCE Cílem práce je provedení asociační analýzy dinukleotidového polymorfismu v genu DGAT1 (diacylglycerol acyltransferáza 1) ve vztahu k parametrům kvality hovězího masa. Do analýzy bude zahrnut soubor býků studovaných na kvalitu masa (260 vzorků). Bude provedeno určení genotypů genu DGAT1 restrikční endonukleázou u daného souboru býků a bude vytvořena databáze. Následně proběhne statistické vyhodnocení asociace mezi ukazateli kvality hovězího masa a zjištěnými genotypy (pomocí softwaru SAS). Součásti práce bude zpracování literatury k tématu asociací kandidátních genů, současný stav problematiky, význam a metody studia, geny ovlivňující ukládání a metabolismus intramuskulárního tuků u skotu. Dále popsání role enzymu DGAT1 v biosyntéze triacylglycerolů a jeho fyziologická funkce ve vztahu k energetickému metabolismu, metabolismu glukózy, lipoproteinů, ukládání tuku a obezitě. 10

12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Kvalita hovězího masa Charakteristiky kvality masa mohou být obecně rozděleny na tři kategorie - fyzikální (ph, barva, vaznost), chemické (obsah sušiny, bílkovin, tuku) a senzorické (vůně, chuť, křehkost). Tyto charakteristiky masa jsou zásadně ovlivněny mnohými faktory zahrnujícími zootechnické vlastnosti zvířete - věk, pohlaví, anatomické rysy, typ masa, dále krmení a technologické parametry chovu (Huidobro et al., 2003). Dalšími důležitými faktory jsou zátěž, strava, množství intramuskulárního tuku, vlastnosti chovu zvířete před porážkou (Adegoke et al., 2005). Bylo prokázáno, že plemena skotu, chovaná pro masnou užitkovost (blonde d'aquitaine a limousin) mají nižší hodnoty obsahu kolagenu v syrovém a uvařeném mase oproti plemenům, která jsou chovaná pro mléčnou výrobu, jako jsou plemena holštýnského skotu (Monson et al., 2004). Je známo, že později dospívající plemena chovaná pro masnou užitkovost (belgické modré, limousin a blonde d'aquitaine) mají vyšší objem svalových vláken a menší zásobou tuku než je tomu u skotu chovaného pro mléčnou užitkovost anebo dříve dospívajících masných plemen (angus a japonský černý skot) (Chambaz et al., 2003). Monson et al. (2004) uvedli, že jsou rozdíly i v textuře masa, která s věkem zvířete ubývá. Stres zvířete před porážkou může mít nežádoucí vliv na měkkost, barvu, pevnost a suchost masa. Podmínky životního prostředí, které způsobují stres u zvířete, jsou extrémy tepla, vlhka, světla, hluku, únavy, hladu, žízně a pohybu. Po porážce a vykrvení zvířete se hromadí kyselina mléčná v jatečně upraveném těle. To způsobuje pokles ph, což má neblahý vliv na kvalitu masa. Maso by mělo být udržováno při teplotě C. Správné způsoby chlazení jatečného masa zlepšují jeho měkkost a chuť (Adegoke et al., 2005). Kromě podmínek porážky a technologických aspektů kvality života zvířete je charakteristika masa přímo závislá na biologii svalu živého zvířete. Ta je regulována genetickými, nutričními a biologickými faktory. Genetické faktory mají zásadní význam, protože genetické zlepšení je trvalé, kumulativní a dědí se na další generaci. 11

13 Genetické faktory mohou být demonstrovány srovnáváním různých plemen skotu nebo různých genotypů u příslušníků stejného plemene. Vlastnosti masa, které jsou regulovány genetickými faktory, jsou množství a rozložení intramuskulárního tuku, ovlivňující chuť a nezávadnost masa. Dále vlastnosti pojivových tkání a svalových vláken, ovlivňující tuhost a měkkost masa (Hocquette et al., 2006). Žádoucí vlastnosti kvality masa u spotřebitele zahrnují smyslové a vizuální vlastnosti. Dále také nezávadnost, čistotu masa a dobré podmínky produkčního systému. Důležité vizuální vlastnosti zahrnují barvu, texturu masa, množství a rozložení tuku, absenci nadbytku vody v balení. Spokojenost zákazníka s uvařeným masem je ovlivněna tím, jak měkké maso je. Také jeho chuť, vůně a šťavnatost jsou pro zákazníka důležité (Warner et al., 2010). Konzument hovězího masa řadí měkkost jako nejdůležitější charakteristiku masa, dále v pořadí důlěžitosti je chuť, vůně a šťavnatost. Autoři však dodávají, že záleží na původu zákazníka. Jednotlivé odchylky v národnosti jsou patrné (Watson et al., 2008). Kvalita masa může být vnímána různě mezi zeměmi, producenty, zpracovateli, prodejci a spotřebiteli. V některých případech je prezentovaná kvalita masa odrazem zákazníkovy spokojenosti, v jiných zahrnuje technologické parametry. Celkové posouzení kvality masa je komplikováno tím, že existuje velké množství znaků, které lze stanovit a hodnocení se provádí na omezeném počtu vzorků (Boukha et al., 2011). 12

14 3.2 Obecná charakteristika marblingu Intramuskulární tuk vyskytující se ve svalu je předpokladem kvalitního hovězího masa. Mramorování má vliv na šťavnatost, křehkost a chuť masa. Selekce skotu na vyšší marbling s sebou přináší zvýšenou křehkost masa. Ta je ovlivněna celou řadou faktorů, mezi něž řadíme genetické pozadí, věk, výživu, pohlaví a také plemennou příslušnost zvířete (Wang et al., 2009). Vysokou mírou mramorování příčně pruhovaného svalstva je znám zejména japonský černý skot. Vysoký stupeň marblingu je charakterizován zvýšeným počtem a velikostí intramuskulárních tukových buněk (Gotoh et al., 2009) Makroskopický pohled na marbling Mezi mramorované maso nezahrnujeme to, které se vykazuje podkožním anebo intermuskulárním tukem, ale pouze to s vysokým podílem intramuskulárního tuku. Mramorovaná tkáň může být hodnocena vizuálně nebo změřena použitím obrázkových analyzujících systémů. Systémy jsou založeny na rozeznávání barvy masa, rozdílnosti mezi tučnou a libovou tkání. Vizuálně můžeme také hodnotit množství mramorované části oproti té libové. Maso mající větší množství viditelného intramuskulárního tuku je kvalitněji ohodnoceno. Pokud mramorovaná tkáň přesahuje více jak 50 % masa, mluvíme pak o vysokém stupni marblingu. Systémy hodnotící maso zahrnující subjektivní ohodnocení marblingu dvanácti stupni jsou často využívány v Japonsku, Austrálii a USA (Wang et al., 2009). Existuje velká variabilita v rozložení mramorované tkáně mezi jednotlivými zvířaty. V extrémních případech maso jednoho zvířete může mít jemné, rovnoměrně roztroušené tukové bílé skvrny nebo pruhy. Zatímco maso jiného zvířete pak může mít silné, hluboké pruhy tukové tkáně, které se propojují s intermuskulárním tukem (Harper and Pethick, 2001). Obrázek 1 zobrazuje stupně marblingu u hovězího masa. 13

