Geneticky modifikované

Transkript

1 Mr Nt Mr Nt 500 bp 500 bp Obr. 1: Ověření možnosti amplifikace DNA Obr. 2: Ověření možnosti amplifikace DNA rostlin kukuřice pomocí PCR s primery Plant1/Plant 2. pomocí PCR s primery Plant1/Plant 2. Dráha 1: kukuřice; dráha 2: MON810; dráha 3: Bt176; Dráha 1: oves; dráha 2: ječmen; dráha 3: pšenice; dráha 4: Bt11; dráha 5: T25; dráha 6: Bt10; Nt: dráha 4: slunečnice; dráha 5: hrách; dráha 6: tabák; beztemplátová kontrola; Mr: marker 100 bp DNA ladder, dráha 7: řepka; dráha 8: sója; dráha 9: kukuřice; Nt: Geneticky modifikované očekávaná velikost produktu: bp. beztemplátová kontrola; Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost produktů: bp. organismy v potravinářských technologiích: význam a detekce 100 bp 200 bp Kamila Zdeňková

2 Obsah přednášky GMO, definice, legislativa význam GMO přehled metod detekce GMO metody založené na polymerásové řetězové reakci (PCR) metody založené na detekci proteinu biočipy PCR s detekcí v reálném čase (real on time PCR, qpcr) digitální PCR (dpcr) kvantifikace GMO referenční materiály ELGL a Konsorcium zástupců laboratoří v ČR zabývajících se detekcí GMO normy

3 Definice GMO GMO organismus, kromě člověka, jehož dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací* Genetická modifikace cílená změna dědičného materiálu organismu způsobem, kterého se nedosáhne přirozenou rekombinací. Tato cílená změna dědičného materiálu může být dvojího typu: 1) zavedení cizího genu do DNA hostitelské buňky, nezávisle na příbuznosti dárce a příjemce, přičemž tento cizorodý gen nazýváme transgen, a organismy takto upravené transgenní nebo rekombinantní 2) gen do hostitelské buňky není vpraven, ale naopak je z ní vyjmut, nebo je utlumena jeho činnost Výsledkem genetické modifikace může tedy být buď získání nové vlastnosti, nebo naopak potlačení vlastnosti nežádoucí*. Literatura a použité zdroje * Zákon č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a o změně některých souvisejících zákonů.

4 Geneticky modifikované organismy (GMO) mikroorganismy živočichové rostliny Přenos genů horizontální přenos: Lidské geny do prasat, ovcí.. Bakteriální geny do rostlin.. Hmyzí, kvasničné a savčí geny do rostlin..

5 Kde lze využít GMO Medicína např. lidský růstový hormon (dříve z podvěsku mozkového mrtvol, dnes produkce z 10 litrů kultury rekombinantní E. coli pro několik set dětí), vakcíny, genová terapie Zemědělství, potraviny Dekontaminace životního prostředí The Plant Journal 49,

6 Důvody přípravy GMO Zvýšit výnosy a nutriční hodnotu zemědělských plodin, produkci hospodářských zvířat, drůbeže a ryb a omezit chemizaci v zemědělské výrobě Snížit ztráty při pěstování hospodářských zvířat zemědělských plodin a chovu Zlepšit chuť, kvalitu a trvanlivost potravin, modifikací rostlin získat nové suroviny pro chemickou výrobu Připravit enzymy s novými vlastnostmi a nové typy léčiv a biopreparátů, vyznačující se vyšší účinností bez nežádoucích účinků Využít mikroorganismy pro ekologické čištění vody a půdy Připravit transgenní rostliny a zvířata produkující farmakologicky aktivní látky Zdokonalit diagnostiku dědičných nemocí a vyhledávání nosičů genetických poškození Zavést nové způsoby léčby genetických onemocnění (genová terapie dědičných a nádorových onemocnění) Pomoc při záchraně organismů ohrožených vymíráním

7 Centrální úloha E. coli Oblíbený model pro molekulární genetiky, existovala řada charakterizovaných mutantů, regulace Genové exprese dobře popsaná a jednoduchá, široký výběr plasmidů Proto jedinečná oproti ostatním mikrobiálním systémům E. coli - nejvíce využívaná i při vnášení genů do ostatních organismů (jako mezikrok) Technicky je klonování v E. coli jednodušší než přímo v ostatních organismech

8 Způsoby nakládání s GMM Způsoby nakládání s GMM vycházejí z obecných zásad nakládání s mikroorganismy. Z hlediska bezpečnosti jsou mikroorganismy klasifikovány do čtyř skupin. Tato klasifikace mikroorganismů je akceptovaná EU legislativou a vychází z principů vypracovaných Světovou zdravotnickou organizací (WHO): 1. skupina organismy, u kterých je nepravděpodobné, že mohou vyvolat onemocnění člověka 2. skupina organismy, které mohou vyvolat onemocnění a mohou ohrozit obslužný personál. Je však nepravděpodobné jejich masové šíření a je známá účinná profylaxe a léčení 3. skupina organismy, které mohou vyvolat závažná onemocnění lidí a představují vážné riziko pro obslužný personál. Je u nich nebezpečí šíření v populaci, ale je známá účinná profylaxe a léčení 4. skupina organismy, které působí velmi závažná onemocnění lidem a mohou vážně ohrozit obslužný personál. Zároveň se mohou nebezpečně šířit v populaci. K omezení jejich šíření není k dispozici účinná profylaxe a jejich léčba není zvládnutá.

9 GM rostliny Zemědělství - kukuřice - sójové boby - bavlník - řepka - rýže Medicína - ječmen - len - tabák - kukuřice - brambory - hrách Remediace - rostliny s velkým množstvím biomasy - topol, switch grass

10 Transgenní rostliny transgenní plodiny mohou nést velmi odlišné vlastnosti výhodné pro pěstitele, spotřebitele či různá odvětví průmyslu často se setkáváme s jejich rozdělením do několika skupin (generací)

11 Transgenní rostliny 1. První generace plodin Plodin zahrnuté do této skupiny se vyznačují přínosy zejména pro pěstitele: usnadňují ochranu proti chorobám, škůdcům a plevelům. Přínosem je i větší šetrnost k životnímu prostředí v důsledku zjednodušení dosavadních technologií Výhoda pro spotřebitele je nepřímá a může (ale také nemusí) spočívat v nižší ceně produktu. 2. Druhá generace plodin Transgenní plodiny odolné abiotickým stresům, například rezistence nebo tolerance k chladu, suchu, zasolení půdy či nedostatku světla. Primárně poskytuje výhody zemědělcům. 3. Třetí generace plodin Transgenní plodiny s vyšší nutriční hodnotou: např. vhodnější složení mastných kyselin, zastoupení deficitních aminokyselin, upravený obsah vitamínu apod. a antikancerogenními a jinými zdravotně působícími a léčivými účinky. Přímé výhody pro spotřebitele a někdy se též označují jako plodiny s upravenými výstupními vlastnostmi. 4. Čtvrtá generace plodin Transgenní plodiny pěstované jako ekologicky výhodné suroviny pro některá průmyslová odvětví. 5. Pátá generace plodin Transgenní plodiny pěstované jako náhrada fosilních paliv (výroba etanolu a bionafty).

12 Transgenní rostliny V současné době jsou pěstovány především plodiny první generace nesoucí transgeny pro toleranci k neselektivním herbicidům, umožňující snadnější ochranu porostů před zaplevelením, dále plodiny s vnesenou rezistencí k hmyzím škůdcům, popřípadě kombinace obou těchto vlastností.

13 Potraviny GM živočišného původu Členové Evropského parlamentu preventivně odmítají dovoz masa, vajec a mléka nejen z geneticky modifikovaných, ale i klonovaných zvířat Naše SVS vydala prohlášení (Potravinářský zpravodaj č.6, ze ) ústy tiskového mluvčí SVS Ing. J. Dubena: Klonů se netřeba báti, život nekrátí. Není pochyb o tom, že ryby (nejen losos) budou prvními transgenními živočišnými produkty, které se objeví v distribuční síti. GM losos Klon

14 Důvody modifikace potravinářských surovin Tolerance k herbicidům Rezistence vůči hmyzu, virům, bakteriím, plísním Rezistence vůči stresovým faktorům (suchu, mokru, teplu, mrazu, zasolení půdy atd.) vzhledem k diskutovaným změnám klimatu, zvyšování počtu obyvatel planety atd. Zlepšení technologických vlastností (nejen pro potravinářské účely) Zlepšení nutriční kvality a zvýšení obsahu látek chránících naše zdraví ( GM Crops for Health )

15 Každoroční údaje: ISAAA mezinárodní nezisková organizace ISAAA - Mezinárodní služba pro získávání údajů o používání zemědělských biotechnologií čili International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications

16

17

18 Pěstování GM plodin 134 milionů hektarů v roce 2009; 77% sojových bobů, 49% bavlníku Pěstování GM plodin 175,2 milionů hektarů v roce 2013; 79% sojových bobů, 70% bavlníku Literatura a použité zdroje

19 Potřeba většího množství surovin pro výživu obyvatelstva Dr. Clive James, executive director of the International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA), said that In the next 50 years, the global population will consume two times as much food as humans have consumed since the beginning of agriculture 10,000 years ago, in a keynote at the Agricultural Biotechnology International Conference (ABIC 2010) in Saskatoon Za dalších 50 let spotřebuje populace 2x více jídla než spotřebovali lidé od počátku zemědělství před lety.

20 GM plodiny pěstované ve světě sója kukuřice bavlník řepka dýně papája cukrovka vojtěška rajče paprika topol brambory karafiát petúnie modrá růže EU pěstování GMO v oběhu v EU kukuřice, sója, řepka, bavlník, cukrovka, mikroorganismy Brevibacterium lactofermentum Saccharomyces cerevisiae Zdroj: Literatura a použité zdroje

21 Literatura a použité zdroje

22 GM potraviny - EU V dubnu 2014 je v EU povoleno pěstovat: Bt kukuřici MON810 K uvedení na evropský trh je povoleno 50 druhů genetických modifikací těchto rostlin V dubnu 2014: 29x kukuřice, 8x bavlník, 7x sója, 3x řepka olejka, 1x cukrová řepa a 2x kvasinky a bakterie. Literatura a použité zdroje Zdroj: GMO bez obalu

23 Zdroj: GMO bez obalu GM potraviny - EU Evropský spotřebitel dle platné legislativy má mít možnost svobodné volby v rozhodování, zda si GM potraviny koupí či nikoliv. Produkty sestávající z GMO nebo je obsahující, potraviny vyrobené z GMO nebo krmiva vyrobená z GMO, které jsou uvedené na trh v souladu s právními předpisy EU, musí mít na etiketě uvedena slova Tento produkt obsahuje geneticky modifikované organismy. Toto se nevztahuje na potraviny obsahující GMO, jehož podíl v jednotlivých složkách nebo v jednosložkové potravině není vyšší než 0,9 % za předpokladu, že přítomnost tohoto materiálu je náhodná nebo technicky nevyhnutelná.

24 Označovat se musí produkty sestávající z GMO nebo obsahující GMO produkty vyrobené z GMO i bez důkazu přítomnosti dotčeného GMO mouka, olej (v obchodech v ČR) apod. produkty klasického a ekologického zemědělství pokud obsahují více než 0,9 % GMO pokud obsahují jakékoliv množství záměrné příměsi GMO (náhodné a technicky nevyhnutelné příměsi do 0,9 % jsou tolerovány) > 0,9 % GMO Zdroj:

25 Legislativa EU GMO jsou součástí společné politiky EU rozhodnutí na úrovni EU platí pro všechny členské státy využívání (tzn. nakládání) je převážně regulováno na úrovni EU ČR je součástí EU (od 2004) právní předpisy a rozhodnutí EU v oblasti GMO jsou pro ČR závazná

26 Základní právní předpisy v EU směrnice 2001/18/ES o záměrném uvolňování GMO do životního prostředí a o zrušení směrnice 90/220/EHS nařízení 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech nařízení 1830/2003 o sledovatelnosti a označování GMO a sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z GMO a o změně směrnice 2001/18/ES nařízení 1946/2003 o přeshraničních pohybech GM účinnost od data vstupu ČR do EU platí přímo, kompetence a sankce v národních předpisech Literatura a použité zdroje

27 Základní právní předpisy v ČR Zákon č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, ve znění pozdějších předpisů poslední novela č. 346/2005 Sb. nahradil první zákon o nakládání s GMO v ČR: zákon č. 153/2000 Sb. Prováděcí vyhlášky Vyhláška č. 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty Vyhláška č. 29/2010 Sb., kterou se mění vyhláška č. 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, ve znění vyhlášky č. 86/2006 Sb. povinnost značit potraviny a krmiva obsahující více než 0,9 % GMO potřeba zavedení spolehlivého, účelného a rychlého kontrolního systému pro detekci GMO v potravinách a krmivech a ( )

28 Působnost zákona GMO schopné rozmnožování a výrobky obsahující tyto organismy Nevztahuje se na uvádění do oběhu léčiv a přípravků na ochranu rostlin obsahujících GMO Nevztahuje se na uzavřené nakládání s prokazatelně bezpečnými geneticky modifikovanými mikroorganismy (GMM)

29 Stav problematiky ve světě (mimo zemí EU) problematika GMO je řešena také v rámci Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD), jíž je ČR členem a Světové zdravotní organizace (WHO) Evropské země nenáležící do EU mají také zavedeny systémy značení GMO. v Norsku se značí potraviny obsahující více než 2 %, ve Švýcarsku jsou značena semena obsahující více než 0,5 % GMO, potraviny obsahující více než 1 % GMO, míchané krmivo obsahující více než 2 % a složky krmiva obsahující více než 3 % příměsi GMO. Ostatní státy značící GMO produkty jsou Nový Zéland a Austrálie (1 %), Jižní Korea (3 %), Tchaj-wan a Japonsko (5 %) v Číně musí být semena, hospodářská zvířata, drůbež, rybí potěr a mikroorganizmy a produkty z GM zvířat, rostlin či mikroorganizmů viditelně označeny. Musí být označeny i produkty, které již GMO neobsahují, ale jsou z nich vyrobené a to i v případě, že GM ingredience nemůže být ve finálním produktu detekována

30 Stav problematiky ve světě (mimo zemí EU) některé státy. označování přítomnosti GMO nevyžadují, je pouze dobrovolné (USA, Kanada, Argentina). v USA neexistuje zvláštní zákonná norma pro GMO, ale využívají se stávající zákony. Legislativa je v USA založena na konstatování, že potenciálně škodlivá není samotná metoda transgenoze, ale některé specifické vlastnosti organizmů, bez ohledu na to, jakým způsobem vznikly. Riziko je tedy odvozováno od vlastností organismu. Toto pravidlo platí od roku 1986 a vyplývá z něho, že např. účinnost transgenní rostliny s vloženým genem bakterie Bacillus thuringiensis, proti škůdcům je posuzována podle zákona o pesticidech. V důsledku této praxe spadá posuzování GMO pod různé instituce a pod různé zákony

31 Legislativa shrnutí příprava, testování, distribuce a využívání GMO podléhají v současné době v řadě zemí celého světa platné legislativě v EU se řídí principem předběžné opatrnosti platí tedy co není dovoleno, je zakázáno podstatnou a významnou částí legislativy je hodnocení rizika daného GMO legislativa v oblasti používání GMO existuje již od 90. let minulého století posuzování každého případu zvlášť na základě všech dostupných znalostí Česká Republika jako jeden ze států Evropské Unie se řídí směrnicemi EU, a nakládání s GMO podléhá zákonům ČR

32 podle zákonů všech členských zemí EU je předpokladem pro schválení GM potraviny stejná bezpečnost, výživová hodnota a zdravotní nezávadnost jako je u srovnatelného konvenčního výrobku. dále musí být GM odrůda shodná s příslušnou konvenční odrůdou ve všech podstatných znacích s výjimkou dané genetické modifikace (Ondřej a Drobník, 2002). testování je velice důkladné a často daleko podrobnější než u konvenčních odrůd, a proto se dá říci, že GMO jsou nejvíce kontrolované organismy používané v zemědělství, a jejich schválení lze považovat za zcela důvěryhodné.

