MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Brno 2009 Eliška Karásková

2 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Molekulární mechanismy regulující časná stádia vývoje zubu a možnosti realizace těchto procesů in vitro Brno 2009 Eliška Karásková

3 Poděkování: Za pomoc a odborné konzultace při vypracování bakalářské práce děkuji svému školiteli doc. MVDr. Aleši Hamplovi CSc. a odbornému konzultantovi doc. Ing. Petrovi Dvořákovi, CSc. Dále bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Evě Matalové, PhD. za poskytnutí cenných informací v oblasti embryonálního vývoje zubů. Tato práce vznikla na pracovišti Biologického ústavu LF MU a Ústavu experimentální medicíny, AV ČR.

4 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně na základě pokynů a rad vedoucího práce, doc. MVDr. Aleše Hampla CSc. Veškeré použité zdroje informací jsou v práci řádně citovány.

5 OBSAH 1. ÚVOD KMENOVÉ BUŇKY SOMATICKÉ KMENOVÉ BUŇKY EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY ROZDĚLENÍ DIFERENCIAČNÍCH SCHOPNOSTÍ KMENOVÝCH BUNĚK ANATOMIE ZUBU TYPY ZUBŮ VÝVOJ ZUBU ROLE KRANIO-NEURÁLNÍ LIŠTY VE VÝVOJI ZUBŮ ROLE INTERAKCÍ MEZI EPITELEM A MEZENCHYMEM FÁZE VÝVOJE ZUBU INICIAČNÍ FÁZE FÁZE PUPENE FÁZE POHÁRKU FÁZE ZVONKU TVORBA BIO-ZUBU JAK SE TVOŘÍ BIO-ZUB Přenesení embryonálního vývoje Rekonstrukce zubu v ústech Tvorba zubů založená na biologickém lešení KONTROLA TVARU A VELIKOSTI ZUBU RŮST BIO-ZUBU V ČELISTI PROŘEZÁVÁNÍ BIO-ZUBU ČELISTÍ ZÁVĚR POUŽITÉ ZKRATKY LITERATURA... 26

6 1. ÚVOD Teze omnis cellula a cellula každá buňka (pochází) z buňky, která popisovala, že tkáně savců obsahují vůdčí buňky, jež se uplatňují při vzniku jiných buněk byla formulována v 19. století Virchowem a Schwannem. Systematické a intenzivní studium kmenových buněk bylo odstartováno prací Tilla a McCullocha v Torontu roku 1961, která si kladla za cíl pochopit rozdíl mezi radiosenzitivitou normálních a rakovinných buněk. Z pohledu současných poznatků je nejvýznamnějším pokrokem v pochopení biologie kmenových buněk objevení způsobu kultivace lidských embryonálních kmenových (hes) buněk in vitro Jamesem Thomsonem z Univerzity of Winsconsin a izolace lidských embryonálních zárodečných buněk Johnem Gertem z John Hopkins Hospital v roce Lidé tímto krokem přinutili kmenové buňky zachovat si své vlastnosti a funkce i mimo přirozené prostředí, což otevřelo cestu ke snadnému množení, manipulaci a cílené diferenciaci buněk, a tím pádem i k využití kmenových buněk v buněčné terapii a tkáňovém inženýrství. Možnost laboratorního vytvoření lidských orgánů de novo a jejich užití při transplantaci je velmi atraktivní myšlenka. Pokud by navíc tyto orgány byly vytvořené z vlastních buněk pacienta (autologně), představovalo by to revoluci v transplantaci orgánů a jejich nahrazení by se tak stalo běžným chirurgickým zákrokem. Nejdříve ale musí být překonány dva základní problémy. Za prvé vytvoření takových metod, které by dokázaly obnovit orgán představující vysoce specializovaný komplex diferencovaných buněk, a za druhé testování uměle vytvořených orgánů na pacientech. Většina výzkumů je zaměřena na obnovení životně důležitých orgánů. Ale právě proto, že tyto orgány jsou pro lidský život tak nezbytné, jejich testování je velmi obtížné. Alternativní cestou v pokračování výzkumů a získávání potřebných znalostí v této oblasti je zaměření se na orgány, které nejsou pro zachování lidského života tak důležité. Zuby jsou umístěné blízko povrchu těla, jsou viditelné v ústech, a proto snadno přístupné. Jejich odstranění a následné nahrazení nevyžaduje nebezpečné chirurgické zákroky. Nejsou pro život esenciální, ačkoli jejich ztráta a chybění představuje snížení kvality života, a proto je jejich biologická náhrada vítána. Tímto zuby poskytují důležité výhody pro zkušební procesy a ověřování konceptu orgánového inženýrství. Ve své práci se pokusím prezentovat základní poznatky týkající se vývoje zubu z kmenových buněk a shrnout molekulární podstatu mechanismů řídících diferenciaci kmenových buněk do buněk tvořících zub, což přestavuje hlavně popis drah signálních molekul s tímto procesem spojených. 5

7 2. KMENOVÉ BUŇKY Kmenové buňky se nachází ve většině mnohobuněčných organismů. Jsou charakterizované schopností obnovovat samy sebe a diferencovat se do rozmanitého množství specializovaných buněčných typů. Mikroprostředí, ve kterém se kmenové buňky vyskytují se označuje jako nika (koutek) kmenových buněk, k jehož struktuře přispívá více typů buněk, extracelulární matrix a různé solubilní faktory, které podporují sebeobnovu kmenových buněk (Scadden 2006). Z pohledu jejich účasti na vývoji jedince, lze rozlišit dva typy kmenových buněk: kmenové buňky časného embrya (embryoblast, ICM), a somatické (tkáňové) kmenové buňky, které se nachází v tkáních dospělého organismu. Kmenové buňky můžeme také definovat jako klonogenní buňky, které mají schopnost vlastní obnovy a schopnost mnoholiniové diferenciace (Weissman 2000) Somatické kmenové buňky Vlasy, kůže, krev, střeva, játra, mužské zárodečné buňky a mnoho dalších představují tkáně a orgány, které jsou schopny vlastní sebeobnovy a tedy obsahují somatické kmenové buňky. Ve všech těchto příkladech somatické kmenové buňky uplatňují svoji základní vlastnost - zachování schopnosti trvalého dělení za účelem obnovení tkáně, ve které se nachází. Například kmenové buňky krvetvorby dávají vznik krevním buňkám, ale nemohou již dát vznik buňkám jiných orgánů a tkání. Vývojový potenciál somatických kmenových buněk je proto omezen. Tato myšlenka je přijímané dogma, ale podle výsledků současného výzkumu není vyloučeno, že kmenové buňky jsou schopny podstupovat transdiferenciaci in vitro kultivací s vhodnými faktory. Ty tkáně a orgány, které si nedokáží udržet dostatečné množství kmenových buněk se samy obnovovat nemohou. Proč si některé tkáně dokáží udržet kmenové buňky a jiné ne, není dosud známo a je předmětem aktivního výzkumu. Nepřítomnost dostatečného množství kmenových buněk se týká mozku, srdce, míchy oka a ledvin. Do skupiny somatických kmenových buněk jsou v současné době také zařazovány kmenové buňky fetální, které se uplatňují během vývoje plodu. Klasifikace těchto buněk však zůstává zatím nejasná Embryonální kmenové buňky Během embryonálního vývoje savců je embryo ve fázi blastocysty tvořeno dvěma typy buněk: vnitřní buněčnou masou (ICM = Inner Cell Mass) (obr.1), která dává vznik všem třem zárodečným vrstvám, a trofoblastem, který podporuje růst embrya. Embryonální kmenové buňky 6