15 Obrázek 1: Znázornění stupňů marblingu u hovězího masa. BMS zkratka pro Beef marbling standards (Standarty hovězího marblingu), (zdroj: upraveno) Mikroskopický pohled na marbling Mramorované maso tvoří tuková tkáň, která je tvořena adipocyty (tukovými buňkami). Ty jsou zakotveny v matrix pojivové tkáně a vyskytují se poblíž krevní kapilární sítě. Tuk mramorované tkáně se odlišuje od jiných tukových tkání (podkožních, intermuskulárních) interfascikulárním (mezisvazkovým) uložením ve svalu. Adipocyty marblingu jsou kulaté buňky s průměrem mezi μm. Tukové buňky mramorovaného masa jsou výrazně menší než buňky jiných tukových tkání. Zatím není jasné, jestli se rozdíl v buněčné velikosti odráží v rozdílných vlastnostech masa. Marblingové adipocyty se vyskytují ve shlucích nebo ostrůvcích. Pokud se 14

16 ostrůvky skládají z 10 až 15 buněk, jsou rozlišitelné makroskopicky. Pokud jsou ostrůvky adipocytů tvořeny stovkami buněk, často se vyskytují poblíž kapilární sítě (Harper and Pethick, 2001) Fyziologické hledisko marblingu Není příliš jasné, jaké fyziologické výhody zvíře získá, pokud obsahuje mramorovanou tkáň. Tukové buňky vyvíjející se uvnitř svalu nejsou běžným jevem, vyskytujícím se u vyšších savců. Marblingové adipocyty mechanicky nesouvisí s tukovými zásobami, které například napomáhají medvědům přečkat hibernaci. Anebo tukovými zásobami, které se vyskytují u migrujících ptáků. Neexistuje ani důkaz, který by podporoval hypotézu, že by mramorovaný tuk poskytoval teplotní výhodu zvířeti. S vývojem vnitrosvalového tuku se můžeme setkat u patologických jevů. Existují nádory a nemoci, které zapříčiňují vznik tukové tkáně ve svalech. U poškozených svalových vláken dochází k náhradě za tuk. Ovšem z histologického hlediska je tento tuk odlišný od tuku mramorované tkáně (Harper and Pethick, 2001). Teorie Occamovy břitvy nás nutí přijmout nejjednodušší vysvětlení vzniku marblingu. Mramorování by nijak nezvýhodňovalo dané zvíře. Existoval by tedy silný evoluční tlak proti tomuto jevu. Marbling se náhodně vyvinul u jednotlivé linie skotu a díky hospodářské selekci, jev udržujeme mezi vybranými plemeny (Kaupe et al., 2007) Signalizace spojená s marblingem Intenzivní genetická selekce zvířat pro zvýšení libového masa dramaticky snížila obsah intramuskulárního tuku, došlo tak i k poklesu kvality masa. Tuk je hlavním faktorem ovlivňujícím chuť masa. Porozumění mechanizmu adipogeneze (tvorby tukových buněk) je nepostradatelné pro objasnění vzniku marblingu u kosterního svalstva skotu. Svalové i tukové buňky kosterního svalstva vznikají z mezenchymálních multipotentních kmenových buněk během časného embryonálního a neonatálního vývoje. Během stárnutí zvířete kmenových buněk ubývá. Většina mezenchymálních 15

17 kmenových buněk se přeměňuje ve svalové buňky. Malé množství kmenových buněk se diferencuje v buňky tukové, které jsou základem intramuskulárního tuku (Du et al., 2010). Genetické, nutriční a environmentální faktory ovlivňují klíčové signální dráhy, které regulují adipogenezi u kosterního svalstva (Harper and Pethick, 2004). Mezi regulační mechanizmy ovlivňující tvorbu tukových buněk patří zejména signální dráhy Hedgehog, Wnt/β-katenin, signální dráha zprostředkovaná morfogenetickými proteiny (BMP) a také AMP aktivovaná protein kináza (Du et al., 2010). Obrázek 2 zobrazuje faktory působící na adipogenezi. Obrázek 2: Tukové buňky vznikající (procesem adipogeneze) z multipotentních buněk kosterního svalstva jsou regulovány komplexem signálních drah. Faktory jako jsou výživa a vliv genetického pozadí ovlivňují tvorbu tukových buněk změnami těchto drah (Du et al., 2010, upraveno). 16

18 3.3 Energetický metabolismus Výskyt obezity se zvyšuje po celém světě spolu s komplikacemi spojených s obezitou, jako je diabetes typu 2, jaterní steatóza a kardiovaskulární onemocnění. Primární defekt u obezity je nadměrné hromadění triacylglycerolu (TAG) v bílé tukové tkáni, kosterním svalstvu, játrech a jiných tkáních. Nahromadění triacylglycerolu v bílé tukové tkáni je asociováno s výskytem větších adipocytů, zánětlivých reakcí a se změnami ve vylučování adipokinů (Fruhbeck et al., 2001). Adipokiny (adipocytokiny) jsou proteiny sekretovány tukovou tkání. Jedná se o metabolicky aktivní látky, které se účastní mnohých funkcí, reakce imunitního systému, tvorby zánětu, výdeje energie. Změny v adipokinech, tvořených v bílé tukové tkáni, mohou přispět k chorobným procesům jiných tkání, jako jsou např. rezistence na inzulin v kosterním svalstvu a jaterní steatóza. Mechanismy, které omezují hromadění triacylglycerolů a podporují tvorbu prospěšných metabolických látek, mají z klinického hlediska velký význam (Streeper et al., 2006). V bílé tukové tkáni a většině savčích buněk je poslední krok v biosyntéze triacylglycerolů, spojování acyl-coa a diacylglycerolu esterovou vazbou, katalyzováno enzymem diacylglycerol-acyltransferázou (DGAT). U savců byly identifikovány dva DGAT enzymy. Porucha exprese genu DGAT2 u myší vyvolává úbytek triacyglycerolů a u homozygotních potomků dochází k časné postnatální letalitě (Stone et al., 2004). DGAT1 je zvýšeně exprimován ve tkáních, které syntetizují a uskladňují triacylglycerol. Narušení exprese DGAT1 u životaschopných myší má pleiotropní účinek na fenotyp. DGAT1 deficientní myši mají mírně sníženou tvorbu triacylglycerolu v tkáních a jsou rezistentní k dietou indukované obezitě (Smith et al., 2000). Dietou indukovaná obezita je metoda, kdy jsou pokusná zvířata týdny krmena stravou s vysokým obsahem tuku a cukru. Ve výsledku jsou zvířata obézní, hyperglykemická a mají narušenou toleranci ke glukóze. Zkoumají se tak genetické a fyziologické mechanismy obezity, zejména diabetu typu 2 (Wang and Liao, 2012). Myši jsou rezistentní k obezitě díky zvýšenému výdeji energie. Příčinou je nárůst termogeneze (produkce tepla) a fyzické aktivity. DGAT1 deficientní myši se vykazují zvýšenou senzitivitou na inzulin a leptin. Látky, tvořené bílou tukovou tkání 17

