2- INDIKACE PRO POUŽITÍ

Transkript

1 PLATELIA ASPERGILLUS Ag 1 destička Platelia Aspergillus Ag je imunoenzymatický test pomocí sendvičové mikrodestičky pro zjištění antigenu galaktomananu Aspergillus ve vzorcích tekutiny bronchoalveolární laváže (bal) /1 1- ÚČEL POUŽITÍ Platelia Aspergillus Ag je imunoenzymatický test pomocí sendvičové mikrodestičky pro zjištění antigenu galaktomananu Aspergillus ve vzorcích séra u dospělých a dětí a vzorcích tekutiny bronchoalveolární laváže (BAL). Platelia Aspergillus Ag je test, který při použití ve spojení s dalšími diagnostickými postupy, jako např. mikrobiologická kultura, histologický rozbor vzorků z biopsie a radiografické údaje, může být používán jako pomoc při diagnóze invazivní aspergilózy. 2- INDIKACE PRO POUŽITÍ Platelia Aspergillus Ag je imunoenzymatický test pomocí sendvičové mikrodestičky pro zjištění antigenu galaktomananu Aspergillus ve vzorcích séra u dospělých a dětí a vzorcích tekutiny bronchoalveolární laváže (BAL). Platelia Aspergillus Ag je test, který při použití ve spojení s dalšími diagnostickými postupy, jako např. mikrobiologická kultura, histologický rozbor vzorků z biopsie a radiografické údaje, může být používán jako pomoc při diagnóze invazivní aspergilózy. 3- SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Infekce Aspergillus obvykle začíná v plicích jako v místě vstupu po inhalaci spor Aspergillus, které jsou přítomny v prostředí. Invazivní formy, jejichž počty se zvyšují za posledních 1 let, představují nejvážnější infekce. Vyskytují se zejména u neutropenních pacientů (po protirakovinné léčbě) a u pacientů léčených imunosupresivy (transplantace orgánů, zejména transplantace kostní dřeně) a kortikosteroidy 1. Aspergillus je vzácně izolován z krevní kultury. Diagnóza je často založena na nespecifických diagnostických nebo radiologických důkazech (klinické příznaky, snímek CT, rentgen hrudníku atd.) Test na rozpustný antigen galaktomananu v séru se jeví jako sérologická metoda, která může pomoci při diagnóze invazivní aspergilózy 9, 12, 24, 53, 61. Navíc u příjemců transplantátů pevného orgánu zajištění antigenu galaktomananu v bronchoalveolární laváži (BAL) se ukázalo jako výhodné pro diagnózu invazivní 8,17, PRINCIP POSTUPU 45 Platelia Aspergillus Ag je jednofázový imunoenzymatický test pomocí sendvičové mikrodestičky, pomocí něhož se zjišťuje galaktomanan v lidském séru a tekutině BAL. Tento test využívá monoklonální protilátky EBA-2, které jsou zaměřeny proti galaktomananu Aspergillus a byly popsány v předchozích studiích 26, 45. Monoklonální protilátky jsou používány (1) pro potažení nádobek mikrodestičky a navázání antigenu a (2) pro zjištění antigenu navázaného na senzibilovanou mikrodestičku (činidlo konjugátu: peroxidázou spojené monoklonální protilátky). Vzorky séra nebo tekutiny BAL jsou tepelně ošetřeny v přítomnosti EDTA za účelem disociace imunitních komplexů a vysrážení bílkovin, které by případně mohly ovlivnit test 25. Ošetřené vzorky a konjugát jsou přidány do nádobek potažených monoklonálními protilátkami a jsou inkubovány. Monoklonální protilátka galaktomanan komplex monoklonální protilátky / peroxidázy se vytváří v přítomnosti antigenu galaktomananu. Stripy jsou promývány za účelem odstranění veškerého nevázaného materiálu. Dále je přidán roztok substrátu, který bude reagovat s komplexy navázanými na nádobku a vytvoří se modře zabarvená reakce. Nové vytváření enzymu je zastaveno přidáním kyseliny, která změní modrou barvu na žlutou. Absorbance (optická hustota) vzorků a kontrol se určuje pomocí spektrofotometru nastaveného na vlnovou délku 45 a 62/63 nm. 5- ČINIDLA Platelia Aspergillus Ag: produkt č (96 testů) Sadu uchovávejte při teplotě 2-8 C. Před použitím přineste všechna činidla do pokojové teploty (18-25 C). Okamžitě po použití vraťte všechna činidla do teploty 2-8 C. Nepoužité stripy/destičky vraťte do sáčku a znovu uzavřete. Neodstraňujte vysoušecí prostředek. Po rozředění je možno Pracovní promývací roztok uchovat po dobu 14 dní při teplotě 2-3 C. Všechna činidla by měla být spotřebována do 8 týdnů po rozbalení. Činidla jsou dodávána v dostatečném množství pro provedení 96 testů v maximálně 9 dávkách. 1

2 Komponent Obsah Množství R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R9 R1 Microplate Concentrated Washing Solution (2x) Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Conjugate Sample Treatment Solution Chromogen TMB Solution Stopping solution Mikrodestička: - 96 nádobek (12 stripů po 8 nádobkách) potažených monoklonálními protilátkami proti galaktomananu - Stripy označené 85 Koncentrovaný promývací roztok (2x): - Tlumivý roztok Tris NaCl (ph 7,4) - 2 Tween 2 - Konzervační prostředek:,4 ProClin TM 3 Negativní kontrolní sérum: - Lidské negativní sérum - Negativní na anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv protilátky a HBs Ag - Konzervační prostředek:,3 ProClin TM 3 Mezní kontrolní sérum: - Lidské sérum obsahující galaktomanan - Negativní na anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv protilátky a HBs Ag - Konzervační prostředek:,3 ProClin TM 3 Positivní kontrolní sérum: - Lidské sérum obsahující galaktomanan - Negativní na anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv protilátky a HBs Ag - Konzervační prostředek:,3 ProClin TM 3 Konjugát (připraven k použití): - Anti- galactomannan monoklonální protilátka / označení peroxidáza - Konzervační prostředek:,3 ProClin TM 3 Roztok k ošetření vzorku (připraveno k použití): - Roztok kyseliny EDTA Roztok TMB chromogenu (připraveno k použití): - 3,3,5,5 -tetrametylbenzidin (<,1 ) - H 2 O 2 (<1, ) Zastavovací roztok (připravený k použití): - 1 N roztok kyseliny sírové (H 2 SO 4 ) Poznámka: TMB (3,3,5,5 -tetrametylbenzidin) je nekarcinogenní a nemutagenní chromogen pro peroxidázu. 1 Destička / 12 x 8 stripů 1 x 7 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 1 x 8 ml 1 x 13 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml 6- UPOZORNĚNÍ PRO UŽIVATELE 1. Pro diagnostické použití in vitro. 2. Pouze pro použití odborníky. 3. Používání těchto testovacích sad se vzorky jinými než lidské sérum a tekutina BAL se nedoporučuje. 4. Pozitivní kontrola, mezní kontrola a negativní kontrola se vytváří z lidského séra, které bylo otestováno a u nějž se prokázalo, že není reaktivní na HBsAg a protilátky na HIV-1, HIV-2 a HCV, pomocí testů označených CE. Se všemi činidly by však mělo být nakládáno tak, jako by mohla přenášet infekci. Všechny testy by měly být provedeny v souladu s normou OSHA na krví přenášené patogeny, úroveň biologické bezpečnosti 2, nebo jiným vhodným postupem týkajícím se biologické bezpečnosti. 5. Používejte ochranné oděvy, včetně laboratorního pláště, ochrany očí/obličeje a rukavic na jedno použití (doporučují se syntetické, nelatexové rukavice) a nakládejte se sadami činidel a vzorky pacientů v souladu s vyžadovanými Osvědčenými laboratorními postupy. Po provedení testu si řádně umyjte ruce. 6. Nepipetujte ústy. 7. V místech, kde se pracuje se vzorky nebo sadami činidel, nekuřte, nepijte a nejezte. 8. Zabraňte rozstřikování vzorků nebo roztoků 9. Rozlitá biologická látka neobsahující kyselinu by měla být řádně otřena účinnou dezinfekcí. Dezinfekce, kterou je možno použít, zahrnuje (mimo jiného) roztok 1 bělidla (,5 roztok chlornanu sodného), 7 etanolu nebo,5 Wescodyne Plus. Materiály používané pro otření rozlitých látek mohou vyžadovat likvidaci jako biologicky nebezpečný odpad. UPOZORNĚNÍ: Roztoky obsahující bělidlo nedávejte do autoklávu. 1. Rozlitá látka obsahující kyselinu by měla být řádně absorbována (otřena) nebo neutralizována jedlou sodou a místo by mělo být opláchnuto a dosucha utřeno. Pokud látka obsahovala materiál představující biologické nebezpečí, místo otřete některou z chemických dezinfekcí. 11. Všechny vzorky a materiály použité pro provedení testu likvidujte tak, jako by obsahovaly infekční činidlo. S laboratorním chemickým a biochemickým odpadem musí být nakládáno v souladu se všemi místními, regionálními a národními předpisy. 2

3 12. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese List s bezpečnostními údaji materiálu (MSDS) je k dispozici na vyžádání. 7- OPATŘENÍ PRO UŽIVATELE 1. ZMRAZENÉ VZORKY SÉRA NEBO TEKUTINY BAL SKLADOVANÉ ZA NEZNÁMÝCH PODMÍNEK MOHOU PŘINÉST NESPRÁVNĚ POZITIVNÍ VÝSLEDKY V DŮSLEDKU KONTAMINACE S PLÍSNÍ A/NEBO BAKTERIEMI. 2. Nepoužívejte sady nebo jakákoliv činidla po vypršení doby trvanlivosti. 3. Nemíchejte činidla z jiných sad, která mají jiná čísla šarží, s výjimkou Promývacího roztoku (R2, označení*: 2x zelená barva), chromogen (R9, označení*: TMB tyrkysová barva) a zastavovací roztok (R1, označení*:1n červená barva), pokud tato činidla jsou zcela ekvivalentní a v daném testování se používá stejné číslo šarže. *na etiketě ampule POZNÁMKA: Promývací roztok (R2, označení* zelenou jako 2x) nesmí být míchán s Promývacím roztokem (R2 označení* modrou jako 1X) poskytnutým v rámci sady činitel Bio-Rad. * na etiketě ampule 4. Přineste všechna činidla do pokojové teploty minimálně 3 minut před použitím. 5. Před použitím každé činidlo řádně promíchejte. 6. Koncentrovaný promývací roztok (R2) řádně promíchejte před přípravou Pracovního promývacího Roztoku, přičemž dávejte pozor, abyste zabránili kontaminaci mikroby. 7. Test neprovádějte v přítomnosti reaktivních výparů (kyseliny, zásady, aldehydy) nebo prachu, což by mohlo mít dopad na enzymatickou aktivitu konjugátu. 8. Pro manuální pipetování kontrol a vzorků používejte individuální hroty pipet pro zabránění přenosu vzorků. 9. Pro zajištění odpovídajícího promývání nádobek dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a zajistěte, že všechny nádobky budou zcela naplněny a poté zcela vyprázdněny. Promývání by nemělo být prováděno manuálně. 1. Nedovolte, aby mikrodestička uschla mezi koncem promývacího cyklu a přidáním činidla. 11. Nepoužívejte stejnou nádobu pro konjugát a roztoky substrátu. 12. Nedovolte, aby se konjugát nebo roztok TMB chromogenu dostal do kontaktu s kovem nebo kovovými ionty. 13. Zabraňte vystavení roztoku TMB chromogenu působení ostrého světla při uskladnění nebo inkubaci. Nedovolte, aby se roztok chromogenu dostal do kontaktu s oxidačním činidlem. 14. Zabraňte kontaktu zastavovacího roztoku s oxidačním činidlem. Nedovolte, aby se zastavovací roztok dostal do kontaktu s kovem nebo kovovými ionty. 15. Používejte čisté, bezprašné materiály (zkumavky, hroty, nádoby atd.) za účelem minimalizace možné kontaminace sporami Aspergillus z okolního prostředí. Protože galaktomanan je odolný proti teplu, sterilizace použitého materiálu nezaručuje nepřítomnost kontaminujícího antigenu. Optimální jsou materiály bez pyrogenu, ale při vynaložení odpovídající opatrnosti je možno používat standardní materiály. 16. Omezit vystavení roztoků (séra, tekutiny BAL, roztoku pro ošetření vzorku, konjugátu) nebo otevřených nádob (destiček, zkumavek, pipet) vzduchu. 17. Nenalévejte žádný nepoužitý konjugát zpět do původní nádoby. 18. TMB roztok chromogenu musí být bezbarvý. Modré zabarvení po zředění ukazuje, že činidlo je kontaminováno a nemělo by se používat. Činidlo zlikvidujte a připravte nové. 8- PŘÍPRAVA A USKLADNĚNÍ ČINIDLA Mikrodestička se stripy (R1) Každý rámeček obsahující 12 stripů je zabalen v obalu. Rozstřihněte obal nůžkami hned pod spojem. Obal otevřete a vyjměte rámeček. Rámeček obsahující nepoužité stripy vraťte zpět do původního obalu. Obal pečlivě znovu uzavřete a skladujte při teplotě +2-8 C. Po otevření vakuového obalu jsou pečlivě zabalené stripy uložené v původním obalu při teplotě +2 až +8 C stabilní po dobu 8 týdnů. Zkontrolujte, zda je v obalu stále vysoušecí prostředek. 3

4 Promývací roztok (R2) Připravte pracovní promývací roztok dle potřeby tak, že přidáte jeden díl koncentrovaného promývacího roztoku (R2) k 19 dílům deionizované nebo destilované vody. Pracovní promývací roztok může být skladován po dobu 14 dní při teplotě 2-3 C. Připravte dostatečné množství pracovního promývacího roztoku pro provedení testu (8 ml na jeden proužek: 4 ml R ml destilované vody). Po otevření je koncentrovaný promývací roztok skladovaný při teplotě +2-3 o C, pokud se zabrání kontaminaci, stabilní do data vypršení uvedeného na etiketě. Negativní kontrolní sérum (R3), mezní kontrolní sérum (R4) a pozitivní kontrolní sérum (R5) Kontrolní séra musí být tepelně ošetřena roztokem kyseliny EDTA (R7) stejně jako vzorky pacientů, aby mohla být rovněž používána pro monitorování léčby. Činidla, která jsou po otevření skladována při teplotě +2-8 C, jsou stabilní po dobu 8 týdnů v případě absence kontaminace. Konjugát (R6), Roztok ošetření vzorku (R7), Chromogen: TMB roztok (R9) Tato činidla jsou připravena k použití. Činidla, která jsou po otevření skladována při teplotě +2-8 C, jsou stabilní po dobu 8 týdnů v případě absence kontaminace. Zastavení reakce (R1) Toto činidlo je připraveno k použití. Toto činidlo, které je po otevření skladováno při teplotě +2-8 C, je stabilní do data použitelnosti uvedeného na etiketě, pokud nedojde ke kontaminaci. 9- SBĚR VZORKŮ Tento test se provádí na séru nebo na tekutině BAL. I. SÉRUM Vzorky krve odebírejte v souladu se standardními laboratorními postupy. Vzorky séra nesmí být kontaminované sporami plísní a/nebo baktériemi. Vzorky přepravujte a skladujte v zapečetěných zkumavkách, nevystavené působení vzduchu. Neotevřené vzorky mohou být skladovány při teplotě 2-8 C po dobu až 5 dní před prováděním testů. Po prvním otevření je možno vzorky skladovat při teplotě 2-8 C po dobu 48 hodin před testováním. Pro delší uchování skladujte sérum při teplotě -7 C. Vzorky séra mohou být podrobeny maximálně 4 cyklům zmrazení / rozmrazení. Dříve zmrazené vzorky by měly být po rozmrazení a před testováním důkladně promíchány. Výsledky nejsou ovlivněny vzorky obsahujícími 2 mg/l bilirubinu, lipemickými vzorky obsahujícími ekvivalent 2 g/l trioleinu (triglyceridu) nebo vzorky podrobenými hemolýze obsahujícími 165 mg/l hemoglobinu. Interference týkající se nadbytečného albuminu nebyly testovány. Neprovádějte dekomplementaci séra. II. TEKUTINA BAL Vzorky tekutiny BAL odebírejte v souladu se standardními laboratorními postupy. Vzorky tekutiny BAL musí být odebrány ve sterilním solném roztoku a mohou být testovány na čistých vzorcích (v neupraveném stavu) nebo supernatantu z odstředěných vzorků (1 otáček za minutu po dobu 1 minut) před přikročením k ošetření vzorku podle části 1. Vzorky tekutiny BAL nesmí být kontaminovány sporami plísní a/nebo bakteriemi. Vzorky přepravujte a skladujte v zapečetěných zkumavkách, nevystavené působení vzduchu. Po prvním otevření mohou být vzorky skladovány při teplotě 2-8 o C po dobu až 24 hodin. Pro delší uložení skladujte vzorky BAL zmražené (-2 C nebo nižší) po dobu až 5 měsíců. Vzorky BAL mohou být vystaveny maximálně 4 cyklům zmrazení/rozmrazení. Dříve zmrazené vzorky by měly být po rozmrazení a před testováním důkladně promíchány. 1- POSTUP Poskytnuté materiály Viz část ČINIDLA. Materiály požadované, ale nedodávané 1. Destilovaná nebo deionizovaná voda na ředění Koncentrovaného promývacího roztoku. 2. Absorpční papír. 3. Rukavice na jedno použití. 4. Ochranné brýle. 5. Chlornan sodný (chlorové vápno) a uhličitan sodný. 6. Pipety nebo multipipety, nastavitelné nebo pevné, na odměřování a aplikaci 5 µl, 1 µl, 3 µl a 1 µl. 7. 1,5 ml polypropylenových zkumavek do mikroodstředivky se vzduchotěsnými zátkami, které umožňují ohřev na teplotu 12 C (ohřívací blok) nebo 1 C (vroucí vodní lázeň). - Šroubovací uzávěry a zkumavky: kuželovité zkumavky 1,5 ml, NEBO - Zkumavky se zaklepávacími uzávěry: testovací zkumavky EZ Micro, 1,5 ml, - Zámky víček mikrozkumavek. Tyto zámky bezpečně uzavřou zkumavky se zaklepávacími víčky tím, že zabrání otevření víčka při změnách teploty a tlaku, a rovněž umožní snadné vyndávání zkumavek z ohřívacího bloku nebo vroucí vodní lázně. 8. Odstředivka na laboratorní stůl na polypropylenové zkumavky 1,5 ml schopné pojmout 1 g (Brinkman kat. č nebo VWR Scientific kat. č nebo ekvivalent). 4

5 9. Pokud se pro ošetření séra/tekutiny BAL používá ohřívací blok: - Ohřívací blok. Doporučeny jsou následující modely ohřívacích bloků: - Model s jedním blokem: Grant kat. č. QBD-1L - mimo USA: Grant kat. č. QBD1 distribuuje VWR pod kat. # 46-74) - Model s dvěma bloky: Grant kat. č. QBD-2L mimo USA: Grant kat. č. QBD2 distribuuje VWR pod kat. # 46-76) - Blok pro ohřívací bloky: oba ohřívací bloky (QBD-1L, QBD1 a QBD-2L, QBD2) musí být používány s blokem Grant kat. č. QB-E1 distribuuje mimo USA VWR pod kat. # Pokud se pro ošetření séra/tekutiny BAL používá vroucí vodní lázeň: - Kulatý, plovoucí stojan mikroodstředivky na kádinku 1 l (v USA: VWR Scientific kat. č nebo nebo Nalgene kat. č nebo ekvivalent). - Vroucí vodní lázeň při teplotě 1 C. 1. Vířivé míchadlo. 11. Inkubátor mikrodestičky při teplotě 37 ± 1 C. 12. Poloautomatická nebo automatická promývačka mikrodestiček. 13. Snímač mikrodestičky vybavený filtry 45 nm a 62/63 nm. Komentář k postupu Negativní, pozitivní a mezní kontrolní vzorky musí být testovány při každém kole za účelem validace výsledků testu. Ošetření séra/tekutiny BAL Všechna kontrolní séra: negativní (R3), mezní (R4) a pozitivní (R5) musí být zpracována zároveň se vzorky séra/tekutiny BAL: 1. Pipetou odměřte 3 µl každého testovaného séra/tekutiny BAL a kontroly do jednotlivých polypropylenových zkumavek 1,5 ml. 2. Přidejte 1 µl roztoku pro ošetření vzorku (R7) do každé zkumavky. 3. Zkumavky pečlivě promíchejte důrazným mícháním nebo vířením za účelem řádného promíchání. Zkumavku pevně uzavřete, abyste zabránili jejímu otevření při ohřívání, 4. Možnost s ohřívacím blokem Zkumavky ohřívejte po dobu 6 minut v ohřívacím bloku při teplotě 12 C. Zkumavky musí být do bloku umístěny, teprve až bude dosažena předepsaná teplota (*). NEBO Možnost vodní lázně Pokud používáte lázeň s vroucí vodou: ohřívejte zkumavky po dobu 3 minut při 1 C (*). Zkumavky musí být umístěny ve vodní lázni až když je dosažena předepsaná teplota. 5. Opatrně vyjměte horké zkumavky z ohřívacího bloku nebo z vroucí vodní lázně a umístěte je do odstředivky. Zkumavky odstřeďujte při 1 x g po dobu 1 minut. Supernatant se používá pro detekci antigenu galaktomananu. 6. Otestujte supernatant pomocí následujícího postupu. Po přípravě je možno supernatant vyjmout a uchovávat při teplotě 2-8 C po dobu až 48 hodin před testováním. Pokud analýza výsledků ukazuje, že bude vyžadováno opětovné testování, pro testování musí být ošetřena jiná poměrná část stejného vzorku. (*) Přísné dodržení předepsané teploty a předepsané doby otočení a rovněž používání doporučených materiálů je podstatné pro úspěšnost testu. Nespoléhejte se na teplotu zobrazenou na přístroji, zkontrolujte prosím, že teplota odpovídá specifikacím tak, že použijete kalibrovaný teploměr, který bude vložen ve zkumavce obsahující minerální olej: 12 C musí být dosaženo uvnitř zkumavky v ohřívacím bloku a 1 C ve vroucí vodní lázni. Postup EIA Přísně dodržovat navržený protokol. Dodržovat Osvědčené laboratorní postupy. 1. Přineste všechna činidla do pokojové teploty ( C) minimálně 3 minut před použitím. 2. Připravit Pracovní promývací roztok. 3. Připravte si tabulku pro identifikaci vzorků testovaného séra / tekutiny BAL a kontrol na mikrodestičce. Použijte jednu nádobku na negativní kontrolní sérum (R3), dvě nádobky na mezní kontrolní sérum (R4) a jednu nádobku na pozitivní kontrolní sérum (R5) A R5 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R3 S8 E S1 S9 F S2 S1 G S3 S11 H S4 S12 4. Vyjměte držák destičky a pásy mikronádobek (R1) z obalu destičky. Všechny stripy, které nebudou použity, vraťte do obalu, spolu s vysušovacím prostředkem, a obal znovu uzavřete. 5. Promíchejte obsah lahvičky konjugátu (R6) tím, že lahvičku před použitím obrátíte. Přidejte 5 µl konjugátu (R6) do každé nádobky. Potom přidejte 5 µl ošetřeného séra/supernatantu BAL do každé nádobky, jak je uvedeno výše. Před konjugátem nepřidávejte do nádobek žádné vzorky séra/tekutiny BAL. 5

6 6. Destičku přikryjte uzávěrem destičky nebo jiným prostředkem za účelem zabránění vypařování a zajistěte, že celý povrch bude zakrytý a vodotěsný. 7. Inkubujte mikrodestičku v suchém inkubátoru mikrodestiček po dobu 9 ±5 minut při 37 C (±1 C). 8. Odstraňte uzávěr destičky. Odsajte obsah všech nádobek do odpadní nádoby (s obsahem chlornanu sodného). Destičku promyjte 5 krát pomocí promývačky mikrodestiček (pomocí 8 µl pracovního promývacího roztoku). Po posledním promytí obraťte mikrodestičku a jemně poklepejte na absorpční papír za účelem odstranění zbývající tekutiny. 9. Rychle přidejte 2 µl roztoku TMB chromogenu (R9) do každé nádobky a zabraňte vystavení jasnému světlu. 1. Inkubujte mikrodestičku ve tmě při pokojové teplotě ( C) po dobu 3 ± 5minut. Při tomto kroku inkubace nepoužívejte přilnavou folii. 11. Přidejte 1 µl zastavovacího roztoku (R1) do každé nádobky s využitím stejného pořadí pro přidání roztoku TMB chromogenu. Dobře promíchejte. 12. Řádně otřete spodní část každé destičky. 13. Přečtěte údaj o optické denzitě každé nádobky při 45 nm (referenční filtr 62/63 nm). Mikrodestičky musí být přečteny do 3 minut od přidání zastavovacího roztoku. 11- KONTROLA JAKOSTI (KRITÉRIA PLATNOSTI) Mezní kontrola: OD každého séra mezní kontroly musí být,3 a,8. Pozitivní kontrola: Index pozitivního kontrolního séra musí být vyšší než 1,5. OD Pozitivní kontrola (R5) I = > 1,5 Střední OD mezní hodnoty Negativní kontrola: Index negativního kontrolního séra musí být nižší než,4. OD Negativní kontrola (R3) I = <,4 Střední OD mezní hodnoty Neschopnost kterékoliv kontroly splnit výše popsaná kritéria platnosti způsobuje, že test je neplatný a výsledky vzorku pacienta by neměly být oznámeny. Operátor se může rozhodnout opakovat test po zhodnocení postupu nebo může kontaktovat výrobce a požadovat pomoc. Pokud je proveden opakovaný test, potom při opakovaném testu by měla být použita nová poměrná část stejného vzorku. Příklad výpočtu: vzorek Absorbance (OD) Negativní kontrola (R3) OD,116 Mezní kontrola (R4) OD,513,533 Pozitivní kontrola (R5) OD 1,834 Výpočty Střední hodnota mezní kontroly Pro výpočet střední OD mezní hodnoty (R4) sečtěte hodnoty OD pro každou opakovanou kontrolu a vydělte výsledek 2: (,513 +,533) 2 =,523 Index negativní kontroly Pro výpočet indexu negativní kontroly vydělte OD negativní kontroly střední hodnotou mezní kontroly:,116 I = =,22,523 Index pozitivní kontroly Pro výpočet indexu pozitivní kontroly vydělte OD pozitivní kontroly střední hodnotou mezníkontroly: 1,834 I = = 3,51,523 Platnost Ve výše uvedeném příkladu: OD každé mezní kontroly je,3 a,8, což udává, že mezní kontrola je platná. Index negativní kontroly je <,4, což udává, že negativní kontrola je platná. Index pozitivní kontroly je > 1,5, což udává, že pozitivní kontrola je platná. Test uvedený v tomto příkladu je považován za platný, protože výsledky splňují kritéria platnosti pro každou kontrolu. 12- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Přítomnost nebo nepřítomnost antigenu galaktomananu v testovaném vzorku je určena výpočtem indexu pro každý vzorek pacienta. Index (I) je hodnota OD vzorku vydělená střední optickou hustotou nádobek obsahujících sérum mezní kontroly. 6

7 Výpočet střední optické denzity mezní kontroly: Sečtěte optickou hustotu dvou nádobek obsahujících sérum mezní kontroly (R4) a součet vydělte 2. Výpočet indexu (I) pro každý zkušební vzorek: Vypočítat následující poměr pro každý zkušební vzorek: OD vzorku I = Střední OD mezní hodnoty Interpretace séra/tekutiny BAL s indexem <,5: Sérum / tekutina BAL s indexem <,5 se považuje za negativní na antigen galaktomanan. Poznámka: Negativní výsledek může ukazovat, že výsledek pacienta je pod zjistitelnou úrovní testu. Negativní výsledky nevylučují diagnózu invazivní aspergilózy. Doporučuje se opakovat test, pokud je výsledek negativní, ale existuje podezření na chorobu. Interpretace séra/tekutiny BAL s indexem,5 Sérum / tekutina BAL s indexem,5 se považuje za pozitivní na antigen galaktomanan. Pro všechny pozitivní pacienty se doporučuje, aby nová poměrná část stejného vzorku (sérum) byla zopakována. Poznámka: Hodnota absorbance nižší než,5 může ukazovat procedurální chybu nebo chybu přístroje, která by měla být zhodnocena. Tento výsledek je neplatný a vzorek musí být opakován. Doporučuje se pravidelná kontrola (dvakrát týdně) séra vzorků pacientů s vysokým rizikem za účelem zvýšení senzitivity a včasné pozitivity každého testu. Poznámka: Platelia Aspergillus Ag je určen k použití jako pomoc při diagnóze invazivní aspergilózy. Pozitivní výsledky získané pomocí Platelia Aspergillus Ag by měly být posuzovány ve spojení s dalšími diagnostickými postupy, jako např. mikrobiologická kultura, histologické vyšetření vzorků biopsie a radiografické důkazy. Příklad výpočtu: vzorek Absorbance (OD) Negativní kontrola (R3) OD,116 Mezní kontrola (R4) OD,513,533 Pozitivní kontrola (R5) OD 1,834 Vzorek pacienta č. 1,134 Vzorek pacienta č. 2,436 Vzorek pacienta č. 3 1,196 Výpočty Viz část týkající se Kontroly jakosti (Kritéria platnosti) pro příklad výpočtů pro stanovení platnosti kontroly rozboru. Střední hodnota mezní kontroly Pro výpočet střední OD mezní hodnoty (R4) sečtěte hodnoty OD pro každou opakovanou kontrolu a vydělte výsledek 2: (,513 +,533) 2 =,523 Vzorek pacienta č. 1 Pro výpočet indexu vzorku pacienta č. 1 podělte ID vzorku pacienta č. 1 středním OD mezního kontroly:,134 I = =,26,523 V tomto příkladu je vzorek pacienta č. 1 negativní, protože index,26 je <,5. Vzorek pacienta č. 2 Pro výpočet indexu vzorku pacienta č. 2 podělte ID vzorku pacienta č. 2 středním OD mezního kontroly:,436 I = =,83,523 V tomto příkladu je vzorek pacienta č. 2 pozitivní, protože index.83 je,5. Vzorek pacienta č. 3 Pro výpočet indexu vzorku pacienta č. 3 podělte ID vzorku pacienta č. 3 středním OD mezního kontroly: 1,196 I = = 2,29,523 V tomto příkladu je vzorek pacienta č. 3 pozitivní, protože index 2.29 je,5. Viz prosím Interpretace pozitivních výsledků v části 12. 7

8 13-OMEZENÍ POSTUPU 1. Negativní test ze vzorků séra a/nebo BAL nemůže vyloučit diagnózu invazivní aspergilózy. Vzorky séra od pacientů s rizikem invazivní aspergilózy by měly být testovány dvakrát týdně. 2. Postup Platelia Aspergillus Ag a interpretace výsledků musí být dodržovány při testování vzorků na přítomnost antigenu galaktomananu. Uživateli sady se doporučuje pečlivě prostudovat příbalový leták před provedením testu. Postup testu musí být obzvláště pečlivě dodržován při pipetování vzorku a činidla, umývání destiček a načasování kroků inkubace. 3. Nepřidání vzorku nebo činidla dle pokynů v tomto postupu by mohlo mít za následek chybně negativní test. Opakované testování dodatečných vzorků by mělo být zváženo v případě, že existuje klinické podezření na invazivní aspergilózu nebo procedurální chybu. 4. Kontaminace nádobek s negativním vzorkem pacienta nádobami s pozitivním kontrolním vzorkem / vzorkem pacienta je možná, pokud se obsah jedné nádobky rozlije na jinou nádobku v důsledku neopatrného zacházení s mikrodestičkou nebo v důsledku špatné techniky pipetování při přidávání činidel. 5. Výkonnost testu Platelia Aspergillus Ag nebyl hodnocen u neonatálních vzorků. V evropské literatuře se uvádí vyšší výskyt počtu nesprávně pozitivních výsledků na galaktomanan u vzorků z neonatální populace 13, 15, 33, Test Platelia Aspergillus Ag může vykazovat sníženou schopnost detekce galaktomananu u pacientů s chronickou granulomatózní chorobou (CGD) a Jobovým syndromem 56, Současné užívání protiplísňové terapie účinné na plíseň může mít za následek u některých pacientů s invazivní aspergilózou sníženou senzitivitu u testu Platelia Aspergillus Ag Test Platelia Aspergillus Ag nebyl hodnocen pro použití plasmy nebo jiných typů vzorků, jako např. moč nebo CSF. 9. Výkonnost testu Platelia Aspergillus Ag nebyla stanovena pro manuální odečítání a/nebo vizuální stanovení výsledků. 1. Další rody plísní, jako např. Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum a Histoplasma, projevily reaktivitu s krysími monoklonálními protilátkami EBA-2 používaných v tomto testu pro detekci galaktomananu Aspergillus. Histoplazmóza by měla být zvažována v endemických oblastech, včetně částí Spojených států amerických 35, 49, Zkřížená reaktivita vzorků tekutiny BAL s Mycoplasma pneumoniae nebo anestetických léků/lubrikantů používaných pro znecitlivění oblasti krku/hrdla pro proces odsávání nebyla posouzena. 12. Pozitivní reakce bez klinických známek: Následující informace by měly být brány do úvahy s ohledem na včasnou detekci antigenu galaktomananu v séru nebo BAL před tím, než se objeví klinické a/nebo radiologické známky. Pozitivní výsledky testu bez klinických známek jsou obvykle pozorovány a ukázalo se, že odpovídají skutečně pozitivním testům u pacientů, pro něž je později stanovena diagnóza prokázané nebo pravděpodobné invazivní aspergilózy. V některých konkrétních případech by však při interpretaci testu měly být zváženy specifické faktory: a. Byly zjištěny pozitivní výsledky testů bez klinických známek, zejména u malých dětí 43. Ačkoliv některé z těchto případů by mohly být připisovány skutečné cirkulaci antigenů Aspergillus, většina případů může být považována za chybnou pozitivitu 7. b. Galaktofuranóza byla prokázána u různých potravin, zejména obilnin, cereálních produktů a krémových zákusků 1, 27. Na rozdíl od lidského mléka, kravské mléko často obsahuje vysokou koncentraci galaktomananu 13. Dietetické faktory musí být tudíž brány do úvahy při interpretaci průběhu antigenémie u malých dětí a obecněji u všech pacientů se změnou střevní bariéry 6, 13. Jakýkoli případ pozitivní antigenémie, který není doprovázen klinickými známkami, by měl být u této populace pacientů interpretován s ještě větší opatrností. c. Objevily se zprávy o pozitivních výsledcích testů u pacientů léčených piperacilinem / tazobaktamem. Dále se rovněž objevily zprávy o určitých skupinách nebo šaržích piperacilinu / tazobaktamu, u nichž byla zjištěna pozitivita na antigen galaktomananu. Proto pozitivní výsledky testu u pacientů, kteří užívají piperacilin / tazobaktam, by měly být interpretovány s opatrností a potvrzeny pomocí dalších diagnostických metod. Detekce galaktomananu byla rovněž uváděna u některých šarží amoxicilinu v souvislosti s mimostřevními prostředky klavulanové kyseliny. Proto při interpretaci testu je nutno brát do úvahy léčbu polosyntetickým ß-laktamem 1, 3, 31. Nicméně, protože Platelia AspergillusAg dokáže dobře detekovat antigen galaktomananu před tím, než se objeví klinické nebo radiologické známky, výskyt invazivní aspergilózy není možno vyloučit. Proto pacienti léčení piperacinem/tazobaktamem s pozitivními výsledky testu by měli být pečlivě sledováni. d. Pozitivní reakce s absencí klinických známek může být pozorována u pacientů, kteří dostávají produkty obsahující galaktomanan, ať už mimostřevně nebo orálně (při existenci změny střevní bariéry). Přítomnost galaktomananu v těchto produktech může být často vysvětlena využitím procesu fermentace založeného na plísňových mikroorganismech. U pacienta však nebude pozorován pozitivní výsledek, pokud koncentrace séra exogenního galaktomanu dosahuje nebo přesahuje prahovou hodnotu detekce testu. Proto pokud se objeví podezřelý pozitivní výsledek v případě absence klinických známek, doporučujeme prošetřit produkt, který pacient bere, a zejména jeho výrobní proces a původ použitých surovin 14, 4, Pozitivní reakce na galaktomanan v séru a tekutině bronchoalveolární laváže spojené s PLASMA-LYTE byly pozorovány v několika studiích 14, 4. Proto jakákoliv aplikace PLASMA-LYTE by měla být brána do úvahy při interpretaci tohoto testu. 14. Výsledky Platelia Aspergillus Ag na vzorcích tekutiny bronchoalveolární laváže (BAL) fluid od pacientů s nenarušenou imunitou by měly být interpretovány s opatrností. 36 8

9 15. Výsledky blížící se mezní hodnotě indexu (,5) by měly být interpretovány s opatrností a měly by být podpořeny jiným klinickým, radiologickým nebo laboratorním důkazem invazivní aspergilózy, protože do výsledku interpretace testu není zahrnuta žádná šedá zóna. 16. Navíc výsledky Platelia Aspergillus EIA na vzorcích tekutiny bronchoalveolární laváže (BAL) s indexem mezi,5-1, mají nižší prediktivní hodnotu než výsledky na vzorcích BAL s hodnotou indexu > 1,, proto výsledky s indexem v rozmezí,5-1, by měly být přehodnoceny a podpořeny jiným klinickým, radiologickým nebo laboratorním důkazem invazivní aspergilózy. 14-PŘEDPOKLÁDANÉ HODNOTY I. SÉRUM Předpokládaná prevalence invazivní aspergilózy se liší podle populace pacientů; uvádí se rozpětí 5 až 2 1, 16. Následující výsledky byly získány z klinických studií provedených na pediatrických (věk 21 let) pacientech ve Spojených státech amerických a na dospělých pacientech v Severní Americe. A-Pediatrie Klinická studie byla provedena na celkovém počtu 1954 vzorků séra od 129 pediatrických pacientech s oslabenou imunitou (věk 21 let) s vysokým rizikem invazivní aspergilózy (IA) a pacientech diagnostikovaných s prokázanou a pravděpodobnou invazivní aspergilózou ve třech zkušebních centrech ve Spojených státech amerických za účelem stanovení výkonnostních vlastností Platelia Aspergillus Ag. Rozložení indexových hodnot pro tuto populaci je uvedeno v následujících tabulkách: Pediatričtí pacienti diagnostikovaní bez invazivní aspergilózy (kontrolní populace) Celkem 1625* pediatrických vzorků séra obdržených od 18 pediatrických pacientů s oslabenou imunitou ve třech testovacích centrech ve Spojených státech amerických bylo otestováno za účelem stanovení výkonnostních vlastností Platelia Aspergillus Ag. Rozložení indexových hodnot vzorků je uvedeno v následující tabulce: Obrázek 1 Number Počet of sér Sera Rozložení Distribution hodnoty of the indexu Serum séra Index z Value kontrolní from the populace Pediatric pediatrických Control Population pacientů (N=1625) Index >1.5 *Poznámka: 8 vzorků od 4 kontrolních pacientů s pozitivními výsledky na antigen galaktomananu v souběhu s terapií piperacilinu/tazobaktamu (Zosyn ) bylo vyloučeno. 9

10 Pediatričtí pacienti diagnostikovaní s invazivní aspergilózou Bodový diagram zobrazuje výsledky testu na galaktomanan pro 249 vzorků séra od 17 pacientů v této studii diagnostikovaných s prokázanou nebo pravděpodobnou invazivní aspergilózou, jak je definována v definicích EORTC/NIAID. Nepředpokládá se, že každé sérum od každého pacienta bude pozitivní. Předpokládaná prevalence invazivní aspergilózy se liší podle populace pacientů; uvádí se rozpětí 5 až 2 1, 24. Hodnota prevalence v této studii byla 13,6. Obrázek 2 Index Pediatrický pacient Proven/ s Probable prokázanou/pravděpodobnou Aspergillosis: Distribution aspergilózou of Rozložení Index/ indexu Pediatric Pediatrický Patient (N=17) pacient (N=17) > Patient Č. pacienta Number B. Dospělí Klinická studie byla provedena na celkovém počtu 1724 vzorků séra od 172 pacientů po transplantaci kostní dřeně (BMT) a s leukémií diagnostikovaných s invazivní aspergilózou a bez invazivní aspergilózy ve třech zkušebních centrech v Severní Americe za účelem určení výkonnostních vlastností Platelia Aspergillus Ag. Distribuce indexových hodnot pro tuto populaci je uvedena v následujících tabulkách. Dospělí pacienti diagnostikovaní bez invazivní aspergilózy (kontrolní populace) Celkový počet 1262 vzorků séra získaných od 143 pacientů po transplantaci kostní dřeně (BMT) a s leukémií ve třech testovacích centrech v Severní Americe bylo testováno s použitím testu Platelia Aspergillus Ag. Distribuce indexových hodnot je zobrazena v následující tabulce. Obrázek 3 Number Počet sér of Sera Rozložení Distribution hodnoty of indexu the Serum séra Index z kontrolní Value from populace the dospělých Adult Control pacientů Population (N=1262) (N=1262) Index >1.5 1

11 Dospělé pacienti diagnostikovaní s invazivní aspergilózou Bodový diagram zobrazuje výsledky testu na galaktomanan pro 462 vzorků séra od 29 pacientů v této studii diagnostikovaných s prokázanou nebo pravděpodobnou invazivní aspergilózou, jak je definována v definicích EORTC/NIAID. Nepředpokládá se, že každé sérum od každého pacienta bude pozitivní. Předpokládaná prevalence invazivní aspergilózy se liší podle populace pacientů; uvádí se rozpětí 5 až 2 1, 24. Hodnota prevalence pro tuto studii byla 16,9. Obrázek 4 Index > Adult Dospělý Proven/ pacient Probable s prokázanou/pravděpodobnou Aspergillosis: Distribution aspergilózou of Rozložení Index/ Adult indexu Patient Dospělý (N=29) pacient (N=29) Patient Č. pacienta Number Následující grafy představují příklady pacienta bez klinických známek nebo příznaků invazivní aspergilózy (negativní na Aspergillus) a pacienta s prokázanou nebo pravděpodobnou invazivní aspergilózou (pozitivní na Aspergillus) v uvedeném pořadí. Obrázek 5 Negativní pacient Index CONTROL PATIENT Kontrolní pacient Days Dní 11

12 Obrázek 6 Pozitivní pacient Index PROVEN Prokázaný INVASIVE pacient ASPERGILLOSIS s invazivní aspergilózou PATIENT Days Dní II. TEKUTINA BAL Byly provedeny dvě studie na celkovém počtu 449 vzorků BAL od 178 příjemců transplantátů pevných orgánů (SOT) a transplantátů plic s invazivní aspergilózou a bez invazivní aspergilózy ve Spojených státech amerických za účelem stanovení výkonnostních vlastností sady Platelia Aspergillus Ag s vzorky tekutiny bronchoalveolární laváže. Z tohoto množství bylo 43 vzorků BAL od 167 příjemců transplantátů pevných orgánů a transplantátů plic bez invazivní aspergilózy. Níže uvedená tabulka zobrazuje distribuci indexových hodnot pro celkový počet 43 vzorků BAL od 167 pacientů z kontrolní populace. Předpokládané hodnoty u vzorků BAL od kombinovaných příjemců transplantátů pevných orgánů a transplantátů plic bez invazivní aspergilózy jsou prezentovány v níže uvedené tabulce. Výsledky jsou prezentovány podle vzorků od příjemců transplantátů s kolonizací plísní a bez kolonizace plísní. Tabulka 1 Předpokládané hodnoty podle vzorku Kombinovaní příjemci transplantátů pevných orgánů a transplantátů plic bez invazivní aspergilózy N= 43 tekutina BAL Diagnóza N Positivní () Negativní () Kontroly bez kolonizace /341 (3,2 ) 33/341 (96,8 ) Kontroly s kolonizací 62 12/62 (19,4 ) 5/62 (8,6 ) Kontrola celkem 43 23/43 (5,7 ) 38/43 (94,3 ) Předpokládané hodnoty u vzorků BAL od kombinovaných příjemců transplantátů pevných orgánů a transplantátů plic bez invazivní aspergilózy jsou prezentovány podle typu transplantátu v níže uvedené tabulce. Tabulka 2 Předpokládané hodnoty podle vzorku Kombinovaní příjemci transplantátů pevných orgánů a transplantátů plic bez invazivní aspergilózy podle typu transplantátu N= 43 tekutina BAL Typ transplantátu N Positivní () Negativní () Srdce 28 3/28 (1,7 ) 25/28 (89,3 ) Ledviny 25 3/25 (12, ) 22/25 (88, ) Játra 23 1/23 (4,3 ) 22/23 (95,7 ) Plíce /327 (4,9 ) 311/327 (95,1 ) Kontrola celkem 43 23/43 (5,7 ) 38/43 (94,3 ) 12

13 15- SPECIFICKÉ VÝKONNOSTNÍ VLASTNOSTI A- REPRODUKOVATELNOST a) Studie reprodukovatelnosti v séru Variability interassay a intraassay pro test Platelia Aspergillus Ag byla stanovena v rámci studie využívající panel 6 shromážděných vzorků séra pacientů (jeden negativní, jeden mírně pozitivní, dva pozitivní a dva vysoce pozitivní) získané na třech místech klinických testů v Severní Americe. Každý z 6 členů panelu byl testován trojnásobně (x3) v 3 různých dnech, v jedné dávce, na druhém místě (celkový počet replikátů na každém místě = 9). Každý z 6 členů panelu byl testován duplicitně (x2) v 3 různých dnech, v 1 dávce, na třetím místě (celkový počet replikátů na třetím místě = 6). Jeden (1) operátor provedl všechny testy přesnosti na každém místě. Údaje byly analyzovány v souladu s Institutem klinických laboratorních norem (CLSI) (dříve Národní komise pro klinické laboratorní normy (NCCLS)). Střední optická hustota (OD) a střední hodnota indexu, standardní odchylka (SD), procentní koeficient změny (CV), v rámci přesnosti testu (intraassay) a v rámci přesnosti místa (inter-assay) pro každého člena panelu na každém místě jsou ilustrovány níže v následujících tabulkách. Tabulka 4 Pracoviště 1 Člen panelu Neg Nízká poz. Poz. č. 1 Poz. č. 2 Silně poz. č. 1 Silně č. 2 Negativní kontrola Kontrola CO Pozitivní kontrola OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index N Průměr,52,9,445,74,72 1,17,931 1,563 1,227 2,6 2,887 4,83,46,8,66 1, 2,216 3,67 V rámci testu (intraassay) SD,2,,22,3,59,9,44,8,51,9,89,17,2,3 VK Celkem (intraassay) 2 SD 4,8 4,4 8,4 7,6 4,7 5,1 4,2 4,4 3,1 3,6 3,7 3,4,36,4,51,8,7,14,44,25,58,29,169,58,12,3,317,12 VK Pracoviště 2 11,5 1,4 1, 11,6 4,7 15,7 4,7 14,3 5,9 11,9 16,9 2,8 14,3 3,3 Člen panelu Neg Nízká poz. Poz. č. 1 Poz. č. 2 Silně poz. č. 1 Silně č. 2 Negativní kontrola Kontrola CO Pozitivní kontrola OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index N Průměr,4,1,28,7,364,89,62 1,49,81 2,1 1,361 3,43,74,18,415 1, 1,197 2,97 V rámci testu (intraassay) SD,6,1,41,9,23,7,45,11,46,1,47,11,,1 VK Celkem (intraassay) 2 SD 14,5 13, 6,4 7,6 7,5 7,1 5,7 4,8 3,5 3,2 1,1 1,1,6,3,58,19,83,18,57,28,42,53,79 1,,94,1,68,54 VK Pracoviště 3 2,8 27, 22,7 19,8 9,5 18,7 5,3 26,5 5,8 29,2 22,7,9 5,7 18,2 Člen panelu Neg Nízká poz. Poz. č. 1 Poz. č. 2 Silně poz. č. 1 Silně č. 2 Negativní kontrola Kontrola CO Pozitivní kontrola OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index N Průměr,49,1,388,81,652 1,36,83 1,73 1,158 2,41 2,378 4,96,59,12,48 1, 1,652 3,45 V rámci testu (intraassay) SD,3,1,9,2,82,17,68,14,94,2,126,25,28,6 VK Celkem (intraassay) 2 SD 2,4 2,4 12,5 12,2 8,2 8,2 8,1 8,2 5,3 5,1 5,8 5,8,12,3,78,13,68,15,14,25,82,15,111,34,28,4,56,23 VK 2, 15,8 1,5 11,1 N/A = 1 NCCLS EP5-A, svazek 19, č. 2, str. 24, rovnice (C2) 12,5 14,3 2 NCCLS EP5-A, svazek 19, č. 2, str. 25, rovnice (C3) a rovnice (C4) 7,1 6,2 4,7 6,8 5,8 4,1 3,4 6,6 13

14 b) Reprodukovatelnost v tekutině BAL Variabilita Interassay a Intraassay pro test Platelia Aspergillus Ag byla stanovena v rámci studie využívající panel 4 shromážděných vzorků BAL pacientů s přídavkem čistého galktomananu (jeden negativní, jeden vysoce negativní, jeden nízce pozitivní a jeden středně pozitivní) na 3 testovacích místech (dvě místa klinického testování v USA a jedno interní místo). Každý z těchto 4 členů panelu a kontroly byly otestovány duplicitně (x2) ve 2 testech denně v 5 různých dnech v jedné dávce (Celkový počet výsledků na jedno místo = 12). Dva (2) pracovníci provedli veškeré testování přesnosti na každém místě. Údaje byly analyzovány v souladu s Institutem klinických laboratorních norem (CLSI) (dříve Národní komise pro klinické laboratorní normy (NCCLS)). Střední optická denzita (OD) a střední hodnota indexu, standardní odchylka (SO), procentní variační koeficient (VK), v rámci přesnosti testu (intraassay) a v rámci přesnosti místa (interassay) pro každého člena panelu jsou ilustrovány níže v následující tabulce: Tabulka 5 Shrnutí kombinovaných míst Vysoká Nízká Středná Pozitivní Negativní Negativní kontrola negativní pozitivní pozitivní kontrola Shrnutí N= 6 N=6 N=6 N=6 N=6 N=6 OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index Průměr,121,29,214,5,375,88,575 1,35 1,58 3,72,47,11 V rámci testu (Intra Assay) Celkem (Inter Assay) SO,37,13,35,78,29,67,111,265 VK 7,4 2,5 9,3 8,9 5, 5, 7, 7,1 SO,42,95,61,122,7,138,19,438 VK 19,6 18,9 16,2 13,9 12,2 1,2 12, 11,8 B- ZKŘÍŽENÁ REAKTIVITA Studie za účelem posouzení účinku potenciálně ovlivňujícího onemocnění nesouvisejícího s invazivní aspergilózou byla provedena s jednou dávkou sady Platelia Aspergillus Ag. Následující vzorky séra byly testovány s ohledem na zkříženou reaktivitu pomocí Platelia Aspergillus Ag. Bylo testováno celkem 151 vzorků séra. Tabulka 6 Patologie # Testované vzorky # Pozitivní Revmatoidní faktor 1 Pozitivní ANA 1 IgG hypergammaglobulínemie 1 IgM hypergammaglobulínemie 1 Rakovina* 11 Nevirová cirhóza (primárně žlučová; vyvolaná alkoholem; vyvolaná drogami) 1 Vícečetné transfúze 1 Vícerodičky 1 HAV 1 HCV 1 Zarděnky 1 CMV 1 Syfilis (RPR+) 1 Toxoplazmóza 1 Mykoplazmóza 1 * Po jednom z močového měchýře, prsu (2), konečníku, děložní sliznice, plic, prostaty, ledvin a epitelu (3). C- Klinické testy KLINICKÉ STUDIE V SEVERNÍ AMERICE I. VZORKY SÉRA Klinické testování za účelem hodnocení senzitivity, specifičnosti a prediktivní hodnoty Platelia Aspergillus Ag bylo provedeno na pediatrických pacientech (věk 21 let) na třech místech nacházejících se ve Spojených státech amerických a na dospělých pacientech na třech místech nacházejících se ve Spojených státech amerických. Studie byly provedeny s využitím celkového množství 1954 vzorků séra získaných od 129 pediatrických pacientů a celkového množství 1724 vzorků séra získaných od 172 dospělých pacientů z následující populace*: Pacienti bez známek invazivní aspergilózy (kontrolní pacienti) Pacienti s pravděpodobnou invazivní aspergilózou 14

15 Pacienti s prokázanou invazivní aspergilózou * Skupina pro spolupráci v oblasti invazivních plísňových infekcí (IFICG) Evropské organizace pro výzkum a léčbu rakoviny (EORTC) a Skupina pro výzkum mykózy (MSG) Národního institutu pro alergie a infekční choroby (NIAID) definovaly v roce 22 kritéria pro diagnózu invazivní aspergilózy (IA) u pacientů s hematologickým zhoubným nálezem nebo s transplantací hematologických kmenových buněk. 2,39 SENSITIVITA A. Pediatrie Výsledky z této studie byly analyzovány s ohledem na senzitivitu pacientů. Testování senzitivity bylo provedeno pomocí Platelia Aspergillus Ag na třech místech dohromady na celkovém počtu 17 pediatrických pacientů s narušenou imunitou s prokázanou nebo pravděpodobnou invazivní aspergilózou. Tabulka7 Diagnóza Počet pacientů Senzitivita 95 interval spolehlivosti Prokázaná aspergilóza 9 44,4 (4/9) 18,9-73,3 Pravděpodobná aspergilóza 8 62,5 (5/8) 3,6-86,3 Kombinovaná prokázaná a 17* 52,9 (9/17) 31,-73,8 pravděpodobná aspergilóza * Poznámka: 8 ze 17 pacientů mělo negativní výsledky na Aspergillus antigen galaktomananu. Všech 8 pacientů s negativními výsledky na Aspergillus antigen galaktomananu bylo léčeno terapií s vícečetnými protiplísňovými prostředky. Průvodní použití protiplísňové terapie účinné na plíseň u některých pacientů s invazivní aspergilózou může mít za výsledek sníženou senzitivitu 3. B. Dospělí Testování senzitivity bylo provedeno pomocí Platelia Aspergillus Ag na třech místech dohromady na celkovém počtu 29 dospělých pacientů s transplantovanou kostní dření (BMT) a leukémií diagnostikovaných s prokázanou a pravděpodobnou invazivní aspergilózou. Tabulka 8 SPECIFIČNOST A. Pediatrie Specifičnost podle pediatrických pacientů Testování specifičnosti bylo provedeno pomocí Platelia Aspergilllus Ag na třech místech dohromady na celkem 18* vzorcích od pacientů s narušenou imunitou bez známek invazivní aspergilózy (kontrolní pacienti). Tabulka 9 Diagnóza Počet pacientů Senzitivita 95 interval spolehlivosti Prokázaná aspergilóza 11 81,8 (9/11) 52,3-94,9 Pravděpodobná aspergilóza 18 77,8 (14/18) 54,8-91, Kombinovaná prokázaná a pravděpodobná Aspergilóza 29 79,3 (23/29) 61,6-9,2 Místo Počet pacientů Specificita 95 interval spolehlivosti ,4 (38/44) 73,3-93, ,4 (51/59) 75,5-93, (5/5) 56,6-1 Kombinovaná místa 18 87, (94/18) 79,4-92,1 * Poznámka: 4 pacienti s pozitivními výsledky na antigen galaktomananu v souběhu s terapií piperacilinu / tazobaktamu byli vyloučeni. Specifičnost podle pediatrických vzorků Testování specifičnosti bylo provedeno pomocí Platelia Aspergilllus Ag na třech místech dohromady na celkem 1625* vzorcích získaných od 18 pediatrických pacientů s narušenou imunitou bez známek invazivní aspergilózy (kontrolní pacienti). 15

16 Tabulka 1 Místo Počet vzorků Specificita 95 interval spolehlivosti ,9 (785/794) 97,9-99, ,8 (715/731) 96,5-98, (1/1) 96,3-1 Kombinovaná místa ,5 (16/1625) 97,7-99, * Poznámka: 8 vzorků 4 pacienti s pozitivními výsledky na antigen galaktomananu v souběhu s terapií piperacilinu / tazobaktamu byli vyloučeni. B. Dospělí Specifičnost podle dospělých pacientů Testování specifičnosti bylo provedeno pomocí Platelia Aspergillus Ag na třech místech dohromady na celkem 143 dospělých pacientech s transplantovanou kostní dření (BMT) a leukémií bez známek invazivní aspergilózou (kontrolní pacienti). Tabulka 11 Místo Počet pacientů Specificita 95 interval spolehlivosti ,6 (22/28) 6,5-89, ,4 (71/77) 84,-96, ,5 (34/38) 75,9-95,8 Kombinovaná místa ,8 (127/143) 82,6-93, Specifičnost podle dospělých vzorků Testování specifičnosti bylo provedeno pomocí Platelia Aspergillus Ag na třech místech dohromady na celkem 1262 vzorcích získaných od 143 dospělých pacientech s transplantovanou kostní dření (BMT) a leukémií bez známek invazivní aspergilózou (kontrolní pacienti). Tabulka 12 Místo Počet vzorků Specificita 95 interval spolehlivosti , (342/349) 95,9-99, ,6 (552/56) 97,2-99, ,9 (349/353) 97,1-99,6 Kombinovaná místa ,5 (1243/1262) 97,7-99, PREDIKTIVNÍ HODNOTA Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty byly analyzovány pro populaci pacientů v této studii. Na základě skutečného průměru míry prevalence 13,6 v pediatrii a míry prevalence 16,9 u dospělých zjištěného v této studii byly pozitivní a negativní prediktivní hodnoty vypočteny následovně: A. Pediatrie Prevalence studie 13,6 PPV: 39,1 95 interval spolehlivosti: 22,2-59,2 NPV: 92,2 95 interval spolehlivosti: 85,3-96, B. Dospělí Prevalence studie 16,9 PPV: 59, 95 interval spolehlivosti: 43,4-72,9 NPV: 95,5 95 interval spolehlivosti: 9,5-97,9 Předpokládaná prevalence invazivní aspergilózy se liší podle populace pacientů; uvádí se rozpětí 5 až 2 1, 24. Pro populaci pacientů na spodní hranici zveřejněné prevalence byla pozitivní a negativní prevalence přepočtena pomocí míry prevalence 5. A. Pediatrie Kalkulovaná prevalence 5 PPV: 17,6 95 interval spolehlivosti: 6,5-39,8 NPV: 97,2 95 interval spolehlivosti: 92,1-99,1 16