8 (ES buňky) jsou izolované z ICM, jsou v plně nediferenciovaném stavu, mají schopnost neomezené proliferace a samy se mohou neustále obnovovat. Obr. 1: Blastocysta bez zóna pellucida. Šipka naznačuje ICM. Fotografie pořízená v laboratoří biologického ústavu LF MU. Lidské embryonální kmenové buňky (hesc = Human Embryonic Stem Cell) jsou schopny nejen asymetrického dělení, jaké je známo u ostatních typů kmenových buněk, ale i dělení symetrického, které u nich převažuje. Během symetrického dělení si obě dceřinné buňky zachovávají vlastnosti buňky mateřské, zatímco při asymetrickém dělení si tyto schopnosti ponechává pouze jedna z nich a druhá se diferencuje do specifického typu. Schopnost diferenciace mají hescs nejen in vitro, ale i in vivo (Thomson et al., 1998). In vitro se mohou diferencovat spontánně a vytvářet tak buňky všech tří zárodečných vrstev (obr. 2): ektodermu (tvořící např. neurony, kůži), mezodermu (vytvářející např. svaly, kosti a chrupavky) a entodermu (tvořící např. hepatocyty či pankreatické β-buňky). V neadherentních podmínkách vytvářejí hescs tzv. embryoidní tělíska (Obr. 3), což jsou sférické útvary obsahující také buňky všech tří zárodečných vrstev (Reubinoff et al., 2000). 7

9 Obr.2: Diferenciace pluripotentních hes do mezodermu, ektodermu a endodermu. Imunocytochemické značení znázorňuje nediferencované hes buněčné kolonie s pozitivní imunoreaktivitou na Oct-4 (zeleně) a SSEA-4 (červeně). Kultury in vitro diferencovaných hes buněk vykazují imunoreaktivitu na hladký sval (mezoderm), beta-tubulin III (ektoderm) a alfa fetoprotein (endoderm). Převzato z (Hoffman,Carpenter, 2005). Obr. 3: Fotografie embryoidních tělísek kultivovaných 6dní v MCM, pořízené skenovacím elektronovým (a), světelným (b) a transmisním elektronovým mikroskopem. Převzato z (Desbillets et al, 2000). 8

10 2.3. Rozdělení diferenciačních schopností kmenových buněk Vývojová kapacita kmenových buněk má určitou stupnici, jejíž mírou je schopnost těchto buněk se diferencovat do různých buněčných typů. Podle stupně diferenciační vývojové kapacity se buňky běžně kategorizují na totipotentní, pluripotentní, multipotentní a unipotentní. Totipotence je schopnost vyvinout se do jakéhokoliv jiného typu buněk, který se v organismu vyskytuje, totipotentní je např. zygota. Pluripotentní kmenové buňky se přetvářejí do mnoha různých typů buněk s výjimkou buněk trofoblastu (zevního obalu savčího embrya). Speciálním případem pluripotence je multipotence, vlastnost, která umožňuje kmenovým buňkám se přeměnit do více typů, ale pouze v rámci dané tkáně. Unipotence přestavuje možnost produkovat pouze jediný typ buněk. Kmenové buňky s touto vlastností se liší od normálních (nekmenových) buněk tím, že jsou schopné se plně samy obnovit. 3. ANATOMIE ZUBU Obr.4: Prořezávající se zub. Schématicky nakreslenou autorkou práce. Na obrázku je vidět podélný řez zubem, který znázorňuje vrstvy zubu a jeho vnitřní strukturu. Zjednodušeně lze stavbu zubu rozdělit na korunku, krček a kořen. Korunka 9

11 představuje část zubu, která vyrůstá z dásně a je potažena sklovinou. Krček tvoří předěl mezi korunkou a kořenem. Kořen je oblast zubu která leží pod dásní. Vnitřní stavbu zubu tvoří sklovina, dentin, dřeň a cement. Sklovina je nejtvrdší látka v lidském těle, dokonce tvrdší než kost, chránící podložní dentin. Svoji tvrdost získává díky vysoké koncentraci vápníku a fosforovým krystalkům, které jsou obsažené v její proteinové matrix. Jakmile se během vývoje zubu vytvoří sklovina, její minerální složení se během života téměř nemění a není považována za živou tkáň. Hlavní část zubu představuje dentin, nažloutlá tkáň ležící pod sklovinou. Tato látka je poněkud měkčí než sklovina, se strukturou podobající se spíše kosti, pružná a stlačitelná. Vyztužuje zubní sklovinu a čelí tlaku, který vzniká při kousání a žvýkání potravy. Dentin je považován za živou citlivou tkáň díky mikrotubulům, které obsahuje. Tyto mikrotubuly prochází skrz jeho strukturu do zubní dřeně a spojují ho tak s centrálními nervy zubu. Pod dásní je dentin kořene místo skloviny pokrytý tenkou vrstvou cementu. Cement je tvrdá, kosti podobná látka, ležící mezi kořenovým dentinem a periodontální membránou, která udržuje zub zasazený v čelistní kosti. Ve většině případů na sebe cement a sklovina navazují v oblasti zubního krčku. Dřeň představuje centrální část zubu, můžeme ji rozdělit na dřeňovou komoru a kořenový kanál. Komora leží v korunce zubu a kanál v kořeni. Dřeň je tvořena měkkou pojivovou tkání, krevními i lymfatickými vlásečnicemi a nervy. Krevní vlásečnice slouží k zásobování zubu nezbytnými živinami, lymfatické cévky přivádí do zubu leukocyty, které zde plní antiinfekční úlohu, nervy přenáší vnímání bolesti do mozku. Zmíněné části zubní dřeně vstupují do kořenového kanálu skrz malý otvor ve špičce kořene a prochází kořenovým kanálem až do dřeňové komory. 4. TYPY ZUBŮ Všechny zuby mají stejnou vnitřní strukturu, ale z hlediska morfologie se liší a to hlavně tvarem korunky a počtem kořenů. Tvarové odlišnosti zubů jsou spojeny s různorodou funkcí při zpracování potravy. Dospělý člověk má 32 zubů, které můžeme rozdělit do 4 různých typů. Zuby přední ( jedničky a dvojky ) se nazývají řezáky jsou ploché, mají jeden dlouhý kuželový kořen, jejich kousací hrana je ostrá a v ústech je jich osm. Čtyři v horní čelisti a čtyři v dolní čelisti. Jejich funkcí je ukousnutí potravy. 10