19 a účastnící se metabolismu, podléhají u deficientních myší řadě změn. Látka adiponektin zvyšuje oxidaci mastných kyselin a posiluje citlivost na inzulin. Studie odhalují, že adiponektin je zodpovědný za normální průběh metabolismu glukózy, lipidů a energie. Výsledky naznačují, že farmakologická inhibice genu DGAT1 by mohla být úspěšným krokem k léčení obezity u lidí a inzulinové rezistence asociované s nízkou hladinou adiponektinu (Streeper et al., 2006). Monoacylglycerol acyltransferáza (MGAT) a diacylglycerol acyltransferáza (DGAT) hrají základní roli v metabolismu monoacylglycerolu (MAG), diacylglycerolu (DAG) a triacylglycerolu (TAG). Mono/di/tri-acylglyceroly se účastní celé řady fyziologických funkcí, jako je vstřebávání tuků ve střevě, syntéza lipoproteinů, tvorba tukové tkáně, signální transdukce pocitu sytosti. Enzymy MGAT a DGAT jsou důležité v regulaci energetické homeostázy a citlivosti na inzulin. V důsledku toho by selektivní inhibice MGAT a DGAT mohla poskytnout novou léčbu obezity a podobných metabolických problémů (Shi and Cheng, 2009). Aktivita enzymu DGAT a jiných enzymů jsou dány polymorfismy genů pro tyto enzymy, z toho důvodu má genetické pozadí zvířete zásadní vliv na složení a kvalitu masa. Obrázek 3 zobrazuje zapojení enzymů DGAT a MGAT do regulace energetické homeostázy. Obrázek 3: Enzymy monoacylglycerol acyltransferáza a diacylglycerol acyltransferáza 18

20 jsou součástí několika signálních drah, které regulují energetickou homeostázu. MGAT a DGAT mají významnou roli v energetickém metabolismu, který reguluje pocit sytosti v mozku (zprostředkováno monoacylglycerolem), vstřebávání tuků ve střevě (formou triacylglycerolu), syntézu fosfolipidů a sekreci lipoproteinu o nízké hustotě v játrech (prostřednictvím di-/tri- acylglycerolu), ukládání tuku v adipocytech (v podobě triacylglycerolu) a sensitivitu na inzulin v kosterním svalstvu (zprostředkováno diacylglycerolem), (Shi and Cheng, 2009, upraveno). 3.4 Geny asociované s masnou produkcí Kandidátní geny jsou vybírány na základě vztahu mezi fyziologickými a biochemickými procesy a vlastnostmi produkce, které jsou testovány jako lokusy kvantitativních znaků (QTL). Asociační analýza je způsob, jak zjistit genetický základ znaků produkce. Vývoj molekulární biologie a statistických metod umožnil lokalizovat geny, které jsou zodpovědné za zájmové znaky zvířete. Díky asociační analýze byly identifikovány kandidátní geny u skotu, prasat a jiných užitkových zvířat. Jsou to geny melanocortin 4 receptor (MC4R), myogenin, myostatine, homogentisate 1,2- dioxygenase (HGD), thyroglobulin (TG), calcium channel voltage-dependent alpha 2/delta subunit 1 (CACNA2D1), adipose fatty acid binding protein 4 (FABP 4), leptin (LEP), calpastatin (CAST), stearoyl-coa desaturase (SCD1) a fat mass and obesity associated genes (FTO) (Yuan et al., 2013). CAST Kalcium dependentní proteinázový systém calpain/calpastatin je spojován s proteolýzou myofibrilárních proteinů během post mortem skladování jatečných těl skotu. Calpain je zodpovědný za rozpad myofibrilárních proteinů. Tento proces bývá spojován se zvýšenou křehkostí masa. Calpastatin inhibuje aktivitu calpainu, reguluje tak post mortem proteolýzu. Zvýšená post mortem aktivita CAST koreluje se sníženou měkkostí masa (Pringle et al., 1995). Schenkel et al. (2006) uvádí SNP alely C genu CAST, který je asociován se zvýšenou měkkostí masa v oblasti LM (longissimus muscle) u jatečného těla. 19

21 MC4R Melanokortinový receptor 4 (MCR4) paří mezi transmembránové G-proteiny, je exprimován v hypothalamu. MC4R protein reguluje působení inzulinu. Mnoho mutací v MC4R genu koreluje s obezitou, výdejem energie a hladinou triacylglycerolů v těle. Jednonukleotidové polymorfismy genu MC4R jsou asociovány s rychlostí růstu u skotu (Liu et al., 2010). Myostatin Myostatin patří do rodiny transformujících růstových faktorů β (TGF-β) a je specifickým negativním regulátorem vývoje kosterního svalstva. Myostatin je považován za důležitý faktor myogeneze (Shibata et al., 2006). McPherron et al. (1997) využili myši s nefunkčním genem pro myostatin a zjistili, že hraje důležitou roli v regulaci tvorby kosterního svalstva. Přirozená mutace myostatinu u skotu je asociována s fenotypem dvojitého osvalení (Grobet et al., 1997). SCD1 Stearoyl koenzym A desaturáza-1 (SCD1) je enzym katalyzující desaturaci nasycených kyselin na mononenasycené mastné kyseliny (MUFAs - monounsaturated fatty acids). Polymorfismy v genu SCD1 jsou spojovány se složením mastných kyselin, ukládáním intramuskulárního tuku a zbarvením hovězího masa (Li et al., 2013). 20

