MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Alena REKOVÁ VYUŽITÍ MUTANTŮ A ANALÝZY GENOVÉ EXPRESE PRO STUDIUM INTERAKCÍ CYTOKININŮ A SVĚTLA V REGULACI DLOUŽIVÉHO RŮSTU HYPOKOTYLŮ SEMENÁČKŮ ARABIDOPSIS THALIANA Disertační práce Školitel: prof. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc. Brno, 2010

2 Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Alena Reková Název disertační práce: Využití mutantů a analýzy genové exprese pro studium interakcí cytokininů a světla v regulaci dlouživého růstu hypokotylů semenáčků Arabidopsis thaliana Název disertační práce anglicky: Utilization of mutants and gene expression analyses to investigate cytokinin-light interactions in the regulation of hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana seedlings Studijní program: Biologie Studijní obor (směr), kombinace oborů: Obecná a molekulární genetika Školitel: prof. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc. Rok obhajoby: 2010 Klíčová slova v češtině: Arabidopsis thaliana, cytokininy, dlouživý růst hypokotylu, fotomorfogeneze, skotomorfogeneze, cytokininová signalizace Klíčová slova v angličtině: Arabidopsis thaliana, cytokinins, hypocotyl elongation, photomorphogenesis, scotomorphogenesis, cytokinin signaling

3 Alena Reková, Masarykova univerzita, 2010

4 Poděkování: Moje upřímné poděkování patří v prvé řadě mému školiteli prof. RNDr. Břetislavu Brzobohatému, CSc., za jeho odborné vedení a především čas, který věnoval diskuzím nezbytným ke směrování experimentů prezentovaných v této práci a k jejich co nejefektivnějšímu přínosu. Můj dík patří i všem mým kolegům z naší laboratoře, především za vytvoření přátelského pracovního prostředí a jejich psychickou podporu, a zejména pak Přemkovi Součkovi, za poskytnutí zkušeností s technikou RT-qPCT a nezanedbatelný experimentální příspěvek k problematice kvantifikace transkriptů cytokininových molekulárních markerů. V neposlední řadě jsem vděčná za podporu, motivaci a energii při vypracování této práce od svých nejbližších přátel a rodiny.

5 ABSTRAKT Doposud bylo popsáno, že cytokininy (CK) nemají žádný vliv na dlouživý růst hypokotylů u semenáčků Arabidopsis thaliana rostoucích na bílém světle a údajně CK stimulují dlouživý růst hypokotylů na bílém světle, když je zabráněno působení etylénu nebo je blokován transport auxinů. Detailněji byl v práci přezkoumán vliv CK na prodlužování hypokotylů u A. thaliana. Zatímco byl pozorován pouze nepatrný vliv CK na prodlužování hypokotylů při standardní intenzitě světla (80 μmol fotonů m -2 s -1 ), při nízké světelné intenzitě (20 μmol fotonů m -2 s -1 ) se projevila výrazná stimulace v prodlužování hypokotylů po aplikaci CK. Vliv CK na délku hypokotylů byl způsoben prodlužováním buněk. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů byla pozorována pro všechny čtyři základní typy CK (t-z, ip, BA, TDZ) a byla koncentračně závislá v nano-molárním rozsahu. Stimulační efekt CK byl potlačen při současné aplikaci antagonisty CK PI-55. Analýza mutantů a transgenních rostlin ukázala, že kanonická dvou-komponentní dráha odpovědi je nezbytná pro tento proces s převažující účastí cytokininových receptorů AHK2 a AHK3. Tento vliv CK byl nezávislý na etylénové signalizaci a částečně inhibován IAA. Naproti tomu, byla pozorovaná inhibice prodlužování hypokotylů způsobená CK při nízké intenzitě červeného světla (20 μmol fotonů m -2 s -1 ). Analýza mutantů ukázala, že tento efekt je zprostředkován cytokininovým receptorem AHK3.

6 Dissertation Abstract Cytokinins (CKs) were reported not to affect hypocotyl elongation in Arabidopsis seedlings grown in the white light, and CK reportedly promoted hypocotyl elongation in the white light when ethylene action or auxin transport was blocked. Here we re-investigated the effects of CKs on hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana. While only a marginal effect of CKs on hypocotyl length was observed at a standard white light intensity (80 μmol photons m -2 s - 1 ), a pronounced stimulation of hypocotyl elongation by CKs was found when the seedlings were cultivated at a decreased white light intensity (20 μmol photons m -2 s -1 ). The CK effect on hypocotyl length was due to cell elongation. The stimulation of hypocotyl elongation was observed for all four principal CKs (t-z, ip, BA, TDZ) and was dose-dependent in the nanomolar range. The stimulatory effect of the CKs was antagonized by PI-55. Mutant and transgenic plant analysis indicated that the canonical two-component response pathway is necessary for this process with prevailing contribution of cytokinin receptors AHK2 and AHK3. This CK action was independent of ethylene signaling and partially inhibited by IAA. In contrary, inhibition of hypocotyl elongation by CKs was observed at a decreased red light intensity (20 μmol m -2 s -1 ). Mutant analysis revealed that this effect is mediated by AHK3.

7 Obsah 1 Úvod Cytokininy Biosyntéza cytokininů Metabolismus cytokininů Přenos cytokininového signálu Světlo Fytohormony Kryptochromy Přenos světelného signálu Dlouživý růst hypokotylu Vliv fytohormonů na růst hypokotylu ve tmě Vliv fytohormonů na růst hypokotylu na světle Fytohormony a snížená intenzita světla Úloha cytokininů při prodlužování hypokotylu na světle Regulace hladiny endogenních cytokininů Zvýšená hladina endogenních cytokininů Degradace endogenních cytokininů Cíle disertační práce Materiál a metody Rostlinný materiál Chemikálie přidávané do kultivačního média Kultivace rostlin Měření délek hypokotylů Stanovení délek epidermálních buněk Kvantitativní RT-PCR (RT-qPCR) Izolace celkové RNA Reverzní transkripce Kvantitativní PCR Extrakce a purifikace CK a stanovení jejich hladin Obsah CK u semenáčků se systémem pop/lhg Obsah CK u semenáčků se systémem pop/lhgr...37

8 4 Výsledky Vliv cytokininů na dlouživý růst hypokotylů u Arabidopsis thaliana při snížené intenzitě bílého světla Role fyziologických hladin endogenních CK a percepce CK signálu v dlouživém růstu hypokotylů při nízkých intenzitách bílého světla Úloha klíčových článků signální dráhy cytokininů ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením cytokininů je nezávislá na signální dráze etylénu a je částečně inhibována auxinem Účinnost netypických forem CK ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů Vliv intenzity bílého světla na citlivost TCS vůči CK Vliv dostupnosti živin na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů cytokininy Nejen kvantita, ale i kvalita světla ovlivňuje cytokininy stimulovaný dlouživý růst hypokotylů Diskuse Úloha cytokininů v dlouživém růstu hypokotylů na světle Závěr Literatura Seznam zkratek...78

9 1 Úvod Rostliny jsou během svého života vystaveny silným vlivům mnoha environmentálních faktorů. Vzhledem ke svému přisedlému způsobu života se rostliny vyznačují vysokou plasticitou a flexibilitou v odpovědi na tyto podněty. Komplexní propojení interakcí environmenálních a endogenních signálů má dopad na růst a vývoj rostlin. Ke studiu vzájemné souhry těchto signálů v regulaci růstových a vývojových odpovědí u modelové rostliny Arabidopsis thaliana (A. thaliana) je používán jako velmi vhodný orgán embryonální a post-embryonální stonek, nazývaný hypokotyl. Hypokotyl slouží především ke studiu vlivu interakcí světla a rostlinných hormonů (fytohormonů) na prodlužování buněk (Vandenbussche et al., 2005; Collett et al., 2000; Gendreau et al., 1997). Mezi molekuly, které plní funkci přenašečů signálů u rostlin patří fytohormon cytokinin (CK). Vnímání a přenos CK signálů probíhá přes kanonickou dvou-komponentní dráhu odpovědi (TCS), který se podobá bakteriálnímu dvou-komponentnímu systému, kterým bakterie vnímají a odpovídají na environmentální podněty (Hutchison a Kieber, 2002; Heyl a Schmülling, 2003; Rashotte et al., 2005; To a Kieber, 2008; Kieber a Schaller, 2010). Světlo, které hraje velmi důležitou roli v růstu a vývoji rostlin je vnímáno světelnými senzory (fotoreceptory). Jsou to fytochromy (PHY) pro červené (R) a vzdálené červené (FR) světlo, kryptochromy (CRY) pro modré (B) a ultrafialové A (UVA) světlo, fototropiny (PHOT) a dosud neidentifikované ultrafialové B (UVB) fotoreceptory. Rostliny rostoucí ve tmě (skotomorfogeneze) a na světle (fotomofogeneze) se morfologicky výrazně liší (Chory et al., 1995; Chory et al., 1996; Jiao et al., 2007). Ve tmě mají rostliny prodloužené hypokotyly, malé nerozvinuté kotyledony a nevyvinuté chloroplasty. Rostliny se označují jako etiolované. Vystavení rostlin rostoucích ve tmě světlu, vede k jejich de-etiolaci, růst hypokotylů je inhibován, dochází k růstu listů, diferenciaci a vývoji chloroplastů. Růst hypokotylů ve tmě i na světle je řízen kromě světla také fytohormony. Účinek některých z nich je již dobře popsán jak ve tmě, tak na světle. CK ve tmě částečně napodobují roli světla tím, že způsobují zkracování hypokotylů, aktivují vrcholový apikální meristém (shoot apical meristem; SAM) a stimulují tvorbu listů (Chory et al., 1994; Lochmanová et al., 2008). Na světle není jejich působení na růst hypokotylů doposud zcela objasněno. Otevřenou otázkou také zůstává, na jaké úrovni jsou propojeny signální dráhy světla a fytohormonů. 9

10 1.1 Cytokininy CK patří do skupiny rostlinných růstových regulátorů, fytohormonů. Byly objeveny v padesátých letech minulého století Millerem a Skoogem jako látky, které stimulují proliferaci rostlinných buněčných kultur. Účastní se mnoha růstových a vývojových procesů, ať už stimulačně nebo inhibičně, např. dělení buněk, vytváření prýtových meristémů a definování jejich funkcí, tvorby vaskulárního systému, potlačení senescence listů, inhibice růstu a větvení kořene, diferenciace chloroplastů a mimo jiné hrají roli i v klíčení semen a odpovědi na stres (Mok a Mok, 2001). Protichůdně působí CK na růst prýtu a kořene. Formují, udržují a stimulují růst prýtového apikálního meristému, ale inhibují růst kořene (Kieber a Schaller, 2010). Kořenová špička je hlavním místem biosyntézy CK, které se zde nachází ve vysoké koncentraci, a které jsou dále přenášeny xylémem do nadzemních částí rostlin. Dříve byla považovaná za jediné místo syntézy CK právě kořenová špička, CK jsou však syntetizovány i v jiných částech rostlin např. v kambiu, v prýtovém apexu a nezralých semenech (Letham, 1974) a mají funkci lokálních signálních molekul i přenašečů signálů na větší vzdálenosti (Sakakibara, 2006). Přirozeně se vyskytující CK jsou deriváty adeninu s postranním řetězcem v poloze N 6. Podle struktury postranního řetězce jsou rozlišovány dva typy CK, isoprenoidní a aromatické. K aromatickým se řadí např. benzyladenin (BA) a ortho-topolin (ot). Jsou vzácnější a přestože byly nalezeny ve vyšších rostlinách (Strnad, 1997), jejich biosyntetická dráha nebyla doposud objasněna. Isoprenoidní CK se rozlišují na dva typy. Isopentenyladeninový, který nese v poloze N 6 adeninu isopentenylový postranní řetězec, a zeatinový, který má v poloze N 6 hydroxylovaný isopentenylový postranní řetězec. Stereoisomerická poloha hydroxylové skupiny ovlivňuje aktivitu trans- (tz) a cis- (cz) zeatinu (Hwang a Sakakibara, 2006; Sakakibara, 2006; Kakimoto 2003). CK se v rostlinách nachází ve formě volných bází, ribosidů nebo ribotidů. Za biologicky aktivní jsou považovány především volné báze, na základě jejich přímé vazby na cytokininový receptor CRE1 (Yamada et al., 2001), na který se CK ribosidy a ribotidy váží méně než odpovídající báze (Romanov et al., 2006; Spíchal et al., 2004). Syntetické CK se v rostlinách přirozeně nevyskytují, jejich zástupcem je difenylmočovinový typ, tidiazuron (TDZ), komerčně používaný jako herbicid (Sakakibara, 2006). 10

11 1.1.1 Biosyntéza cytokininů Klíčová role v biosyntéze isoprenoidních CK připadá enzymu adenosinfosfátisopentenyltransferase (IPT; EC ), katalyzujícímu přenos isopentenylu z dimetylallyldifosfátu (DMAPP) nebo 1-hydroxy-2-metyl-2-(E)-butenyl 4-difosfátu (HMBDP) na adenosin-5 -fosfát (AMP, ADP nebo ATP) do polohy N 6. IPT identifikovaná u některých fytopatogenních mikroorganismů, např. Agrobacteria tumefaciens (kódovaná genem ipt; Barry et al., 1984) využívá jako akceptor isopentenylu AMP (Sakakibara, 2006). IPT identifikovaná u vyšších rostlin, např. A.thaliana, upřednostňuje ADP a ATP před AMP (Kakimoto, 2001; Takei et al., 2003). U A.thaliana je IPT kódována multi-genovou rodinou reprezentovanou 7 geny (AtIPT1, AtIPT3-8); (Kakimoto, 2001). Další cestou biosyntézy isoprenoidních CK u rostlin, ale i živočichů, je trna prenylace adeninu na 3 konci antikodonu, katalyzovaná enzymem trna-isopentenyltransferasou (trna-ipt; EC ) (Golovko et al., 2002). Degradací prenylované trna dochází k uvolnění cz. U A.thaliana je trna-ipt kódována dvěma geny, AtIPT2 a AtIPT9 (Miyawaki et al., 2006). Není však považováno za pravděpodobné, že by touto cestou u rostlin vznikalo významně velké množství CK (obr. 1) Metabolismus cytokininů Metabolismus CK lze rozdělit do dvou kategorií, jedna se týká adeninového kruhu, druhá postranního řetězce. Za nejaktivnější formy CK jsou považovány jejich volné báze, jejichž uvolnění z nukleosidových či nukleotidových forem a naopak jejich vytváření je u A.thaliana katalyzováno několika enzymy, fosfatasou, adenosinkinasou a dvěma isoenzymy, adenin fosforybosyl-transferasami (APT2 a APT3; Allen et al,. 2002). Hladina aktivních CK může být dále regulována tvorbou konjugátů a to N- nebo O-glukosidů. N-glukosilace v polohách (N 3, N 7 a N 9 ) adeninového kruhu je katalyzována enzymem N-glukosyltrasferasou. N-glukosidy představují ireverzibilně neaktivní formu CK a jsou biologicky neaktivní s výjimkou částečně aktivních N 3 -glukosidů. Konjugace může probíhat také na hydroxylové skupině postranního řetězce tz, cz a dihydrozeatinu (DHZ). Konjugaci zbytků glukosy nebo xylosy za vzniku O-glukosidů respektive O-xylosidů katalyzuje zeatin-o-glukosyltransferasa (Martin et al., 1999), respektive zeatin-o-xylosyltransferasa (Martin et al., 1999). O- 11

12 glukosidy, na rozdíl od N-glukosidů, představují reverzibilní zásobní formy CK a uvolnění aktivních forem CK je katalyzováno ß-glukosidasou (Brzobohatý et al., 1993). Ustálená hladina aktivních CK je dána poměrem uvolněných CK bází z jejich konjugátů a degradací respektive konjugací CK. Velmi důležitou roli v homeostáze CK hraje cytokininoxidasa/dehydrogenasa (CKX; Galuszka et al., 2004; Werner et al., 2003), která katalyzuje oxidaci a odštěpení postranního řetězce CK, čímž je ireverzibilně degraduje. Substrátová specifita CKX spočívá v rozlišování dvojné vazby, proto jsou DHZ, O-glukosidy a aromatické CK vůči CKX rezistentní. CK isopentenylového typu mohou být hydroxylovány na konci postranního řetězce, což je katalyzováno enzymem cytochrom P450 monooxigenasou (CYP735A1 a CYP735A2) za vzniku tz nukleotidů, nukleosidů a volných bází (Takei et al., 2004b). Další metabolické enzymy se účastní změny přítomnosti nebo stereoisomerické polohy hydroxylové skupiny postranního řetězce. Zeatinreduktasa katalyzuje přeměnu tz na DHZ a zeatin cis-trans isomerasa katalyzuje vzájemnou přeměnu tz a cz. (obr. 1). Obr. 1 Současný model biosyntetické dráhy isoprenoidních CK u Arabidopsis thaliana (Sakakibara, 2006). Isoprenoidní postranní řetězec ip a tz pochází přednostně z metyleritritol fosfátové dráhy (MEP), zatímco postranní řetězec cz je odvozen převážně z mevalonové dráhy (MEV) (zelené šipky). Rostlinné IPT využívají preferenčně ATP nebo ADP jako akceptor isoprenoidu k tvorbě iprtp nebo iprdp (modré šipky). 12

13 1.1.3 Přenos cytokininového signálu Přenos CK signálu je u rostlin zprostředkován kanonickou dvou-komponentní dráhou odpovědi dvoukomponentním systémem (TCS) (obr. 2). Model TCS vznikl na základě podobnosti s dvou-komponentním systémem bakterií, jehož prostřednictvím bakterie vnímají a odpovídají na environmentální podněty. U bakterií se přenosu signálu účastní dvě komponenty, senzorová histidin (His) kinasa, která přijímá podněty a autofosforyluje konzervovaný histidyl kinasové domény, následuje fosforylace konzervovaného asparagylu regulátoru odpovědi, druhého člena dvou-komponentního systému. U některých bakterií a eukaryot včetně A.thaliana probíhá fosforylace ze senzorové His kinasy na regulátor odpovědi multi-krokově His Asp His Asp a zahrnuje navíc dalšího člena TCS, His fosfotransferový protein (Hwang a Sheen, 2001; To a Kieber, 2008; Kieber a Schaller, 2010). U A.thaliana jsou jednotlivé členy TCS kódovány multi-genovými rodinami. Tři receptory CK, transmembránové hybridní His kinasy, AHK4/WOL/CRE1 (CRE1/AHK4), AHK2 a AHK3 obecně nazývané Arabidopsis His kinasy (Arabidopsis histidin kinases; AHK) jsou tvořeny dvěma typy domén, extracelulární CK vazebnou doménou (CHASE) a cytoplazmatickou His- přijímačovou a vysílací doménou. Ostatní His kinasy identifikované u A. thaliana (AtHK1, CKI1 a CKI2/AHK5) nejsou považovány za CK receptory, jelikož postrádají CK vazebnou CHASE doménu (Kakimoto, 2003). Odlišná ligandová specifita receptorů CK, v rámci derivátů CK, umožňuje rostlinám ladit procesy řízené CK a tím rozhodovat o celkovém dopadu jejich působení na rostlinu (Hwang a Sakakibara, 2006). Receptory CK AHK2 a AHK3 jsou ve velké míře exprimovány především v nadzemních částech rostliny, jejich funkce pozitivních regulátorů přenosu CK signálu (CK signalizace) se zde překrývají. V menší míře je v prýtu exprimován i CRE1, avšak jeho exprese je lokalizována především v kořeni (Higuchi et al., 2004). Dalšími články přenosu CK signálu je pět Arabidopsis His fosfotransferových proteinů (Arabidopsis histidin phosphotransfer proteins; AHP; AHP1-AHP5). Nesou konzervované aminokyselinové zbytky, nezbytné k fosforylaci prostřednictvím konzervovaného His. AHP jsou prostředníkem zajišťujícím fosforylaci mezi senzorovými His kinasami (receptory CK), a regulátory odpovědi, posledními členy TCS, přičemž fosforylace přijímačové domény regulátoru odpovědi mění jeho aktivitu. Pro uskutečnění tohoto kroku přenosu CK signálu dochází k transportu AHP z cytoplazmy do jádra, ve kterém jsou lokalizovány regulátory odpovědi (Hwang a Sheen, 2001). 13

14 Regulátory odpovědi u A. thaliana (Arabidopsis response regulators; ARR) spadají do dvou hlavních tříd, označovaných jako typ-a (ARR3-ARR9, ARR15-ARR17) a typ-b (ARR1, ARR2, ARR10-ARR14, ARR18-ARR21). Geny kódující ARR typu A nesou přijímačovou doménu a pouze krátkou C-terminální doménu a jejich transkripce je zvýšena do 10 minut po aplikaci CK (D'Agostino et al., 2000). ARR typu B mohou jako transkripční faktory řídit expresi mnoha genů, což vede ke změnám funkce buněk. ARR typu A jsou označovány jako negativní regulátory primární odpovědi na CK a v reakci na CK inhibují přenos CK signálu (To a Kieber, 2008). Geny kódující ARR typu B nesou kromě přijímačové domény na svém C-terminálním konci také DNA-vazebnou a transaktivační doménu, která řídí transkripci mnoha genů regulovaných CK, mezi které spadají i geny ARR typu A. ARR typu B působí jako transkripční faktory řídící expresi mnoha CK regulovaných genů. Před nedávnem byly objeveny faktory odpovědi na CK (cytokinin response factors; CRF), které byly zařazeny jako nové komponenty účastnící se odpovědi na CK. Experimentálně u nich byla prokázána CK regulovaná transkripce. Transkripce tří z těchto genů je indukovaná pomocí ARR typu B. U A. thaliana jsou CRF kódovány malou šestičlennou genovou rodinou (CRF1-CRF6). CRF spadají do větší třídy transkripčních faktorů podobných genu Apetala2 (AP2) V odpovědi na CK se akumulují v jádře a to v závislosti na aktivitě AHK a AHP, ale zcela nezávisle na ARR typu A i B (Rasshote et al., 2003; To a Kieber, 2008). Doposud však není objasněno, jak CK řídí jejich transport mezi jádrem a cytoplazmou, a jak probíhá přenos signálu z AHP na CRF. Účast CRF na řízení exprese regulovaných genů CK byla prokázána analýzou mutantů v CRF genech (Rashotte et al., 2006). 14