12 Po obou stranách následují špičáky ( trojky ) dva v horní a dva v dolní čelisti. Jsou větší a mají delší kořen než řezáky. Tvar špičáků se vyznačuje velkou, kuželovitou korunkou, která vyčnívá přes úroveň ostatních zubů. Pomáhají v utrhnutí a ukousnutí sousta Vedle špičáků jsou zuby třenové ( čtyřky a pětky ) čtyři v horní a čtyři v dolní čelisti. Široká plochá korunka má dvě pyramidové vyvýšeniny neboli hroty. Podílejí se na rozžvýkávání potravy. Za nimi leží stoličky ( šestky a sedmičky ) čtyři v horní a čtyři v dolní čelisti, tvoří zadní část lidské dentice. Stoličky mají značně široký, plochý povrch a 2-4 kořeny. Jsou používány k finálnímu rozmělnění a rozžvýkaní potravy před polknutím. Zubní oblouk končí zubem moudrosti ( osmičkou ), další stoličkou, která se prořezává v ústech jako poslední. Zuby moudrosti jsou dva v horní a dva v dolní čelisti. 5. VÝVOJ ZUBU Vývoj savčích zubů je regulován prostřednictvím vzájemných, po sobě jdoucích interakcí, mezi mesenchymálními buňkami odvozenými z kranio-neurální lišty a ústním epitelem. Vývoj zubu představuje jedinečný modelový systém pro studium základních procesů a mechanismů embryogeneze obratlovců, zahrnující indukci, diferenciaci a ustanovení organizace tkání. Zárodek myší stoličky je modelový systém, ze kterého vychází většina našich dosavadních znalostí o zubním vývoji Role kranio-neurální lišty ve vývoji zubů Významné informace o povaze tkáňových interakcí působících v ranných fázích zubního vývoje se nahromadily až v posledních 70 letech výzkumu díky homo- a hetero specifickým experimentům in vivo a in vitro. První experimenty probíhaly na embryích obojživelníků a ukázaly, že dentální mesenchym má původ v kranio-neurální liště. Pokud je neurální lišta z embrya obojživelníka odstraněna, struktura prvního žaberního oblouku se nevyvine. V roce 1955 Wilde dokázal vyrobit zcela diferencované zuby díky kombinaci neurální lišty v oblasti urodele s epitelem stomodea a Wagner v 1949 a 1955 užitím xenoplastických transplantátů dokázal, že ektoderm stomodea může zlepšit induktivní signály nezbytné pro iniciaci zubního vývoje. Protože zuby savců a obojživelníků jsou považované za homologní, další výzkumy byly zaměřené na roli savčí neurální lišty v procesu vytváření dentice. V roce 1982 bylo dokázáno, že hlavní část kraniofaciálního mesenchymu pochází z neurální lišty. Hlavní důkaz přímého vlivu neurální lišty na savčí dentici byl stanoven v roce 1984, kdy Lumsden na základě Wildeho 11

13 experimentu kombinoval myší neurální lištu s mandibulárním ústním epitelem a nechal je kultivovat v přední komoře myšího oka, kde vznikl zubní zárodek. Další studie naznačují, že po vstupu buněk neurální lišty do dentálního epitelu, se stává tento epitel odontogenický. Zuby se tedy formují v kombinaci neurální lišty s epitelem mandibulárního oblouku Role interakcí mezi epitelem a mezenchymem Interakce mezi epitelem a mesenchymem jsou koordinované tkáňové pochody pozorované během formování většiny embryonálních orgánů. Formování zubů je kontrolováno reciprokými indukčními signály mezi epitelem (odvozeným z ektodermu) a ektomezenchymem (odvozeným z neurální lišty). Odontogenický potenciál, který je původně v dentálním epitelu, se přesouvá k podložnímu mesenchymu, kde je zodpovědný za další epiteliální morfogenezu a diferenciaci buněk (Thesleff and Sharpe 1997). Tyto epiteliální-mezenchymové interakce se neodehrávají jen během normálního vývoje, ale také v heterospecifických experimentech zahrnujících výměnu tkání různých druhů. Například zub může být vytvořen kuřecím embryonálním epitelem kombinovaným s myším embryonálním mesenchymem ze stoliček jako intra-okulární transplantáty (Kollar and Fischer 1980). Toto dokazuje, že signály mohou křížit druhové hranice. Zásadní molekulární mechanismy epitelio-mezenchymálních interakcí zahrnují difuze schopné proteiny jako jsou BMP = bone morphogenetic proteins (Chen et al.2000, Vainio et al.1993), FGF = fibroblast growth factors (Kettunen and Thesleff 1998; Niswander and Martin 1992), SHH = sonic hedgehog (Cobourne and Sharpe 2005; Dasule et al. 2000), TNF family = tumor necrosis factor family (Jernvall and Thesleff 2000; Tucker et al. 2000) a Wnt (Dassule and McMahon 1998; Sarkar and Sharpe 1999). Molekuly FGF8 a BMP4 představují podněty, které místně uspořádávají ektoderm, samy jsou původu endodermálního. Tímto uspořádáním ektoderm získá nové vlastnosti, které výrazně ovlivňují další vývoj cnc buněk, které osídlují embryonální žaberní oblouk. Exprese růstových faktorů BMP a FGF probíhá jak v ektodermu, tak i v ektomezenchyme, zatímco růstové faktory SHH a WNT jsou vylučovány pouze v ektodermu. Důležitá regulační funkce BMP4 je inhibovat sekreci FGF8. Je zjištěno, že BMP4 působí protichůdně k FGF8, aby docházelo k produkci lokalizovaných míst ektomezenchymu, která produkují PAX9 a blíže tak určují, kde přesně se zuby mají vyvíjet. (Neubüser at al. 1997, Peters et al. 1998). Zvláště molekuly BMP hrají důležitou roli v utváření periodických zákonitostí v těchto procesech a to tím, že inhibují rozšíření FGF signálu. Nedostatečnost BMP signalizování např. kvůli ztrátě BMP receptorů nebo nadměrné expresi BMP inhibitorů, má za následek různé defekty v zubních hrbolech a samotných 12

14 zubech.(plikus et al.2005). Molekula SHH je vylučovaná při počátečních fázích vzniku dentálního epitelu a specifikuje další místa rozšíření ústního ektodermu, invaginaci do ectomesenchymu a zubní iniciaci. (Hardcastle et al. 1998, Dassule et al. 2000). Bez ohledu na typ zubu a jeho umístění v čelisti, si vývoj každého zubu projde čtyřmi morfologickými stupni: fází iniciační, fází pupene, pohárku a zvonku. 6. FÁZE VÝVOJE ZUBU 6.1. Iniciační fáze Iniciace zubního vývoje začíná na konci pátého týdne vývoje zárodku člověka [u myší je to v E den embryonální vývoje]. Během "iniciačního stupně" probíhají molekulové a buněčné procesy, které určují přesný typ, pozici a orientaci každého zubu na rozvíjející se čelisti. Spolupráce WNT7B a SHH genů vymezuje ústní (neodontogenický) a dentální (odontogenický) epitel a tím snižuje expresi SHH směrem k dentálnímu epitelu (Sarkar et al. 2000). Poté, co je rozdělen epitel a snížená exprese SHH, startují buňky dentálního epitele proliferaci a tvoří úzkou podkově podobnou formaci, kterou nazýváme dentální lamina. První morfologická identifikace vývoje zubů na dentální lamině je formování ektodermálních plakod v (E11.5), což představuje tloustnutí embryonálního epitelu. Molekuly FGF a WNT byly identifikovány jako aktivátory a molekuly BMP jako inhibitory formace plakod (Jung et al. 1998). Obr.5: Před počátkem epiteliálního tloustnutí je ektoderm v úzkém kontaktu s ektomezenchymem, který pochází z kranio-neurální lišty. Schématicky nakresleno autorkou práce. 13