22 3.5 Geny asociované s marblingem Mramorování u skotu je kvantitativní vlastností, která je regulována interakcemi mezi mnoha QTL a okolním prostředím. Jsou prováděny četné studie na nalezení genetických markerů asociovaných s marblingovým fenotypem. K nalezení kandidátních genů pro intramuskulární tuk se využívá tradiční QTL analýzy. Studují se geny: fatty acid binding protein 4 (FABP 4) (Michal et al., 2006), thyroglobulin (TG) (Wood et al., 2006), růstový hormon 1 (GH1) (Taylor et al., 1998), leptin (LEP) (Buchanan et al., 2003) a diacylglycerol acyltransferáza 1 (DGAT1) (Thaller et al., 2003). Pro identifikaci dalších kandidátních genů asociovaných s marblingovým fenotypem se využívá mikročipové analýzy a studia diferenciální exprese genů na základě transkriptomu (Wang et al., 2009) FABP 4 Bovinní gen FABP 4 je lokalizován na 14. chromozomu na lokusu s označením BOS_13990 ( Obrázky 4 a 5 zobrazují organizaci a lokalizaci bovinního genu FABP 4. Obrázek 4: Znázornění lokalizace bovinního genu FAPB 4 (zdroj: Adipocytární protein vázající mastné kyseliny (AFABP, gen FABP 4) je protein o velikosti 14,4 kda, který je členem rodiny FABP proteinů, schopných vázat mastné kyseliny a eikosanoidy (Stejskal et al., 2006). Protein FABP 4 je cytoplazmatický protein, který je exprimován v tukové tkáni a váže dlouhý řetězec mastných kyselin a jiné hydrofobické ligandy. Hlavní funkcí je vychytávání, transport a přeměna mastných kyselin. Protein FABP4 je nezbytný pro regulaci lipidů a udržení glukózové 21

23 homeostázy prostřednictvím PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors - receptory peroxizómů aktivovaných proliferatory), které se nachází v buněčném jádru. Proteiny FABP 4 a FABP 5 byly určeny jako kandidátní geny obezity (Michal et al., 2006). AFABP byl lokalizován v cytosolu zralých adipocytů a makrofágů a je považován za regulátor produkce zánětlivých cytokinů a regulátor akumulace esterů cholesterolu (Stejskal et al., 2006). Michal et al. (2006) uvádí polymorfismy genu FABP 4, které se signifikantně podílejí na zvýšeném mramorování masa a tloušťce podkožního tuku v F2 populaci, vzniklé křížením plemene wagyu a limousin. Obrázek 5: Struktura bovinního genu FABP 4 (zdroj: Ensembl:ENSBTAG ) TG Bovinní gen thyroglobulin (TG) je lokalizován na dlouhém raménku 14. chromosomu, přesněji: 14q12-q15 (zdroj: Obrázky 6 a 7 zobrazují organizaci a lokalizaci bovinního genu TG. Obrázek 6: Znázornění lokalizace bovinního genu TG (zdroj: 22

24 Thyroglobulin je glykoproteinový hormon, syntetizován folikulárními buňkami štítné žlázy. Thyroglobulin je prekurzorem pro thrijodthyronin (T3) a tetrajodthytonin (T4) (Fortes et al., 2009). Thyroidní hormony hrají důležitou roli v regulaci metabolismu, ovlivňují růst a diferenciaci tukových buněk (Hou et al., 2011). Studie ukazují, že polymorfismy v bovinním TG genu mají vliv na tloušťku podkožního tuku a na procento tuku obsaženého v mléce. Alely genu TG jsou také asociovány s ukládáním tuku a mramorovaným fenotypem u skotu (Fortes et al., 2009). Barendse (1999) objevil polymorfismus TG genu v 5 UTR oblasti, který koreluje s fenotypem marblingu. Polymorfismus může být použit k testování a následné selekci zvířat na marbling. Mears et al. (2001) uvedli, že geny pro T3 a T4 jsou spojovány s marblingem u japonského černého skotu. Hou et al. (2011) identifikovali 6 nových jednonukleotidových polymorfismů v 3 UTR oblasti genu TG. SNP asociační analýza objevila polymorfismy: T354C, G392A, A430G a T433G. Všechny čtyři jsou asociovány se zvýšeným marbling skóre a proto mohou být použity jako selekční markery. Obrázek 7: Struktura bovinního genu TG (zdroj: Ensembl:ENSBTAG ) Leptin Gen pro leptin se u skotu nachází na 4. chromosomu, na lokusu 4q32. Je dlouhý 16,735 kb a obsahuje 3 exony. Gen kóduje 167 aminokyselin (Giblin et al., 2010). Obrázky 8 a 9 zobrazují organizaci a lokalizaci bovinního genu LEP. 23

25 Obrázek 8: Znázornění lokalizace bovinního genu leptinu (zdroj: Leptin je peptidový hormon, který je syntetizován a vylučován zejména bílými adipocyty. Leptin přispívá k regulaci nadměrné tělesné hmotnosti, příjmu potravy a výdeji energie (Pannier et al., 2009). Leptin funguje také jako lipostatický signál, který ovlivňuje energetický metabolismus celého těla (Nkrumah et al., 2005). Gen pro leptin je také nazýván genem obezity. Jednonukleotidové polymorfismy genu pro leptin jsou asociovány s hladinou intramuskulárního tuku u skotu (Pannier et al., 2009). Studie in vivo naznačují, že leptin může přímo regulovat energetický metabolismus v periferních tkáních. Zároveň může působit jako antagonista inzulinu v tukové a svalové tkáni. Jeho fyziologické vlastnosti podporují tezi, že leptin je silným kandidátním genem pro obsah tuku u jatečného těla skotu (Buchanan et al., 2002). Zvířata s genotypem TT (C/T substituce detekovaná na 528 pozici regionu promotoru pro leptin u skotu) se projevují 9% - 13% nárůstem marbling skóre v porovnání s genotypy CC a CT (Nkrumah et al., 2005). Obrázek 9: Struktura bovinního genu leptinu (zdroj: Ensembl:ENSBTAG ). 24

