KAM KRÁČÍ ANALYTICKÁ CHEMIE?

Transkript

1 KAM KRÁČÍ ANALYTICKÁ CHEMIE? doc. RNDr. Vlastimil Dohnal, Ph.D. Podpora přednášky kurzu Mezioborové dimenze vědy

2 KAM KRÁČÍ ANALYTICKÁ CHEMIE? doc. RNDr. Vlastimil Dohnal, Ph.D. Katedra chemie, PřF UHK

3 ??? Kolik obsahuje mykotoxinů? Kolik má dusíkatých látek? Jaký je poměr amylosa/amylopektin? Jaký je obsah beta-glukanů? Kolik má v sobě vitamínů? Obsahuje těžké kovy? Je skutečně pouze z pomerančů? Odkud pochází? Kolik je účinné látky v tabletě? Jak čistá byla účinná látka?

4 ANALYTICKÁ CHEMIE Interdisciplinární obor zabývající se složením zkoumaného vzorku Otázky CO? KOLIK? KDE? Kvalitativní analýza, důkaz jedné či více složek (prvky, funkční skupiny) ve vzorku. Kvantitativní analýza stanovení množství látky ve vzorku. Analytická topografie - rozložení analytu ve vzorku (povrch, jádro, atd.) STRUKTURA Strukturní analýza prostorové uspořádání atomů v molekule

5 ANALYTICKÉ METODY Jednoduché testy Složité instrumentální metody

6 SCHÉMA ANALYTICKÉHO POSTUPU Výběr vhodné metody Odběr vzorku Příprava vzorku k analýze Separace Měření Validace metody Vyhodnocení výsledků

7 TRENDY VE VÝVOJI METOD Zvyšování citlivost, přesnosti a selektivity instrumentálních metod Snižování ekonomické a časové náročnosti Vývoj nedestruktivních metod Automatizace, laboratorní roboti

8 VYBRANÉ SKUPINY LÁTEK mykotoxiny

9 PLÍSNĚ (VLÁKNITÉ MIKROMYCETY) Je známo více jak kmenů plísní Nejčastěji Aspergillus, Penicillium a Fusarium Extracelulární trávení Biodegradace organické hmoty absorpce Produkce více jak sekundárních metabolitů

10 ČLOVĚK A PLÍSNĚ Benefity Houby jako potrava Fermentace Asijské potraviny, sýry Výroba Enzymy, organické kyseliny, antibiotika, steroidy, léčiva apod.

11 PRŮMYSLOVÉ VYUŽITÍ PLÍSNÍ Claviceps purpurea Ergotové alkaloidy Aspergillus niger Kyselina citronová (>99 %) Rhizopus oligosporus Tempeh Aspergillus oryzae Fermentované sojové omáčky

12 PLÍSNĚ OHROŽUJÍCÍ Negativní vliv Paraziti Změny Mykózy Vůně, morfologie, barvy, chuti apod. Snížení nutriční hodnoty Aminokyseliny, sacharidy, tuky Toxické metabolity Mykotoxikózy Tvorba alergenů

13 PLÍSNÍM NA STOPĚ

14 DETEKCE POMOCÍ DNA A KULTIVACÍ PCR kultivace PCR detekce ( )

15 ERGOSTEROL JAKO BIOMARKER 1977 Seitz a kol. marker přítomnosti plísní Dnes Extrakce, stanovení HPLC Marker kvality rajčat Kvalita odpadních vod Monitoring plísní Sklady, domy, města apod.