15 Obr. 2 Model přenosu CK signálu u A. thaliana (To a Kieber, 2008). CK jsou vnímány transmembránovými receptory AHK2, AHK3 a CRE1/AHK4. Poté je zahájena multi-kroková fosforylace (modré šipky). CK signalizace se dále účastní His fosfotransferové proteiny (AHP) a regulátory odpovědi na CK (ARR) ARR typu A jsou negativní regulátory CK signalizace a ARR typu B jsou transkripční faktory, které řídí expresi genů regulovaných CK. 1.2 Světlo Světlo, zdroj energie pro fotosyntézu, současně působí jako jeden z nejvýznamnějších environmentálních faktorů ovlivňujících růst a vývoj rostlin. Ke vnímání světelných signálů mají rostliny vyvinuty fotoreceptory čtyř skupin, jak bylo uvedeno v kapitole 1. Jsou to fytochromy (PHY) pro červené (R) a vzdálené červené (FR) světlo, kryptochromy (CRY) pro modré (B) a ultrafialové A (UVA) světlo, fototropiny (PHOT) a neidentifikované receptory ultrafialového B záření (UVB). Jejich funkce se částečně překrývají, tudíž je morfogeneze semenáčků komplexním výsledkem spoluúčasti jednotlivých fotoreceptorů. Rostliny citlivě vnímají jak množství (intenzitu) světla, tak jeho kvalitu (vlnové délky). Neméně významný je také směr dopadajícího světla a doba po kterou na rostlinu působí. Odpověď rostlin na světlo 15

16 se promítá do mnoha vývojových procesů, např. klíčení semen, fotomorfogeneze semenáčků, vývoje a diferenciace chloroplastů, úniku před zastíněním, cirkadiánních rytmů a indukce kvetení. Klíčovou úlohu ve zprostředkování přenosu světelného signálu plní hierarchicky uspořádaný komplex transkripčních faktorů, které aktivují nebo potlačují expresi cílových, světlem regulovaných genů. Je známo, že přinejmenším 20 % genů A. thaliana vykazuje odlišnou expresi u semenáčků rostoucích na světle (fotomorfogeneze; de-etiolace) v porovnání s těmi co rostou ve tmě (skotomorfogeneze; etiolace). V přirozeném prostředí je každá vývojová fotomorfogenetická změna reakcí na různé světelné signály z více fotoreceptorů. V uspořádání transkripčních faktorů existují tzv. místa integrace signálů. Jedním z takových míst je světlem indukovaný transkripční faktor (Long Hypocotyl 5) (HY5), klíčový pozitivní regulátor během fotomorfogeneze semenáčků A. thaliana, který se účastní přenosu signálu R, FR i B světla. Ve světelné signální dráze působí za všemi fotoreceptory, je součástí kaskády transkripčních faktorů účastnících se fotomorfogeneze a váže se k promotorům některých světlem regulovaných genů (Jiao et al., 2007) (obr. 3). Fotoreceptory PHY, CRY i PHOT, jsou tvořeny proteinovou složkou, která váže apoprotein, pigment absorbující světlo (chromofor). Schopnost každého chromoforu absorbovat různé vlnové délky určuje spektrální specifitu jednotlivých fotoreceptorů. Obr. 3 Síť transkripčních faktorů světelné signální dráhy účastnících se fotomorfogeneze semenáčků (Jiao et al., 2007). Jednotlivé skupiny transkripčních faktorů vytváří separované sítě, které přímo interagují s určitým fotoreceptorem. Silná černá linka uprostřed označuje dráhu sbíhání signálních sítí separovaných skupin transkripčních faktorů. 16

17 1.2.1 Fytohormony Fytochromy (PHY) absorbují R a FR světlo a následně regulují odpovědi rostlin k světlu této části spektra, jako jsou např. klíčení, fotomorfogeneze a únik ze zastínění. U A. thaliana jsou kódovány malou genovou rodinou pěti genů (PHYA-PHYE). Na základě jejich stability na světle jsou rozděleny do dvou skupin. Fotolabilní, typ I, konkrétně PHYA, hromadí se v etiolovaných semenáčcích a velmi rychle degraduje po vystavení světlu. Fotostabilní, typ II, reprezentují čtyři zbylé fytochromy, PHYB-E. Vyznačující se relativní stabilitou na světle, na kterém jejich množství v buňkách významně převládá nad obsahem PHYA (Chen et al., 2004). PHY je rozpustný protein vyskytující se ve formě homodimeru. Každý monomer váže pigment, lineární tetrapyrolový chromofor (fytochromobilin). PHY se vyskytuje ve dvou spektrálně odlišných formách, mezi kterými dochází k fotokonverzi po absorpci světla dané vlnové délky. Forma PHY red (Pr) s absorpčním maximem max = 660 nm po absorpci R světla přechází do formy PHY far-red (Pfr) s max = 730 nm a ta je absorpcí FR světla konvertována zpět na formu Pr. PHY jsou syntetizovány ve formě Pr a v této podobě se vyskytují v cytosolu. Jejich fotokonverze vede nejen ke změně formy z Pr na Pfr, ale také ke změně lokalizace. Z cytosolu se přemisťují do jádra, kde se váží na nukleární proteiny např. CRY, aux/iaa proteiny a transkripční faktory, např. (phytochrome interacting factor; PIF3; pozitivní regulátor přenosu signálu ve PHY signální dráze), které spouští transkripci specifických, světlem regulovaných genů (Kim et al., 2003; Chen et al., 2004). Za biologicky aktivní se považuje forma Pfr a to na základě pozorování, kdy fotokonverze Pr do Pfr zahajuje celou škálu biologických odpovědí, zatímco forma Pr tyto odpovědi zastavuje a je tudíž považována za neaktivní formu PHY (Chory et al., 1996). Molekulární mechanismus, kterým Pfr vyvolává biologické odpovědi, není zatím objasněn. Ale za obecně přijímané vysvětlení biologické aktivity Pfr se považuje konformační změna chromoforu během fotokonverze, jejímž důsledkem odlišně interaguje s funkčními komponentami světelné signální dráhy. Z molekulárních a genetických analýz mutantů necitlivých ke světlu, identifikovaných na základě jejich neschopnosti inhibovat růst hypokotylu při různých vlnových délkách bylo prokázáno, že PHYA i B řídí podobné odpovědi na světlo s tím rozdílem, že PHYA vnímá FR a PHYB R. Ovšem analýzy dvojnásobného mutanta phyaphyb dále ukázaly, že funkce PHYA i B není zcela oddělená, ale společně zajišťují odpověď na R světlo, kterou je de-etiolace semenáčků. U dvojnásobného mutanta phyaphyb byla detekována silnější deficience deetiolace na R světle než u jednoduchého mutanta phyb (Chory et al., 1995, 1996). 17

18 1.2.2 Kryptochromy U mutanta s deficiencí v lokusu HY4 byl identifikován fotoreceptor kryptochrom (CRY) detekující B a UVA světlo. U A. thaliana se vyskytují dva příbuzné kryptochromy, CRY1 a CRY2, kódované geny CRY1 a CRY2. Mají odlišnou, i když částečně se překrývající, funkci. Jsou to rozpustné jaderné proteiny přítomné ve všech rostlinných orgánech. Každý z nich nese dva chromofory, flavin a pterin. CRY2 je, podobně jako PHYA, na světle nestabilní. Rychlý pokles jeho hladiny, u semenáčků vystavených světlu bezprostředně po jejich růstu ve tmě, je důsledkem degradace proteinu CRY2, nežli snížení transkripce genu CRY2. Naproti tomu, CRY1 je na světle stabilní (Taiz a Zeiger, 2002) Přenos světelného signálu Funkce všech tří fotoreceptorů ve vývoji rostlin jsou nejen specifické, ale také překrývající se, z čehož vyplývá, že fotoreceptory mohou jednak aktivovat společnou signální dráhu s jejími obecnými členy, ale na druhou stranu se tu vyskytují i členy specifické jednotlivým fotoreceptorům R, FR a B světla (Chory et al., 1996). Například k zahájení fotomorfogeneze po přijetí a přenosu světelného signálu světelnou signální dráhou dochází dvěma možnými způsoby. Transkripce fotosyntetických genů může být spuštěna pozitivní regulací, nebo přenos světelného signálu zastavují negativní regulárory fotomorfogeneze, jejichž úkolem je potlačit fotomorfogenezi u semenáčků rostoucích ve tmě. Analýzou mutantů byli u A. thaliana identifikovány geny DET, COP a FUS, které kódují egativní regulátory fotomorfogeneze. U semenáčků mutantů de-etiolated (det), constitutively photomorphogenic (cop) a fusca (fus) docházelo i ve tmě k fotomorfogenezi (Chory et al., 1995, 1996). Dále byly analýzou mutantů ve světelné signální dráze identifikovány tři pozitivně fungující přenašeče světelného signálu. Jedná se o HY5, který se účastní přenosu signálu R, FR i B světla.far-red elongated hypocotyl (FHY1 a FHY3), fungující v přenosu signálu FR světla a CAB underexpressed (CUE), řídící expresi některých světlem regulovaných genů v buňkách mezofylu (Li et al., 1995; Chen et al., 2004). 18

19 1.3 Dlouživý růst hypokotylu Vhodným objektem ke studiu interakcí mezi environmentálními a endogenními podněty a jejich dopadu na růst a vývoj rostlin, je embryonální stonek dvouděložných rostlin, hypokotyl. Vhodný je především pro svou plasticitu, rychlou vývojovou odpověď na podněty a jednoduchou morfologii. Jedním ze studovaných jevů u hypokotylu je jeho prodlužování, které je regulováno komplexem spolupůsobících faktorů, mezi které patří mimo jiné i světlo a fytohormony (Vandenbussche et al., 2005). Hypokotyl je embryonální a postembryonální stonek, který spojuje embryonální lity (kotyledony) s kořenem semenáčku. Po své délce, od báze až k vrcholu je tvořen přibližně dvaceti epidermálními buňkami, z nichž většina je založena již v embryonálním stádiu. Na jeho příčném řezu, ve směru od středu k vnějšímu okraji, lze pozorovat cévní svazek, jednu endodermální, dvě kortikální a jednu epidermální vrstvu buněk. Růst hypokotylu je zprostředkován prodlužováním buněk, během růstu dochází k dělení jen nepatrného počtu buněk (Gendreau et al., 1997). Na prodlužování hypokotylu mají velký vliv světlo a fytohormony. Z fytohormonů jsou to především auxiny, CK, etylén, gibereliny (GA) a brasinosteroidy (BR). Fototropická odpověď, tedy směr růstu nadzemní části rostliny (prýtu) za světlem, zdrojem energie pro fotosyntézu, dopadajícím na rostlinu z určitého směru, je řízena fotoreceptory ze skupiny PHOT a distribucí fytohormonu auxinu Vliv fytohormonů na růst hypokotylu ve tmě Ve tmě jsou semenáčky etiolované, kotyledony zůstávají uzavřené, vytváří se tzv. apikální háček, který chrání apex před poškozením při prorůstání semenáčku substrátem na jeho povrch. Růst kořene je redukován, zatímco hypokotyl se silně prodlužuje. Účelem tohoto vývojového programu (skotomorfogeneze) je rychlé dosažení světla, které umožní následné zahájení de-etiolace (fotomorfogeneze). Hned několik fytohormonů přispívá k ovlivnění růstu hypokotylu ve tmě. Etylén, v rámci tzv. trojné odpovědi, inhibuje prodlužování buněk. Podobný účinek na růst hypokotylu mají i CK. Ty působí prostřednictvím etylénu tak, že zvyšují jeho biosyntézu stabilizací klíčového enzymu v biosyntetické dráze etylénu, syntasy kyseliny 1-aminocyklopropan-1- karboxylové (ACS). Důsledkem zvýšené biosyntézy etylénu 19

20 podmíněné CK je inhibice prodlužování hypokotylu (Chae et al., 2003; Vandenbusche et al., 2005). GA patří mezi přední růstové regulátory, ovšem ve tmě exogenně dodané GA již nepodporují další prodlužování hypokotylů etiolovaných semenáčků (Cowling a Harberd, 1999). Z toho vyplývá, že ve tmě je dosaženo maximální odpovědi již při fyziologické hladině endogenních GA. Transport auxinů ve tmě sice nezprostředkovává prodlužování hypokotylu, přesto bylo pozorováno, že mutace některých genů nezbytných pro auxinovou odpověď (suppressor of hy2 mutation; SHY1 a SHY2) (Kim et al., 1996), zapříčiňuje krátký hypokotyl u etiolovaných semenáčků. Dalšími nezbytnými fytohormony, které zajiťují normální růst hypokotylů ve tmě jsou BR. Jejich úloha byla prokázána na základě fenotypu mutantů v biosyntetické a signální dráze BR, např. photomorphogenic dwarf (cpd), det2 (Kauschmann et al., 1996), vykazujících krátký hypokotyl i při růstu ve tmě Vliv fytohormonů na růst hypokotylu na světle Jak je již řadu let známo, auxiny (Smets et al., 1995), GB (Cowling a Harberd, 1999), BR (Clouse, 1996) a etylén (Smalle et al., 1997; Smets et al., 1995) patří mezi fytohormony podporující růst hypokotylu na světle. Ke studiu vlivu fytohormonů na růst hypokotylu jsou používáni mutanti v metabolických a signálních drahách a rovněž transgenní linie nesoucí transgen, důsledkem jehož exprese je modulována přirozená hladina příslušného fytohormonu. Dále je možné využít chemických inhibitorů biosyntézy a antagonistů působení příslušného fytohormonu. První popsaná látka s antagonistickým účinkem k CK je 6-(2- hydroxy-3-methylbenzylamino) purin (PI-55), který potlačuje aktivitu CK na úrovni receptorů CK (Spíchal et al., 2008). Z environmentálních faktorů je světlo jedním z nesilnějších, které růst hypokotylu inhibují (Gendreau et al., 1997). Folta et al. (2003) pozorovali inhibici prodlužování hypokotylu způsobenou světlem, která je založena na potlačení signálních drah auxinů a GA, modrým světlem. Tuto hypotézu vytvořili na základě analýzy mutanta cryptochrome1 (cry1), která odhalila jeho zvýšenou odpověď na přítomnost auxinů a GA v podobě prodloužených hypokotylů ve srovnání s divokým typem (kontrolou). Podobně byla pozorována i inhibice prodlužování hypokotylu potlačením signální dráhy BR modrým světlem. Vysoká hladina BR 20

21 je nezbytná pro skotomorfogenezi ve tmě, zatímco jejich biosyntéza je inhibována světlem a snížená hladina BR přispívá k celkové fotomorfogenezi na světle (Ma et al., 2001). Na rozdíl od tmy, na světle přidané exogenní GA stimulují prodlužování hypokotylu. Toto pozorování bylo potvrzeno analýzou mutantů v biosyntetické a signální dráze GA. Semenáčky mutanta s deficiencí v genu pro biosyntézu GA (GA requiring 1; GA1) vykazovaly krátké hypokotyly, naopak u mutanta s konstitutivní GA signalizací spindly (spy) byly pozorovány dlouhé hypokotyly (Cowling a Harberd, 1999; Vandenbussche et al., 2007). Na základě pozorování fenotypového projevu mutanta v auxinové signální dráze auxin resistant (axr1), kdy semenáčky mutanta měly krátké hypokotyly ve srovnání s kontrolními semenáčky, byla potvrzena role auxinů v prodlužování hypokotylu na světle. Na druhou stranu bylo prokázáno, že již přirozená hladina auxinů u semenáčků A. thaliana je optimální pro dlouživý růst a přídavek auxinu způsobuje inhibici růstu hypokotylu (Collet et al., 2000). Ovšem, za určitých růstových podmínek byl pozorován i pozitivní vliv exogenních auxinů na růst hypokotylu, a to tehdy pokud byly semenáčky pěstovány na růstovém médiu s velmi nízkým obsahem minerálních solí (LNM). Prodlužování hypokotylu je v tomto případě zapříčiněno růstovými podmínkami, které nejsou za těchto kultivačních podmínek dostačující pro syntézu endogenních auxinů u semenáčků (Smalle et al., 1997). Smalle et al. (1997) pozorovali pozitivní vliv etylénu a jeho prekurzoru, 1- aminocyklopropan-1-karboxylové kyseliny (ACC), na prodlužování hypokotylu na světle. Bylo pozorováno dvojnásobné prodloužení hypokotylu ve srovnání s kontrolou pokud byly semenáčky kultivovány na LNM. Prodlužování hypokotylů podmíněné etylénem je důsledkem prodlužování buněk nikoliv jejich dělení. Nezbytnou podmínkou etylénem podmíněného prodlužování hypokotylů na světle je přítomnost modrého světla, respektive funkční CRY signalizace. Dvojnásobný mutant v signální dráze modrého světla cry1cry2 kultivovaný na modrém světle odpovídal fenotypově kontrole kultivované ve tmě. Po aplikaci ACC cry1 i cry2 vykazovaly redukovaný růst hypokotylu. Prodlužování hypokotylu na světle, jako odpověď na přítomnost etylénu, je závislé na minimální přípustné hladině GA, tedy funkční signální dráze GA, ale paradoxně není touto dráhou zprostředkováno (Vandenbussche et al., 2007). 21

22 1.3.3 Fytohormony a snížená intenzita světla Etiolace, která byla zmíněná již v kapitole 1.2, není morfologickou odpovědí pouze u rostlin rostoucích ve tmě, ale je vyvolána i při zastíněním, při kterém dochází ke snížení poměru R/FR. V souvislosti s morfologickými reakcemi rostlin na zastínění byla dlouhou dobu studována především kvalita (spektrální složení) světla. Nicméně důležitou roli zde hraje i kvantita (intenzita) světla, které se rostliny musí přizpůsobit. Nedávno bylo prokázáno, že prodlužování hypokotylu při snížené intenzitě světla je podmíněno auxiny a etylénem. Obecně je přijatý poznatek, že světlo inhibuje biosyntézu etylénu snížením aktivity enzymu ACC oxidasy (ACO), která katalyzuje biosyntézu ACC. Naopak, při snížené intenzitě světla je produkce etylénu zvýšená (Vandenbussche et al., 2003). Význam auxinů a etylénu v prodlužování hypokotylu při snížené intenzitě světla byl prokázán analýzou mutantů s deficiencí v jejich signálních drahách (axr a etr), kteří vykazovali v porovnání s kontrolami sníženou odpověď na sníženou intenzitu světla (Vandenbussche et al., 2003) Úloha cytokininů při prodlužování hypokotylu na světle Su a Howell (1995) pozorovali nezávislý a aditivní inhibiční vliv světla a CK na prodlužování hypokotylu. Inhibice růstu hypokotylu, byla blokována u mutanta long hypocotyl 5 (hy5), ale nebyla u něj změněná odpověď na přítomnost CK. Podobně, blokovaná CK-etylénová odpověď u mutanta cytokinin resistant/ethylene insetsitive (ckr1/ein2) neovlivnila odpověď na světlo. Inhibice prodlužování hypokotylu u A. thaliana byla odpovědí na světlo i CK. Jelikož světlo a CK způsobují inhibici prodlužování hypokotylu nezávisle a aditivně, při saturující hladině světla (7 µmol fotonů m -2 s -1 ), světlo překrývalo účinek CK, a naopak při saturující koncentraci CK (50 µm BA), CK maskovaly účinek světla. V pozdější práci Smets et al. (2005) popsali, že CK podporují prodlužování hypokotylu při snížené intenzitě světela (40 µmol fotonů m -2 s -1 ) pokud byla blokována buď funkce etylénu, nebo transport IAA. Kontrolní rostliny na médiu s BA obohaceném navíc o inhibitory působení nebo biosyntézy etylénu (dusičnan stříbrný nebo aminoetoxyvinylglycin; AVG), stejně jako na médiu s inhibitorem transportu IAA kyselinou 1-naftylftalamovou (NPA), vykazovaly významně delší hypokotyly ve srovnání se semenáčky na médiu s přídavkem samotného BA. Podobně se chovali i mutanti v etylénové signální 22