26 3.5.4 DGAT1 Gen DGAT1 (diacylglycerol acyltransferáza 1) je umístěn na 14. chromozomu, v oblasti bohaté na mléčné a masné QTL (Winter et al., 2002). Je velký 8,6 kb a obsahuje 17 exonů a 16 intronů. Exony jsou velké v průměru 121,8 bp (rozpětí bp). První dva introny jsou dlouhé 3,6 a 1,9 kb a zbývajících 14 intronů je průměrně velkých 92,4 bp (rozpětí bp). Všechny introny podléhají pravidlu GT-AG. Kódující oblast genu DGAT1 je z 89,5% shodná u lidí a skotu. Pořadí AMK v proteinu DGAT1 je shodné z 92,5% (Grisart et al., 2002). Obrázek 10 zobrazuje lokalizaci bovinního genu DGAT1. Obrázek 10: Znázornění lokalizace bovinního genu DGAT1 (zdroj: Enzym DGAT1 (diacylglycerol O-acyltransferáza 1) katalyzuje poslední krok v syntéze triacylglycerolů (TAG) (Thaller et al., 2003). Triacylglyceroly jsou hlavními zdroji energie u eukaryot. TAG také slouží jako rezervoáry mastných kyselin pro syntézu biomembrán a vedou k obezitě v důsledku nadměrného hromadění tukové tkáně (Cao, 2011). Zvýšená tvorba TAG je asociována s vyšším procentem obsažených lipidů v mléce (Thaller et al., 2003). Protein DGAT1 hraje klíčovou roli v metabolismu buněčných glycerolipidů (Weiss et al., 1960). Enzym DGAT1 katalyzuje přeměnu diacylglycerolu (DAG) a acyl- CoA v triacylglycerol (Wang et al., 2007). DGAT1 se také podílí na syntéze enzymu thyroglobulin. DGAT1 a TG jsou nezbytné v procesu ukládání živočišného tuku (Cui et al., 2011). Diacylglycerol acyltransferáza je funkčním a pozičním kandidátním genem pro obsah tuku v mléce. Myši mající nefunkční gen DGAT1 nebyly schopny laktace z důvodu nedostatečné syntézy triacylglycerolů (Smith et al., 2000). 25

27 Polymorfismus K232A v genu DGAT1 Polymorfismus K232A je lokalizovaný v 8. exonu genu DGAT1, konkrétně v pozici a bp. Jedná se o dinukleotidovou záměnu AA za GC, důsledkem toho dochází k náhradě aminokyseliny lyzin (K) za alanin (A) (Nowacka-Woszuk et al., 2008). V literatuře se setkáme s různým značením alel polymorfismu K232A. Mnohdy je alela kódující lyzin označována také jako DGAT1 K, K anebo alela Q. Alela kódující alanin bývá označována také jako DGAT1 A, A anebo q. Substituce má vliv na plemennou hodnotu. Dinukleotidový polymorfismus K232A je asociován s vlastnostmi produkce mléka. Lyzin kódující alela DGAT1 K je asociována se zvýšeným obsahem tuku v mléce oproti alele kódující alanin (Nowacka- Woszuk et al., 2008). Winter et al. (2002) uvádí, že zvýšený obsah tuku v mléce u různých plemen skotu je asociován s lyzinem na pozici proteinu, který je kódován bovinním genem DGAT1. Přítomnost alaninu na této pozici souvisí s nižším obsahem tuku v mléce. Ke stejným závěrům ve své studii došli i Grisart et al. (2002). Podle Kaupe et al. (2007) alela kódující alanin (DGAT1 A ) může mít negativní efekt na procento nepřeběhlých plemenic a následně na délku reproduktivního života. Szyda a Komisarek (2007) uvádí, že polymorfismus K232A má mnohem větší aditivní účinek na mléko, tuk a proteinové výnosy oproti jiným polymorfismům než se očekávalo. Thaller et al. (2003) ve své studii tvrdí, že alela K (DGAT1 K ) má pozitivní vliv na obsah intramuskulárního tuku u plemen charolais a holštýn. Domnívají se také, že výskyt lyzinu v pozici proteinu DGAT1 bude studován v budoucnu i u jiných druhů savců. Výskyt lyzinu v dané pozici posiluje vazbu acyl-coa oproti alele kódující alanin. Obrázek 11 zobrazuje organizaci bovinního genu DGAT1. 26

28 Obrázek 11: Struktura bovinního genu DGAT1 zdroj: Ensembl:ENSBTAG ). Winter et al. (2002) se také zmiňují o tom, že na základě výsledků analýzy haplotypu je lyzinová varianta alely původní. Tuto teorii podpořili i Kaupe et al. (2004), kteří došli ve své studii ke stejným výsledkům. Substituce v polymorfismu K232A se zřejmě objevila po oddělení plemen linií Bos indicus a Bos taurus (Kaupe et al., 2004). K takovéto divergenci došlo před více než lety (Loftus et al., 1994). Kaupe et al. (2004) identifikovali jedinců u 38 různých plemen Bos taurus a Bos indicus ze 13 zemí a pěti kontinentů. Uvedli, že dochází k divergenci v četnosti alel mezi Bos taurus a Bos indicus. Zjistili, že došlo k úplné fixaci alely DGAT1 A (q) u některých plemen Bos taurus (belgické modré, gelbvieh, hereford, pinzgavský skot a slovinský syrmian) a k úplné fixaci alely DGAT1 K (Q) u plemene Bos indicus (nellore). Plemena Bos taurus se projevují nižší frekvencí alely DGAT1 K (Q). Nejmenší četnost alely Q byla nalezena u plemen pezzata rossa a piemontese (frekvence alely Q okolo 1 %). Loftus et al. (1999) ve své studií tvrdí, že alela DGAT1 A byla nalezena i u afrického plemene n dama stejně tak jako u evropské linie Bos taurus. Naznačovalo by to, že polymorfismus K232A se objevil po divergenci linii Bos taurus a Bos indicus, ale před rozdělením linie Bos taurus do jednotlivých plemen. Předpokládá se totiž, že plemeno n dama bylo domestikováno samostatně, odděleně od evropských plemen Bos taurus. Obrázek 12 zobrazuje rozložení frekvencí alel u 38 plemen. 27

29 Obrázek 12: Znázornění distribuce alely DGA1T A a DGAT1 K u plemen Bos taurus a Bos indicus (Kaupe et al., 2004). Po domestikaci divokého skotu se objevila zvýšená selekce na alelu DGAT1 A u ušlechtilých, evropských plemen z důvodu vyšších požadavků na objem mléka. Substituce v polymorfismu K232A zapříčinila nižší energetický výdej, což podporovalo vyšší fertilitu krávy. I u nedomestikovaných aurochů, kde alela DGAT1 A vznikla, byla upřednostňována přírodním výběrem (Lucy et al. 1992). Před více než 200 lety se začal klást důraz na zvýšený obsah tuku v mléce, jako zdroje energie v lidské výživě. Proto existuje zvýšený selekční tlak pro tuto vlastnost u černo-bílých severoevropských plemen skotu chovaných pro mléčnou produkci (Kaupe et al., 2004). Plemena Bos taurus určená na mléčnou produkci se prokazují vyšší frekvencí alely DGAT1 K. U plemen jersey a německého anglera je vyšší frekvence alely DGAT1 K zapříčiněná konstantní dlouhotrvající selekcí na zvýšený tuk v mléce. U plemene jersey byla nalezena relativní frekvence alely DGAT1 K 0,69 a u novozelandské jersey 0,88 (Spelman et al., 2002). Centra domestikace linií Bos taurus a Bos indicus byla od sebe ve velké blízkosti, kterou dokázal neolitický lid překonat migrací. Proto nemůže být vyloučen kontakt mezi liniemi Bos indicus a Bos taurus. Předpokládá se, že tímto způsobem se objevila alela DGAT1 A, která vznikla u evropských plemen, u zástupců Bos indicus (Kaupe et al., 2004). 28

