Identifikácia baktérií pomocou fenotypových testov. Vašková, Liščáková, Šlahorová

Transkript

1 Identifikácia baktérií pomocou fenotypových testov Vašková, Liščáková, Šlahorová

2 Klinická mikrobiológia využíva poznatky mikrobiológie a lekárskej mikrobiológie na: DIAGNOSTIKU (identifikácia mikroorganizmov) TERAPIU (stanovenie citlivosti na antimikrobiálne látky)

3 Vždy je nutné zvážiť mikrobiologické nálezy s cieľom vylúčiť možnú kolonizáciu či kontamináciu a správne definovať bakteriálny agens, ktorý sa s najvyššou pravdepodobnosťou podieľa na vzniku bakteriálnej infekcie Veľmi dôležitá sa preto javí úzká spolupráca medzi ošetrujúcim lekárom a mikrobiológom

4 Jedným zo základných predpokladov úspešnej kultivácie je správný odber materiálu na mikrobiologickému vyšetrenie Adekvátny klinický materiál, jeho následné vyšetrenie podľa zásad správnej laboratórnej praxe a v neposlednej rade jeho zodpovedajúca klinická interpretácia sú dôležitým zdrojom diferenciálnej diagnostiky a vhodného liečebného prístupu k pacientovi

5 Vizuálne hodnotenie kultivačných médií po hod. kultivácii vyžaduje skúsenosť lab. prac. je založený na hodnotení morf. kolónií, na základných a selektívnych agaroch s potvrdením alebo vylúčením prítomnosti susp. patogénnych baktérií a ich kvantity Bližšia identifikácia suspektných kolónií ak výsledok hodnotenia morf. kolónií naznačuje prítomnosť možného patogéna s ohľadom na dg., lokalitu odberu,vek pacienta posúdenie zákl. fyziolog. vlastností a enzymatickej aktivity rýchlymi testami (tvorba katalázy, oxidázy) na základe získaných výsledkov - ďalšie zostavy testov (komerčné zostavy, doplnkové testy)

6 Fenotypová identifikácia baktérií Fenotyp je súbor všetkých definovateľných charakteristík (znakov) baktérie Fenotypové metódy sledujú fyziologické a biochemické vlastnosti Princíp biochemických testov základom je dôkaz aktivity špecifických enzýmov alebo typická enzýmová aktivita Baktéria??? Substrát bez zmeny + substrát Produkt Indikátor Zmena farby (vizualizácia produktu)

7 TESTY VÝHODY NEVÝHODY Mikroskopické vyšetrenie lacné, rýchle (minúty) zachytáva baktérie, ktoré nevyrastú na kult. pôde (mŕtve baktérie, anaeróby...) rádovo nižšia citlivosť ako kultivácia Kultivačné vyšetrenie (základné selektívne) zlatý štandard v bakt. diagnostike indikujú aktuálnu prítomnosť vitálnych baktérií vo vzorke odhalí celé spektrum baktérií,ktoré sú prítomné vo vzorke získame bakt. kultúry - ďalšie testy (identifikačné, citlivosť na ATB hod vyrastú len vitálne baktérie nároky na odber, transport materiálu správny výber vhodnej zostavy kult. pôd a kult. prostredia

8 TESTY VÝHODY NEVÝHODY Detekcia antigénu Biochemické testy (detekcia enzýmov) Detekcia DNA (genotypová metóda) rýchle (minúty) cenová dostupnosť? špecifické, nenáročné na čistotu kultúry pomerne široký výber na trhu cenová dostupnosť? relatívne rýchle (min 4 až 24 hod) možnosť rýchleho a presného vyhodnotenia pomocou softvéru senzitivita, špecificita rýchlosť (hodiny) deteguje aj mŕtve baktérie odpoveď len na konkrétnu otázku (Napr. Str. pyogenes???) neodhalí baktérie, ktoré neaglutinujú s danou suspenziou nároky na čistotu presnosť tým cena cena Odpoveď len na konkrétnu otázku (Napr. Chlamydia trachomatis???) Hmotnostná spektrometria (MALDI-Tof) rýchla a presná identifikácia bez nutných predchádzajúcich testov (minúty hodiny) cena, nutný nárok na čistotu špeciálne vyškolený pracovník problémy pri identifikácii (baktérie s rovnakou hmotnosťou (E. coli Shigella, Str. pneumoniae Str. mitis)

9 Príklady rastu niektorých typických patogénov na krvnom agare a mikroskopický vzhľad niektorých typických patogénov Pseudomonas Str. pneumoniae Staphylococcus aureus Str. pyogenes

10 Jednoduché biochemické ID testy Dôkaz katalázy enzým, hydrolyzujúci H2O2, pričom vzniká kyslík (prejaví sa ako bublinky) Pozitívny napr: u stafylokokov, negatívny napr. u streptokokov Dôkaz koagulázy konvertuje fibrinogén na fibrín/králičia plazma/ a tvorí viditeľné koagulum. Používa sa na dif. dg. Staphylococcus aureus: PK+ a ostatné stafylokoky: PK Dôkaz oxidázy Filtračný papier napustený parafenylendiamínom a alfanaftolom priložíme (alebo priamo na papier nanesieme) na vyšetrovanú kolóniu Pozitívny výsledok = zmodranie papierika

11 Hajnova pôda-id gramnegatívnych črevných paličiek - dôkaz skvasovania cukrov a produkcie H2S. Obsahuje tri cukry: glukóza, sacharóza, laktóza a železité soli + indikátor ph Zožltnutie pôdy znamená pozit. skvasovanie Enzymatickou činnosťou MO dochádza k zmene pôvodne červenej farby média na žltú Súčasne možno sledovať produkciu plynu a tvorbu sírovodíku/ bublinky, čierna zrazenina/

12 Christensenova pôda-id gramnegatívnych črevných paličiek-dôkaz produkcie ureázy a tvorby indolu Pôda obsahuje ureu a farebný indikátor Ak baktérie tvoria ureázu, štiepia ureu na amoniak a vodu, vzniká zásadité ph a pôda zmení farbu na červenú Tvorba Indolu: Vzniká z tryptofánu, ktorý sa pridáva do Christensen pôdy Po 24 hod. kultivácii a pridaní činidla vznikne červený prstenec na povrchu pôdy Negat., ak činidlo zostane nezmené

13 Rozlíšenie beta-hemolytických streptokokov OPTOCHÍNOVÝ TEST Na celú plochu pôdy KA naočkujeme kmeň a pridáme optochínový disk. Po kultivácii hodnotíme pozitívny dôkaz pneumokoka CAMP Test Dôkaz str. sk. B Str. Agalactiae Str. sk. B produkujú substanciu, ktorá hemolyzuje baranie krvinky, na ktoré predtým pôsobil stafylokokový beta-toxín. Na KA sa naočkuje vo forme čiar kmeň str. a kolmo na tieto čiary sa naočkuje kmeň stafylokoka produk. beta-toxín. Pozitívna reakcia v mieste kríženia očkovacích čiar vznikne klinovitá zóna úplnej hemolýzy BACITRACÍNOVÝ TEST Dôkaz str. sk. A Streptokoky sk. A /Str. pyogenes /- citlivejšie na bacitracín ako kmene iných Str. V strede naočkovanej pôdy je disk (0,04 IU Bacitracínu) Streptokoky skupiny A sú 100% citlivé na PNC

14 Komerčné testy v mikrotitračných dostičkách Založené na schopnosti baktérií metabolizovať rôzne substráty Baktéria+substrát+indikátor..pozit/negat Kombinujú niekoľko biochemických testov miniaturizovanej podobe - širšia škála reakcií inkubácia 4-24h, výsledky odčítavané posúdením farebných zmien priamo alebo po pridaní príslušného činidla vyhodnotením pozit. a negat. reakcií vzniká číselný kód, ktorý pomocou špeciálneho softvéru určí najpravdepodobnejšiu identifikáciu

15 Entero-Screen Test Využitie : na identifikáciu najčastejšie sa vyskytujúcich enterobaktérií Hodnotenie podľa farebnej matice a dif. tabuľky

16 REMEL RapID TM ANA II System REMEL RapID TM ANA II System mikrometóda- identifikácia lekársky závažných anaeróbnych baktérií Inkubácia C 4-6 hod. Výsledky se hodnotia podľa matice a zaznamenávajú sa do hodnotiaceho programu v PC. ERIC - Electronic RapID Compendium

17 BBL Crystal system Je určená na identifikáciu izolovaných aeróbnych grampozitívnych a gramnegatívnych baktérií Vyhodnotenie pomocou farebnej matice a PC softvéru CRYSTAL Testy sú založené na degradácii špecifických substrátov

18 Detekcia antigénu Metóda založená na reakci antigen protilátka V priamom dôkaze ide o reakciu bakt. antigénu z vypestovaného kmeňa s polyvalentnými či monovalentnými protilátkami pomocou aglutinácie spravidla na latexových časticiach. Metóda má široké využitie: Napr. odlíšenie Staphylococcus aureus /viazaná koaguláza/ rozlíšenie beta-hemolytických streptokokov. Na kartičku sa kvapne latexová supenzia s protilátkou+ bak. kolónia vznik aglutinátu. Pastorex Staph Plus Streptex aglutinácia Likvor aglutinácia

19 Maldi-Tof v mikrobiológii??? ( Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, s analyzátorom doby letu Time of Flight) Identifikácia na princípe hmotnostnej spektrometrie je analytická metóda založená na rozdelení nabitých častíc podľa ich molekulových hmotností (M r ) k stanoveniu vyšších molekulových hmotností sa používa ionizácia laserom za prítomnosti matrice (MALDI, matrix assisted laser desorption/ionization) v kombinácii s detektorom doby letu (TOF, time-of-flight) Princíp TOF Ióny sú separované na základe rôznych pomerov hmotností a náboja m/z Trubica vyplnená vákuom poskytuje priestor pre pohyb iónov rôznou rýchlosťou vzhľadom na ich hmotnosť a náboj vzniknuté hmotn. spektrum je charakteristické pre daný MO a slúži na jeho identifikáciu

20 Najpomalším krokom je kultivácia, ktorej sa však nevyhneme ani pri klasických metódach Maldi-Tof hmotnostná spektrometria VÝHODY Rýchla identifikácia /minúty/ Vhodný pre vojenské nemocnice NEVÝHODY Niektoré príbuzné druhy baktérií majú veľmi podobné Maldi-Tof hmotnostné spektrá (Napr. Str. pneumoniae a Str. mitis) (E. coli a Shigella) Takéto baktérie Maldi-Tof nerozozná - nutná klasická identifikácia Vysoké náklady na prístrojové vybavenie

21 Záver Fenotypová identifikácia mikroorganizmu je dôležitou úlohou klinickej mikrobiológie Techniky fenotypovej identifikácie baktérií sa v posledných rokoch intenzívne rozvíjajú a umožňujú tak veľký pokrok v bakteriálnej diagnostike I napriek moderným technológiám, ktoré sa už využívajú v niektorých laboratóriach klinickej mikrobiológie (MALDI-Tof) je stále nevyhnutné mať k dispozícii aj klasické metódy Preto kultivácia je stále jednou z kľúčových postupov mikrobiológie, zostáva najľahším a najefektívnejším spôsobom dôkazu prítomnosti baktérií vo vzorke a ich identifikácie

22 Ďakujem za pozornosť