16 STANOVENÍ ERGOSTEROLU Imunochemicky Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kapalinová chromatografie UV detekce Hmotnostní detekce

17 PŘÍKLAD ANALÝZA PÍCNIN Stanovení ergosterolu ve třech pícninách metodou HPLC/UV Cíle Vliv druhu Vliv doby sklizně Festuca arundinacea x Lolium multiflorum Dactylis glomerata Arrhenatherum elatius

18 PŘÍPRAVA VZORKU zmýdelnění 250 mg vzorku 2 ml 10% KOH v methanolu C 0.5 ml H 2 O Extrakce 3 x 1 ml hexan

19 HPLC/UV STANOVENÍ 0,8 A [mau] 0,6 0,4 0, Modified method: čas [min] ergosterol Varga, M., Bartók, T., Mesterházy, Á. Determination of ergosterol in Fusarium-infected wheat by liquid chromatography atmospheric pressure photoionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1103 (2006) Chromatograph Agilent HP1100 Column Zorbax SB-C18 (4.6 x 30 mm, 1.8 m) Isocratic elution methanol/h 2 O (97.5:2.5, v/v) Flowrate 0.6 ml/min Temperature 25 C UV 282 nm Injected 2 l of sample Calibration using standard addition method Matrix influence elimination

20 VÝSLEDKY říjen listopad prosinec Festulolium 40,94 10,68 30,29 4,46 212,04 15,92 Dactylis glomerata Arrhenatherum elatius 52,02 13,01 59,29 7,32 339,63 33,94 39,70 9,04 49,43 4,71 314,05 48,19

21 VÝSLEDKY pícnina měsíc seč červen [mg/kg] červen + červenec [mg/kg] Festulolium (Festuca arundinacea x Lolium multiflorum) říjen 59,90 12,14 21,98 7,97 listopad 38,76 0,75 21,82 5,21 prosinec 210,71 10,22 213,36 34,07 Dactylis glomerata říjen 72,92 19,93 31,11 3,46 listopad 69,75 4,42 48,82 11,78 prosinec 342,36 56,23 336,90 50,89 Arrhenatherum elatius říjen 52,53 10,07 26,86 11,93 listopad 44,53 4,65 54,33 8,08 prosinec 216,35 27,08 411,75 36,52

22 ZÁVĚR Obsah ergosterolu vzrůstá od října do prosince (až 5x) Senoseč Červen + červenec = méně ergosterolu v říjnu a listopadu než pro sklizeň pouze v červnu V prosinci nepozorovány významné rozdíly Pozorovány mezidruhové rozdíly Festulolium nejodolnější

23

24 DETEKCE METABOLITŮ Více jak sekundárních metabolitů Metabolické markery Těkavé organické látky Ergosterol Chitin a chitosan Mykotoxiny

25 TĚKAVÉ ORGANICKÉ LÁTKY Plynová chromatografie Kapalné či plynné vzorky I složité směsi

26 TĚKAVÉ ORGANICKÉ LÁTKY Iontová mobilita Odpaření vzorku Ionizace v plynné fázi Detekce Měření doby letu trubicí

27 HMOTNOSTNÍ DETEKTOR

28 Q-TOF MS

29 IONTOVÁ MOBILITA Iontově mobilitní spektrometr na mikročipu

30 DESI (DESORPTION ELECTROSPRAY IONIZATION)

31 DESI

32 DART (DIRECT ANALYSIS IN REAL TIME)

33 DART

34 ELEKTRONICKÉ NOSY Zachycení těkavých látek Detekce Převod změny vlastnosti na elektrickou veličinu Zpracování signálu využití kalibrace pomocí předem změřené databáze (A) metal-oxide sensor, (B) surface acoustic wave, (C) quartz crystal sensor, (D) sensor array

35 ELEKTRONICKÉ NOSY

36 OTISKY PRSTŮ ( FINGERPRINTS ) Hmotnostní spektrometrie Plynová chromatografie

37 TRENDY DO BUDOUCNA Využití hmotnostně spektrometrické detekce Modelování obsahu ergosterolu v závislosti na počasí Inkorporace produkce mykotoxinů do tohoto modelu Předpověď a výběr faktorů ovlivňujících kontaminaci pícnin plísněmi (ergosterol, mykotoxiny) Využití modelu pro prevenci a minimalizaci kontaminace potravin/krmiv plísněmi