30 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál Analyzované vzorky Vzorky DNA, které jsem ve své práci analyzoval, byly získány na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomické fakulty, Mendelovy Univerzity v Brně. Soubor činil celkem 260 vzorků DNA izolovaných z krve a pocházejících od býků plemene český strakatý skot Použité přístroje Automatický termální cykler PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research) Automatický termální cykler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) Centrifuga Mikro 20 (Hettich Zentrifugen) Centrifuga Mikro 120 (Hettich Zentrifugen) Electronic UV Transilluminator (Ultra LŪM) Fotoaparát Powershot G6 (Canon) UltraCam - Digital Imaging (Ultra-Lum) Váha Scaltec SBA 41 (Denver Instrument) Votrex Bio Vortex V1 (Biosan) Sekvenátor 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Hitachi) Termostat BE 200 (Memmert GmbH) Třepačka Vortex Genie 2 (Scientific Industries) Použité roztoky a další materiál Použité roztoky a jiný materiál jsou pro větší názornost uváděny vždy u příslušných metod. 29

31 4.2 Metodika Metodika a postup práce byly převzaty z práce Thaller et al. (2003). Návrhy primerů byly převzaty z dizertační práce Bartoňová (2012) PCR Roztoky-PCR reakční směs: Tabulka 1: Složení reakční směsi pro PCR reakci Složka Výsledné množství Pufr pro LA polymerázu (včetně 2,5 mm Mg2 + ) 1,25 µl dntp mix 0,25 µl Přímý primer (BT-DGAT1 2A) 0,25 µl Zpětný primer (BT-DGAT1 2B) 0,25 µl DMSO 0,625 µl LA polymeráza 0,1 µl dh 2 O doplněno do 11,5 µl Celkové množství 11,5 µl Pracovní postup: 1. PCR reakční směs byla připravena na ledu dle tabulky 1 a řádně promíchána. 2. Reakční směs byla rozpipetována po 11,5 µl do mikrozkumavek. 3. K 11,5 µl reakční směsi byl přidán 1 μl testované DNA, obsah mikrozkumavky byl zvortexován. 4. PCR reakce byla provedena v automatickém termálním cykleru (PTC-200 Peltier Thermal Cycler, MJ Research). 30

32 Pro průběh amplifikace byly zvoleny následující podmínky: 95 C/5 min.; 35 cyklů (95 C/30s, 62 C/30s; 68 C/30s); 68 C/7 min.; 4 C /. Délka amplifikovaného fragmentu byla 254 bp. 5. Část PCR produktu byl nanesen na 3% agarózový gel (viz Agarózová elektroforéza) pro ověření průběhu PCR. Zbytek produktu byl uchován při 4 C. Návrhy primerů byly převzaty z dizertační práce Bartoňové (2012): Přímý: (5 - TAG GTC AGG TTG TCG GGG TA - 3 ) Zpětný: (5 - CCA TCC TCT TCC TCA AGC TG - 3 ) RFLP Roztoky- RFLP reakční směs: Tabulka 2: Složení reakční směsi pro RFLP reakci Složka Výsledné množství Pufr pro restrikční endonukleázu RE AciI (10 U/μl) dh 2 O Celkové množství 1,5 μl 0,1 μl doplněno do 10 μl 10 μl Pracovní postup: 1. RFLP reakční směs byla připravena dle tabulky Reakční směs byla rozpipetována po 10 µl do mikrozkumavek. 3. K 10 µl reakční směsi bylo přidáno 5 μl testované DNA, obsah mikrozkumavky byl zvortexován. 4. Reakční směs byla přes noc inkubována v termostatu BE 200 (Memmert GmbH) na konstantních 37 C. 5. Po ukončení inkubace byly vzorky nanášeny na 3% agarózový gel. 31

33 4.2.3 Agarózová elektroforéza Roztoky: 1x TBE pufr (Sigma-Aldrich Corp.) Agarose SERVA Premium (SERVA Electrophoresis GmbH) Marker M50, GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder o rozsahu: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 GelStar (LONZA Ltd.) Ethidium bromid Nanášecí pufr: 40% sacharóza, 0,25% bromfenolová modř v 1x TE pufru Pracovní postup: 1. 1,8 g agarózy bylo rozvařeno v 60 ml 1x TBE pufru v mikrovlnné troubě. 2. Za občasného míchání byl roztok ponechán při pokojové teplotě, aby zchladl na cca 60 C. 3. Do roztoku bylo přidáno 6 µl x koncentrovaného barviva GelStar nebo 12 µl etidium bromidu. 4. Roztok by nalit do vaničky a byly zasunuty hřebínky. Gel polymerizoval 20 minut. 5. Vanička s gelem byla přesunuta do elektroforetické aparatury naplněné 1x TBE pufrem, do jamek bylo nanášeno vhodné množství vzorků smíchaných s 1,5 µl nanášecího pufru. 6. Souběžně se vzorky byl nanesen DNA M50 hmotnostní marker pro určení velikosti PCR a RFLP fragmentů. 6. Elektroforéza probíhala v 1x TBE pufru při napětí 4V/cm po dobu minut. 7. Po separaci byly vzorky vizualizovány Electronic UV Transilluminator (Ultra LŪM). Jako záznamové zařízení byl použit fotoaparát Canon Power Shot G6. 32

34 4.2.4 Sekvenování Roztoky: Sekvenční reakční směs BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Life Technologies Corp.). Tabulka 3: Složení sekvenační směsi Složka Reakční sekvenační mix Sekvenační pufr Přímý primer (BT-DGAT1 2A) PCR produkt dh 2 O Celkové množství Výsledné množství 0,5 μl 1,75 μl 0,16 μl 0,5 μl doplněno do 10 μl 10 μl BigDye XTerminator Purification Kit (Life Technologies Corp.) Postup: 1. Byla připravena sekvenační směs dle tabulky Amplifikace templátu probíhala v termálním cykleru GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Podmínky amplifikace byly zvoleny následující: 95 C/1 min.; 25 cyklů (96 C/10s, 50 C/5s; 60 C/4min); 4 C /. 3. Po amplifikaci byla sekvenační směs purifikována pomocí BigDye XTerminator Purification Kit (Life Technologies Corp.) dle přiloženého protokolu. 4. Ze směsi byly odstraněny terminátory třepáním na třepačce Vortex Genie 2 (Scientific Industries) po dobu 30 min. 5. Vzorky byly analyzovány pomocí automatického sekvenátoru 3500 Genetic Analyzer (Hitachi Applied Biosystems). Pro vyhodnocení výsledků sekvence byl využit Sequence Scanner Software v