15 Obr. 6: Epiteliální buňky sekretují specifické signály v různých oblastech, proliferují a formují vrstvu epiteliální tkáně, nazývanou dentální lamina a dentální plakoda. Schématicky nakresleno autorkou práce. Signály, které poskytují v iniciační fázi významnou poziční informaci o vzniku zubních plakod, nejsou ale dosud podrobně známy. Současná přítomnost BMP2 a BMP4 v jednom místě inhibuje expresi PAX9, a tím pádem se zastavuje tvorba zubů (Peters et al. 1998). Další geny, které jsou exprimovány během iniciační fáze zubního vývoje zahrnují LEF1, MSX1, MSX2, DLX1, DLX2. Pokud jsou ale oba geny MSX1 a MSX2 nebo oba geny DLX1 a DLX2 neaktivní, vývoj zubu je zastaven (Line 2003, Stock 2001) Fáze pupene Buňky tvořící dentální plakody sekretují molekuly všech čtyř růstových a transkripčních faktorových rodin (BMP, FGF, SHH a WNT), a tím v mezenchymu indukují expresi mnoha genů (např. PAX9, MSX1/2, RUNX2, BMP, FGFS, Activin, LEF1, DLX1, BARX1, LHX6/7, GLI1/2/3). Obr.7: Fáze pupene. V místech dentálních plakod epiteliální buňky znovu proliferují a vtlačují se dovnitř mezenchymu, přičemž formují zubní pupen. 14

16 Protože má mléčný chrup dvacet zubů, tak na dentální lamině lidského embrya na dvaceti místech přibližně v týdnu těhotenství epiteliální buňky pod vlivem BMP4 a aktivinu βa startují proliferaci a vtlačují se dovnitř mesenchymu. Tvoří se cylindrická struktura na konci s cibulovitým pupenem (E 13.5). Fáze pupene je charakteristická vznikem zubní blastemy (zakrnělá protoplazma) bez jasného uspořádání buněk. Poté začínají ektomezenchymalní buňky prudce růst a hromadit se kolem každého epiteliálního pupene. V této fázi dochází k expresi PAX9, která je nutná pro mezenchymální zhušťování. O něco později nejniternější buňky zubního pupene získávají hvězdicovitý tvar a začínají se syntetizovat glykosaminoglykany.v tomto místě také hraje důležitou roli voda, která vyplňuje prostor mezi buňkami a odděluje jednu od druhé. Vnitřní část zubního pupenu obsahuje hvězdicové retikulum a střední vrstvu (intermediate layer), která ovlivňuje zvrásnění (sbalení) vnitřního sklovinného epitelu. Během stádia pupenu se odontogenický potenciál z epitele vytrácí (kolem E ) a získává ho ectomezenchyme (Mina and Kollar 1987). Tato souhra zahrnuje komplikovanou časově a prostorově koordinovanou expresi a inhibici několika dalších genů Fáze pohárku Mezenchymální buňky v této části vývoje sekretují různé extracelulární molekuly jako jsou tenascin a syndecan. Tyto extracelulární molekuly se navzájem spojují, vytěsňují růstové faktory do určitých míst, kde se tím pádem zvyšuje jejich koncentrace. Rozdílná koncentrace mezi těmito místy indukuje také rozdílné množení buněk v epiteliálních vrstvách a dochází k transformaci zubního pupene do polopyramidální struktury, která spolu s dentální laminou dále tvoří kuželovitý vrchol. BMP4 zde představuje mezenchymální signál, který indukuje přechod pupene do fáze pohárku. Obr.8: Fáze pohárku. Pupen se v této fázi stáčí směrem dovnitř. Nejdříve získává tvar převráceného pohárku a později tvar zvonku (obr.9).schématicky nakresleno autorkou práce. 15

17 Pokud je BMP4 v mesenchymu nepřítomný, geny LEF1, MSX1 a PAX9 nejsou exprimovány a zubní vývoj je zastaven ve fázi pupene (Kapadia et al. 2007, Keränen et al. 1999, Maas et al. 1997). V embryonálním dni myšího vývoje E12, WNT a BMP4 indukují histologicky odlišnou epiteliální masu, primární sklovinný uzel, který leží v centru základu této pyramidy (Vaahtokari et al. 1996). Zvláštní rys buněk sklovinného uzlu je absence buněčného dělení, díky proteinu p21, který buňkám nedovolí vstoupit do S fáze buněčného cyklu (Jernvall et al. 1998). Obecná představa je taková, že sklovinný uzel je přechodná řídící struktura, která zprostředkovává morfogenetickou informaci přilehlým buňkám, produkuje mitogenetické faktory (hlavně FGF) a rozptyluje a indukuje specifickou buněčnou proliferaci. Konec pohárkové fáze (E15) je navozen apoptózou, která začne odstraňovat buňky sklovinného uzlu. Úplné odstranění primárního sklovinného uzlu se dokončuje ve fázi zvonku (E16). V okolí uzlu je výrazná produkce FGF4 molekul, které zabraňují poškození epiteliálních a mezenchymálních buněk. Rozšiřující se epiteliální plocha uvnitř pupenu se ohýbá směrem dopředu i dozadu, a tím tedy celá struktura získá formu převráceného pohárku. Okraj této struktury pokračuje v cervikální smyčku neboli krční očko, které výrazně roste směrem dolů (Luan, Ito, Diekwisch 2006). Epitel uvnitř pohárku je charakterizovaný jako vnitřní sklovinný epitel (iee). Vnější část pohárku je krytá vnějším sklovinným epitelem (oee). Mezi těmito dvěmi epiteliální vrstvami jsou vakuolizované buňky hvězdicovitého retikula a střední buněčné vrstvy. Struktura, zahrnující iee, oee, hvězdicové retikulum a střední vrstvu je známá jako sklovinný neboli dentální orgán. Mezenchym zhuštěný "pod" iee a mezi cervikální smyčkou je dentální papila přestavující budoucí zubní dřeň, kdežto mezenchym zhuštěný kolem zubní papily a dentálního orgánu je nazýván dentální folikul, který dává vznik cementoblastum, osteoblastum a fibroblastům (Slavkin HC,1974) Fáze zvonku Formování prvního sekundárního sklovinného uzlu v E 15 označuje začátek zvonkové fáze zubního vývoje. Později se formuje i druhý, třetí a čtvrtý sekundární uzel. Iee pokračuje ve vchlipování pod direkcí signálů vycházejících z primárního a sekundárního uzlu, vytlačuje hvězdicové retikulum a získává formu zvonku. (E 16.5). 16