23 dráze ethylene resistant (etr1) a ein2. V této studii byl rovněž pozorován stimulační vliv CK na biosyntézu etylénu v souladu s prací Cary et al., (1995). Vandenbussche et al. (2007) studovali vliv CK na dlouživý růst hypokotylu při nízkých intenzitách B světla (0,8; 2,5 a 12 µmol fotonů m -2 s -1 ). Pozorovali, že samotné B světlo inhibuje dlouživý růst hypokotylu divokého typu (Ler-0), ale ne dvojnásobného mutanta cry1cry2. Avšak exogenní CK (BA) na B světle inhibuje dlouživý růst hypokotylu u každé z použitých linií, Ler a cry1cry2. Při nejvyší použité intenzitě světla pozorovali, že inhibice dlouživého růstu hypokotylu je saturována a není dále stimulována CK. Avšak mutant cry1cry2 reagoval na rostoucí koncentraci BA i při nejvyšší použité intenzitě světla. Vzhledem k tomu že při nejnižších použitých intenzitách světla a ve tmě způsobil BA stejnou míru inhibice dlouživého růstu hypokotylu u Ler-0 i mutanta cry1cry2, znamená to, že CK způsobují inhibici dlouživého růstu hypokotylu nezávisle a aditivně s CRY. Mira-Rodado et al. (2007) ve své práci pozorovali inhibici dlouživého růstu hypokotylů způsobenou přítomností CK (0,5µM kinetinu) při kultivaci semenáčků divokého typu Col-0 na R světle. 1.4 Regulace hladiny endogenních cytokininů Zvýšená hladina endogenních cytokininů Systém CaMV35S-LhG4/pOp-ipt (pop/lhg4; Moore et al., 1998) umožňuje zahájit syntézu proteinu ipt po zkřížení reportérové linie nesoucí konstrukt pop-ipt a aktivátorové linie s konstruktem CaMV35S-LhG4. Ke konstitutivní expresi genu zájmu ipt dochází již v generaci F1, díky dominantnímu charakteru každého z uvedených transgenů (obr.4a,b). Modifikací systému pop/lhg4 byl vytvořen systém CaMV35S-LhGR-N/pOp-ipt (pop/lhgr; Craft et al., 2005; Šámalová et al., 2005) s indukovatelnou expresí genu zájmu ipt. V tomto případě se v genomu jedné transgenní rostliny vyskytují dva konstrukty - popipt, který je shodný s konstruktem uvedeným v systému pop/lhg4 a konstrukt CaMV35S- LhGR-N, který má na N konci LhG4 domény připojenou doménu GR (obr. 4C). Je to vazebná doména krysího receptoru glukokortikoidů. Nepřítomnost steroidního ligandu, např. dexametazonu (Dex), vede k vazbě hsp90 (heat shock protein 90) na transkripční aktivátor LhGR, důsledkem čehož dochází k jeho inaktivaci. Naopak transkripce genu zájmu umístěného pod pop promotorem (pop-ipt) je spuštěna aplikací steroidního hormonu Dex, 23

24 který vyvázáním hsp90 umožní uvolnění trans-aktivační domény LhGR a může dojít k vazbě na pop promotor, čímž dochází ke spuštění transkripce. C Obr. 4 (A), Princip binárního transaktivačního systému (Moore et al., 1998). Exprese reportérového genu je spuštěna v generaci F1, získané zkřížením rodičovské reportérové- a aktivátorové linie. Aktivátorová linie exprimuje heterologní transkripční faktor, který specificky rozpoznává promotor reportérového genu. (B), Schématické znázornění reportérového a aktivátorového konstruktu. V reportérovém konstruktu je spojen gen zájmu s minimálním promotorem TATA postrádajícím transkripční aktivitu. Před TATA boxem jsou umístěna vazebná místa pro transkripční faktor s DNA vazebnou specifitou, která se nenachází u rostlin. (C), Schématické znázornění reportérového (pop-ipt) a aktivátorového (LhG4 respektive LhGR-N) konstruktu (Šámalová et al., 2005). Exprese reportérového genu ipt v pop reportérovém konstruktu je řízena chimerickým promotorem, který je tvořen ze dvou operátorů umístěných před minimálním CaMV35S promotorem. Exprese aktivátorových konstruktů LhG4 respektive LhGR je řízena promotorem CaMV35S. Transkripční aktivátor LhG4 je tvořen DNA vazebnou doménou laci z lac represorového mutanta a GAL4 transkripční-aktivační doménou-ii z kvasinky. Steroidní vazebná doména GR je připojena k N-terminálnímu konci LhG4. 24

25 1.4.2 Degradace endogenních cytokininů Galuszka et al. (2004) vytvořili transgenní rostliny A. thaliana nesoucí konstrukt CaMV35S>GR>HvCKX2 s Dex indukovatelnou expresí genu HvCKX2 z ječmene (Hordeum vulgare). Cytokinin oxidasa/dehydrogenasa (CKX2) katalyzuje degradaci endogenních CK s nesaturovaným postranním řetězcem. Rostliny CaMV35S>GR>HvCKX2 po ošetření Dex vykazovaly CK deficientní fenotyp. 25

26 2 Cíle disertační práce Regulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK byla uspokojivě objasněna u semenáčků kultivovaných ve tmě. Naproti tomu při studiu účinků CK na dlouživý růst hypokotylů u semenáčků kultivovaných na bílém světle byly nezávislými autory publikovány nekonzistentní výsledky. Cílem disertační práce bylo podrobně prozkoumat vliv CK na dlouživý růst hypokotylů semenáčků Arabidopsis thaliana kultivovaných na bílém světle. K dosažení tohoto cíle byly vytyčeny tyto dílčí cíle. 1. Stanovit vliv exogenních CK na dlouživý růst hypokotylů semenáčků Arabidopsis thaliana kultivovaných při různých intenzitách bílého světla za různých nutričních podmínek kultivačního média. Srovnat vliv ošetření exogenními CK a účinku zvýšení hladin endogenních CK s využitím transgenních linií umožňujících regulovatelnou expresi genu ipt. 2. Poznat roli fyzilogických hladin CK a signální dráhy CK v regulaci dlouživého růstu hypokotylů při snížených intenzitách bílého světla s využitím regulavané exprese genu kódujícího cytokininoxidasu/dehydrogenasu HvCKX2 a antagonisty cytokininů PI Identifikovat receptory CK a jednotlivé návazné články signální dráhy CK podílející se na regulaci dlouživého růstu hypokotylů s využitím odpovídajících mutantů a transgenních rostlin. 4. Srovnat míru responsivity signální dráhy CK při standardní a snižené intenzitě světla jako možného faktoru podílejícího se na regulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK. 5. Zjistit podíl jednotlivých fotoreceptorů na regulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK s využitím odpovídajících mutantů. 6. Potvrdit dříve zjištěné vlivy CK na dlouživý růst hypokotylů kultivovaných při nízkých intenzitách modrého a červeného světla. 26

27 3 Materiál a metody 3.1 Rostlinný materiál Interakce zvýšených nebo snížených hladin endogenních CK a světla v regulaci růstu hypokotylu byly studovány s využitím transgenních rostlin Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotypu Columbia 0 (Col-0), nesoucích konstrukty se dvěma různými transgeny (ipt nebo HvCKX2), jejichž exprese vede k modulaci endogenních hladin CK. Vliv interakcí zvýšených hladin endogenních CK a světla na dlouživý růst hypokotylu byl studován na transgenních rostlinách se systémem pop/lhg4 nesoucích konstrukt CaMV35S-LhG4/pOp-ipt (Moore et al., 1998) s konstitutivní expresí genu pro isopentenyltransferasu (ipt) izolovaného z Agrobacterium tumefaciens. Zvýšenou endogenní hladinu CK měla F1 generace rostlin získaná křížením homozygotní rodičovské aktivátorové linie (CaMV35S-LhG4) 14C se čtyřmi nezávislými rodičovskými reportérovými liniemi (pop-ipt) 2H 2, 44G 4, 7G 1, 4G 3. Následně byly použity transgenní rostliny s pop/lhgr systémem s Dex regulovatelnou expresí genu ipt (CaMV35S-LhGR-N/pOp-ipt dále CaMV35S>GR>ipt; linie 11 a 13 ; Craft et al., 2005). Ke studiu vlivu interakcí snížených hladin endogenních CK a snížené intenzity světla na dlouživý růst hypokotylu byly použity rostliny A. thaliana nesoucí transgen CaMV35S-LhGR-N/pOp-HvCKX2 (dále CaMV35S>GR>HvCKX2; linie 4) na pozadí Col-0 s nadprodukcí enzymu cytokinin oxidasy/dehydrogenasy CKX2 z ječmene (HvCKX2), které je dosaženo Dex indukovatelnou expresí genu HvCKX2 (Galuszka et al., 2004). Rostliny byly laskavě poskytnuty doc. Galuszkou. V případě studia morfologických změn na semenáčcích v přítomnosti exogenních CK v médiu byly použity rostliny ekotypu Col-0 a dvojnásobné mutantní linie s deficiencí v receptorech CK - Arabidopsis histidine kinase (ahk2ahk3, ahk2cre1 a ahk3cre1) ahk2-5, Sail collection - SAIL_575_E05, Sesion et al., 2002; ahk3-7, GABI-KAT - 105E02, Rosso et al., 2003; cre1-2, Kakimoto, Inoue et al., 2001) a transgenní rostliny CaMV35S-ARR1- SRDX (dominantní represorová verze Arabidopsis response regulator ARR1; linie 8; Heyl et al., 2008) na pozadí ekotypu Col-0. Mutanti v receptorech CK, stejně jako transgenní rostliny CaMV35S-ARR1-SRDX, byli laskavě poskytnuti prof. Schmüllingem. Jednoduchý a trojnásobný mutant cytokinin response factor (crf) crf5 a crf1crf2crf5 (Rashotte et al., 2006) byli laskavě poskytnuti prof. Rashottem. Linie mutantní v biosyntetických nebo signálních drahách fytohormonů ethyleneresistant (etr1-3), ethylene-insensitive (ein2-1) a de-etiolated (det2-1) na pozadí ekotypu Col- 27

28 0 byly získány z The European Arabidopsis Stock Centre. Linie mutantní ve fotoreceptorových signálních drahách cryptochrome2 (cry2-1) na pozadí Col-0 a long hypocotyl (hy1-1, hy2-1, hy4-1, hy5-1), phytochrome A (phya-201), phytochrome B (phyb-1), phytochrome A phytochrome B (phya-201 phyb-5) na pozadí ekotypu Ler-0, byly získány z The European Arabidopsis Stock Centre (seznam mutantů je uveden v tabulce P1). Col-0 a všechny tři výše uvedené linie dvojných mutantů v cytokininových receptorech byly dále použity ke stanovení hladiny transkriptů cytokininových molekulárních markerů, Arabidopsis response regulator (ARR3-6 a ARR16) Chemikálie přidávané do kultivačního média Zásobní roztoky hydrofobních látek byly připraveny jejich rozpuštěním v dimetyl sulfoxidu (DMSO; Sigma), tak, aby finální koncentrace DMSO v médiu byla vždy 0,002%, a tedy kontrolní médium bylo identické s kultivačním médiem obsahujícím studovanou látku (vyjma studované látky samotné) (tab. 1). Název Zkratka Koncentrace Jednotky Výrobce aminoetoxyvinylglycin AVG 10 M Fluka cis-zeatin cz 0.1, 1, 10, 50, 100 M Olchemim Ltd dexametazon Dex 10, 80, 100, 130, 200 nm Sigma 1, 10 M dihydrozeatin DHZ 0.1, 1, 10, 50, 100 M Olchemim Ltd dimetyl sulfoxid DMSO % Sigma kyselina indolyl-3-octová IAA 6 M Duchefa orto-topolin ot 0.1, 1, 10, 50, 100 M Olchemim Ltd tidiazuron TDZ 1, 10, 50,100, 500 nm Olchemim Ltd 1, 5, 10 M trans-zeatin tz 1, 10, 50,100, 500 nm Olchemim Ltd 1, 5, 10, 50, 100 M 1-aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina ACC 50 M Sigma 6-benzyladenin BA 1, 10, 50,100, 500 nm Olchemim Ltd 1, 5, 10 M 6-isopentenyladenin ip 1, 10, 50,100, 500 nm Olchemim Ltd 1, 5, 10 M 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino) purin PI-55 5 M Dr. Spíchal Tab. 1 Seznam látek přidávaných do kultivačního MS nebo LNM média. 28

29 3.2 Kultivace rostlin Semena A. thaliana byla povrchově sterilizována 75% etanolem po dobu 5-7 minut. Poté byla osušena na filtračním papíře a vyseta (po 15 kusech na jednu misku) na čtvercové Petriho misky (12,5 12,5 cm) do jedné linie, aby byly všechny rostliny během svého růstu ve stejné vzdálenosti od světelného zdroje. Po výsevu byly misky zalepeny polopropustnou páskou z netkaného textilu (Medipor 2210; Mediplast) Semena byla vyseta na pevné Murashige-Skoogovo (MS) kultivační médium (Duchefa) s 1,2% rostlinným agarem (Duchefa) s přídavkem 0,05% MES (Merck) a ph upraveným před autoklávováním na hodnotu 5,7-5,8 pomocí 1M KOH. Semena na miskách byla vystavena chladu (4-7 C) ve tmě, po dobu 78 hod. za účelem vernalizace a dosažení synchronizace klíčení. Poté byly misky vertikálně umístěny do kultivačních boxů CU36L5 (Percival Scientific) a semenáčky rostly v podmínkách odpovídajících dlouhému dni s ostrými přechody mezi dnem a nocí (16 hod./ 21 C světlo 8 hod./ 19 C tma), pod fluorescenčními trubicemi vyzařujícími bílé studené světlo (Philips). Spektrální složení bílého studeného světla je uvedeno v (obr. 5) Obr. 5 Spektrální složení bílého studeného světla vyzařovaného fluorescenčními trubicemi TL-D 18W/ (Philips). U vybraných experimentů semenáčky rostly při specifických světelných podmínkách na R ( =660 nm), FR ( =740 nm) nebo B ( =470 nm) světle. Zdrojem světla o přesných vlnových délkách byl panel osazený diodami vyzařujícími světlo (light emitting diode, LED). Panel byl konstruován v rámci spolupráce s Fakultou elektrotechniky a komunikačních 29

30 technologií VUT v Brně. Je osazen LED o spektrálních charakteristikách uvedených v (tab. 2). Uspořádání LED na panelu je ukázáno na (obr. 6). Výrobce ( Philips) Vlnová délka Tok fotonů Počet diod Název mol s -1 ) na 1 modul GreenPower LED module HF blue GreenPower LED module HF far red GreenPower LED module HF deep red Tab. 2 Spektrální charakteristika LED modulů. LED moduly jsou vytvořeny tak, že světlo je homogenní ve vzdálenosti 50 cm od zdroje vyzařování. Obr. 6 Uspořádání jednotlivých LED modulů na panelu. V experimentech s barevnými LED moduly byly semenáčky kultivovány při kontinuálním osvětlení při teplotě 21 C v kultivačním boxu AR36L (Percival Scientific). V jedné sérii experimentů bylo kromě MS média použito i médium s nízkým obsahem minerálních solí (LNM) pro vyhodnocení vlivu úrovně minerální výživy v regulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK při snížených intenzitách bílého světla. Složení média bylo převzato z práce (Smets et al., 1995). 30