35 4.2.5 Popis chemických analýz Vyhotovení chemických analýz a zpracování vzorků provedla Ing. Eliška Dračková v biotechnologické laboratoři. Stanovení obsahu sušiny v mase (%) Sušina byla stanovena vysoušením homogenizovaného vzorku masa o hmotnosti 5 g do konstantní hmotnosti. Vzorek byl smíchán s mořským pískem, vysušeným při 105 C po dvě hodiny. Poté byl vzorek spolu s mořským pískem předsoušen čtyři hodiny při 60 C a poté byl sušen šest hodin při 105 C do konstantní hmotnosti. Vzorek po vychladnutí v exsikátoru byl zvážen. Z rozdílu hmotnosti vzorku po vysušení a původní navážky byl vypočítán obsah sušiny. Stanovení obsahu intramuskulárního tuku v mase (%) Obsah tuku byl zjištěn extrakční metodou podle Soxhleta. Vzorek z předchozího stanovení sušiny byl extrahován s diethyletherem po dobu 6 hodin. Po extrakci byl v digestoři ze vzorku odpařen zbytkový ether a poté se hodinu sušil při 105 C. Obsah tuku byl zjištěn rozdílem mezi váhou vzorku před analýzou a hmotností vzorku po provedené analýze. Tuky jsou látky rozpustné v etheru etylnatém, xylenu a tetrachlormetanu. Stanovení celkového obsahu proteinů v mase (%) Obsah dusíku byl stanoven metodou dle Kjeldahla. Tato metoda se skládá ze tří částí: mineralizace, kdy je dusík převeden na roztok síranu amonného, destilace, která umožňuje přeměnu soli amoniaku na amoniak a titrace slabou kyselinou sírovou. Zjištěný obsah dusíku byl přepočten na obsah bílkovin: N 6,25. Stanovení obsahu popelovin (%) Při stanovení obsahu popelovin se 1-2 g masa postupně spalovali v muflové peci při teplotě C po dobu 8 hodin. Po vychladnutí v exsikátoru byl vzorek zvážen a zjištěn obsah popelovin. 34

36 Stanovení obsahu vaznosti vody masa (%) Dva gramy homogenizovaného vzorku masa na filtračním papíře Whatman č. 2 byl vložen mezi dvě skleněné destičky, které byly zatíženy 500 g závažím po dobu 5 min. Poté byl vzorek opět zvážen a hmotnostní úbytek vody po vylisování masa vyjadřoval procentuální vaznost vody. Stanovení svalových pigmentů masa (mg.g -1 ) Ke stanovení svalových pigmentů bylo využito metody dle Hornseye. K 10 g homogenizovaného vzorku masa byl přidán okyselený roztok acetonu, poté byla provedena filtrace a následně byla zjištěna absorbance na spektrofotometru. Jako standard sloužil okyselený roztok acetonu. Celkový obsah barevných pigmentů byl stanoven v miligramech kyselého hematinu a faktorem 0,026, který byl převeden na miligramy myoglobinu v 1 g svaloviny. Stanovení ph 48 masa Hodnota ph byla zjištěna 48 hodin po porážce zvířete. Hodnota ph je definována jako záporný dekadický logaritmus vodíkových iontů. Byla zjištěna pomocí ph metru WTW se dvěma elektrodami, kdy jedna měřila teplotu a druhá ph. Stanovení remise masa (%) Na hodnoceném vzorku masa byl provedený rovný řez na svalová vlákna těsně před měřením. Měření bylo provedeno ve středu plátku fotokolorimetrem Spekol 11, při vlnové délce 522 nm. 35

37 4.3 Matematicko-statistické zpracování dat Výpočet frekvencí alel a genotypů Tabulka 4: Výpočet frekvencí genotypů (zdroj: Genotypy Absolutní frekvence Relativní frekvence AA Aa aa D H R Součet D +H + R = N d + h + r = 1 Tabulka 5: Výpočet frekvencí alel (zdroj: Alely Absolutní frekvence Relativní frekvence A P = 2D + H a Q = 2R + H Součet P + Q = 2N p + q = 1 Pozn.: D, H, R = absolutní frekvence genotypů d, h, r = relativní frekvence genotypů P, Q = absolutní frekvence alel p, q = relativní frekvence alel N = absolutní frekvence všech jedinců 36

38 4.3.2 Hodnocení genetické rovnováhy dle Hardy-Weinbergova zákona Rovnovážný stav zjištěných frekvencí genotypů byl posouzen dle Hardy- Weinbergova zákona, platí: 1 = p 2 + 2pq + q 2 Na vyhodnocení byl použit statistický test dobré shody - χ 2 (chí kvadrát) test: Kde platí, že: P O Σ α n p 1 pozorovaná četnost genotypů očekávaná četnost genotypů suma hladina významnosti výpočet stupně volnosti 37

39 4.3.3 Asociační analýza Asociační analýza byla provedena pomocí programu SAS v8.2 (SAS Institute Inc.). Jako pevné efekty byly určeny: efekt genotypu, efekt roku porážky a efekt chovu. Mezi náhodné efekty byly zahrnuty: efekt otce a efekt plemene. K vyhodnocení asociační analýzy byla navržena rovnice: y ijklmn = μ + DGAT1 i + rok j + chov k + ot l + plem m + e ijklm Kde platí, že: y ijklmn μ DGAT1 i rok j chov k ot l plem m e ijklm sledovaný znak odhadovaný průměr sledovaného znaku pevný efekt i-tého genotypu genu pevný efekt roku porážky pevný efekt chovu náhodný efekt otce náhodný efekt plemena náhodná chyba každého pozorování 38

40 5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 PCR Polymorfismus K232A genu DGAT1 byl amplifikován pomocí metody PCR. Gen DGAT1 se vyskytuje na 14. bovinním chromozomu a amplifikovaný polymorfismus se nachází v 8. exonu genu DGAT1. Zmnožený fragment byl o délce 254 bp. Pro ověření si amplifikovaného PCR produktu byla využita horizontální agarózová elektroforéza. Obrázky 13 a 14 zobrazují namnožené fragmenty jednotlivých vzorků. Je patrný rozdíl v použití vizualizačního barviva GelStar, které je senzitivnější, a ethiduim bromidu. Obrázek 13: Amplifikovaný úsek DNA, gen DGAT1. Fragmenty jsou naneseny na 3% agarózový gel, jako vizualizační barvivo byl použit GelStar. Obrázek 14: Amplifikovaný úsek DNA, gen DGAT1. Fragmenty jsou naneseny na 3% agarózový gel, jako vizualizační barvivo byl použit ethidium bromid. 39

41 5.2 RFLP Amplifikovaný produkt PCR reakce byl štěpen restrikční endonukleázou AciI. Metodou RFLP vznikly fragmenty o délce 161 bp, 53 bp, 30 bp, 10 bp pro alelu q (GC) a fragmenty 161, 83, 10 pro alelu Q (AA). Teoretickou vizualizaci štěpení zobrazuje obrázek 15. Obrázek 15: Vizualizace štěpení RE AciI polymorfismu K232A genu DGAT1. Pro vyhodnocení genotypů vzorků byla využita horizontální agarózová elektroforéza. Výsledek metody RFLP je vyobrazen na obrázcích 16 a 17. Je patrné, že genotypy Qq a QQ se na agarózovém gelu nedají rozeznat. Proto bylo dále využito metody sekvenování (viz. 5.3 Sekvenování). V obrázku 16 snadno odlišíme vzorky 55 a 58, sekvenování ověřilo, že se jedná o genotyp Qq. Zbylé vzorky bylo možné identifikovat na základě metody RFLP, jedná se o genotypy qq. Obrázek 16: Štěpený PCR produkt (gen DGAT1) restrikční endonukleázou AciI. 40

42 Obrázek 17: Štěpený PCR produkt (gen DGAT1) restrikční endonukleázou AciI. Genotypy QQ a Qq nelze na základě metody RFLP rozlišit. Pro větší názornost jsou zvýrazněny. 5.3 Sekvenování Z důvodů nerozpoznání genotypů QQ a Qq bylo využito metody sekvenování PCR produktů. Obrázky 18, 19 a 20 zobrazují výstupy ze sekvenátoru. Obrázek 18: Ukázka homozygota QQ (AA/AA) v genu DGAT1. 41

43 Obrázek 19: Ukázka heterozygota Qq (AA/GC) v genu DGAT1. Písmeno R značí, že se jedná o purinovou bázi (možnost výskytu báze A/G), písmeno M značí, že se jedná o aminoskupinu (možnost výskytu báze A/C). Obrázek 20: Ukázka homozygota qq (GC/GC) v genu DGAT1. 42

44 5.4 Matematicko-statistické vyhodnocení Výpočet frekvencí alel a genotypů Celková populace obsahovala 260 zkoumaných jedinců. U všech byl stanoven genotyp. Určení absolutních a relativních frekvencí genotypů a alel bylo provedeno dle tabulek v kapitole 4.5 Matematicko-statistické zpracování dat. Tabulka 6: Frekvence genotypů genu DGAT1 Alely Absolutní frekvence Relativní frekvence Q 40 0,0777 q 480 0,9231 Součet 560 p + q = 1 Tabulka 7: Frekvence alel genu DGAT1 Genotypy Absolutní frekvence Relativní frekvence QQ 3 0,0115 Qq 34 0,1307 qq 223 0,8576 Součet Ve zkoumané populaci byl nejvíce zastoupen genotyp qq s 223 jedinci. Heterozygotní stav Qq byl detekován u 34 jedinců. Nejméně četný byl genotyp QQ, který byl zastoupen pouze 3 jedinci. Frekvence genotypů je QQ 1,15 %, Qq 13,07 % a qq 85,76 %. Početnější alelou v populaci je alela q s četností 92,31 %. Alela Q má četnost 7,69 %. 43

45 V kapitole ( Polymorfismus K232A v genu DGAT1) se zmiňuji o tom, že distribuce alely Q a q je rozdílná u linií Bos indicus a Bos taurus. Kaupe et al. (2004) pozorovali u plemen česká červinka četnost alely Q 14 % a u německého simmentála 6 % (jedná se o podobné plemeno skotu jako je v mém pozorování: český strakatý skot). Souza et al. (2010) zkoumali soubor 357 jalovic indického plemene nellore. Frekvence genotypu QQ byla 94 %, Qq 5 % a qq pouhé 1 %. Distribuce alely Q byla 97 % a alely q 3 %. Cardoso et al. (2011) studovali 349 krav plemene girolando (kříženec mezi plemenem qir zástupcem Bos indicus a holštýnským skotem). Frekvence genotypu QQ byla 27 %, Qq 54 % a qq 27 %. Distribuce alely Q byla 54 % a alely q 46 %. Jelikož se jedná o plemeno vzniklé křížením Bos indicus a Bos taurus, pozorujeme vysoký výskyt heterozygotů pro polymorfismus K232A v genu DGAT1. Obě studie tak potvrdili výsledky Kaupe et al. (2004), kteří pozorovali vyšší frekvenci alely Q u linie Bos indicus. Anton et al. (2011) identifikovali 173 jedinců plemene červený angus. Frekvence genotypů pozorovaného vzorku byla QQ 5,2 %, Qq 27,75 % a qq 67,05 %. Frekvence alely Q byla tedy vyšší než u mého pozorování, které uvádím výše ve své práci. Li et al. (2013) uvedli ve své studii pozorování 243 býků pěti plemen. Soubor vzorků činil 43 kusů plemene angus, 109 jedinců plemene charolais, 35 kusů limousin a 21 býků plemene simmentál. Pozorovali u nich četnosti alely q 81 % (angus), 89 % (charolais), 100 % (hereford), 94 % (limousin) a 100 % (simmentál). Distribuce alely q v celém pozorování byla 91 %. Bartoňová (2012) ve své dizertační práci testovala 152 kusů dojnic českého strakatého skotu. Pozorovala 95,4 % jedinců s genotypem qq, 4,6 % jedinců s genotypem Qq a žádného homozygota QQ. Frekvence alely q byla 97,7 % a alely Q 2,3 %. Horecký (2013) ve své diplomové práci testoval 77 jedinců plemen highland a galloway. Frekvence genotypů pozorovaného vzorku byla qq 93,5 %, Qq 6,5 % a žádného jedince s genotypem QQ. Frekvence alely q byla 97,7 % a alely Q 2,3 %. Oba autoři uvádějí ve svých pracích nižší distribuci alely Q, než v mém testovaném vzorku skotu. Lešková et al. (2013) pozorovali 57 jedinců slovenského strakatého skotu. Metodou PCR-RFLP identifikovali 45 homozygotů qq (AA, varianta kódující alanin), 10 heterozygotů Qq (AK, varianta kódujíci alanin i lyzin) a 2 homozygoty QQ (KK, varianta kódující lyzin). Frekvence alel byly spočteny u alely q na 87,7 % a u alely Q na 12,3 %. 44