33 Struktura genetických konstruktů v rostlinách KONSTRUKT Promotor TRANSGEN Selekce Terminátor

34 Zjednodušené schéma rozboru vzorku pro splnění platné EU legislativy Detekce GMO Identifikace Monitorování přítomnosti GMO Positivní Identifikace a určení GMO Negativní Kvantifikace Kvantitativní rozbor jednotlivých složek > 0,9% Autorizované Musí být značeno? < 0,9% Neschválené Neschválené GMO: Aktuální seznam na merg-unauth.html Značení vyžadováno Značení není nutné Nezákonné

35 Metody používané pro detekci GMO Molekulárně - Detekce PCR a její variace (multiplex PCR, nested PCR) biologické DNA Kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR) metody PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qrt PCR) PCR-ELISA SNPlex TM genotyping metoda Southernův přenos Biočipy, sekvenace Detekce RNA Reversní transkripce PCR (RT-PCR) Northern přenos RPA (ribonuclease protein assay) Imunochemické Detekce ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) metody proteinu Western přenos (imunoblot) Imunochromatografický test (Lateral flow imunoassay) Ostatní techniky Určení aktivity produktu transgenu Chromatografie Určení aktivity produktu transgenu Literatura a použité zdroje 1 Rozšířené schéma z Zdeňková K., Pazlarová J., Macková M., Demnerová K.: Chem. Listy 96, (2002).

36 Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction PCR) in vitro reakce umožňující amplifikaci DNA katalyzována termostabilní DNA polymerasou k namnožení cílového úseku používá oligonukleotidových primerů navržena Kary B. Mullisem roku 1983 Nobelova cena udělena roku 1993 Vlastní PCR - cyklické opakování 3 kroků Fáze Prů bě h Teplota 1. DENATURACE tepelné oddě lení vláken dvojšroubovice DNA C 2. ANNEALING př ipojení primerů úsek seků m v DNA k jejich komplementárn rním C 3. ELONGACE prodlouž ení primerů polymerasou 72 C

37 Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction PCR) Denaturace Nasedání primerů Prodlužování primerů Literatura a použité zdroje Obrázek: Andy Vierstraete (1999)

38 Směr DNA produktů nejdostupnější metodou detekce produktů PCR je elektroforesa v agarosovém gelu interkalační barvivo Ethidium bromid či SYBR Green I Mr Detekovaný vzorek * - Nemodifikovaná plodina (negativní kontrola) 1 0,1% GM plodina 1000bp 429bp 2 0,5% GM plodina 3 1% GM plodina 4 2% GM plodina 500bp 100bp + + 5% GM plodina (pozitivní kontrola) Negativní a pozitivní kontroly se zařazují z důvodu odhalení případné kontaminace či technické chyby, která by mohla za konečné zkreslení výsledků. Z důvodu jistoty u celého průběhu se obě kontroly řadí mezi vzorky již na počátku celého testu. * Ústav pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements), organizace Evropské komise EC JRC,

39 Multiplex PCR PCR s násobným množstvím párů primerů Výhoda: + možnost analysy více parametrů Nevýhoda: - zvýšení tvorby nespecifických produktů - možná diskriminace delších DNA fragmentů

40 Příklad multiplex PCR Mr Nt bp 101 bp 151 bp 100 bp Detekční limit duplex PCR s primery P35S 1-3 / P35S 1-5 a nost 2-3 / nost 2-5. Dráha 1: nemodifikovaná sója, dráha 2: 0,1% RR sója, dráha 3: 0,25% RR sója, dráha 4: 0,5% RR sója, dráha 5: 1% RR sója, dráha 6: 5% RR sója, Nt: beztemplátová kontrola. Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost produktů: 101 a 151 bp.

41 Nested PCR dvě po sobě následující amplifikační reakce dva druhy oligonukleotidových primerů - vnitřní a vnější templát první reakce - DNA extrahovaná z vyšetřovaného vzorku templát druhé reakce - produkt získaný první amplifikací + zvýšení citlivosti a přesnosti 1. PCR 2. PCR vnější primery DNA templát cílový produkt 1. PCR vnitřní primery DNA templát (cílový produkt 1. PCR) Cílový produkt 2. PCR

42 Standardy a kontrola PCR procesu vhodné zařazení pozitivní, negativní či beztemplátové kontroly PCR procesu negativní kontrola - necílová DNA beztemplátová kontrola - sterilní voda pozitivní kontrola - ověřená cílová sekvence negativní nebo beztemplátové kontrola: ověření možné kontaminace reagencií a používaných pomůcek pozitivní kontrola: ověření funkčnosti všech kroků vhodné zařazení beztemplátové kontroly celého procesu analýzy vzorku, tzn. nejprve je podrobena izolačnímu procesu společně s analyzovaným vzorkem (beztemplátová kontrola izolačního procesu) a dále je podrobena všem PCR procesům jako analyzovaný vzorek

43 ad 1) Transgenní odrůda sóji Roundup Ready Sója GTS Rostlinná DNA P-E35S Petunia EPSPS CTP EPSPS T-nos Rostlinná DNA Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu (obchodně nazývaného ). Literatura a použité zdroje

44 ad 2) Detekce GMO pomocí metody PCR Literatura a použité zdroje 1 Zdeňková K., Pazlarová J., Macková M. a Demnerová K.: Přehled metod detekce GMO v potravinách a potravinářských surovinách, Chemické listy, 96 (2002), 26.

45 Analýza vzorku sóji 1. zisk dostupných informací o GM sóje (studium databází) 2. zisk dostupných informací o metodách detekce a kvantifikace (studium databází a studium norem (Comité Europeén de Normalisation (CEN)). Výběr vhodné a dostupné metody 3. výběr vhodného referenčního materiálu 4. vlastní analýza

46 ad 1) GM odrůdy sóji: svět Event Company Description A , A , A Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Glufosinate ammonium herbicide tolerant soybean produced by inserting a modified phosphinothricin acetyltransferase (PAT) encoding gene from the soil bacterium Streptomyces viridochromogenes. A BPS-CV127-9 DP DP Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) BASF Inc. Pioneer Hi-Bred International Inc. Pioneer Hi-Bred International Inc. Glufosinate ammonium herbicide tolerant soybean produced by inserting a modified phosphinothricin acetyltransferase (PAT) encoding gene from the soil bacterium Streptomyces viridochromogenes. The introduced csr1-2 gene from Arabidopsis thaliana encodes an acetohydroxyacid synthase protein that confers tolerance to imidazolinone herbicides due to a point mutation that results in a single amino acid substitution in which the serine residue at position 653 is replaced by asparagine (S653N). High oleic acid soybean produced by inserting additional copies of a portion of the omega-6 desaturase encoding gene, gm-fad2-1 resulting in silencing of the endogenous omega-6 desaturase gene (FAD2-1). Soybean event with two herbicide tolerance genes: glyphosate N-acetlytransferase, which detoxifies glyphosate, and a modified acetolactate synthase (ALS) gene which is tolerant to ALS-inhibitng herbicides. G94-1, G94-19, G168 High oleic acid soybean produced by inserting a second copy of the fatty acid desaturase (GmFad2-1) encoding DuPont Canada Agricultural Products gene from soybean, which resulted in "silencing" of the endogenous host gene. GTS GU262 MON89788 OT96-15 W62, W98 Monsanto Company Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Monsanto Company Agriculture & Agri-Food Canada Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Glyphosate tolerant soybean variety produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) encoding gene from the soil bacterium Agrobacterium tumefaciens. Glufosinate ammonium herbicide tolerant soybean produced by inserting a modified phosphinothricin acetyltransferase (PAT) encoding gene from the soil bacterium Streptomyces viridochromogenes. Glyphosate-tolerant soybean produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) encoding aroa (epsps) gene from Agrobacterium tumefaciens CP4. Low linolenic acid soybean produced through traditional cross-breeding to incorporate the novel trait from a naturally occurring fan1 gene mutant that was selected for low linolenic acid. Glufosinate ammonium herbicide tolerant soybean produced by inserting a modified phosphinothricin acetyltransferase (PAT) encoding gene from the soil bacterium Streptomyces hygroscopicus. Literatura a použité zdroje , 11/2013 nedostupné

47 ad 1) GM odrůdy sóji povolené v EU Transformation event/ Unique ID/ Company Genes Introduced / Characteristics Authorized use Authorization Expiration Date Soybean (A ) ACS-GMØØ5-3 Bayer Genetically modified soybean that contains: pat gene inserted to confer tolerance to the glufosinateammonium herbicide Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of ACS-GMØØ5-3 soybean 07/09/2018 Soybean (MON89788) MON Monsanto Genetically modified soybean that contains: cp4 epsps gene inserted to confer tolerance to the herbicide glyphosate Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of MON soybean 03/12/2018 Soybean (MON40-3-2) MON-Ø4Ø32-6 Monsanto Genetically modified soybean that contains: cp4 epsps gene inserted to confer tolerance to the herbicide glyphosate Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of MON soybean 09/02/2022 Soybean (MON87701) MON-877Ø1-2 Monsanto Genetically modified soybean that contains: cry1ac gene inserted to confer protection against certain lepidopteran pests Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of MON-877Ø1-2 soybean 09/02/2022 Soybean (356043) DP-356Ø43-5 Pioneer Genetically modified soybean that contains: gat gene inserted to confer tolerance to the herbicide glyphosate gm-hra gene inserted to confer tolerance to the ALS-inhibiting herbicide Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of DP-356Ø43-5 soybean 09/02/2022 Soybean (A ) ACS-GMØØ6-4 Bayer Genetically modified soybean that contains: pat gene inserted to confer tolerance to the glufosinate-ammonium herbicide Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of ACS-GMØØ6-4 soybean 09/02/2022 Soybean (MON87701 x MON89788) MON-877Ø1-2 x MON Literatura a použité zdroje Genetically modified soybean that contains: cry1ac gene inserted to confer protection against certain lepidopteran pests cp4 epsps gene inserted to confer tolerance to the herbicide glyphosate Foods and food ingredients containing, consisting of, or produced from MON-877Ø1-2 x MON soybean (including food additives) 27/06/2022

48 ad 1) GM odrůdy sóji povolené v EU podle databáze CERA Event Company Description A , A , A Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo)) Glufosinate ammonium herbicide tolerant soybean produced by inserting a modified phosphinothricin acetyltransferase (PAT) encoding gene from the soil bacterium Streptomyces viridochromogenes. GTS Monsanto Company Glyphosate tolerant soybean variety produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase (EPSPS) encoding gene from the soil bacterium Agrobacterium tumefaciens. MON89788 Monsanto Company Glyphosate-tolerant soybean produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) encoding aroa (epsps) gene from Agrobacterium tumefaciens CP4. Literatura a použité zdroje

49

50 ad 1) Transgenní odrůda sóji Roundup Ready Sója GTS Rostlinná DNA P-E35S Petunia EPSPS CTP EPSPS T-nos Rostlinná DNA Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu (obchodně nazývaného ). Literatura a použité zdroje

51 ad 2) Databáze JRC Ispra Literatura a použité zdroje 6q%3Dac%253A ( ).

52 ad 2) Databáze Euginius připravovaná databáze metod pro detekci GMO zahrnuté všechny publikované články poslední dodělávky, potom zkoušení. Pro veřejnost by mohla být přístupná v Literatura a použité zdroje

53 ad 2) Detekce GMO pomocí metody PCR Literatura a použité zdroje 1 Zdeňková K., Pazlarová J., Macková M. a Demnerová K.: Přehled metod detekce GMO v potravinách a potravinářských surovinách, Chemické listy, 96 (2002), 26.

54 Transgenní odrůda sóji Roundup Ready Sója GTS Rostlinná DNA P-E35S Petunia EPSPS CTP EPSPS T-nos Rostlinná DNA Le1 414 bp Le2 35Sp F 92 bp 35Sr R nos1 180 bp nos3 GMO5 447 bp 169 bp GMO9 GMO7 GMO8 Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu - obchodně nazývaný Literatura a použité zdroje

55 Certifikované referenční materiály (CRM)

56 ad 3) Referenční materiály (1/4) 1. materiály různého procentuálního zastoupení GMO 2. izolovaná genomová DNA 3. plazmidová DNA s vloženým cílovými úseky, kterými jsou nejčastěji PCR produkty standardy GMO jsou připravovány v Institutu pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements IRMM, Geel, Belgie) jedno z výzkumných center EK, spolupracuje s ostatními instituty JRC, s univerzitami, výzkumnými centry a s mezinárodními organizacemi katalog dostupných certifikovaných referenčních materiálů (angl. certified reference material, CRM)

57 ad 3) Referenční materiály (2/4) plazmidy jsou oproti přirozeným plazmidům upravené a obsahují tři důležité sekvence: počátek replikace selekční marker polyklonovací místo (angl. polylinker). Při přípravě standardů pro detekci a kvantifikaci GMO bývají použity plazmidy, které se exprimují ve velkém počtu kopií (angl. high copy number) jako například pcr 2.1 či pbr322. mohou obsahovat jednu vloženou sekvenci (STPs, angl. single-target plasmids) nebo více vložených sekvencí (MTPs, angl. multiple-target plasmids) v současné době je jako standard pro kvantifikaci GMO nejčastěji používána genomová DNA izolovaná z referenčních materiálů GM odrůd plazmidy jako kalibrátory pro kvantifikaci GMO se začaly používat v posledních patnácti letech, rozsah jejich použití rostl (max ), poté ustálený

58 TOPO TA klonovací kit Plasmid pcr 2,1-TOPO, vkládání PCR produktů kate CTP P-35S StLS pcr 2,1 TOPO plazmid

59 ad 3) Referenční materiály (3/4) státní laboratoř Velké Británie LGC provedla porovnání plazmidových a genomových DNA standardů pro kvantifikace RR sóji pomocí qrt PCR, bylo dosaženo srovnatelných výsledků s použitím obou standardů (zástupce LGC, ústní sdělení, 2006 a lit. 3 ) EK JRC - IRMM připravuje dva typy plazmidů pro diagnostiku GMO připraveno více než 40 plazmidů označených jako pengl pro detekci a identifikaci GMO (např. rýže Bt63: pengl-00-em02/06-01m) cca 10 plazmidů označených pjanus (kvantifikace jednotlivých GMO) uloženy v úřední sbírce LMBP-BCCM TM a jsou k dispozici od léta roku 2006 Literatura a použité zdroje Doporučení Komise 2004/787/ES : o technických pokynech pro odběr vzorků a detekci geneticky modifikovaných organizmů a materiálu vyrobeného z geneticky modifikovaných organizmů nebo produktů s jejich obsahem podle nařízení (ES) č. 1830/2003, ze dne 4. října Internet ( ): 3

60 ad 3) Referenční materiály (4/4) IRMM certifikované referenční plasmidy 1 1. MON810 kukuřici (ERM-AD413) 2. NK603 kukuřici (ERM-AD415) kukuřici (ERM-AD427) firma Nippon gene ( produkuje plasmidy jako referenční materiál a GMO detekční kity 2 Literatura a použité zdroje Žel, J., Milavec, M., Morisset, D., Plan, D., Van den Eede, G., Gruden, K.: SprinqerBriefs in Food, Health and Nutrition, 2012, 1-95, DOI: / _1.

61 ad 4) Analýza reálných vzorků 1. Izolace DNA (ideálně: jednoduchá, snadno reprodukovatelná, bezpečná a levná metoda pro izolaci DNA) 2. Druhově specifické PCR (nekódující úsek chloroplastové DNA a/nebo úsek genomu rostliny) 3. Monitorovací PCR (P-35S CaMV promotor, selekční gen npt II nebo T-nos terminátor) 4. Identifikace transgenu 5. Kvantifikace obsahu GMO pomocí PCR s fluorescenční detekcí (qpcr, dpcr)

62 Transgenní odrůda sóji Roundup Ready Sója GTS Rostlinná DNA P-E35S Petunia EPSPS CTP EPSPS T-nos Rostlinná DNA Le1 414 bp Le2 35Sp F 92 bp 35Sr R nos1 180 bp nos3 GMO5 447 bp 169 bp GMO9 GMO7 GMO8 Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu - obchodně nazývaný Literatura a použité zdroje

63 Výsledky analýzy vzorků semen sóji G A B C D1 D2 Dráhy 1-3: vzorek 1; dráhy 4-6: vzorek 2; dráhy 7-9: vzorek 3; dráha 10: 1 % RR sója. NtE: negativní kontrola izolačního procesu, Mr: marker λ/hindiii DNA (G), marker 100 bp DNA ladder (A-D2). Očekávané velikosti produktu: A 414 bp, B 92 bp, C 180 bp, D1-447 bp a D2 169 bp.

64 Metody založené na detekci proteinu specifická interakce antigenu (Ag) s protilátkou (Ab) běžně používány pro studium akumulace proteinů v transgenních rostlinách Pro detekci GMO je nejčastěji používána: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

65 Enzymová imunoanalysa na pevné fázi ELISA imunoanalytická metoda, které ve fázi detekce nebo kvantifikace používají enzymovou reakci jeden z imunoreaktantů (Ag, Ab) je vždy imobilizován na pevný nosič (membrána, skleněná podložka, stěna zkumavky nebo mikrotitrační destičky) nejčastější uspořádaní metody používané pro detekci GMO v potravinách je přímá nekompetitivní ELISA, tzv. sendvičový formát

66 Přímá nekompetitivní ELISA a) b) c) a) protilátka imobilizovaná na povrchu mikrotitrační destičky d) b) přídavek vzorku c) specifická interakce protilátky a antigenu d) Sendvič antigenu a obou protilátek většinou dvě protilátky reagující s jinými determinantními skupinami na odlišné části molekuly antigenu - první Ab imobilizovaná na povrch nosiče a specificky interaguje s antigenem - druhá Ab je značená enzymem (nejčastěji peroxidasa, alkalická fosfatasa, -galaktosidasa a glukosa oxidasa). po přidání chromogenního substrátu je výsledná enzymová reakce vyhodnocena spektrofotometricky

67 Imunochromatografický test Lateral Flow Strip* + výsledky během 5-10 minut + nízká cena + jednoduchost provedení - informativní stanovení, pozitivní výsledky testu musí být konfirmovány jinou metodou metoda je vhodná a v praxi používaná pro přímé získání prvních předběžných výsledků přímo na poli nebo při příjmu vzorků Literatura a použité zdroje * Ahmed F.E.: LabPlus international, 8-16 (2002).

68 Biočipy (microarrays nebo arrays) kolekce mikroskopických spotů DNA navázaných k pevnému povrchu (např. sklo, plast nebo křemíkový čip) až tisíce krátkých DNA sond komplementárních k hledaným sekvencím založeno na klasické technologii hybridizace DNA imobilizované DNA fragmenty (sondy) mohou být kratší oligonukleotidy (20-30 bp), PCR produkty, genomová DNA, umělé bakteriální chromosomy (BAC), plazmidy nebo i dlouhé oligonukleotidy DNA biočipy jsou nejčastěji využívány k měření exprese velkého množství genů současně NK bývají izolovány z buněk, RNA je převedena na cdna nebo crna, a jsou amplifikovány pomocí PCR technik řetězec NK hybridizuje se sondou imobilizovanou na povrchu pevného nosiče, detekce je prováděna buď stříbrem, chemiluminiscenčně (pro DIG značku) nebo přímo fluorescenčně

69 Biočipy (microarrays nebo arrays) Navázaný cílový fragment Imobilizovaný DNA fragment Pevný povrch Literatura a použité zdroje Počítačový model prost. uspořádání na DNA biočipu. Převzato z

70 DualChip GMO V2.0 (fa Eppendorf) 1) izolace DNA z analyzovaného vzorku 2) amplifikace DNA pomocí multiplex PCR procesů 3 h Genomová DNA 3) hybridizace PCR prodůktů na čip 1h 4) detekce hybridizovaných produktů 1h 30 m 5) analysa výsledků 10 min

71 DualChip GMO V2.0 (fa Eppendorf) Screening target elements (12): CaMV 35S promoter (p35s) Nopaline synthase terminator (tnos) Phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces hygroscopius (bar) Phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes (pat) The junction between the Nopaline synthase promoter and the neomycin phosphotransferase II gene (pnos-nptii), probe specific of Topas 19/2. cry1ab delta-endotoxin gene (cry1ab) Three capture probes are used to detect this target element; each sequence is specific of the sequence present in a defined transformation event: cry1ab-1 probe specific of Bt176 cry1ab-2 probe specific of MON810 and its hybrids cry1ab-3/cry1ac probe specific of Bt11, MON531, MON15985 and their hybrids cry3bb1 delta-endotoxin gene (cry3bb1) 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene (EPSPS) Three capture probes are used to detect this target element; each sequence is specific of the sequence present in a defined transformation event: EPSPS-A probe specific of GA21 and its hybrids EPSPS-B probe specific of RRS, NK603 and their hybrids EPSPS-C probe specific of GT73, H7-1, MON1445 and their hybrids Plant species target elements (7): Invertase gene (Maize) Cruciferin gene (Brassicaceae sp. including rapeseed) Lectin gene (Soybean) Glutamine synthetase gene (Sugar beet) UDP-glucose pyrophosphorylase gene (Potato) Oryza sativa root-specific gos9 gene (Rice) Acyl carrier protein gene (Cotton) Event-specific target elements (11): Bt176 MON810 Bt11 MON863 GA21 RRS GT73 T45 MON1445 MON531 MON15985 Contamination control target element (1): Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) Literatura a použité zdroje DualChip GMO microarrays enable the detection of the EU-approved genetically modified organisms (GMOs) by identifying their genetic elements. This system also facilitates the screening of other GMOs that contain corresponding transgene elements (about 60% of all GMOs worldwide).

72 Zjednodušené schéma rozboru vzorku pro splnění platné EU legislativy Detekce GMO Identifikace Monitorování přítomnosti GMO Positivní Identifikace a určení GMO Negativní Kvantifikace Kvantitativní rozbor jednotlivých složek > 0,9% Autorizované Musí být značeno? < 0,9% Neschválené Neschválené GMO: Aktuální seznam na merg-unauth.html Značení vyžadováno Značení není nutné Nezákonné

73 PCR s detekcí v reálném čase PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qpcr, angl. Real on Time PCR) monitorování vznikajícího produktu v průběhu celého amplifikačního procesu qpcr je nejpřesnější a nejvýhodnější v současné době dostupná kvantitativní metoda vysoká pořizovací cena nástrojů interkalační barviva - (např. SYBR green I, Ethidium bromid) = levnější fluorescenčně značené sondy - přesnější

74 Prahový detekční cyklus C T (threshold cycle) nejnižší cyklus ve kterém hodnota fluorescence měřeného vzorku vzroste nad hodnotu fluorescence pozadí C T

75 Fluorescence reportéru ( Rn) Vzorek beztemplátová kontrola Ct Amplifikační křivka Vzorek 1: 10 6 kopií cílového úseku vzorek 2: 10 5 kopií cílového úseku vzorek 3: 10 4 kopií cílového úseku vzorek 4: 10 3 kopií cílového úseku vzorek 5: 10 2 kopií cílového úseku zelená přímka znázorňuje mezní hodnotu pozadí Počet cyklů

76 PCR teoretická účinnost reakce - 100% teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení N; N=N0*2^n No=1 No=10 n 2^n ,43597E ,09951E+12 1,09951E+12 1,09951E+13 N = N 0 (2) n N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N 0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce) n = počet cyklů

77 Skutečná amplifikační účinnost reakce N = N 0 (1+E) n N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N 0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce) E = amplifikační účinnost reakce <0,1> n = počet cyklů

78 Ct Ct Amplifikační účinnost reakce E (angl. efficiency) E=10 (-1/sklon kalibrační křivky) 1 (90-100% pokud je sklon mezi od -3,6 do -3,1) Teoreticky E=1, sklon 3, Standardní křivka pro zein (Bt11) y = -3,36x + 38,54 R 2 = 0,99 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Log počtu kopií DNA Standardní křivka druhově specifického PCR (6,25; 12,5; 25; 50 a 100 ng) Standardní křivka P-35S (Bt y = -3,24x + 40,75 R 2 = 0,99 1,5 2 2,5 3 Log počtu kopií DNA Standardní křivka monitorovací s 5% Bt11 (6,25; 12,5; 25; 50 a 10

79 SYBR Green I Systém SYBR Green I (SG I) interkaluje do malého žlábku dsdna fluorescence SG I se po navázání do dsdna zvýší až 1000-krát delší amplikony = více navázaného SGI = vyšší fluorescenční signál detekce veškeré dsdna = nižší specifičnost systému nutnost pečlivého výběru reakčních podmínek nutná analysa křivek tání cenově dostupnější než detekce pomocí fluorescenčně značených sond

80 SYBR Green I a) b) c) a) prostředí reakce po teplotní denaturaci b) nasednutí primerů a vazba barviva c) prodlužování primerů upraveno dle

81 Posuzované parametry PCR procesů velikost produktu a možnost konfirmace produktu restrikčním štěpením specifita limit detekce = LOD vyjádřena v %GMO, ng DNA nebo v počtu kopií, vyjádřené jako ekvivalent haploidního genomu = HGE HGE - vypočítán ze známého množství DNA přidaného do reakce [ng] a z publikovaných hmotností haploidních genomů specifita limit detekce = LOD Posuzované parametry qpcr limit kvantifikace (LOQ) nejnižší množství cílové sekvence, kterou lze danou metodou spolehlivě kvantifikovat

82 Digitální PCR (dpcr) Rozdělení analyzovaného vzorku do velkého počtu separátních reakčních komor Literatura a použité zdroje