38 MYKOTOXINY Je známo více jak sekundárních metabolitů plísní OCHRATOXIN A CITRININ Některé jsou toxické pro lidi nebo zvířata 450 známo ZEARALENON TRICHOTHECENY LEDVINY TRICHOTHECENY ÚSTNÍ DUTINA se odhaduje REPRODUKČNÍ ORGÁNY STŘEVA 20 se běžně vyskytuje ERGOT. TOXINY KREV KŮŽE JÁTRA AFLATOXINY OCHRATOXIN A RUBRATOXIN B SATRATOXIN AFLATOXINY OCHRATOXIN A TRICHOTHECENY

39 MYKOTOXIKÓZY Mycotoxicosis Mycotoxin Producent Aflatoxicosis Aflatoxins Aspergillus flavus AcuteDON toxicosis Deoxynivalenol Fusarium sp. Acute cardiial beri-beri Citreoviridin Penicillium citreoviride Alimentar toxic aleukia Trichothecens, (DON, T-2 toxin) Fusarium sp. Balcan endemic nephropathy Ochratoxin A Aspergillus ochraceus Ergotism Ergot alkaloids Claviceps purpurea Kvashiokor Aflatoxins Aspergillus flavus Renal tumors Ochratoxin A Aspergillus ochraceus Yellow rice disease Citrinin, citreoviridin, etc. Penicillium citreoviride Red mold disease Deoxynivalenol Fusarium sp. Primar hepatic carcinom Aflatoxins Aspergillus flavus Cancer Fumonisins Fusarium moniliforme Rey syndrome Aflatoxins Aspergillus flavus Stachybotryotoxicosis Trichothecenes Fusarium sp.

40 VÝSKYT Limity jsou ve více jak 100 zemích Více jak 25 % cereálií je kontaminováno Produkce Na poli (Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Diplodia, Giberella etc.) Ve skladu (Aspergillus, Penicillium etc.) Na poli i ve skladu (Penicillium)

41 ANALÝZA MYKOTOXINŮ Vzorkování Mletí a homogenizace Extrakce Filtrace Čištění extraktu Příprava k analýze Analýza Zpracování dat

42 ODEBRÁNÍ VZORKU Přibližně 80 % chyb Neuniformní výskyt ve vzorku Vzorkovací plány

43 FUMONISINY Objeveny v roce 1988 Produkovány Fusarium verticillioides Je známo více jak 28 fumonisinů Toxicita FB 1 >FB 2 >FB 3 O HO O O O HO O O O OH OH OH O OH OH OH CH 3 CH 3 OH NH 2 CH 3 CH 3 NH 2 O OH O OH O O HO O Fumonisin B1 O O HO O Fumonisin B2

44 ANALÝZA Příprava vzozrku C18, imunoafinitní kolonky, SPE, SPME, extrakce kapalinakapalina Stanovení ELISA Chromatografie Tenkovrstvá HPLC SPE Mycosep

45 IMMUNOASSAY - ELISA Princip Metoda v některých případech není selektivní Falešné pozitivní/negativní výsledky

46 TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE Detekce UV/VIS fluorescence

47 STANDARDNÍ ANALÝZA HPLC-MS Příprava vzorku Mixer nebo třepačka Stanovení pomocí HPLC-MS Validace metody Testování FAPAS Aplikace Porovnání GMO a konvenční kukuřice Testování kukuřičných výrobků

48 LC-MS/MS TIC FB 1 FB 2 HPLC 5 l vzorku Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm), guard column Metaguard ODS-2 (30 x 4,6 mm; 5 μm) Mobile phase 5 mm ammonium acetate/acetic acid; ph 3 Acetonitril (ACN) time [min] Fumonisin identification FB 1 FB 2 m/z identification m/z identification 744 [FB 1 +Na + ] [FB 2 +Na + ] + MS Gradient elution 0 min 33% ACN, 8 min 60% ACN Flowrate 0.8 ml/min Capillary voltage 6000 V Fragmentor 300 V Nebulizer gas flow 11 l/min Nebulizer pressure 60 psig 721 [FB 1 +H + ] [FB 1-2TCA-H 2 O+H + ] [FB 1-2TCA-2H 2 O+H + ] [FB 2 +H + ] [FB 2-2TCA-H 2 O+H + ] [FB 2-2TCA-2H 2 O+H + ] + 47

49 VÝHLED DO BUDOUCNA

50 MOLEKULÁRNĚ VTIŠTĚNÉ POLYMERY Syntetické receptory Molekulární paměť Vlastnosti Afinita Specifita Reverzibilita Výhody oproti ELISA Nízká cena Rychlá syntéza Žádné testy na zvířatech Stabilita Tepelná, ph, dlouhodobé skladování Opětovné použití Více jak100x

51 MOLEKULÁRNĚ VTIŠTĚNÉ POLYMERY Stacionární fáze pro HPLC Receptory pro senzory SPE založená na MIP Vyšší selektivita než C18 nebo aktivní uhlí Nižší cena než imunoafinitní kolonky Recyklovatelné

52 BUDOUCÍ TRENDY VE STANOVENÍ MYKOTOXINŮ Kapalinová chromatografie tandemová hmotnostní spektrometrie Série mykotoxinů v jedné analýze Vysoká rychlost Použití izotopicky značených vnitřních standardů Drahé přístroje Rychlotesty (lateral flow) Tři až čtyři mykotoxiny v analýze Nízká cena

53 PROČ VÍCE MYKOTOXINŮ? Potraviny a krmiva mohou být kontaminovány více mykotoxiny Různá toxicita mykotoxinů jedné skupiny Eg. FB 1 > FB 2 > FB 3 Synergický efekt Aditivní efekt v toxicitě Antagonismus mezi mykotoxiny

54 LC-MS/MS 19 mykotoxinů

55 LC-MS/MS 71 mykotoxinů

56 LC-MS/MS Současné stanovení 186 metabolitů plísní a bakterií ve vzorcích z bytu pomocí kapalinové chromatografie s detekcí tandemovou hmotnostní spektrometrií Vinay Vishwanath & Michael Sulyok & Roman Labuda & Wolfgang Bicker & Rudolf Krska Anal Bioanal Chem (2009) 395:

57 LATERAL FLOW TEST

58 konjugace MASKOVANÉ MYKOTOXINY Produkt konjugace a biotransformace mykotoxinů Mohou být hydrolyzovány během trávicích procesů a ovlivnit zdraví lidí/zvířat v důsledku uvolnění volného mykotoxinu Nedetekovatelné konvenčními metodami hydrolýza Deoxynivalenol-3-glukosid 45 % DON v pšenici

59 ANALYTICKÉ PROBLÉMY Vyšší polarita než volné mykotoxiny Problémy s extrakcí Ztráty během extrakce Standardy nejsou dostupné Možno syntetizovat Křížová reaktivita ELISA DON a DON-3-Glu Nadhodnocení výsledků Detekovatelné pouze metodou LC- MS/MS

60 DALŠÍ TRENDY V ANALYTICKÉ CHEMII

61 TĚŽKÉ KOVY X-ray fluorescence Příprava vzorku Mletí, lisování, bez úpravy Analýza X-Ray fluorescence Laser induced break down spectroscopy (LIBS) Výhody Použití pro prvky N = 11 až 95 Minimální příprava vzorku Ruční přístroj

62 X-RAY FLUORESCENCE Princip Spektrum

63 TĚŽKÉ KOVY LIBS Příprava vzorku Lisování Analýza Excitace laserovým pulsem Všechny prvky Limitace energií laseru, citlivostí detektoru či spektrografu Eliminace matrice kalibrací

64 LIBS Přístrojové uspořádání Spektrum Představení přístroje ST-LIBS v Arizonské poušti. Výzkum byl podpořen NATO.

65 TĚŽKÉ KOVY Detekce mědi 1-(2-pyridylazo)-2-naftol (PAN) Chromazurol S (CS)

66 ZÁVĚR Minimální příprava vzorku Jednoduché i sofistikované metody Rychlost analýzy

67 Děkuji za pozornost.