18 Obr.9: Fáze zvonku. Schématicky nakresleno autorkou. Na rozdíl od dentálního epitele, v dentálním mesenchymu nebyly pozorovány žádné změny v buněčné proliferaci. Sklovinné uzly, které jsou na vrcholech epiteliálního vychlípení, koordinují formování, určení pozice a velikosti odpovídajících hrbolků na korunce (Coin et al. 1999). V tomto okamžiku je sklovinný orgán zřetelně oddělený od dentální papily, hrbolky startují svoje formování a korunka se zvyšuje. Morfogeneze korunky a cytodiferenciace se vyskytuje během fáze zvonku (Slavkin 1991, Lyngstadaas et al. 1998). Během tohoto stupně se buňky místě diferencují a korunka zaujímá svůj konečný tvar. Mezenchymální buňky na hranici zubní dřeně se připojují k bazální membráně vnitřního sklovinného epitelu (iee), zaujímají cylindrickou formu a transformují se do odontoblastů, které sekretují predentin. Ihned po uložení predentinu se jejich tvar mění do sloupcové podoby a diferencují se do ameloblastů, které startují syntézu a ukládání předsklovinných prizmat. Predentin a předsklovinná prizmata jsou vylučované dvěma různými buněčnými populacemi a mineralizované různými mechanismy, vršením krystalků hydroxyapatitu produkují zubní matrix (Yokkozeki et al. 2003). Buňky střední vrstvy výrazně napomáhají v procesu formování skloviny a po zubní erupci se transformují do buněk bazální vrstvy epiteliálního spojení pomocí znovunavrácení schopnosti podstupovat mitozu. V tomto stupni se dentální lamina rozpadá. Nakonec jsou dřeň a sklovinný orgán zapouzdřeny a začíná se formovat zhuštěný mezenchym, který zakládá dentální folikuly. 17

19 Obr.10: Zjednodušené znázornění vniku a zániku sklovinných uzlů během vývoje stoliček u myší. Převzato z (Tucker and Sharpe, 1999) A) Vznik primárního sklovinného uzlu pod indukčním vlivem mezenchymu. B) Vznik zubního pupene proliferací okolní tkáně a zastavením proliferace v PEK. C) Vymizení primárního sklovinného uzlu díky zástavě proliferace a navození apoptózy. D) Tvorba sekundárních sklovinných uzlů pod vlivem rozšířené exprese Bmp-2 a Shh a působení Fgf-4. Obr. 11: Schéma znázorňuje působení signálních molekul a genetických faktorů v epitelu a mezenchymu během jednotlivých fází zubního vývoje. Převzato z (Koussoulakou et al., 2009). 18

20 7. TVORBA BIO-ZUBU Pro stárnoucí populaci je ztráta zubů běžná a je to častá příčina zdravotních potíží. Nepříznivě ovlivňuje kvalitu žvýkání, mluvení i psychické zdraví. V rozvojových zemích má přibližně 7% populace ve věku 17 let trvalou ztrátu alespoň jednoho zubu. Kolem věku 50 let nemají lidé průměrně 12 zubů. K opravě těchto nedostatků se dnes používají především mechanické metody a to např. kovové implantáty či umělý chrup. Tyto nebiologické náhrady zubů mají ve srovnání s biologickými preparáty několik nevýhod. Především nepříjemný pocit z umělého materiálu v ústech, nedostatečnou biokompatibilitu, poničení okolní tkáně a potřebu dlouhodobého ošetřování zákroku. Zkoumání nových možností náhrady zubů se proto stalo aktivní oblastí dentálního výzkumu. Rychlé pokroky v buněčné terapii přinesly možnost biologického řešení zubní regenerace. Očekává se, že tento nový směr může v blízké budoucnosti nahrazovat umělé zubní implantáty. Biologický zub (bio-zub) představuje zub vytvořený in vitro, který má schopnost se začlenit do čelisti pacienta na místo, kde původní zub chybí. Bio-zub vykonává všechny funkce přirozeného zubu včetně regenerační schopnosti při jeho poranění. Předtím, než může být vytvořen bio-zub, musí být vyřešeno několik klíčových problémů. Buňky, ze kterých se generuje zub, musí být lehce izolovatelné i od starších pacientů, protože hlavní postiženou skupinou je právě nejstarší populace. Tyto buňky musí být také dobře rozšiřitelné in vitro, aby bylo možné získat dostatečné množství buněčných populací nezbytných pro zubní rekonstrukci. Buňky musí být v odontogenním mikroprostředí, které usnadňuje buňkám tvořit trojrozměrný bio-zub. Navíc zub vytvořený z těchto buněk musí mít schopnost pokračovat v následném zubním vývoji, vytvořením kořeno-periodontálního systému a realizovat řízenou erupci na správném místě. Velikost a tvar těchto zubů musí být velikostně synchronizován s ostatními zuby pacienta, aby nedocházelo k narušení normálního skusu. Tvorba bio-zubu se tedy musí přizpůsobit základním principům zubního růstu a vývoje Jak se tvoří bio-zub Existují čtyři základní cesty jak vytvořit bio-zub: přenesení embryonálního vývoje zrekonstruovat dospělý zub, který je v ústech vytvořit konstrukci, tzv. biologické lešení ve tvaru zubu Ačkoli jsou všechny tyto tři cesty teoreticky možné, pouze o dvou z nich jsou v současnosti činěny pokusy o jejich realizaci. 19

21 Přenesení embryonálního vývoje Napodobení přirozeného vývoje zubů v podmínkách dospělého jedince představuje velmi slibný přístup tkáňového inženýrství. Tento postup byl zaveden v Londýně profesorem Sharpem. Jeho metoda je založena na programování kmenových buněk, která koresponduje s normálním embryonálním vývojem zubů. Na myším modelu byly testovány kmenové buňky z různých zdrojů (zubních i nezubních). Tyto kmenové buňky se použily jako náhrada za mezenchymální část a překryly se embryonálním epitelem. Takto kombinované tkáně se vnesly do ledvinných kapsulí hostitele (dospělé myši), kde došlo po dvou týdnech k vývoji plně mineralizovaných zubů. Protože interakce mezi epitelem a mezenchymem odvozeným z neurální lišty začínají instruktivními signály z epitelu, mezenchymální část zubního zárodku lze zcela nahradit kmenovými buňkami. Celý výsledný zub pak pochází z kmenových buněk s výjimkou ameloblastů, které jsou epiteliálního původu. Zuby vytvořené tímto způsobem odpovídaly velikostí a tvarem normálním myším molárům (Yen,A.H.;Sharpe PT, 2006) Rekonstrukce zubu v ústech Zkonstruování dospělého zubu navrhla Pamela Robey a její kolegové (Robey 2005). V tomto pojetí jsou jednotlivé části zubů navrženy zvlášť. K ukotvení zubů je nejdříve nutné sestrojit alveolární kost což vyžaduje spojení stromálních buněk kostní dřeně (BMSC) a hydroxyapatit/trikalcium fosfátu (HA/TCP). Zubní dřeň a sklovina mohou být zkonstruovány užitím buněk zubní dřeně a HA/TCP ve formě korunky, zatímco periodontální vazivo připojující zuby ke kosti by bylo získáno z kmenových buněk periodontálního vaziva (PDLSCs). Navzdory velmi vysoké obtížnosti, může být tento přístup v budoucnu zvládnut s dostatečnou mírou opakovatelnosti a kontrolovatelnosti. (Podrobněji rozpracováno v Robey 2005) Tvorba zubů založená na biologickém lešení Tvorba zubu při této metodě začíná enzymatickým rozvolněním epiteliálních a mezenchymálních buněk neprořezaných zubů. Přitom se využije podpůrné biodegradovatelné polymerové lešení (konstrukce), na které jsou tyto buňky vysety. Populace buněk přijme tvar podpůrného lešení, které se připravuje ve tvarech odpovídacích jednotlivým zubům. Díky své biodegradovatelnosti se podpůrné lešení ve vhodném okamžiku rozpadá. Biologické lešení napodobuje přirozené prostředí extracelulární matrix (ECM). Ideálně by mělo být lešení chemicky stabilní a jeho fyzikální vlastnosti by měly být stejné, jako vlastnosti okolní tkáně s ohledem na pevnost buněčného spojení, schopnost adheze, buněčnou proliferaci, kontrolovaný rozklad a mechanickou odolnost (Taylor PM 2007). Pro vytvoření takového lešení bylo do dnešní doby použito mnoho materiálů od trvanlivého pórovitého hydroxyapatitu, přes přírodní 20

22 molekuly se středně dlouhou trvanlivostí (např. kolagen nebo chitosan), až k polymerům s krátkou životností (polyglykolová kyselina [PGA], polylaktidová kyselina [PLA], směs polyglykolové a polylaktidové kyselina [PGA-PLLA] a kopolymer polyglykolové a polylaktidové kyseliny [PLGA]). Komplex zubní struktury je tvořen nasazením disociovaných buněk zubního pupene na spleť vláken např. polyglykolové kyseliny nebo jiných biodegradovatelných konstrukcí. Kmenové buňky zubní dřeně (DPSC) ve spojení s částicemi hydroxyapatitu/trikalciem fosfátu (HA/TCP) in vivo tvoří dentinové struktury lemující povrch HA/TCP částic (Gronthos et al. 2000, Gronthos et al. 2002). Pokud jsou kmenové buňky z apikální papily a periodontálního vaziva kombinovány s HA/TCP, může být in vivo vytvořen kořen a periodontální vazivo (Sonoyama et al. 2006). Nicméně návrh na vytvoření zubu pomocí biologického lešení dosud nedosáhl kvůli několika komplikacím dobrých výsledků: a) existence lešení vyvolává některé negativní účinky na interakce mezi epitelem a mesenchymem a také na nepříznivě ovlivňuje odontogenické mikroprostředí (Yu; Deng et al. 2006, Yu; Shi et al. 2006). Za druhé, vnitřní poziční informace (poziční informace je definovaná gradienty různých genů, interakcemi mezi dvěma buňkami či mezi buňkou a okolním prostředím), která se nachází v dentálních buňkách, může být kvůli přítomnosti lešení přerušena v různém rozsahu. Tím pádem se znemožní kontrola velikosti a tvaru uměle tvořeného zubu (Duailibi et al. 2004; Young et al. 2002; Honda et al.2007). Dále, kyselé produkty některých konstrukcí (jako jsou PGA, PLGA a PLA) mohou vyvolat nepříznivý účinek na formování zubní tkáně (Yang et al. 2005; Edwards, Mason 2006; Sung et al. 2004). Dodávání živin a následné odstraňování metabolického odpadu uvnitř lešení je často omezeno a to může ovlivňovat následnou buněčnou diferenciaci a normální zubní morfogenezu (Yang 2005). Dalším nedostatkem je nespecifická zánětlivá reakce pacienta na většinu polymerních materiálů, které jsou nezbytné pro transplantaci (Hing et al. 2007). Proto by měl být vztah mezi zubními kmenovými buňkami a materiálem pro biologické lešení před klinickým užitím dobře zvažován. V procesu tvorby bio-zubů také nedochází ke zformování kosti, která je nezbytná pro vývoj kořene a připojení zubu k čelisti. Avšak i přes mnoho nedostatků má tato metoda výrazné možnosti k dosažení plně obnoveného, strukturně i funkčně odpovídajícího zubu, ale jsou ještě nezbytné další studie. 8. KONTROLA TVARU A VELIKOSTI ZUBU Vhodný tvar a velikost tvořeného zubu jsou pro rekonstrukci správného skusu a obnovu žvýkací funkce velmi důležité. Během odontogeneze je o tvaru zubu rozhodnuto už ve fázi dentální laminy díky expresi různých genů v různých místech mezenchymu v základu čelisti. 21

23 Tyto geny, z nichž nejdůležitější jsou homeobox geny, jsou specificky exprimovány v ektomezenchymu (Tucker et al. 1998). Fyzikální morfogentické procesy začínají ve fázi pohárku a jsou regulovány sklovinnými uzly, které tvoří přechodná signální centra ležící v zubním epitelu (Vaahtokari et al. 1996). Poté co mezenchym přijme signály z epitelu stává se sám zdrojem signálu a určuje následnou morfogenezu zubu (Yu; Shi et al. 2006). Jak napodobit tyto odontogenické procesy k vytvoření bio-zubu a regulace jeho tvaru je klíčová otázka, která musí být zodpovězena. V dnešní době víme že rozměry dentálních mezenchymálních a epiteliálních buněk mohou ovlivnit regulaci tvaru tvořeného zubu, což poskytuje úvodní informace k určení tvaru bio-zubu (Yu et al. 2008). 9. RŮST BIO-ZUBU V ČELISTI Existují tři základní cesty k inkubaci bio-zubu. Zub může být tvořen in vitro, in situ (na svém přirozeném místě) a na heterotopických místech. Některá místa představují pro růst biozubu pouze dočasné lokality, patří sem například oblast podkožní, ektoderm kuřecího embrya, omentum, ledvinové pouzdro či zadní komora oka (Yu et al. 2007). Nicméně žádná z těchto lokalit není tak vhodná jako lokalita umístěná přímo v čelistech, představující konečné místo pro růst bio-zubu. Ohazama a kol. prokázal, že pokud je embryonální zubní základ transplantován do diastemálního regionu dospělé myši, může se zub normálně vyvíjet a formovat. Pokud jsou disociované buňky zubního pupene kombinovány s biodegradovatelným polymerem a transplantovány zpět do stejného alveolárního pouzdra, ze kterého byl tento zubní pupen vyextrahován, je vytvořen tubulární dentin a nová kost v čelisti, zatímco amelogeneze a cementogeneze zde chybí (Honda et al. 2006). Nakao a kol. dále dokázal, že vytvořený primární orgán vzniklý z kombinovaných dentálních epiteliálních a mezenchymálních buněk může napodobit embryonální zubní organogenezu v dentálním alveolu dospělé myši (Nakao et al. 2007). Před klinickým transplantováním bio-zubu do čelisti člověka musí být překročeno mnoho nevyhnutelných překážek, jako například rejekce štěpu, nedostatečná zásoba krve v čelistech a hrozící kontaminace implantátu slinami. 10. PROŘEZÁVÁNÍ BIO-ZUBU ČELISTÍ Zubní erupce je vysoce lokalizovaný proces závislý na měkkosti obklopující tkáně, která vytváří směrem ven dentální folikul a směrem dovnitř sklovinný orgán. Současné studie zubní regenerace jsou hlavně zaměřeny na rekonstrukci sklovinného orgánu a zanedbávají roli buněk 22

24 dentálního folikulu. Prořezání zubu a jeho začlenění do přesné pozice skusu bude nejobtížnější prací pro budoucí zubní regeneraci. Experimentální důkazy jasně naznačují, že pro zubní erupci je nejdůležitější normální vývoj zubního folikulu (Larson et al. 1994). Zubní folikul, také nazývaný dentální váček, dává vznik cementoblastům, fibroblastům a osteoblastům. Pokud je vyvíjející se zub chirurgicky odstraněn, nahrazen silikonovou replikou a pokud je dentální folikul nedotčený, tento silikonový implantát se začne prořezávat jako normální zub. Larson a kol. dokázal, že zuby, které nemají dentální folikuly se nemohou prořezávat a naopak zuby, které vznikly kombinací s dentálním folikulem, se prořezávat mohou (Larson et al. 1994). Tyto studie tedy poskytují nepřímý důkaz pro zásadní roli dentálního folikulu při erupci zubu. Pro klinickou zubní regeneraci jsou buňky dentálního folikulu velkou nadějí. 23

25 11. ZÁVĚR I když kmenové buňky v oblasti výzkumu poskytují velmi cenné poznatky, stále ještě v jejich medicínských aplikacích existuje řada překážek. Vzhledem k přítomnosti kmenových buněk přímo v organismu pacienta a možnosti jejich mnohočetného využití se jedná o velice atraktivní a dynamickou oblast, která neustále přináší nové poznatky. Tkáňové inženýrství a jeho aplikace v klinické praxi je velmi aktuálním, ale také hojně diskutovaným tématem. Zuby, jako dobře dostupné a do jisté míry postradatelné orgány, poskytují výhodný model pro zkušební procesy, díky nimž získáváme potřebné informace pro další výzkum a pokroky. U myšího modelu již byly zuby s využitím kmenových buněk získány, avšak pro aplikace v humánní medicíně je třeba ještě mnoho objasnit. Savčí zuby se zakládají již během embryonálního vývoje. Správný průběh odontogeneze je řízen řadou signálních molekul, z nichž nejvýznamnější jsou molekuly z rodin TGF, FGF, TNF, Wnt a Shh. Tyto signály se uplatňují v mezibuněčných komunikacích při vývoji mnoha dalších tkání a orgánů. Studium odontogeneze tak napomáhá porozumění řadě obecných principů embryogeneze a naopak další nové informace o morfogenetických mechanismech vývoje jiných epitelio-mezenchymálních orgánů přispívají k objasňování odontogeneze. Využití získaných znalostí týkajících se kmenových buněk a vývoje zubních základů v kombinaci s metodami tkáňového inženýrství v klinickém zubním lékařství je ještě otázkou mnoha let, nicméně se jedná o nadějnou a velmi perspektivní oblast výzkumu a jistě bude v budoucnu v tomto směru výrazně zlepšovat kvalitu lidského života. 24

26 12. POUŽITÉ ZKRATKY E EB EC ESC hesc ICM BMP FGF SHH TNF Wnt MCM MSX DLX LEF RUNX PAX Iee Oee (Eee) BMSC HA/TCP PDLSC ECM PGA PLA PGA-PLLA PLGA DPSC embryonic day embryoid body embryonal carcinoma embryonic stem cells human embryonic stem cells inner cell mass bone morphogenetic protein fibroblast growth factor sonic hedgehog tumor necrosis factor wing-less-type MMTV integration site family methylcellulose medium msh-like homeobox distal-less homeobox lymphoid enhancer-binding factor runt-related transcription factor paired-box family inner (internal) enamel epithelium outer (external) enamel epithelium bone marrow stromal cell hydroxyapatite/tricalcium phosphate periodontal ligament stem cells extracellular matrix polyglycolic acid polylactic acid polyglycolic acid-poly-l-lactic acid polylactic polyglycolic acid dental pulp stem cell 25

27 13. LITERATURA Bhattacharya B, Cai J, Luo Y, Miura T, Mejido J, Brimble SN, Zeng X, Schulz TC, Rao MS, Puri RK (2005). Comparison of the gene expression of undifferentiated human embryonic stem cell lines and differentiating embryoid bodies. BMC Dev Biol, 5:22 < Cobourne MT, Sharpe PT (2005). Sonic hedgehog signaling and the developing tooth.curr Top Dev Ciol, 65: 255 Coin R, Lesot H, Vonesch JL, Haikel Y, Ruch JV (1999). Aspects of cell proliferation kinetics of the inner dental epithelium during mouse molar and incisor morphogenesis: a reappraisal of the role of the enamel knot area. Int J Dev Biol, 43(3):261. Dassule HR, Lewis P, Bei M, Maas R, McMahon AP (2000). Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development 127:4775. Dassule HR, McMahon AP (1998). Analysis of epithelial-mesenchymal interactions in the initial morphogenesis of the mammalian tooth. Dev Biol, 202:215. Desbaillets I, Ziegler Urs, Groscurth P, Sasssmann M (2000). Embryoid bodies: An in vitro model of mouse embryogenese. Exp Physiol 85 (6):645 Duailibi MT, Duailibi SE, Young CS, Bartlett JD, Vacanti JP, Yelick PC (2004). Bioengineered teeth from cultured rat tooth bud cells. J Dent Res 83:523. Edwards PC, Mason JM (2006). Gene-enhanced tissue engineering for dental hard tissue regeneration:(1) overview and practical considerations. Head Face Med, 2: 12. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Chernam N, Boyde A, DenBesten P, Robey PG, Shi S (2002). Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res, 81: 531. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S (2000). Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 97: Hardcastle Z, Mo R, Hui CC, Sharpe PT (1998). The Shh signalling pathway in tooth development:defects in Gli2 and Gli3 mutants. Development, 125(15):2803. Hing KA, Wilson LF, Buckland R (2007). Comparative performance of three ceramic bone graft substitutes. Spine J, 7: 475. Hoffman Lisa M, Carpenter Melissa K (2005). Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nat Biotech, 23 (6); 699. Honda MJ, Ohara T, Sumita Y, Ogaeri R, Kagami H, Ueda M (2006). Preliminary study of tissue-engineered odontogenesis in the canine jaw. J Oral Macillofac Surg, 64:

28 Honda MJ, Tsuchiya S, Sumita Y, Sagara H, Ueda M (2007). The sequential seeding of epithelial and mesenchymal cells for tissue-engineered tooth regeneration. Biomaterials, 28: 680. Chen Y, Zhang Y, Jiang TX, Barlow AJ, St Amand TR, Hu Y, Heaney S, Francis-West P, Chuong CM, Maas R (2000). Conservation of early odontogenic signaling pathways in Aves. Proc Natl Acad Sci USA, 97: Jernvall J, Aberg T, Kettunen P, Thesleff I (1998). The life history of an embryonic signaling center:bmp4 induces p21 andis associated with apooptosis in the mouse tooth enamel knot. Development,125(2):161. Jernvall J, Thesleff I (2000). Reiterative signaling and patterning during mammalian tooth morphogenesis. Mech Dev, 92:19. Jung HS, Francis-West PH, Widelitz RB, Jiang RX, Ting-Berreth S, Tickle C, Volpert L, Chuong CM (1998). Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Dev Biol,196(1):11. Kapadia H, Mues G, D'Souza R (2007). Genes affecting tooth morphogenesis. Orthod Craniofac Res, 10(4):237. Keränen SV, Kettunen P Aberg T, Thesleff I, Jernvall J (1999). Gene expression patterns associated with suppression of odontogenesis in mouse and vole diastema regions. Dev Genes Evol, 209(8):495. Kettunen P, Thesleff I (1998). Expression and function of FGF-4, -8, and -9 suggest functional redundancy and repetitive use as epithelial signals during tooth morphogenesis. Dev Dyn 211:256. Kim HS, Oh SK, Park YB, Ahn HJ, Sung KC, Kang MJ, Lee LA, Suh CS, Kim SH, Kim D- W, Moon SY (2005). Methods for Derivation of Human Embyonic Stem Cells. Stem cells, 23: Kollar EJ, Fisher C (1980). Tooth induction in chick epithleium: expression of quiescent genes for enamel synthesis. Science, 207: 993. Koussoulakou DS, Margaritis LH, Koussoulakos (2009). A Curriculum Vitae of Teeth: Evolution, Generation, Regeneration. Int J Biol Sci 5(3):226 Larson EK, Cahill DR, Gorski JP, Marks SC Jr (1994). The effect of removing the true dental follicle on premolar eruption in the dog. Arch Oral Biol, 39, 271. Laslett AL, Filipczyk AA, Pera MF (2003). Characterization and culture of human embryonic stem cells. Trends Cardiovasc Med, 13:

29 Line SRP (2003). Variation of tooth number in mammalian dentition: connecting genetics, development, and evolution. Evol Devel, 5(3):295. Luan X, Ito Y, Diekwisch RG (2006). Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Dev Dyn, 235(5):1167. Lyngstadaas SP,Møinichen CB, Risnes S (1998). Crown morphology, enamel distribution, and enamel structure in mouse molars. Anat Rec, 250(3):268. Maas R, Bei M (1997). The genetic control of early tooth develoment. Crit Rev Oral Biol Med, 8(1):4. Mina M, Kollar EJ (1987). The induction of odontogenesis in non-dental mesenchyme combined with early murine mandibular arch epithelium. Arch Oral Biol, 32(2):123 Nakao K, Morita R, Saji Y, Ishida K, Tomita Y, Ogawa M, Saitoh M, Tomooka Y, Tsuji T (2007). The development of a bioengineered organ germ method. Nat Methods 4, 227. Neubüser A, Peters H, Balling R, Maritn GR (1997). Antagonistic interactions between FGF and BMP signalling pathways: a mechanism for positioning the sites of tooth formation. Cell, 90 (2):247. Niswander L, Martin GR (1992). FGF-4 expression during gastrulation, myogenesis,limb and tooth development in the mouse. Development 114: 755. Ohazama A, Modino SA, Miletich I, Sharpe PT (2004). Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J Dent Res, 83: 518. Otto F, Thornell ap, Crompton R, et al. (1997). Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome, is essential for osteoblast differentiation and bone development. Cell, 89: 765. Peters H, Neubüser A, Balling R (1998). Pax genes and organogenesis: Pax9 meets tooth development. Eur J Oral Sci, 106:38. Plikus MV, Zeichner-David M, Mayeer JA, Reyna J, Bringas P, Thewissen JG, Snead ML, Chai Y, Chuong CM (2005). Morphoregulation of teeth:modulating the number, size shape and differentiation by tunning Bmp activity. Evol Dev, 7(5):440. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A, Bongso A (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol, 18:399. Robey PG (2005). Post-natal stem cells for dental and craniofacial repair. Oral Biosci Med, 2: 83. SarkarL, Cobourne M, Naylor S, Smalley M, Dale R, Sharpe PT (2000). Wnt/Shh interactions regulate ectodermal boundary formation during mammalian tooth development. Proc Natl Acad Sci USA, 97(9):

30 Sarkar L, Sharpe PT (1999). Expression of Wnt signalling pathway genes during tooth development. Mech Dev, 85:197. Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action. (2006). Nature 441: Slavkin HC (1974).Embryonic tooth formation. A tool for developmental biology. Oral Sci Rev, 4(0):7 Slavkin HC (1991). Molecular determinants during dental morphogenesis and cytodifferentiation:a review. J Craniofac Genet Dev Biol.;11(4):338. Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza t, Seo BM, Zhang C, Liu H Gronthos S, Wang CY, Shi S Wang S (2006). Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in Swine. PLoS ONE, 1(1): 79. Stock DW (2001). The genetic basis of modularity in the development and evolution of the vertebrate dentition. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 356(1414):1633. Sung HJ, Meredith C, Johnson C, Galis ZS (2004). The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials, 25: Taylor, PM (2007). Biological matrices and bionanotechnology. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 362: Thesleff I, Sharpe P (1997). Signaling networks regulating dental development. Mech Dev 67: 111. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshal, V. S. and Jones, J. M. (1998). Embryonic stem cell line derived from human blastocysts. Science, 282: Tucker AS, Headon DJ, Schneider P, Ferguson BM, Overbeek P, Tschopp J, Sharpe PT (2000). Edar/Eda interactions regulate enamel knot formation in tooth morphogenesis. Development, 127:4691. Tucker AS, Matthews KL Sharpe PT (1998). Transformation of tooth type induced by inhibition of BMP signaling. Science, 282:1136. Vaahtokari A, Aberg R, Jernvall J, Keränen S, Thesleff I (1996). The enamel knot as a signaling centre in the developing mouse tooth. Mech Dev, 54(1):39. Vainio S, Karavanova I, Jowett A, Thesleff I (1993). Identification of BMP-4 as a signal mediating secondary induction between epithelial and mesenchymal tissues during early tooth development. Cell, 75:45. Weissman IL(2000). Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell, 100:

31 Yang J, Yamato M, Kohno C, Nishimoto A, Sekine H, Fukai F, Okano R (2005). Cell sheet engineering: recreating tissues without biodegradable scaffolds. Biomaterials, 26: Yokozeki M, Afanador E, Nishi M, Kaneko K, Shimokawa H, Yokote K, Deng C, Tsuchida K,Sugino H, Moriyama K (2003). Smad3 is required for enamel biomineralization. Biochem Biophys Res Commun, 305(3):684. Young CS, Terada S, Vacanti JP, Honda M, Bartlett JD, Yelick PC (2002). Tissue engineering of complex tooth structures on biodegradable polymer scaffolds. J Dent Res, 81: 695. Yu JH, Deng ZH, Shi JN, Zhai HH, Nie X, Zhuang H, Li YC, Jin Y (2006). Differentiation of dental pulp stem cells into regular-shaped dentin-pulp complex induced by tooth germ cell conditioned medium. Tissue Eng, 12: Yu JH, Jin F, Deng ZH, Li YF, Tang L, Shi JN, Jin Y (2008). Epithelial-mesenchymal cell ratios can determine the crown morphogenesis of dental pulp stem cells. Stem Cells Dev.,17: 333. Yu JH, Shi JN, Deng ZH, Zhuang H, Nie X, Wang RN, Jin Y (2006). Cell pellets from dental papillae can reexhibit dental morphogenesis and dentinogenesis. Biochem Biophys Res Commun, 346: 116. Yu J, Wang Y, Deng Z, Tang L, Li Y, Shi J, Jin Y (2007). Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell, 99: