MFPSB 1. b) Úloha COP1 ve fotomorfogenezi rostlin c) COP1 a tumorogeneze

Transkript

1 1 Úloha genu COP1 v rostlinné fotomorfogenezi a tumorogenezi u živočichů a) Fotomorfogeneze b) Úloha COP1 ve fotomorfogenezi rostlin c) COP1 a tumorogeneze Martin Fellner Martin Fellner 2010

2 2 a) Fotomorfogeneze Briggs WR, Spudich JL (eds) (2005) Handbook of Photosensory Receptors, Wiley-VCH Schäfer E, Nagy F (eds) (2006) Photomorphogenesis in Plants and Bacteria, 3rd ed., Springer Rockwell NC et al. (2006) Phytochrome Structure and Signaling Mechanisms. Annu Rev Plant Biol 57: p

3 3 Růst ve tmě (etiolizovaný růst, skotomorfogeneze) Růst na světle (fotomorfogeneze)

4 4 Fotomorfogeneze = světlem indukované změny ve vývoji a růstu rostliny. Proces, při kterém světlo jako signál změní vývoj rostliny tak, aby mohla pro svůj další růst využít světlo jako energii. Světlo Základní fotomorfogenické reakce: Tma - inhibice prodlužování - stimulace syntézy chlorofylu - stimulace růstu listu - regulace klíčení

5 5 Při fotomorfogenezi je světlo zachycováno pigmenty, které jsou součástí fotoreceptorů: červeného světla: fytochromy A až E (phytochromes) modrého světla a UV-A: kryptochromy a fototropiny (cryptochromes, phototropins) Absorpce světla aktivace signálních drah Aktivace světlem indukovaných genů

6 6 Fytochrom funguje v jádře aktivuje transkripční faktory. Je však lokalizovaný původně v cytoplazmě => musí být přemísťěn do jádra. Sharma R (2001) Current Science 80: Fytochrom se přemísťuje ř ť do jádra vlivem světla Vizualizace pomocí GFP (green fluorescent protein; GFP aktivovaný světlem emituje fluorescenční záření) - Pohyb phyb indukován R, inhibován FR;! do jádra putuje pouze ve formě Pfr, pohyb je pomalý - Pohyb phya indukován FR; putuje v obou formách; pohyb je rychlý. Konstrukt Promotor PHYB GFP Transformace rostlin phya-gfp phyb-gfp Sledování exprese PHYB v buňkách a pletivech

7 7 Regulace genové exprese fytochromem B PhyB je syntetizován v cytolazmě ve formě PrB PIC iniciuje transkripci MYB genů (CCA1, LHY) Jaderný protein PIF3 (phytochrome y interacting factor3): ) -přesná funkce není známa transkripční faktor reagující s G-boxem (= část promotoru genu MYB) - reaguje s C- terminálním koncem fytochromu B Pfr tvoří komplex s PIF3 Nové informace Kim J et al. (2003) Plant Cell 15: Ve formě PfrB je fytochrom transportován do jádra PfrB se váže k dimeru PIF3 Transkripční faktor MYB aktivuje transkripci LHCB

8 8 b) Úloha COP1 ve fotomorfogenezi rostlin Genetický skríning Selekce mutantů Identifikace genů cop1 (constitutive photomorphogenesis) - etiolizované rostliny ukazují fenotyp rostlin rostoucích na světle

9 9 Mutovaný (poškozený) gen COP1 vede ke konstitutivní fotomorfogenezi Zdravý gen COP1 negativní regulátor fotomorfogeneze COP1 centrální tál gen fotomorfogeneze f rostlin

10 10 Struktura Arabidopsis COP1 (AtCOP1) NES RING Coiled-coil NIS WD40 N-terminální doména: RING finger a coiled-coil doména RING finger a coiled-coil doména vnesení do cop1 mutanta vede k osvobození letálního fenotypu N-terminální doména má základní funkci ve vývoji rostlin NES = leucine-rich Nuclear Export Signal NIS = Nuclear Import Signal C-terminální doména: WD40

11 11 Interakce Arabidopsis COP1 s dalšími proteiny NES RING Coiled-coil NIS WD40 COP10 CIP8 SPA1-4, COP1, CIP1, CIP4, CIP7 HY5, HYH, STO, HFR1, CRY1, CRY2, phya, phyb Nezmapovaný faktor: LAF1

12 12 COP1 funguje jako E3 ubiquitin ligáza Negativní funkce COP1 byla odhalena pomocí HY5 HY5 bzip transkripční faktor: - akumuluje se v reakci na světlo - v reakci na světlo aktivuje fotomorfogenické geny - ve tmě dochází k degradaci HY5 pomocí proteolýzy zprostředkované proteazomem Proteolýza zprostředkovaná proteazomem vyžaduje protein ubiquitin ubiquitin protein ubiquitin protein RING finger E3 ubiquitin ligáza Proteazom

13 13 COP1 podezřelý z toho, že jde od HY5 E3 ubiquitin ligázu důkazy: -COP1 interaguje přímo s HY5 - degradace HY5 je narušena v mutantu cop1 - mutant cop1 s bodovou mutací v WD40 špatně interaguje s HY5 - HY5 se stabilizuje na světle, když COP1 je z jádra odstraněn COP1 = E3 ubiquitin ligáza COP1 rovněž ubiquitinuje HYH a transkripční faktory jiných typů: LAF1 (Myb) nebo HFR1 (bhlh) COP1 funguje jako hlavní vypínač: ve tmě vypíná fotomorfogenezi degradací transkripčních faktorů, které aktivují specifické geny fotomorfogeneze

14 14 phya fotoreceptor dlouhovlného červeného světla (FR); na světle extrémně labilní CRY2 fotoreceptor modrého světla; na světle extrémně labilní COP1 přímo interaguje s phya a CRY2 a směřuje je k ubiquitinaci proteazomem Ochrana před nadměrnou aktivací signálních drah phyb fotoreceptor červeného světla; na světle stabilní CRY1 fotoreceptor modrého světla; na světle stabilní COP1 přímo interaguje s phyb a CRY1, ale nemá vliv na jejich stabilitu COP1 reguluje interakci i phyb a CRY1 s terčovými č proteiny Schéma úlohy COP1 ve fotomofogenezi

15 15 Schéma úlohy COP1 ve fotomofogenezi

16 Funkce COP1 je modulována nukleoplazmatickou translokací 16 Mutace Leu zbytků v doméně COP1 odpovědné za export proteinu z jádra Zvýšená akumulace mutovaného COP1 v jádře Transgenní rostliny overexprimující COP1 s mutovanou doménou zodpovědnou za import proteinu do jádra Update 2008 Hong SH et al. (2008) Plant J (April 2008) Nový transkripční faktor BIT1 (MYB transcription factor Blue Insensitive Trait 1) Tma: degradace BIT1 působením COP1. BL: BIT1 stabilizován CRY1, není degradován. BIT1 se váže k promotoru Pdbs (člen light-harvesting complex genů) a tak aktivuje jeho expresi. Snížena akumulace mutovaného COP1 v jádře = konstitutivní fotomorfogeneze

17 17 Faktory regulující COP1 1) Proteiny SPA - kvasinkový dvouhybridní skríning - genetické interakce - purifikace proteinových komplexů - regulují funkci COP1 v signální dráze phya - obsahují N-terminální kinase-like doménu, coiled-coil doménu, WD40 na C-konci - WD40 vysoce homologní k WD40 doméně COP1 - fyzicky interagují s COP1 prostřednictvím coiled-coil domény NES RING Coiled-coil NIS WD40 COP10 CIP8 SPA1-4, COP1, CIP1, CIP4, CIP7 HY5, HYH, STO, HFR1, cry1, cry2, phya, phyb Mechanizmus regulace COP1 proteiny SPA není znám. - zvyšují aktivitu (fosforylací COP1) - usnadňují interakci COP1 se substráty - stabilizují COP1 komplexy

18 18 2) Kryptochromy - na světle CRY1 a CRY2 jsou fosforylovány => stávají se aktivními - na světle CRY1 a CRY2 negativně regulují aktivitu COP1 asociací C-terminální domény CRY (CCT) s doménou WD40 proteinu COP1 - transgenní rostliny exprimující CCT1, CCT2 => cop1 fenotyp - transgenní rostliny s mutací v CCT narušena interakce s COP1 => bez cop1 fenotypu

19 19 Navržený mechanismus regulace COP1 kryptochromy Modré světlo => přenos elektronů uvnitř PHR => změna konformace CCT => autofosforylace CRY => aktivace kryptochromu Modré světlo Aktivní (Pi)n CRY Neaktivní PHR CCT PHR CCT Kináza Fosfatáza PHR CCT PHR = Photolyase-related doména; N- terminální doména Aktivace kryptochromu Deaktivace COP1

20 20 3) COP/DET/FUS Další geny: DET (DE ETIOLATED) FUS (FUSCA) Mutanti s fenotypem konstitutivní fotomorfogeneze Součástí dvou velkých komplexů: COP9 signalozom CDD komplex COP9 signalozom konzervovaný u rostlin a živočichů; spojen s multikomplexy E3 ubiquitin ligázy; reguluje aktivitu E3 CDD komplex nalezen pouze u rostlin Vztah mezi COP, DET a FUS není zatím znám: - mutace cop/det/fus potlačuje jadernou akumulaci COP1 -stabilita CDD komplexu je postižena mutací v COP9 signalozomu - mutace cop10 vede ke změně velikosti komplexu COP1

21 21 c) COP1 a tumorogeneze COP1 velice konzervovaný u ryb, obojživelníků, ptáků a savců; nebyl identifikován u Drosophily, ale byl nalezen u komára MmCOP1 role v tumorogenezi a reakcích ke stresům Struktura savčího COP1 (MmCOP1) NE umožňuje interakci COP1 s jadernou obálkou COP1 migruje mezi jádrem a cytoplazmou. Má ale odlišné import a export signály (NIS, NES) Coiled-coil doména self dimerizace i COP1; interaguje s DET1 COP1 interaguje s c-jun, p53 a MVP prostřednictvím WD40

22 22 Funkce COP1 v savčích buňkách Stejně jako u rostlin, živočišný COP1 je zapojen v ubiquitinaci proteinů. Jeho úloha u savců je však mnohem méně známa než u rostlin Tři známé substráty COP1: p53 (tumor suppressor protein) c-jun (proto-oncogene) MVP (major vault protein) p53 (tumor suppressor protein) COP1 degraduje p53: Overexprese COP1 Inhibice transkripce a apoptózy závislé na p53 COP1 byl overexprimován ve vysokém procentu v endokarcinomech prsu a vaječníků Eliminace COP1 Zastavení buněčného cyklu v G1 fázi Update 2008 He L et al. (2007) Nature 447: Transkripční factor p53 reguluje expresi genů kódujících microrna (mir-34), které potlačují buněčné dělení. Hladiny microrna jsou radikálně sníženy v nádorových buňkách.

23 23 U rostlin je aktivita COP1 regulována světlem. Otázka: Co reguluje aktivitu COP1 u živočichů? Co způsobuje zvýšení či redukci exprese COP1? p53 Poškození DNA Protein ATM fosforyluje COP1 na Ser 387 Transport COP1 z jádra do cytoplazmy a autodegradace COP1 Rozpad komplexu COP1-p53 Zastavení ubiquitinace a degradace p53 Apoptóza Update 2008 Poškození DNA důsledek UV a ionizačního záření P53 je nejčastěji mutovaným supresorem e Benjamin CL et al. (2008) Photochem Photobiol 84: UVB indukuje mutaci (C=>T a CC=>TT) v genu p53. Mutace jsou spojené s vývojem rakoviny kůže. Mutace p53 - detekovány v myší kůži dopředu před vypuknutím rakoviny. Využití: Testování opalovacích krémů. Bensaad K, Vousden KH (2007) Trends in Cell Biology 17: Rakoviny ukazují metabolické změny vedoucí k upregulaci glykolýzy a spotřeby glukózy. p53 reguluje metabolismus glukózy a oxidativní stres - potlačování vzniku nádorů

24 24 c-jun MVP UV záření UV záření Akumulace c-jun Fosforylace MVP Iniciace transkripce AP-1 (activator protein) Rozpad komplexu COP1-MVP Redukce transkripce p53 Redukce transkripce AP-1 (activator protein) Tumorogeneze Apoptóza

25 Ionizační 25 záření UV záření Stres Poškození DNA COP1 Transport do cytoplazmy P P COP1 p53 p53 Apoptóza ATM P c-jun P c-jun P c-jun p53 AP-1 COP1 Tumorogenesis Transport do cytoplazmy P MVP P MVP COP1 MVP = major vault protein Transport do cytoplazmy COP1 COP1 = constitutive photomorphogenesis 1 ATM = ataxia telangiectasia mutated AP-1 = activator protein p53 = tumor suppressor protein c-jun = proto-oncogene

26 26 Použitá literatura Hong SH et al. (2008) Plant J (April 2008) Benjamin CL et al. (2008) Photochem Photobiol 84: Bensaad K, Vousden KH (2007) Trends in Cell Biology 17: He L et al. (2007) Nature 447: Jiao Y et al. (2007) Nature Reviews in Genetics 8: Taiz L, Zeiger E (2006) Plant Physiology. 4th Edition, Sinauer Asociates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts Hoeller D et al. (2006) Nature Reviews Cancer 6: Dornan D et al. (2006) Science 313: Burger A et al. (2006) Neoplasia 8: Yi C et al. (2005) Cancer Res 65: Yi C, Deng XW (2005) Trends in Cell Biology 15: Dornan D et al. (2004) Cancer Research 64: Wertz IE et al. (2004) Science 303: Dornan D et al. (2004) Nature 429: Bianchi E et al. (2003) J Biol Chem 278: Yi C et al. (2002) BMC Cell Biology 3: 30-46

27 27 Kdo jsou? Xing-Wang Deng Yale University, New Haven Vishva M. Dixit Genentech, Inc., San Francisco Joanne Chory The Salk Institute, La Jolla? Chunling Yi Yale University, New Haven David Dornan Genentech, Inc., San Francisco

28 28 Klíčová slova pro příští přednášku Boron Boron transporter Boron channel Boron transport NIP5;1 Borate transport NaBC1 Na + -coupled borate transporter Boric acid BOR1 Xylem loading Google: NCBI: