Cytokininy ve vývoji Arabidopsis pi nízkých intenzitách svtla

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brn Agronomická fakulta Ústav molekulární biologie a radiobiologie Cytokininy ve vývoji Arabidopsis pi nízkých intenzitách svtla Bakaláská práce Vedoucí práce: doc. RNDr. Betislav Brzobohatý, Csc. Vypracovala: Irena Neumannová Brno 2010

2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem závrenou práci na téma Cytokininy ve vývoji Arabidopsis pi nízkých intenzitách svtla vypracovala samostatn a použila jen pramen, které cituji a uvádím v piloženém seznamu literatury. Dne. Podpis studenta..

4 PODKOVÁNÍ Chtla bych podkovat doc. RNDr. Betislavu Brzobohatému, Csc., vedoucímu mé bakaláské práce a Mgr. Alen Rekové za odborné vedení, cenné rady a za pomoc pi laboratorní práci.

5 ABSTRAKT Cílem bakaláské práce bylo zpracování pehledu hormonální kontroly odpovdi rostlin k nízkým intenzitám svtla, biosyntézy a metabolismu cytokinin, jejich funkce a signalizace v rostlinách. Cytokininy jsou fytohormony, které ovlivují adu rstových a vývojových proces, jako je nap. bunné dlení, regenerace orgán, apikální dominance a zpomalení stárnutí. Za rzných svtelných podmínek mají cytokininy odlišný vliv na rst a vývoj rostlin. Praktická ást bakaláské práce je vnována vlivu interakce cytokinin a nízké intenzity svtla na fotomorfogenezi klíních rostlin Arabidopsis thaliana. Délky hypokotyl byly meny u jedenáctidenních klíních rostlin kontrolní linie a mutantních crf liní pstovaných na médiu s nebo bez pídavku cytokininu trans-zeatinu. U crf mutantních linií bylo pozorováno prodlužování hypokotyl v pítomnosti trans-zeatinu v podobném rozsahu jako u kontrolních rostlin, CRF se tedy pravdpodobn neúastní prodlužování hypokotyl. Klíová slova: Arabidopsis, cytokininy, hypokotyl, svtlo

6 ABSTRACT The aim of the bachleor thesis was to review hormonal regulation of plant response to decreased light intensities, cytokinin biosynthesis, metabolism, functions and signalling in plants. Cytokinins are phytohormons, which affect the number of growth and development processes, e.g. cell division, organ regeneration, apical dominance and leaf senescence. Under different light conditions the effect of cytokinins on plant growth and development is dissimilar. The practical part of the thesis was focused on the effect of cytokinins and decreased light intensity on photomorphogenesis of Arabidopsis thaliana seedlings. The length of hypocotyls was measured for 11 day old seedlings of control and crf loss-offunction mutants cultivated on media with or without cytokinin trans-zeatin. The hypocotyl elongation in the control and mutant seedlings was comparable on the media supplemented with trans-zeatin implicating that CRFs do not seem to participace in hypokotyl elongation. Key words: Arabidopsis, cytokinins, hypocotyl, light

7 OBSAH 1 POUŽITÉ ZKRATKY ÚVOD LITERÁRNÍ PEHLED Rstové regulátory Cytokininy Historie Rozdlení Funkce Biosyntéza Metabolismus Transport Cytokininová signalizace Faktory odpovdi na cytokininy Svtlo Dopad spolupsobení svtla a fytohormon na morfogenezi rostlin Arabidopsis thaliana METODIKA Rostlinný materiál Podmínky kultivace rostlin Kontrola homogenity svtla Mení délek hypokotyl Kvantitativní (Q) RT-PCR Sbr materiálu Izolace RNA Mení koncentrace RNA a výpoet istoty... 34

8 4.5.4 Reverzní transkripce Kvantitativní (Q) PCR VÝSLEDKY A DISKUSE Vliv homogenity intenzity svtla a exogenních cytokinin na dlouživý rst hypokotyl Arabidopsis thaliana Vliv mutací v genech CRF na dlouživý rst hypokotyl Arabidopsis thaliana Výbr vhodné koncentrace cytokininu Prodlužování hypokotyl klíních rostlin kultivovaných na tz pi nízké intenzit svtla Srovnání citlivosti CSD vi cytokininm pi standardní a snížené intenzit svtla ZÁVR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZK SEZNAM TABULEK PÍLOHY... 55

9 1 POUŽITÉ ZKRATKY ADP AGI AHK AHP AMP AP2/ERF ARR ARR5 Asp ATP BA cdna CK CKX CRF crf CRY CSD cz datp dctp dd DEPC dgtp DH DMAPP DMSO DNA dntp dsdna DTT adenosindifosfát The Arabidopsis genome initiative Arabidopsis histidin kinasa Arabidopsis histidin obsahující fosfotransferový protein adenosinmonofosfát tída transkripních faktor Arabidopsis regulátor odpovdi molekulární marker pro cytokininy aspartát adenosintrifosfát benzyladenin komplementární DNA cytokinin cytokinonoxidasa/dehyrogenasa faktory odpovdi na cytokininy genová rodina CRF kryptochrom cytokinin signální dráha cis-zeatin deoxyadenosintrifosfát deoxycytosintrifosfát redestilovaná voda 0,05% diethylpyrokarbonát deoxyguanintrifosfát délka hypokotylu v milimetrech dimetylalyldifosfát dimethylsulfoxid deoxyribonukleová kyselina sms deoxynukleotidtrifosfát dvouetzcová DNA dithiotreitol

10 dttp DZ ERF FAD FSB His HK HMBDP HPT ip ipmp iprdp iprtd IPT klux LT mt memt meot MEP MS MVA n ot P450 PCR PHR PHY Pr Pfr Q-PCR RH RR deoxythymintrifosfát dihydrozeatin etylen odpovdné faktory flavin adenin dinukleotid first strand buffer histidin histidin kinasa hydroxymethyldifostátbutenyl histidin fosfotransferový protein isopentenyladenin isopentenyladenosin-5'-monofosfát isopentenyribosid-5 -difosfát isopentenyribosid-5 -trifosfát isopentenyltransferasa kilolux labaratorní teplota meta-topolin meta-methoxytopolin ortho-methoxytopolin methylerythritolfosfátová cesta Murashige and Skoog médium mevalonová cesta haploidní sada chromozom ortho-topolin cytochrom monioxydasa polymerázová etzová reakce amino terminální fotolyasa fytochrom fytochrom absorbující záení o vlnové délce 660 nm fytochrom absorbující záení o vlnové délce 730 nm kvantitativní PCR délka hypokotylu v relativních hodnotách regulátor odpovdi

11 RT RTP SE SS II trna trna-ipt TSC tz UBQ10 reverzní transkripce primer pro reverzní traskriptasu standardní chyba reverzní transkriptasa Superscript II transferová ribonukleová kyselina isopentenyltransferasa-trna dvou-komponentní systém trans-zeatin referenní gen, exprimující se ve všech pletivech stejn

12 2 ÚVOD Rst je jedním z nejcharakteristitjších projev života organism, tedy i rostlin. Rozumí se jím nevratná kvantitativní zmna spojená s funkcemi živé hmoty, zvtšování objemu a hmotnosti nových bunk. Rst je tsn spjat s diferenciací, tj. se zmnami struktury, s utváením jednotlivých pletiv a orgán rostlinného tla. Diferenciací se obecn rozumí rozlišování pvodních dlivých (meristematických) pletiv ve specializovaná, nabývání rozdílné struktury a funkcí a vytváení uspoádanosti rostlinného tla (Macháková, 1998). Rst a diferenciace se prolínají v asové ose individuálního vývoje organismu, jde tedy o komplexní zmny probíhající v konkrétním organismu od jeho vzniku do jeho zániku (Macháková, 1998). Rostliny rostou za uritých podmínek. Faktory, které ovlivují rst jsou rozdleny na vnjší a vnitní. Mezi vnjší faktory se adí teplota, svtlo, zneištné prostedí, dostupnost vody a živin. K vnitním faktorm patí zejména pirozené rstové regulátory. Rstovými regulátory jsou obecn nazývány látky, které regulují rstové a vývojové procesy u rostlin. Tyto látky lze rozdlit do dvou skupin, na pirozené (nativní) a umlé (syntetické). Mezi rstové regulátory se adí rostlinné hormony (fytohormony) cytokininy, auxiny, gibereliny, ethylen a kyselina abscisová. Každý z fytohormon ovlivuje nkolik asto odlišných proces a naopak, týž proces bývá ovlivnn vtším potem rzných látek (Macháková, 1998). Cytokininy byly objeveny prof. Fredem Skoogem v 50. letech 20. století pi rozvoji technik rostlinných tkáových kultur na University of Wisconsin, USA. V rostlinách se vyskytují bu jako volné látky, nebo jsou souástí molekuly trna. Po chemické stránce jsou to substituované deriváty adeninu. Podle postranního etzce, který se pipojuje v poloze N 6, se dlí na isoprenoidní a aromatické. V rostlinách se astji vyskytují cytokininy isoprenoidní. Cytokininy hrají dležitou roli v procesech rstu a vývoje rostlin. Mezi jejich nejdležitjší funkce patí stimulace bunného dlení a vtvení, dále odnožování rostlin, iniciace rstu adventivních pupen (potlaení apikální dominance), oddálení stárnutí pletiv (potlaení senescence), klíení semen a mnoho dalších (Mok a Mok 1994; Khodakavskaya a kol., 2005; Li a kol., 1992). Také bylo zjištno, že cytokininy 12

13 psobí na fyziologické procesy a na vývoj v interakci s ostatními fytohormony, zejména auxinem (McGaw a kol., 1988; Moubayidin a kol., 2009; Pernisová a kol., 2009). Cílem mé bakaláské práce bylo seznámení se s problematikou hormonální kontroly odpovdi rostlin k nízkým intenzitám svtla metodou kvantitativní RT-PCR. Literární pehled je vnován hormonální kontrole odpovdi rostlin k nízkým intenzitám svtla, biosyntéze a metabolismu cytokinin, jejich funkci, signální dráze a konen vnímání svtla rostlinami. Praktická ást zahrnuje vyhodnocení vlivu cytokinin na fenotypové a molekulární odpovdi k nízkým intenzitám svtla u modelové rostliny Arabidopsis thaliana. 13

14 3 LITERÁRNÍ PEHLED 3.1 Rstové regulátory Nativní rstové regulátory si rostlina vytváí sama. Jsou oznaovány fytohormony. Syntetické rstové regulátory nejsou souástí metabolismu rostlin. V obou pípadech psobí na rst rostlin bu povzbudiv (stimulátory) nebo brzdiv (inhibitory) (Procházka a kol., 2006). Jedná se o organické sloueniny, které jsou po syntéze v jedné ásti rostliny transportovány do jiné její ásti a ve velmi malé koncentraci zpsobují fyziologickou reakci. O objev a poátení výzkum fytohormon se nejvíce zasloužila holandská fyziologická škola F. W. Wenta, ameriané F. Skoog a K. V. Thimann a další chemici a botanici. K objevu fytohormon pispla i eská botanická škola profesor Bohumila Nmce a Rudolfa Dostála (Procházka a Šebánek, 1997). Historicky se rozlišuje pt základních skupin endogenních rstových regulátor, které jsou považovány za fytohormony. Jsou to cytokininy, gibereliny, auxiny, kyseliny abscisová a ehtylen. Mezi rstové regulátory jsou dále azeny i brassinosteroidy a kyseliny jasmonová. Cytokininy, gibereliny a auxiny psobí pevážn stimulan, naproti tomu kyselina abscisová a ethylen psobí inhibin (Procházka a kol., 2006). Mimo skupiny existují v rostlinách další látky regulující rst, které nejsou azeny mezi fytohormony, nebo jsou úinné ve vyšších koncentracích. Patí sem zejména polyaminy, oligosacharidy a skupina fenolických látek (Macháková, 1998) Cytokininy Historie Objev cytokinin vycházel z poznatk rakouského rostlinného fyziologa G. Haberlandta, který roku 1913 prokázal, že z floému difundují látky indukující rst (meristemizaci) parenchymatického pletiva bramborových hlíz (Kamínek, 1997). Na poátku padesátých let dvacátého století byly testovány a hledány látky, které by mohly ovlivovat bunné dlení cytokinezi. Tyto látky byly proto pojmenovány cytokininy 14

15 (CK). Od jejich objevu bylo prokázáno, že mají vliv na mnoho jiných fyziologických a vývojových proces. V letech 1940 a 1950 pracovní skupina prof. Freda Skooga na University of Wisconsin, USA, vyvinula citlivý biotest založený na stimulaci bunného dlení v explantované stonkové deni tabáku. De tabáku byla kultivována na médiu obsahující minerální látky, sacharózu, nkteré vitamíny a auxin. Buky deového parenchymu se dlily pouze po pidání látek s cytokininovou aktivitou (Jablonski a Skoog, 1954). Testováním rzných biologických materiál byl vytipován bohatý zdroj cytokinin (Miller a kol., 1956). Autoklávovaná DNA spermií sled mla silný podprný úinek na bunné dlení (Taiz a Zeiger, 2002; Amasino, 2005; Miller a kol., 1955; Miyawaki, 2004). Rozborem této autoklávované DNA byla v laboratoi prof. Skooga identifikována slouenina 6-furfurylaminopurin, nazvaná kinetin (Taiz a Zeiger, 2002). I když nebylo prokázáno, že je kinetin pirozený cytokinin, byly jeho pomocí definovány biologické funkce a fyziologické úinky cytokinin. V pítomnosti auxinu cytokininy stimulují množení bunk. Kinetin je velmi úinná látka, ale pozdji se zjistilo, že se v rostlinách pirozen nevyskytuje, ale jedná se o odpadní látku tepelné degradace DNA (Miller a kol., 1956). V šedesátých letech byla objevena látka, která mla podobné úinky a strukturu jako kinetin. Tato látka byla izolována z endospermu nedozrálých obilek kukuice (Zea mays) a byla pojmenována zeatin - trans-6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino) purin. Je nejhojnji se vyskytujícím cytokininem ve vyšších rostlinách a stejn jako v pípad kinetinu jde o derivát adeninu (Letham, 1973). Díky dvojné vazb na postranním etzci se mže zeatin vyskytovat ve dvou konfiguracích, cis a trans. Ve vyšších rostlinách se vyskytují ob formy zeatinu Rozdlení V souasné dob je známo více než padesát pirozených cytokinin. Cytokininy jsou rozdlovány podle nkolika hledisek. Dle pvodu na nativní a syntetické, dle charakteru postranního etzce na isoprenoidní a aromatické. Nativní cytokininy jsou deriváty aminopurinu, které nesou postranní etzec v poloze N 6. Patí mezi n transzeatin, isopentenyladenin, dihydrozeatin a topoliny. K syntetickým se adí kinetin, benzyladenin a thidiazuron. Isoprenoidní cytokininy nesou v poloze N 6 ptiuhlíkatý 15

16 isoprenoidní substituent (postranní etzec). Do této skupiny se adí isopentenyladenin (ip), trans-zeatin (tz), cis-zeatin (cz) a dihyrozeatin (DZ) (obr. 1A). Cytokininy typu tz jsou zastoupeny nap.: v kukuici, rýži a cizrn. Aromatické cytokininy, nesoucí aromatický postranní etzec, jako jsou ortho-topolin (ot), meta-topolin (mt), jejich methoxy deriváty ortho-methoxytopolin (meot) a meta-methoxytopolin (memt) a benzyladenin (BA) jsou pouze v nkterých rostlinných druzích, nap. v topolu (obr. 1B) (Sakakibara, 2006). Cytokininy se v rostlinách vyskytují ve form volných molekul, které nejsou kovalentn vázány k jiným makromolekulám. Je to velké množství derivát ribotid, ribosid a volných bází nebo jsou souástí nkterých molekul transferové ribonukleové kyseliny (trna). Pokud je cytokinin souástí trna, nachází se vždy vedle 3 -konce antikodonu (Kamínek, 1997). Hormonáln aktivní formu cytokinin reprezentují pevážn volné báze, jejichž úinek je podstatn vyšší v porovnání s ostatními formami cytokinin (Letham a kol., 1983; Yamada a kol., 2001). K výraznému poklesu aktivity nebo její úplné ztrát mže dojít modifikací adeninového kruhu, nebo zmnou potu atom uhlíku v postranním etzci. Cytokininy, které se vyskytují v rostlinách nejhojnji zeatiny, obsahují ptiuhlíkatý isoprenoidní postranní etzec s dvojnou vazbou v poloze C-2 (Kamínek, 1992). A Isoprenoidní CK 16

17 B Aromatické CK Obr. 1 Struktura isoprenoidních a aromatických cytokinin (Sakakibara, 2006). V prbhu studia vztahu mezi strukturou a aktivitou cytokinin byly objeveny látky, které psobí jako antagonisté cytokinin. Tyto látky se nazývají anticytokininy a jsou cenným nástrojem pro studium mechanismu úink jak endogenních, tak i exogenních cytokinin. Úinné anticytokininy jsou rzné pyrolové a pyrazolové deriváty s modifikovaným postranním etzcem (Macháková, 1998; Spíchal, 2008). Obr. 2 Struktura PI-55 anticytokininu (Spíchal a kol., 2008). 17

18 Funkce Po objevení cytokinin bylo zjištno, že mají vliv na mnoho vývojových, biochemických, metabolických a fyziologických proces v interakci s ostatními fytohormony. Jedna z nejdležitjších funkcí je regulace a stimulace bunného dlení a prbh bunného cyklu. Mezi další funkce patí stimulace vtvení a odnožování rostlin, iniciace rstu adventivních pupen, oddálení stárnutí pletiv, regenerace a diferenciace, stimulace klíení. Ovlivují také pohyb živin, diferenciaci chloroplast, zesilují sílu sinku, podílí se na pekonávání stresu a stimulaci transpirace (Mok a Mok, 2001). Bunné dlení Stimulace bunného dlení je hlavním úinkem cytokinin. Vysoké koncentrace cytokini se nachází ve všech meristematických a intenzivn se dlících pletivech. Cytokininy ovlivují nkteré reakce v bunném cyklu, mají vliv na replikaci DNA ve fázi S mitózy tak, že zkracují replikony, urychlují pepis DNA a synchronizují bunné dlení v pletivech (Macháková, 1998; Khodakavskaya a kol., 2005). Regenerace orgán Cytokininy mají klíové postavení v regeneraních procesech in vitro i in vivo. Mohou psobit samostatn v nkterých fázích kultivace nebo v kombinaci s jinými fytohormony. Nejastji se cytokininy používají v kombinaci s auxinem pi regeneraních procesech in vitro. Pomr koncentrací tchto dvou fyohormon rozhoduje o tom, jakým smrem bude regenerace probíhat. Jejich vyrovnaný pomr povede vtšinou k tvorb nediferencovaného pletiva - kalusu, nadbytek cytokinin vyvolá regeneraci prýt a naopak nadbytek auxin regeneraci koen. Postupnými zmnami média mžeme tedy dosáhnout regenerace celé rostliny (Macháková, 1998). Apikální dominance Cytokininy potlaují apikální dominanci, psobí tedy jako antagonisté auxinu. Aplikace cytokinin stimuluje vtvení rostlin, rst i zakládání pupen. Zpomalení stárnutí Stárnutí rostliny zaíná ztrátou schopnosti buky dlit se. Listy rychle ztrácejí chlorofyl a žloutnou, nastává rozklad nukleových kyselin i protein, dochází 18

19 k degradaci ástí buky. Aplikace cytokinin tyto procesy stárnutí výrazn zpomalují (Taiz a Zeiger, 2002; Khodakavskaya a kol., 2005). Podpora pohybu živin Cytokininy ovlivují pohyb živin do list z jiných ástí rostliny. Tento pohyb lze pozorovat s využitím radioaktivn znaených živin, jako jsou cukry nebo aminokyseliny. Tímto zpsobem byl prokázán transport živin a jejich akumulace v pletivech ošetených cytokininy. Pedpokládá se, že cytokinin zpsobuje mobilizaci živin tím, že vytvoí nový vztah zdroj sink. Živiny se pohybují ve floému z místa produkce nebo skladování (zdroj) na místo využití (sink) (Taiz a Zeiger, 2002) Biosyntéza Prvním a klíovým krokem v biosyntéze cytokinin je penos isopentenylové skupiny z dimetylalyl difosfátu (DMAPP) na adenosin. Enzym, který katalyzuje tuto reakci, se nazývá adenosinfosfát isopentenyltransferasa (IPT), a byl poprvé zjištn v bunné hlence Dictyostelium discoideum (Sakakibara, 2006 ). Následn byl v pdní bakterii Agrobacterium tumefaciens nalezen gen ipt, který tento enzym kóduje (Barry a Rogers, 1984). Geny kódující IPT byly identifikovány také u vyšších rostlin, a to u Arabidopsis thaliana, petunie a chmele. U Arabidopsis bylo nalezeno devt IPT gen, z toho sedm (AtIPT1, AtIPT3 až AtIPT8) je zalenno do biosyntézy cytokinin de novo (Kakimoto, 2001; Sakakibara, 2006). Rostlinná IPT katalyzuje penos isopentenylové skupiny z DMAPP preferenn na adenosintrifosfát (ATP) nebo adenosindifosfát (ADP) za vzniku isopentenylribosid-5 -trifosfát (iprtp) a isopentenylribosid-5 difosfát (iprdp). Bakteriální IPT naopak využívá adenosinmonofosfát (AMP) za produkce isopentenylribosid-5 -monofosfát (iprmp). Biosyntéza cytokinin de novo mže probíhat mevalonovou cestou (MVA), to se týká preferenn cz, nebo methylerythritol fosfátovou cestou (MEP) preferenn v pípad ip a tz (obr. 3). Prvním krokem biosyntézy isoprenoidních cytokinin je N-prenylace adenosin 5 -fosfát, ADP nebo ATP katalyzovaná IPT. Ze vzniklých iprdp nebo iprtp mohou být odštpeny pomoci enzym fosfátové skupiny a ribosa za vzniku biologicky aktivních cytokinin volných bází, ip, tz a DZ (obr. 3) (Sakakibara, 2006). 19

20 Obr. 3 Schéma biosyntézy a metabolismu cytokinin (Sakakibara, 2006). Biosyntéza cytokinin probíhá dvma cestami, MEP a MVA. Prvním krokem je pipojení isopentenylové skupiny z DMAPP na ATP, nebo ADT (u rostlin), na AMP (u bakterií) pomocí enzymu IPT. Ze vzniklých ribosid fosfát vznikají volné báze cytokinin. Tyto volné báze jsou dále metabolizovány enzymy: cytokininoxidasou (CKX), zeatin cis-trans isomerasou (5), O-glukosyltransferasou (ZOGT), -glukosidasou (Glc) a CK N-glukosyltransferasou (CK-N-GT). U vyšších rostlin jsou dv možné cesty biosyntézy tz. Závislá a nezávislá na ip. U dráhy závislé na ip je syntéza tz katalyzována cytochromem monooxydasou P450 (P450). Další dva enzymy, CYP735A1 a CYP735A2, byly identifikovány u Arabidopsis. V dráze nezávislé na ip se pedpokládá, že tz je produkován pímo IPT za úasti neznámého hydroxylovaného prekurzoru, který je pravdpodobn odvozen od MVA cesty (Sakakibara, 2006). Jinou cestou biosyntézy isoprenoidních cytokinin je trna prenylace katalyzována adenosinfosfát - isopentenyltransferasou-trna (trna-ipt) (Nobusada 20

21 a Sakakibara, 2009). Cytokinin vzniká na úrovni polynukleotidu penesením isopentenylového etzce odvozeného od mevalonátu na adenylový zbytek v trna. Isopentenyladenosin je vtšinou dále modifikován hydroxylací terminální metylové skupiny za vzniku cis-zeatinu. Takto modifikovaná trna je potenciálním zdrojem cytokininu, který se mže uvolnit pi její metabolické degradaci (obr. 3) (Skoog a Armstrong, 1970). Jde o nepímou cestu biosyntézy cytokinin Metabolismus Metabolismus cytokinin zahrnuje procesy N-glukosylaci purinu a konjugaci alaninu v poloze N 9, O-glykosylaci a acetylaci postranního etzce, redukci dvojné vazby postranního etzce a jeho odštpení. Bhem metabolismu dochází k pemnám cytokinin na formy s odlišnými vlastnostmi. Vzájemné pemny katalyzují rzné enzymy. Podobn jako u auxin a giberelin mohou vznikat konjugáty, pedevším glykosidy, které jsou dále využívány pro transport nebo ukládány do rezervních orgán. Glukosylace v polohách N 7 a N 9 pedstavuje nevratnou cestu fyziologické inaktivace cytokinin, protože narozdíl od O- a N3-glykosid nejsou N7- a N9-glukosidy štpeny enzymem -glukosidasou (Brzobohatý a kol., 1993). O-glykosidy se vyznaují vysokou biologickou aktivitou, naproti tomu N7- a N9-glukosidy jsou biologicky neaktivní. Hlavní a v nkterých rostlinách výlunou cestou inaktivace cytokinin je jejich degradace cytokinonoxidasou/dehyrogenasou (CKX) (obr. 3) (Cedzich a kol., 2008). Tento enzym, obsažený v mnoha rostlinných pletivech, katalyzuje odštpení nenasyceného postranního etzce. Cytokininy s nasyceným postranním etzcem nebo aromatickým postranním etzcem v poloze N 6 a O-glykosidy všech cytokinin jsou odolné vi oxidaci (McGaw a Horgan, 1985). Aktivita CKX je závislá na koncentraci cytokinin v buce. K jejímu zvýšení dochází po aplikaci exogenních cytokinin (Kamínek a Armstrong 1990). V genomu Arabidopsis bylo identifikováno sedm gen, patících do malé genové rodiny, kódujících CKX (AtCKX1 AtCKX7) (Schmüllingen a kol., 2003; Werner a kol., 2006; Taiz a Zeiger, 2002). 21

22 Transport Vzhledem k tomu, že se cytokininy vyskytují jako složka nkterých molekul trna, mohou být syntetizovány v každé buce, by jen v omezeném množství. Nejvyšší obsah cytokinin i jejich tvorba de novo byly zjištny pevážn v koenech, zejména v jejich vrcholové ásti (Torrey, 1976). Apikální meristém koene je hlavním místem biosyntézy cytokinin (Sakakibara, 2006). Odtud jsou tranportovány symplasticky xylémem do nadzemních ástí, pedevším do lodyh a list. Dnes je již známo, že cytokininy jsou syntetizovány a psobí v rzných místech rostlinného tla (Sakakibara, 2006). Pro píjem cytokinin rostlinnými bukami je rozhodující jejich molekulární forma. Velmi dobe jsou pijímány lipofilní cytokininové báze, zatímco pro polární glykosidy a zejména ribotidy nejsou rostlinné membrány permeabilní. Ribotidy a O-glykosidy však mohou být metabolicky pemnny, a tak pedstavují metabolickou zásobu cytokinin v buce (Kamínek, 1997). 3.2 Cytokininová signalizace Penos cytokininového signálu u rostlin se uskuteuje prostednictvím vícestupového dvou-komponentního systému [cytokinin signální dráha (CSD)]. Tento model byl vytvoen na základ podobnosti s dvou-komponentním systémem (TCS) u bakterií, u nichž zprostedkovává adu odpovdí na podnty z prostedí. Mezi tyto odpovdi se adí osmoregulace nebo chemotaxe. Práv u bakterií byl tento systém stanoven jako pevládající signalizaní mechanismus. U bakterií je TCS tvoen ze dvou funkních prvk: senzorové histidin kinasy (HK), obvykle jde o trans-membránový protein, a regulátoru odpovdi (RR) (obr. 4A). HK pijímá podnt a autofosforyluje histidinový (His) zbytek HK domény. Signál je dál pedáván penosem fosfátu na aspartátový zbytek (Asp) pijímaové domény RR, piemž je zahájena odpov (To a Kieber, 2008; Horák a Lexa, 2003; Taiz a Zeiger, 2002). 22

23 Obr. 4 Dvou-komponentní systém u bakterií a Arabidopsis (Taiz a Zeiger, 2002). U bakterií je tvoen dvma jednotkami, senzor histidin kinasou a regulátorem odpovdi (A). U Arabidopsis obsahuje navíc His fosfo-transferový protein (B). U eukaryot, tedy i modelové rostliny Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), se penos fosfátu z HK na RR dje prostednictvím vícestupové HisAspHisAsp fosforylace, které se úastní další len: His fosfo-transferový protein (HPT) (obr. 4B). Funkní prvky CSD u Arabidopsis jsou kódovány multigenovými rodinami. Pi studiu genomu Arabisopsis bylo celkem objeveno 17 protein podobných histidin kinasam, patí mezi n mimo jiné ethylenové a cytokininové receptory (Horák a Lexa, 2003; Urao a kol., 2000). Histidin kinasy Arabidopsis (AHK), konkrétn AHK4/CRE1, AHK2, AHK3, jsou hybridní kinasy podobné HK TCS bakterií. Jde o cytokininové receptory. Tyto ti trans-membránové hybridní kinasy jsou tvoeny cytokinin-vazebnou doménou oznaovanou CHASE doména (cyklasa / His kinasa-asociující extracelulární podnty) a cytoplazmatickou His transmiterovou a pijímaovou doménou. Další genová rodina kóduje His fosfotransferové proteiny Arabidopsis (AHP). AHP1-AHP5 mohou být lokalizovány v cytoplazm i jádru (Hwang a Sheen, 2001). Nesou konzervovaný His zbytek, který se úastní penosu fosfátu z AHK na ARR, a tím zprostedkovávají cytokininovou signalizaci. AHP6 se vyznauje substitucí na His zbytku a nazývá se pseudo HPT, psobí jako negativní regulátor cytikoninové signalizace. Jiná genová rodina kóduje regulátory odpovdi Arabidopsis (ARR), které jsou lokalizovány v jáde. Dv hlavní skupiny ARR jsou oznaovány jako typ-a ARR a typ-b ARR. Typ-A ARR, negativní regulátory primární odpovdi na cytokininy, mají krátkou C-terminální doménu. Typ-B ARR, pozitivní regulátory odpovdi na 23

24 cytokininy, se vyznaují tím, že jejich C-konec nese DNA-vazebnou a transaktivaní doménu, která ídí transkripci cytokinin aktivovaných gen. Mezi n spadají i ARR typu-a. Nedávno byli identifikováni noví lenové cytokininové signalizace, kteí byli pojmenováni faktory odpovdi na cytokininy (CRF) (Rashotte, 2006). Role dvoukomponentního systému v cytokininové signalizaci u Arabidopsis byla objasnna studiemi in vitro v heterologních kvasinkových a bakteriálních systémech a dále v protoplastech Arabidopsis (Kakimoto, 2003; To a Kieber, 2008; Horák a Lexa, 2003; Taiz a Zeiger, 2002; Chang a Stewart, 1998). Obr 5 Model cytokininové signalizace. (To a Kieber, 2008) Cytokinin se naváže na transmembránové receptory AHK2, AHK3 nebo CRE1/AHK4, ímž se aktivuje vícestupová fosforylace. Po vazb cytokininu na cytokinin vazebnou doménu dochází k autofosforylaci His zbytku His kinasové domény. Dále dochází k penosu fosfátu prostednictvím Asp zbytku na pijímaovou His doménu AHP, které se nachází v cytoplazm. Fosfát mže být penesen z cytoplazmy do jádra na Asp pijímaovou doménu ARR typu-a respektive typu-b prostednictvím AHP. ARR typu-a zptnovazebn negativn regulují cytokininovou signální dráhu (CSD). Fosforylace ARR typu-b indukuje transkripci specifických gen (cytokinin ízené geny), kam spadají i ARR typu-a a CRF (To a Kieber, 2008). 24

25 3.3 Faktory odpovdi na cytokininy Faktory odpovdi na úinek cytokinin jsou považovány za nové leny cytokininové signální dráhy. U Arabidopsis jsou kódovány šestilennou genovou rodinou (CRF1 CRF6). adí se do tídy transkripních faktor APETALA2 / faktor odpovdi na etylen (AP2/ERF), jejichž genová exprese se zvyšuje v odpovdi na úinek cytokinin, piemž dochází k jejich akumulaci v jáde. Pemístní z cytoplazmy do jádra je závislé na fosforylaci zprostedkované AHK, AHP, nikoliv však na ARR. Ovšem spolu s ARR typu-b souasn regulují transkripci gen, jejichž exprese je ízena cytokininy. Patí sem geny, které ídí vývoj prýt a kotyledon, deetiolizaci, rozvoj list, diferenciaci cév v koenech, senescenci a cytokininovou homeostázu. Fyziologickými studiemi na mutantních liniích bylo prokázáno, že CRF ídí vývoj embryí, kotyledon a list. U jednoduchých mutant byl pozorován jen nepatrný defekt (redukce rstu a dlení bunk) ve vývoji kotyledon (dložních list) i pravých list. U vícenásobných mutant byl defekt nkolikanásobn rozsáhlejší (Rashotte, 2006; To a Kieber, 2008). 3.4 Svtlo Kvalita, množství a smr dopadajícího svtla pedstavují jeden z nejdležitjších faktor životního prostedí ovlivujících rst a vývoj rostlin, u kterých vyvolává nkolik typ odezvy. Na jednostranné ozáení reagují rostliny usmrnným rstem ke zdroji záení tento jev nazýváme fototropismus. Další jev, pi kterém rostliny rozeznávají délku dne a noci, fotoperiodismus, má rozhodující význam pi regulaci ady vývojových proces u rostlin. Ostatní odezvy rostlin na dopadající záení zahrnujeme pod názvem fotomorfogeneze (Macháková a Krekule, 1998). Fotomorfogeneze je biologický proces, jehož výsledkem jsou rstové a morfologické zmny zpsobené svtlem (Procházka a kol., 2006). Aby mohly rostliny na svtelné záení reagovat, musí být schopny signál pijmout, zpracovat a penést na bunnou úrove. Pro píjem signál záení je rostlina vybavena specifickými receptory. Rostliny reagují na záení jen uritých vlnových délek. Nejaktivnjší oblasti spektra záení, které nejvíce ovlivují rst a vývoj rostlin, je oblast erveného záení, zejména vlnové délky 660 nm (ervená red) a 730 nm (vzdálená ervená far-red), a záení modré spektrální oblasti nm (modrá 25

26 blue). Rstov aktivní je asto i oblast tzv. UV-B-záení v rozmezí vlnových délek nm. Nejlépe prostudovaný je fotoreceptor pro ervené záení fytochrom (Macháková a Krekule, 1998; Chory a kol., 1995) Nativní fytochrom je chromoprotein, který se vyskytuje jako dimer složený ze dvou stejných podjednotek. Každá podjednotka má dv složky: pigment absorbující svtlo zvaný chromofor a polypeptidový etzec zvaný apoprotein. Ve vyšších rostlinách je chromofor lineární tetrapyrol zvaný fytochromobilin, který je kovalentn vázán na protein. Apoprotein a chromofor dohromady tvoí holoprotein (Taiz a Zeiger, 2002). Fytochrom se v rostlinách vyskytuje ve dvou konformaních formách, které vratn pecházejí z jedné formy na druhou (obr. 6). Tuto pemnu zjistil v roce 1952 Borthwick se svými spolupracovníky pi klíení nažek salátu. První neaktivní forma, která je syntetizována v rostlinách, absorbuje ervené svtlo s maximální vlnovou délkou 660 nm a oznauje se Pr nebo také jako forma cis. Druhá forma oznaovaná jako Pfr neboli trans forma je biologicky aktivní, ale i labilnjší a absorbuje dlouhovlnné ervené svtlo s optimální vlnovou délkou 730 nm. Ve vratných reakcích je ervené svtlo absorbováno fytochromem Pr a zpsobuje jeho pemnu na Pfr, který absorbuje dlouhovlnné ervené záení a jeho psobením se mní na Pr (Šetlík a kol.). Obr. 6 Schéma fotoreverzibilního pechodu mezi formami Pr a Pfr fytochromu ( Další výzkum fytochromu ukázal, že existují dv rzné tídy fytochromu s rznými vlastnostmi. Tyto tídy byly oznaeny fytochrom I a fytochrom II. Typ I je astjší v etiolovaných rostlinách a po ozáení se rychle rozkládá. Fytochrom II je hojnjší v zelených rostlinách a na svtle je pomrn stabilní. 26

27 Pomocí metod molekulární biologie byly rozšíeny poznatky o typech fytochrom a jejich genetický podklad. Geny pro fytochrom kódují malou rodinu fotoreceptor nazývanou PHY. Existují ti hlavní fytochromy phya, phyb a phyc, které jsou kódovány geny PHYA, PHYB a PHYC. U Arabidopsis bylo sekvenováno a charakterizováno pt fytochrom kódujících gen (PHYA PHYE) (Franklin a Whitelam, 2005). V mnoha pípadech interaguje ervené záení s modrým. Záení modré spektrální oblasti ovlivuje zejména fototropismus, regulaci dlouživého rstu stonku a otevírání prduch list. U rostlin pstovaných ve tm i v erveném svtle vyvolá krátkodobé ozáení modrou spektrální oblastí tém okamžitou redukci rychlosti dloužení stonku (Macháková a Krekule, 1998). Fotoreceptory, které zprostedkovávají tyto svtelné regulace ve vývoji a rstu rostlin, oznaujeme kryptochromy. Kryptochromy jsou strukturáln podobné fotolyasám, což jsou flavoproteiny, a to navzdory tomu, že kryptochrom nemá žádnou fotolyasovou aktivitu. Vtšina kryptochrom je složena ze dvou domén: amino terminální fotolyasy (PHR) a oblast karboxy terminální domény. Na oblast PHR se váží dva chromofory, které absorbují svtlo. Jeden chromofor je flavin adenin dinukleotid (FAD) a druhý je pterin (Lin a Todo, 2005). První kryptochromy byly identifikovány u Arabidopsis. Fotoreceptorová rodina kryptochrom u Arabidopsis se skládá ze dvou len, CRY1 a CRY2 (Kleiner a kol., 1999). Jsou to pevážn jaderné proteiny, které regulují genovou expresi (Lin a Todo, 2005) Dopad spolupsobení svtla a fytohormon na morfogenezi rostlin Skotomorfogenezí i etiolací je oznaován rst rostlin ve tm, dochází k prodlužování hypokotylu, apikální meristém je chránný tzv. apikálním hákem a dložní listy (kotyledony) nejsou rozvinuté, nejsou pítomny chloroplasty a neprobíhá fotosyntéza. Po svtelném impulsu nastává de-etiolace, je zahájena fotomorfogeneze. Dochází k potlaení prodlužování hypokotylu, otvírání apikálního háku, rozvoji kotyledon, tvorb chloroplast a zahájení fotosyntézy (Vandenbussche a kol., 2005). Na klíních rostlinách Arabidopsis pstovaných ve tm byly pozorovány podobné odpovdi na cytokininy, jaké jsou vyvolávány v reakci na svtlo, tedy zahájení 27

28 de-etiolace (Chory a kol., 1994; Lochmanová a kol., 2008). Dosud není zcela známo, na jaké úrovni spolu svtlo a cytokininy interagují. Dlouhou dobu byla vnována pozornost pedevším vlivu kvality svtla na fotomorfogenezi rostlin. Nicmén i kvantita svtla zde má své významné postavení. Chory a kol. (1994) a Su a Howell (1995) pozorovali, že cytokininy potlaují prodlužování hypokotyl klíních rostlin Arabidopsis rostoucích ve tm, tento vliv je zprostedkován cytokinin indukovanou produkcí ethylenu (Cary a kol.,1995). Cytokininy stimulují jeho produkci u klíních rostlin Arabidopsis dokonce již svou submikromolární koncentrací. Ne zcela jasný je vliv cytokinin na prodlužování hypokotyl na svtle. Smets a kol. (2005) pozorovali cytokininy zpsobené prodlužování hypokotyl na svtle, pokud je zabránno psobení ethylenu, nebo je blokovaný transport auxin. Ethylen na svtle zpsobuje významné prodlužování hypokotyl (Smalle a kol., 1997), stejn psobí i auxiny (Romano a kol., 1995). Cytokininy interagují s ehtylenovou signální dráhou a podmínn zvyšují biosyntézu ethylenu a auxin (Smets a kol., 2005). Jak již bylo zmínno v kapitole 3.4, jeden z nejdležitjších environmentálních faktor pro rostliny je svtlo, jeho dostatená dostupnost. V pírod pedstavuje zastínní jednak zmnu v kvalit svtla, kdy se mní pomr red / far-red ve prospch far-red. A dále pokles svtelné intenzity zahrnující ervené i modré svtlo, jenž má pímý vliv na fotosyntézu a fotomorfogenezi. Rostliny se snaží uniknout zastínní adaptací svého fenotypu takovým zpsobem, aby získaly co nejvíce svtla. Na tchto morfogenetických zmnách se podílí ada fytohormon. Auxiny, ethylen a gibereliny, se podílí zejména na re-orientaci list (Vandenbussche a kol., 2003). Regulace prodlužování hypokotylu se úastní auxiny, cytokininy, ethylen, gibereliny a brassinosteroidy. Hypokotyl (embryonální stonek) je velmi plastický orgán, siln ovlivován nejen fytohormony, ale i vnjšími faktory jako jsou svtlo, teplota a gravitace (Vandenbussche a kol., 2005; Vandenbussche a kol., 2007). Vandenbussche a kol. (2007) popsali ethylenem nebo jeho prekursorem 1-aminocyklopropan-1-karboxylovou kyselinou (ACC) regulované prodlužování hypokotyl pi snížené svtelné intenzit, závislé pedevším na modrém svtle a bazální hladin giberelin, ale pesto nezprostedkované gibereliny. Gibereliny jsou hlavn rstové stimulátory. 28

29 3.5 Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (huseníek rolní) je drobná dvoudložná kvetoucí bylina z eledi Brasicaceae. Je to jednoletý efemerní druh, tvoící pízemní listovou ržici a obvykle jednu vtvící se lodyhu vysokou 5 30 cm, která nese hroznovité kvtenství s drobnými bílými kvty. Plodem je šešule obsahující mnoho drobných hndých semen. Arabidopsis nemá zásadní agronomický význam, ale používá se jako modelový organismus pro základní výzkum v oblasti genetiky a molekulární biologie pro identifikaci gen a urení jejích funkcí (Nature 408, 2000). Jako modelová rostlina se používá pro své vyhovující vlastnosti. První významnou vlastností je krátká vegetaní doba (6 týdn), bhem které vytvoí velké množství semen. Pro molekulární genetiku je dležitý malý genom s pti chromozomy (n = 5) (Bedná a kol., 2008). Arabidopsis má nejlépe prostudovaný a nejmenší genom ze všech rostlin, který byl osekvenován koncem roku Na výzkumu genomu Arabidopsis se intenzivn pracovalo souasn v mnoha zemích, od roku Tento projekt zahrnoval jak sekvenování genomu, tak studium funkce všech gen a jejich hlavních interakcí. Roku 1996 bylo založeno konsorcium AGI (angl. The Arabidopsis genome initiative), sdružující laboratoe z Evropy, Japonska a USA (Ondej a kol., 1999). Díky tomuto projektu byl uren poet gen. Celkový obsah gen v genomu Arabidopsis pesahuje , které kódují rzné druhy protein ( 29

30 4 METODIKA 4.1 Rostlinný materiál Pro vlastní experimentální práci byla použita semena Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ekotypu Col-0 (divoký kmen) a semena mutantních linií crf (crf1, crf2, crf5; crf2,5; crf3,5; crf1,2,5; crf2,3,6) (T-DNA inzerce v genech kódujících jednotlivé CRF na pozadí Col-0 zpsobující ztrátu funkce genu loss-of-function mutation). Semena jednoduchých, dvojných a trojných crf mutant nám poskytl Aeron M. Rashotte (Rashotte a kol., 2006). Celkem bylo použito sedm crf mutantních linií. 4.2 Podmínky kultivace rostlin Semena Arabidopsis byla nejprve povrchov vysterilizována v 75% etanolu po dobu 5 7 minut a následn vyseta v biohazard-boxu (Aura vertical S.D.4, Bioair instrument) na tvercové Petriho misky (12,5 cm x 12,5 cm) na živné 1x Murashige a Skoogovo médium (Duchefa) s 1,2% agarem (Duchefa) (ph média bylo upraveno na hodnotu 5,7 5,8 za pídavku 1M roztoku KOH ped autoklávováním) (tab. 1). Po sterilizaci byla média vychlazena na teplotu cca 55 C a ped nalitím na misky obohacena o dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma) (rozpouštdlo cytokininu), respektive o tz (Olchemim) v požadovaných koncentracích (tab. 1). Na každou misku bylo vyseto pibližn patnáct semen Arabidopsis v jedné ad, pro zajištní stejné vzdálenosti klíních rostlin od svtelného zdroje. Po vysetí byly misky oblepeny polopropustnou náplastí Medipor, ímž se dosáhlo zachování sterility uvnit misky a také zabránní nekontrolovanému hromadní metabolit, pedevším ethylenu. Pipravené misky byly nechány ti dny v lednici, aby došlo k nabobtnání, indukci a synchronizaci klíení semen, k tzv. vernalizaci. Po tech dnech byly misky vertikáln umístny do kultivaního boxu Percival CU36L5 (Percival Scientific). Klíní rostliny byly kultivovány po dobu jedenácti dn pi dvou svtelných podmínkách: nízké intenzit svtla 20 mol.m -2.s -1, standardní 100 mol.m -2.s -1 a režimu dlouhého dne (16 hod / 21 C svtlo; 8 hod /19 C tma). 30

31 Tab. 1 Složení kultivaního média. Navážky jednotlivých složek média jsou uvedeny v gramech, popípad mikrolitrech na 1l destilované vody. MS (Murashige and Skoog medium) (Duchefa) 4,4 g MES (Morpholinoethane sulfonic acid) (Serva) 0,6 g 1 M KOH 1250 l 1,2% Plant agar (Duchefa) 12 g DMSO (Dimetylsulfoxid) (Sigma) 20 l 50 mm tz (trans-zeatin) (Olchemin) 20 l 4.3 Kontrola homogenity svtla Cílem tohoto experimentu bylo ovení homogenity svtla dopadajícího na klíní rostliny kultivované na vertikáln umístných miskách v kultivaním boxu. Kultivaní box byl osazen fluorescenními lampami firmy Philips (TL-D 18W/33-640, studené bílé svtlo). Semena divokého kmene (Col-0) byla paraleln vyseta na MS medium obohacené o DMSO ( % v/v) respektive 1M tz. Intenzita svtla byla mena Luxmetrem (PU 550, Metra Blansko a.s.) pro ticet bod na polici, na kterou byly misky umístny. Každá namená hodnota odpovídá konkrétní misce umístné na polici (obr. 7). idlo pístroje bylo bhem mení umístno ve výšce rostoucích klíních rostlin. Hodnoty získané z mení v kiloluxech (klux) byly pevedeny na mol.m -2.s -1 vynásobením hodnoty v luxech koeficientem 0,0135, dle doporuení spolenosti Apogee instruments inc. ( (píloha 4). Jedenáctidenní klíní rostliny byly zdokumentovány fotoaparátem Olympus SP-350 a délky hypokotyl vyhodnoceny v softwarovém programu Analysis (Olympus). Posouzení úrovn homogenity svtla dopadajícího na klíní rostliny vycházelo ze srovnání délek hypokotyl na jednotlivých miskách. 31

32 Obr. 7 Schéma umístní misek v kultivaním boxu. ísla ve schématu oznaují polohy jednotlivých misek na polici. Na levé polovin byly misky s DMSO, na pravé s tz. 4.4 Mení délek hypokotyl Pro hodnocení délek hypokotyl klíních rostlin Arabidopsis byly provedeny dv sady experiment. Každou sadu reprezentovala ti biologická opakování, pro každé z nich byla vypotena prmrná hodnota. Koneným výsledkem je prmr ze všech tí opakování. Klíní rostliny byly kultivovány pi nízké svtelné intenzit na MS médiu s pídavkem DMSO respektive tz. V první sad byla použita koncentraní ada tz (10nM, 100nM, 1M, 5M a 10M). Namené délky hypokotyl zdokumentovaných klíních rostlin vysetých semen pti mutantních linií Arabidopsis (crf5; crf2,5; crf3,5; crf1,2,5; crf2,3,6) byly srovnány s kontrolní liníí Col-0. V druhé sad byly klíní rostliny kultivovány pouze na DMSO a 1M tz. Celkem zde bylo použito sedm mutant, pedchozích pt mutant a navíc mutanti crf1, crf2. Statisticky významné rozdíly byly stanoveny t-testem (P = 0.05). 32

33 4.5 Kvantitativní (Q) RT-PCR Sbr materiálu Po jedenácti dnech kultivace byly klíní rostliny, jejichž semena byla vyseta na MS medium s DMSO, peneseny z pevného média do tekutého MS média s obsahem DMSO respektive 1M tz. Kultivace probíhala paraleln pi nízké i standardní svtelné intenzit. V tekutém médiu byly klíní rostliny inkubovány dv hodiny na tepace (Infors AG CH-4103 Botmingen) pi nastavených otákách 160 RPM/min. Po inkubaci byl rostlinný materiál o navážce 100 mg zamražen v tekutém dusíku Izolace RNA Po zamražení byl každý vzorek homogenizován v tekutém dusíku a následn lyzován pidáním 1 ml TRIzol reagent (Invitrogen) na 100 mg pletiva. Lyzace vzork probíhala 5 minut pi laboratorní teplot (LT). Poté bylo pidáno 0,2 ml chloroformu. Vzorky byly dkladn protepány a inkubovány 2 3 minuty pi LT a následn centrifugovány ( x g, 15 minut, 4 C) v pedem vychlazené centrifuze (Avanti J-30I, Beckman Coulter). Centrifugací došlo k oddlení supernatantu vodné fáze RNA od sedimentu s DNA, proteiny, zbytky pletiv a organických rozpouštdel. Vodná fáze byla penesena do nové zkumavky a bylo k ní pidáno 0,5 ml isopropylalkoholu. Sms byla protepána a inkubována 10 minut pi LT a následn centrifugována ( x g, 15 minut, 4 C). Vysrážený RNA pelet byl rozpuštn v 1 ml 75% etanolu a opt centrifugován ( x g, 5 minut, 4 C), vysušen a rozpuštn ve vod ošetené 0,05% diethylpyrokarbonátem (DEPC). Následn byla ke každému vzorku pidána TurboDNasa (Ambion), která rozložila pípadnou zbytkovou DNA ve vzorku. DNasa štpila 30 minut pi 37 C a následn byla inaktivována 10 minut pi 65 C. Inkubace probíhala v termoblocích (Dri-block DB 3, Dri-block DB 2D, Techne). 33

34 4.5.3 Mení koncentrace RNA a výpoet istoty Pro mení koncentrace byla použita 80x zedná RNA v redestilované (dd) vod. Koncentrace byla vypotena dle vzorce: c(g/l) = (A ) / 1000 A260 hodnota absorbance pi vlnové délce 260 nm 40 pepotový koeficient 80 koeficient ední Mení absorbance probíhalo na spektrometru (Specord S300 UV VIS) pi dvou vlnových délkách, 260 nm a 280 nm. Podílem hodnot namených pi tchto dvou vlnových délkách byla stanovena istota RNA. Pokud se hodnota pohybovala v rozmezí 1,8 2,1, RNA byla považována za istou (tab. 9) Reverzní transkripce Reverzní transkripce (RT) je proces, pi kterém dochází k pepisu RNA do komplementární DNA (cdna) metodou polymerázové etzové reakce (PCR). Do reakce byla použita RNA, ke které byly postupn pidány 2 reakní smsi pedpipravené bezprostedn ped pipetováním. Jako první byla pidána sms redestilované vody a oligo(dt) RTP (primery pro reverzní transkripci) primer. Druhá sms obsahovala first strand buffer (FSB), sms deoxyribonukleosidtrifosfát (dntp) (sms datp, dctp, dgtp a dttp), dithiotreitol (DTT) a reverzní transkriptasu Superscript II (SSII) (Invitrogen) (tab. 2C). Reverzní transkripce probíhala v termocykleru (MJ Research PTC-200 Peltier thermal cycler) s navoleným ty krokovým programem (tab. 2B). V prvním kroku byla sms RNA, RTP a vody zaháta na 70 C po dobo 10 minut. V druhém kroku, který trval 30 sekund, byla reakní sms zchlazena na 4 C a v tomto okamžiku byly pidány zbývající složky reakce (druhá sms). Reverzní transkripce probíhala 52 minut pi teplot 42 C. V posledním kroku probíhala inaktivace transkriptasy 15 minut pi 70 C. 34

35 Tab. 2 Reakní podmínky a složení reakce RT. Sekvence použitého primeru oligo(dt) RTP (A). Program RT (B). Objemy složek reakce uvedené v mikrolitrech na jednu reakci. Celkový objem reakní smsi ve zkumavce byl 20 l (C). A B Sekvence primeru oligo (dt) 5 - CGT TCG ACG GTA CCT ACG TTT TTT TTT TTT TTT TT-3 Krok reverzní transkripce Teplota as Denaturace 70 C 10 min Pidání druhé reakní smsi 4 C 30 s Nasedání primer + prodlužování DNA etzce 42 C 52 min Inaktivace transkripce 70 C 15 min C dd voda 10M RTP 10mM dntp 0,1 M DTT 5x FSB SS II RNA Kvantitativní (Q) PCR Kvantitativní PCR (Q-PCR) je založena na klasické PCR. Umožuje detekci a kvantifikaci DNA bhem každého cyklu reakce. Hlavní podmínkou je pítomnost fluorescenního barviva, které se váže na dvou etzcovou DNA (dsdna). Množství PCR produktu je úmrné fluorescenní aktivit barviva. Pro vlastní reakci byla k cdna pidána sms reakních látek obsahující Blue Buffer (Top-Bio), dntp, Taq polymerasu 1.1 (Top-Bio), SybrGreen I (fluorescenní barvika) (Molecular Probes), levý a pravý primer syntetizovaných gen a dd voda (tab. 3C). PCR probíhala na cykleru RotorGene6000 (Corbett Research). Pro každý biologický vzorek byla provedena dv technická opakování. Relativní hladina transkriptu ARR5, molekulární marker pro cytokininy, (Huang a kol., 2009; D Agostino a kol., 2000) je vyjádena podílem expresí cílového genu ARR5 a referenního genu UBQ10. 35

36 Tab.3 Reakní podmínky a složení PCR reakce. Sekvence použitých primer (A). Program PCR (B). Objemy složek v mikrolitrech na jednu reakní sms. Celkový objem smsi ve zkumavce byl 25 l (C). A Gen Název primeru Sekvence primeru UBQ10 ARR5 fubq10 5 -AAC GGG AAA GAC GAT TAC -3 rubq ACA AGA TGA AGG GTC GAC -3 farr5 5 -GCT GAT AGA ACC AAG ACT GA -3 rarr5 5 -CTT CCA AAA TAA CAC ACC AC-3 B UBQ10 ARR5 Krok PCR Teplota as Teplota as Poátení denaturace 94 C 1 min 94 C 1 min Denaturace 94 C 15 s 94 C 35 s Nasedání primer 60 C 20 s 56 C 35 s Prodlužování DNA etzce 72 C 20 s Denaturace nespecifických produkt 82 C 15 s 72 C 35 s Závrené prodlužování DNA etzce 72 C 1 min 72 C 2 min Poet cykl 33 C dd voda 10x buffer 10mM dntp 10x SG Taq Pol Primery cdna 13 2,5 1 0,8 0,

37 5 VÝSLEDKY A DISKUSE 5.1 Vliv homogenity intenzity svtla a exogenních cytokinin na dlouživý rst hypokotyl Arabidopsis thaliana Prvním experimentálním úkolem v mé bakaláské práci bylo ovení homogenity svtla dopadajícího na klíní rostliny Arabidopsis rostoucí na Petriho miskách umístných vertikáln v kultivaním boxu. V kultivaním boxu byla nastavena požadovaná intenzita svtla: 20 mol.m -2.s -1. Z ticeti namených hodnot svtelné intenzity na jednu polici (tab. 4B), které se pohybovaly v rozmezí mol.m -2.s -1, byla vypotena prmrná hodnota 18 mol.m -2.s -1. Pro levou polovinu police s miskami s DMSO byla vypotena prmrná hodnota 19 mol.m -2.s -1 a pro pravou polovinu s miskami s tz 17 mol.m -2.s -1. Klíní rostliny Arabidopsis Col-0 byly za této svtelné podmínky a režimu dlouhého dne kultivovány jedenáct dn a poté zdokumentovány. Prmrné hodnoty namených délek hypokotyl pro každou misku jsou uvedeny v tabulce. 4C a píloze 2, 3. I pes uvedené rozdíly v intenzitách svtla dopadajících na jednotlivé misky nebyly mezi hypokotyly klíních rostlin pstovaných na rzných miskách se stejným složením média zjištny statisticky významné rozdíly v jejich délce. Naopak byly pozorovány oekávané statisticky významné rozdíly v prodlužování hypokotyl mezi klíními rostlinami kultivovanými na miskách s pídavkem DMSO a tz. Tento výsledek nám ukázal, že prodlužování hypokotyl podmínné zvýšenou hladinou cytokinin pi nízké svtelné intenzit (Reková, nepublikované výsledky) je robustní jev, který není statisticky významn ovlivnn uvedenou nehomogenitou dopadajícího svtla na klíní rostliny. Pro tento typ experiment lze považovat svtlo za homogenní. 37

38 Tab. 4 Umístní misek na polici, intenzita svtla a délka hypokotyl klíních rostlin Col-0. Oznaení misek a jejich umístním v boxu (A). Intenzita svtla v mol.m -2.s -1 namená pro jednotlivé misky (B). Délky hypokotyl Col-0 v milimetrech (C). Hodnoty jsou prmrem ze dvou biologických opakování. Pro každé opakování bylo použito pibližn deset klíních rostlin. A DMSO tz (1M) B C oznaení misek intenzita svtla délka hypokotylu Obr. 8 Délky hypokotyl Col-0 pi rzné svtelné intenzit svtla. 38

39 Obr. 9 Fenotyp klíních rostlin Col-0 na DMSO (vlevo) a 1M tz (vpravo). Klíní rostliny byly kultivovány 11 dn pi svtelné intenzit 18 mol.m -2.s -1 a režimu dlouhého dne. 5.2 Vliv mutací v genech CRF na dlouživý rst hypokotyl Arabidopsis thaliana CRF byly ped nedávnem objeveny a zaazeny mezi proteiny CSD u Arabidopsis (To a Kieber, 2008). Výsledky Rekové (nepublikovaná data) potvrzují úast ostatních len CSD (AHK, AHP a ARR rodin protein) u Arabidopsis v prodlužování hypokotyl pi nízké intenzit svtla a zvýšené hladin cytokinin. Na základ tchto pozorování jsme provedli stejný experiment s crf mutanty za úelem potvrzení nebo vyvrácení úasti CRF v prodlužování hypokotyl za výše zmínných podmínek Výbr vhodné koncentrace cytokininu Pro tento experiment byla použita Col-0 a crf mutantní linie. Klíní rostliny byly kultivované na DMSO a na koncentraní ad tz (10nM, 100nM, 1M, 5M a 10M) pi svtelné intenzit 18 µmol.m -2.s -1. Namené délky hypokotyl jsou uvedeny v tabulce. 5 a graficky znázornny na obrázku