1 destička Kvalitativní detekce IgM protilátek proti borrelia burgdorferi sensu lato v lidském séru nebo plazmě enzymovou imunoanalýzou

Transkript

1 PLATELIA LYME IgM 1 destička Kvalitativní detekce IgM protilátek proti borrelia burgdorferi sensu lato v lidském séru nebo plazmě enzymovou imunoanalýzou /11 1. POUŽITÍ Platelia Lyme IgM je imunoanalýza využívající formát imuno záchytu pro kvalitativní detekci IgM protilátek proti Borrelia burgdorferi sensu lato v lidském séru nebo plazmě. 2. KLINICKÝ VÝZNAM Lymská borelióza (nebo Lymská nemoc) je nekontagiózní infekce způsobená baktériemi skupiny spirochet, Borrelia burgdorferi, které se přenášejí kousnutím klíšťat Ixodes genus (2). Různá zvířata slouží jako hostitelé těchto baktérií a k přenosu na lidi dochází kousnutím infikovaným klíštětem. Riziko přenosu je vyšší při delším kousnutí klíštětem. Prevalence Lymské nemoci je vysoká v zemích s teplým nebo chladným podnebím na severní polokouli, od Číny až po Severní Ameriku a od Skandinávie po Severní Afriku. Odhaduje se, že se ve Spojených státech (3) každý rok vyskytne zhruba případů a přibližně více než případů v Evropě, kde existuje pozitivní gradient od západu na východ (4). Nyní je jednoznačně prokázáno, že bakterie Borrelia burgdorferi popsaná v r jako jedinečný druh, je ve skutečnosti komplexem několika druhů, z nichž pět je pro člověka patogenních: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii a Borrelia bavariensis (7,8). Dva další druhy jsou potenciálně patogenní: Borrelia valaisiana a Borrelia lusitaniae. Těchto sedm druhů cirkuluje v Evropě, kdežto ve Spojených státech se vyskytuje jen B. burgdorferi sensu stricto. Klinické symptomy Lymské nemoci jsou různé a někdy nesnadno rozpoznatelné (6). Během klinického vývoje nemoci lze rozpoznat tři stádia. Časné stádium (stádium I) může být asymptomatické a je charakterizováno syndromem podobným chřipce. V 50 až 80 % případů se několik dnů až týdnů po kousnutí klíštětem objeví typická lokalizovaná kožní vyrážka s odstředivou expanzí s názvem stěhovavý erytém (EM). Bez léčby vyvolá hematogenní diseminace Borrelia o několik týdnů později zánětlivou artritidu, neurologické nebo meningeální poruchy a kožní nebo srdeční symptomy (stádium II). Po několika měsících nebo letech se nemoc může rozvinout do chronického stádia, s přidružením (při různých úrovních) acrodermatitis chronica atrophicans, encefalopatie, encefalomyelitidy a chronické artritidy (stádium III) (1). Každý druh Borrelia burgdorferi má zvláštní tropismus. Stěhovavý erytém (EM) v stádiu I je indiferentně asociován s těmito třemi druhy. Neurologické komplikace jsou však častěji spojovány s B. garinii a artritidy jsou častěji spojovány s B. burgdorferi ss, zatímco acrodermatitis chronica atrophicans je specifická pro B. afzelii. Diagnóza Lymské nemoci se nesmí potvrdit bez pečlivého prozkoumání anamnézy pacienta, klinických a biologických kritérií a odhadu rizika expozice kousnutí. Kvůli potížím spojeným s přímou detekcí, izolace kultur nebo implementace metod molekulární biologie, sérologie zůstává klíčovým elementem v biologické diagnóze Lymské nemoci (1,5,9). IgM protilátky proti Borrelia burgdorferi se objevují zhruba 3 až 6 týdnů po kontaminaci a mohou přetrvávat během rozvinutí nemoci, zatímco IgG protilátky se objevují později a svého vrcholu dosahují až po měsících nebo dokonce letech. I když je sérologie méně užitečná v časném stádium, je přesto důležitá během sekundárního nebo terciálního stádia, zejména při absenci stěhovavého erytému. Jestliže je sérologie negativní navzdory sugestivnímu klinickému stavu, novou sérologii je nutné provést 3 týdny po počátečním testu. Přítomnost specifických IgM protilátek není synonymem včasného stádia infekce. Podobně, přítomnost specifických IgG protilátek není vždy známkou pozdního stádia infekce. Antigeny a protilátky použité v testech Platelia Lyme IgM (Ref ) a Platelia Lyme IgG (Ref ) byly vybrány tak, aby umožnily detekci příslušných specifických IgM a specifických IgG protilátek proti různým americkým a evropským kmenům Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCIP Platelia Lyme IgM je kvalitativní test pro detekci IgM protilátek proti Borrelia burgdorferi sensu lato v lidském séru nebo plazmě enzymovou imunoanalýzou využívající záchyt IgM na pevnou fázi. Protilátky proti lidským řetězcům μ se navážou na pevnou fázi (jamky mikrotitrační destičky). Jako konjugát slouží směs nativního antigenu bakterie Borrelia a monoklonální protilátky proti bičíkovému antigenu bakterie Borrelia označené peroxidázou. Test sestává z následujících kroků: Krok 1 Vzorky pacientů a kontroly se naředí v poměru 1/101 a poté přenesou do jamek mikrodestičky. Během hodinové inkubace při 37 C se IgM protilátky proti Borrelia burgdorferi přítomné ve vzorku navážou na anti-µ protilátky nanesené na jamkách mikrodestičky. Po inkubaci se nenavázané nespecifické protilátky a jiné sérové proteiny odstraní promytím. 1

2 Krok 2 Konjugát (směs antigenu Borrelia a anti-borrelia protilátky značená peroxidázou) se přidá do jamek mikrodestičky. Během této inkubace při 37 C se konjugát naváže na specifické IgM anti-borrelia protilátky. Nenavázaný konjugát se na konci inkubace odstraní promytím. Krok 3 Přítomnost imunokomplexů (protilátka proti lidským µ-řetězcům / IgM anti-borrelia / Borrelia antigen / anti-borrelia monoklonální protilátka značená peroxidázou) se prokáže přidáním enzymatického vyvíjecího roztoku do každé jamky. Krok 4 Po inkubaci při pokojové teplotě ( C) se enzymatická reakce zastaví přidáním 1N roztoku kyseliny sírové. Odečet optické hustoty získaný pomocí spektrofotometru nastaveného na 450/620 nm je přímo úměrný množství IgM protilátek proti Borrelia burgdorferi přítomných ve vzorku. 4. INFORMACE O PRODUKTU Dodávané množství činidel je určeno tak, aby umožnilo 96 testů v maximálně 6 sériích. Všechna činidla jsou určena výlučně pro diagnostické použití in vitro. Označení Složení činidel Provedení R1 R2 R3 R4 R5 R6a R6b R7 R9 R10 Microplate Concentrated Washing Solution (20x) Negative Control Cut-off Control Positive Control Antigen Conjugate (51x) Diluent Chromogen TMB Stopping Solution Mikrodestička (připravená k použití) 12 stripů po 8 jamkách potažených protilátkami proti lidským µ- řetězcům Koncentrovaný promývací roztok (20x) TRIS-NaCl pufr (ph 7,4), 2 % Tween 20 Konzervační látka: 0,04 % ProClin 300 Negativní kontrola Lidské sérum negativní na IgM protilátky proti Borrelia burgdorferi a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv Konzervační látka: 0,15 % ProClin 300 Cut-off kontrola Lidské sérum reaktivní na IgM protilátky proti Borrelia burgdorferi a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv Konzervační látka: 0,15 % ProClin 300 Pozitivní kontrola Lidské sérum reaktivní na IgM protilátky proti Borrelia burgdorferi a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv Konzervační látka: 0,15 % ProClin 300 Antigen (lyofilizovaný) Hovězí sérový albumin, Borrelia antigen Konjugát (51x) Myší monoklonální protilátka proti Borrelia značená peroxidázou Konzervační látka: 0,16 % ProClin 300 Ředidlo pro vzorky a konjugát (připravené k použití) Tris-NaCl (ph 7,7), fetální telecí sérum, 0,1 % Tween 20 a fenolová červeň Konzervační látka: 0,15 % ProClin 300 Chromogen (připravený k použití) 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin (< 0,1 %), H 2O 2 (<1 %) Zastavovací roztok (připravený k použití) 1N roztok kyseliny sírové 1 mikrodestička 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2 x qsp. 8,0 ml 1 x 0,4 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Podmínky uchovávání a doba použitelnosti jsou uvedeny v popisech umístěných na obalu soupravy. 5. VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Spolehlivost výsledků závisí na bezchybné implementaci následující správné laboratorní praxe: Činidla nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti. Během testu nemíchejte ani nekombinujte činidla různých šarží. POZNÁMKA: Pro promývací roztok (R2, označení štítku: 20x, zelená barva), chromogen (R9, označení štítku: TMB, tyrkysová barva) a zastavovací roztok (R10, označení štítku: 1N červená barva). Je možné použít také jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v sadě za předpokladu, že jsou tato činidla striktně ekvivalentní a že se během konkrétního testu použije stejná šarže. 2

3 Před použitím nechte činidla 30 minut temperovat na pokojovou teplotu ( C). Činidla opatrně rozpusťte nebo nařeďte a zamezte kontaminaci. Test neprovádějte za přítomnosti reaktivních par (kyselina, alkálie, páry aldehydů) nebo prachu, které mohou pozměnit enzymovou aktivitu konjugátu. Sklo používejte důkladně vyčištěné a opláchnuté deionizovanou vodou, nebo použijte spíše materiál na jedno použití. Důkladné promytí mikrodestičky je kritickým krokem tohoto postupu: Dodržte doporučený počet promývacích cyklů a zajistěte, aby se všechny jamky zcela zaplnily a poté zcela vyprázdnily. Nesprávné promytí může vést k nepřesným výsledkům. Nedovolte, aby mikrodestička vyschla v období mezi ukončením promývání a nanášením činidla. K distribuci konjugátu a vyvíjecího roztoku nikdy nepoužívejte stejnou nádobu. Enzymatická reakce je velmi citlivá na kovy nebo ionty kovů. V důsledku toho nesmí žádný kovový prvek přijít do styky s různými roztoky obsahujícími konjugát nebo chromogen. Chromogenový roztok (R9) musí být bezbarvý. Vzhled modré barvy znamená, že činidlo se nesmí použít a musí se vyměnit. U každého vzorku používejte novou pipetovací špičku. Zkontrolujte přesnost a správnou funkci pipet a dalšího zařízení. Zdravotní a bezpečnostní pokyny Lidský biologický materiál použitý při přípravě činidel byl testován a shledán nereaktivní na povrchový antigen proti hepatitidě B (HBs Ag), protilátky proti viru hepatitidy C (anti-hcv) a protilátky proti virům lidské imunodeficience (anti-hiv1 a anti-hiv2). Protože žádná známá metoda nemůže nabídnout úplnou záruku nepřítomnosti infekčních agens, manipulujte s činidly lidského původu a vzorky od pacientů jako s látkami, které jsou schopny přenášet infekční nemoci. Veškerý materiál, který je v přímém kontaktu se vzorky a činidly obsahující materiály lidského původu, rovněž tak promývací roztoky, je třeba považovat za materiál, který je schopen přenášet infekční nemoci. Při manipulaci se vzorky a činidly používejte jednorázové ochranné rukavice. Nepipetujte ústy. Zamezte rozlití vzorků nebo roztoků se vzorky. Rozlité místo je třeba opláchnout 10% chlornanem. Pokud je kontaminovanou kapalinou kyselina, rozlitou látku je nutno nejdříve neutralizovat bikarbonátem sodným, poté vyčistit 10% chlornanem a vysušit savým papírem. Materiál používaný na čištění se musí zlikvidovat v nádobě na kontaminovaný odpad. Vzorky pacientů a činidla obsahující materiál lidského původu, včetně kontaminovaných materiálů a produktů, se musí po dekontaminaci zlikvidovat pouze: - buď ponořením na 30 minut do bělící lázně o finální koncentraci 5 % chlornanu sodného - nebo autoklávováním při teplotě 121 C po dobu minimálně 2 hodin. POZOR: Do autoklávu nevkládejte roztoky obsahující chlornan sodný. Zamezte kontaktu chromogenu a zastavovacího roztoku s kůží a sliznicemi (riziko toxicity, podráždění nebo popálení). Manipulace a likvidace chemických a biologických zbytků se musí provádět v souladu se správnou laboratorní praxí. Všechna činidla v soupravě jsou určena výlučně pro diagnostické použití in vitro. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese 6. ODBĚR VZORKŮ, PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ 1. Doporučenými typy vzorků je sérum nebo plazma (EDTA, heparin nebo citrát). 2. Při manipulaci, zpracování a uchovávání krevních vzorků dodržujte následující doporučení: Všechny krevní vzorky odebírejte při dodržení rutinních bezpečnostních opatření platných pro venepunkci. U séra umožněte, aby se před centrifugací vzorky zcela srazily. Zkumavky musí být po celou dobu zazátkované. Po centrifugaci separujte sérum nebo plazmu od sraženiny nebo červených krvinek v těsně zazátkované zkumavce určené pro skladování. Vzorky lze uchovávat při +2-8 C, pokud se test provede do 7 dní. Pokud se test nedokončí do 7 dní, nebo pro účely expedice, vzorky zmrazte při teplotě -20 C nebo nižší. Nepoužívejte vzorky, které byly zmrazené a rozmražené více než pětkrát. Dříve zmrazené vzorky je nutno po rozmrazení a před testováním důkladně promíchat (vortexovou míchačkou). 3. Vzorky obsahující 90 g/l albuminu nebo 100 mg/l nekonjugovaného bilirubinu, lipemické vzorky obsahující ekvivalentní množství 36 g/l trioleinu (trigycerid) a hemolyzované vzorky obsahující až 10 g/ml hemoglobinu neovlivňují výsledky. 4. Vzorky nezahřívejte. 3

4 7. TESTOVACÍ POSTUP 7.1 Potřebný materiál, který není součástí dodávky Vortexová míchačka. Spektrofotometr vybavený filtry 450 nm a 620 nm (*). Inkubátor mikrodestiček termostaticky nastavitelný na 37 ± 1 C (*). Automatická, poloautomatická nebo manuální promývačka mikrodestiček (*). Sterilní destilovaná nebo deionizovaná voda. Jednorázové rukavice. Brýle nebo ochranné brýle. Absorpční papír. Automatické nebo poloautomatické, nastavitelné nebo předem nastavené pipety nebo multipipety, které jsou schopny odměřovat a rozplňovat objemy 10 µl až 1000 µl, 1 ml, 2 ml a 10 ml. Odměrné válce o objemu 25 ml, 50 ml, 100 ml a 1000 ml. Chlornan sodný (bělidlo) a bikarbonát sodný. Nádoba na biologicky nebezpečný odpad. Jednorázové zkumavky. (*) Detaily ohledně doporučeného zařízení poskytne naše technické oddělení. 7.2 Rekonstituce činidel R1: Před otevřením obalu nechte 30 minut temperovat na pokojovou teplotu ( C). Vyjměte manipulační rámeček, okamžitě vraťte nepoužité stripy do obalu a zkontrolujte přítomnost desikantu. Obal pečlivě uzavřete a uchovávejte při +2-8 C. R2: V destilované vodě nařeďte promývací roztok R2 v poměru 1/20: např. 50 ml R2 a 950 ml destilované vody pro získání promývacího roztoku připraveného k použití. Při manuálním promývání připravte pro jednu destičku s 12 stripy 350 ml naředěného promývacího roztoku. R3, R4, R5: V ředidle (R7) nařeďte v poměru 1/101 (např.: 10 µl R3 + 1 ml R7). R6a: Pro jednu destičku rekonstituujte lyofilizovaný antigen přidáním 8 ml ředidla (R7) do každé lahvičky. Důkladně promíchejte. Čekání v délce 15 minut před smícháním s konjugátem (R6b) umožní homogenní rehydrataci antigenu. R6b: Připravte nezbytné množství konjugátu pro jeden test přidáním jednoho objemového množství koncentrovaného konjugátu (51x) do 50 objemů ředidla (R7). Pro jednu destičku namíchejte 0,3 ml R6b a 15 ml R7. R6 (R6a+R6b): Smíchejte stejné objemy rekonstituovaných činidel R6a a R6b. Pro jednu destičku namíchejte 12 ml rekonstituovaného roztoku R6a a 12 ml rekonstituovaného roztoku R6b. Před použitím počkejte 45 minut. 7.3 Uchovávání a validita otevřených a/nebo rekonstituovaných činidel Tato souprava se musí uchovávat při +2-8 C. Pokud je souprava před otevřením uchovávána při +2-8 C, každou komponentu lze použít do skončení doby použitelnosti vyznačené na štítku soupravy. R1: Po otevření zůstávají stripy stabilní až jeden měsíc, pokud se uchovávají při +2-8 C v původním, pečlivě uzavřeném obalu (zkontrolujte přítomnost desikantu). R2: Po naředění lze promývací roztok uchovávat 2 týdny při C. Koncentrovaný promývací roztok uchovávaný při teplotě C je při nepřítomnosti kontaminace stabilní do skončení doby použitelnosti vyznačené na štítku. R3, R4, R5, R6b, R7: Po otevření a při nepřítomnosti kontaminace jsou činidla uchovávaná při teplotě +2-8 C stabilní až jeden měsíc. R6a+R7: Po rekonstituci je antigen stabilní 15 dní při +2-8 C nebo zmrazený při -20 C. Rekonstituovaný antigen uchovávaný zmrazený se nesmí rozmrazit více než třikrát. R6b+R7: Po rekonstituci je roztok konjugátu stabilní 8 hodin při pokojové teplotě ( C) nebo 24 hodin při +2-8 C. R6 (R6a+R6b): Po rekonstituci je pracovní roztok konjugátu stabilní 8 hodin při pokojové teplotě ( C). R9: Po otevření a při nepřítomnosti kontaminace je činidlo uchovávané při teplotě +2-8 C stabilní až dva měsíce. R10: Po otevření a při nepřítomnosti kontaminace je činidlo uchovávané při teplotě +2-8 C stabilní až do doby použitelnosti vyznačené na štítku. 7.4 Postup Důsledně dodržujte testovací postup a zásady správné laboratorní praxe. Před použitím nechte činidla temperovat na pokojovou teplotu ( C). Za účelem validace výsledků testů u každého běhu (cyklu) použijte negativní, cut-off a pozitivní kontroly. 1. Pečlivě stanovte plán nanášení a identifikace pro kontroly a vzorky pacientů. 2. Připravte naředěný promývací roztok (R2) [Viz část 7.2]. 3. Vyjměte manipulační rámeček a stripy (R1) z ochranného pouzdra [Viz část 7.2]. 4. Rekonstituujte lahvičku s antigenem R6a přidáním 8 ml ředidla (R7). Důkladně promíchejte. 5. Nařeďte kontroly R3, R4, R5 a vzorky pacientů (S1, S2 ) v ředidle (R7) pro získání zředění v poměru 1/101: 10 µl vzorku a 1,0 ml ředidla (R7). Vortexovým míchadlem promíchejte naředěné vzorky. 6. Připravte pracovní roztok konjugátu (R6): v poměru 1/51 nařeďte nezbytné množství konjugátu (R6b) s ředidlem (R7). Poté namíchejte stejná množství rekonstituovaných činidel R6a a R6b [Viz část 7.2]. Pracovní roztok konjugátu se musí připravovat nejméně 45 minut před nanesením na destičku. Důkladně promíchejte. 7. Důsledně dodržujte níže uvedené pořadí a do každé jamky naneste 200 µl naředěných kontrol a vzorků pacientů: 4

5 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 8. Mikrodestičku přikryjte adhezívní krycí fólií a pevně přitiskněte na destičku pro zajištění těsnosti. Destičku okamžitě inkubujte v termostaticky řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru po dobu 1 hodiny ± 5 minut při 37 C ± 1 C. 9. Na konci první inkubační doby odstraňte adhezívní krycí fólii. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4-krát promyjte v 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku obraťte a odstraňte zbylou tekutinu opatrným poklepáním na absorpční papír. 10. Do všech jamek naneste 200 µl pracovního roztoku konjugátu (R6). Roztok je nutno před použitím opatrně zatřepat. 11. Mikrodestičku přikryjte adhezívní krycí fólií a pevně přitiskněte na destičku pro zajištění těsnosti. Destičku okamžitě inkubujte v termostaticky řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru po dobu 1 hodiny ± 5 minut při 37 C ± 1 C. 12. Na konci druhé inkubační doby odstraňte adhezívní krycí fólii. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4-krát promyjte v 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku obraťte a odstraňte zbylou tekutinu opatrným poklepáním na absorpční papír. 13. Do každé jamky rychle naneste (chráněné před světlem) 200 µl chromogenového roztoku (R9). Umožněte vznik reakce v temnu na 30 ± 5 minut při pokojové teplotě ( C). Během této inkubace nepoužívejte adhezívní krycí fólii. 14. Zastavte enzymatickou reakci přidáním 100 µl zastavovacího roztoku (R10) do každé jamky. Použijte stejný sled a rychlosti nanášení, které byly použity pro vyvíjecí roztok. 15. Spodek destičky opatrně otřete. Pomocí spektrofotometru odečtěte optickou hustotu při 450/620 nm do 30 minut po zastavení reakce. Stripy se před odečtením musí vždy uchovávat chráněné před světlem. 16. Před zaznamenáním výsledků zkontrolujte shodu mezi odečtem a plánem nanášení destičky a vzorků. 8 VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 8.1 Výpočet limitní hodnoty cut-off (CO) Cut-Off hodnota (CO) odpovídá průměrné hodnotě optických hustot/denzit (OD) cut-off kontrol v dubletu (R4): CO = průměrná OD R4 8.2 Výpočet poměru vzorku Výsledek vzorku je vyjádřen poměrem vypočítaným podle následujícího vzorce: Poměr vzorku = OD vzorku/co 8.3 Kontrola kvality Zahrnuje všechny kontroly pro každou mikrodestičku a každý test a analyzuje získané výsledky. Pro validaci testu musí být splněna následující kritéria: Hodnoty optických hustot: - CO > 0,2-0,80 x CO < OD R4 replikát 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 replikát 2 < 1,20 x CO (Individuální OD každého replikátu cut-off kontroly (R4) se nesmí lišit o více než 20 % od hodnoty CO). Poměry optických hustot: - Poměr R3 (OD R3 / CO) < 0,5 - Poměr R5 (OD R5 / CO) > 2,0 Pokud nejsou tato kritéria kontroly kvality splněna, testovací běh se musí opakovat. 8.4 Interpretace výsledků Poměr vzorku Výsledek Interpretace Poměr < 0,80 Negativní 0,80 Poměr < 1,2 Nejednoznačný Poměr 1,2 Pozitivní Vzorek je považován za nereaktivní na přítomnost IgM protilátek proti Borrelia burgdorferi sensu lato. Vzorek je považován za nejednoznačný na přítomnost IgM protilátek proti Borrelia burgdorferi sensu lato. Výsledek musí být potvrzen dalším testem na druhém vzorku nejméně 3 týdny po prvním testování. Vzorek je považován za reaktivní na přítomnost IgM protilátek proti Borrelia burgdorferi sensu lato. 5

6 Při podezření na infekci může být užitečné potvrdit diagnózu doplňujícími testy, např. pro detekci IgG anti-borrelia protilátek. Pokud je sérologie pozitivní nebo neurčitá (sporná), doporučujeme otestovat vzorek pomocí konfirmační metody, např. Western-Blot (9). 8.5 Průvodce odstraňováním potíží Nevalidní nebo neopakovatelné reakce jsou často způsobeny: Neadekvátním promytím mikrodestiček. Kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou s vysokým titrem protilátek. Kontaminací vyvíjecího roztoku chemickými oxidačními činidly (chlornany, ionty kovů...). Kontaminací zastavovacího roztoku. 8.6 Příklad výpočtu Poznámka: Následující údaje jsou uváděny pouze jako příklad a nesmí se používat namísto výsledků získaných uživatelem. Kontroly a vzorky pacientů OD (450/620 nm) Poměr Výsledek R3 0,155 0,22 Negativní R4 0,709 / / R4 0,697 / / R5 2,280 3,24 Pozitivní Vzorek 1 1,181 1,67 Pozitivní Vzorek 2, atd... 0,597 0,85 Pozitivní Cut-off hodnota: - CO = (0,709+0,697)/2 = 0,703 Hodnoty optických hustot: - OD CO = 0,703 (N > 0,200) - OD R4 replikát 1 = 0,709 (0,80 x OD CO < OD R4 replikát 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 replikát 2 = 0,697 (0,80 x OD CO < OD R4 replikát 2 < 1,20 x OD CO) Poměry optických hustot: - Poměr R3 = 0,22 (N < 0,5) - Poměr R5 = 3,24 (N > 2,0) Kontrola kvality: akceptováno. 9 FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY 9.1 Prevalence Odhad prevalence IgM protilátek proti Borrelia burgdorferi sensu lato v lidském séru se provedl použitím panelu 296 vzorků získaných od dárců krve ze severní části Francie. Získaly se následující výsledky: 286 negativních, 8 neurčitých (sporných) a 2 pozitivní séra. Prevalence pomocí testu Platelia Lyme IgM byla stanovena na 0,68 % (2/296). 9.2 Specificita Specificita v neendemické oblasti Odhad specificity se provedl použitím panelu 286 vzorků séra získaných od zdravých dárců krve bydlících v neendemické oblasti severní části Francie. Vzorky byly vybrány z negativních výsledků získaných pomocí komerční EIA soupravy používané v Evropě (CE značené) a považované za referenční Specificita v endemické oblasti Specificita se rovněž stanovila na panelu 197 vzorků séra získaných od zdravých dárců krve bydlících v endemické oblasti východní části Francie, kdy žádný nevykazoval příznaky spojené s Lymskou nemocí (žádné klinické symptomy boreliózy ani anamnéza kousnutí klíštětem). Vzorky byly vybrány z negativních výsledků získaných pomocí komerční EIA soupravy používané v Evropě (CE značené) a považované za referenční. 6

7 Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce: Panel sér Negativní Neurčitý (1) Pozitivní (2) Specificita 99,6% Neendemická oblast (n=286) (280/281) [98,0% ] Endemická oblast (n=197) ,0% (191/193) [96,3% 99,9%] (1) Neurčité (sporné) výsledky nebyly při výpočtu specificity použity. (2) Jeden ze třech pozitivních vzorků u testu Platelia Lyme IgM byl rovněž shledán pozitivním při použití metody Western blot. IC 95%: 95% interval spolehlivosti. 9.3 Citlivost Byla vypočítaná citlivost testu Platelia Lyme IgM a zahrnuta do výsledků testu Platelia Lyme IgG (Ref ) na panelu 70 vzorků od pacientů představujících různé formy Lymské nemoci v různých klinických stádiích. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce a byly porovnány s citlivostmi získanými pomocí komerčních EIA soupravami používanými v Evropě (CE značené) a považovanými za referenční: Klinické stádium Stěhovavý erytém (Stádium I) Neuroborelióza (Stádium II) Acrodermatitis chronica atrophicans (Stádium III) Lymská artritida (Stádium III) Počet sér Platelia Lyme (1) Reference Evropa (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG 58,8% [32,9% 81,6%] 36,7% [19,9% 56,1%] 20,0% [0,05% 71,6%] 0,0% [0,0% 18,1%] (1) Neurčité (sporné) výsledky nebyly při výpočtu citlivosti použity. IC 95%: 95% interval spolehlivosti. 66,7% [38,4% 88,2%] 96,9% [83,4% 99,9%] [54,9% ] [81,9% ] 82,4% [56,6% 96,2%] 96,9% [83,4% 99,9%] [54,9% ] [81,9% ] 93,3% [68,1% 99,8%] 97,0% [84,2% 99,9%] [54,9% ] [81,9% ] Citlivost testu Platelia Lyme IgM byla rovněž prokázána na dokumentovaném panelu vzorků získaných od CDC (Centrum pro kontrolu nemocí) a porovnána s citlivostmi získanými pomocí komerčních EIA souprav používaných v Evropě (CE značené) a v USA (schválené úřadem FDA Americký úřad pro kontrolu potravin a léků) a považovaných za referenční. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce: Klinické stádium Stěhovavý erytém Artritida / artralgie Neznámé stádium Počet sér Platelia Lyme (1) Reference Reference USA Evropa (1) (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG IgM + IgG 73,7% [48,8% 90,9%] 40,0% [5,3% 85,3%] [0,05% ] 38,5% [20,2% 59,5%] [60,7% ] [36,8% ] (1) Neurčité (sporné) výsledky nebyly při výpočtu citlivosti použity. IC 95%: 95% interval spolehlivosti. 86,4% [65,1% 97,1%] [60,7% ] [47,3% ] 70,4% [49,8% 86,3%] [60,7% ] [19,4% 99,9%] 87,0% [66,4% 97,2%] [60,7% ] [36,8% ] 7

8 9.4 Přesnost Přesnost v rámci testu (opakovatelnost): Pro vyhodnocení opakovatelnosti "intra assay" (v rámci testu) byl testován jeden negativní a tři pozitivní vzorky 30-krát ve stejném cyklu. Poměr (OD vzorku / CO) se určil pro každý vzorek. Průměrná hodnota poměrů, standardní odchylka (SD) a variační koeficient (%CV) pro každý ze čtyřech vzorků jsou uvedeny v následující tabulce: Přesnost v rámci testu (opakovatelnost) N=30 Negativní vzorek Slabě pozitivní vzorek Pozitivní vzorek Vysoce pozitivní vzorek Poměr (OD vzorku/cut off hodnota) Průměr 0,24 1,17 1,88 4,23 SD 0,040 0,052 0,070 0,104 %CV 15,2% 4,4% 3,7% 2,5% Přesnost mezi testy (reprodukovatelnost): Pro vyhodnocení reprodukovatelnosti "intra assay" (v rámci testu) byl testován každý ze čtyřech vzorků (jeden negativní a tři pozitivní vzorky) dvojmo ve dvou cyklech denně po dobu 20 dní. Poměr (OD vzorku / CO) se určil pro každý vzorek. Průměrná hodnota poměrů, standardní odchylka (SD) a variační koeficient (%CV) pro každý ze čtyřech vzorků jsou uvedeny v následující tabulce: Přesnost mezi testy (reprodukovatelnost) N=80 Negativní vzorek Slabě pozitivní vzorek Pozitivní vzorek Vysoce pozitivní vzorek Poměr (OD vzorku/cut off hodnota) Průměr 0,24 1,21 1,76 4,18 SD 0,029 0,067 0,104 0,153 %CV 12,0% 5,5% 5,9% 3,7% 9.5 Zkřížená reaktivita Testem Platelia Lyme IgM bylo testováno 338 vzorků s charakteristikami, které mohou potenciálně vést ke vzniku nespecifických reakcí. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce: Panel Počet vzorků Neurčitý (1) Pozitivní Zkřížená reaktivita% Syfilis ,2% (2) CMV ,3% (2) EBV ,4% (3) Leptospiróza ,3% (3) Malárie ,0% (3) Antinukleární protilátky (ANA) ,0% Heterofilní protilátky (HAMA) ,0% Revmatoidní faktor ,0% HSV ,0% Toxoplazmóza ,6% (2) Zarděnky ,0% Spalničky ,0% Příušnice ,0% HIV ,0% VZV ,0% CELKEM ,8% (1) Neurčité (sporné) výsledky nebyly při výpočtu zkřížené reaktivity použity. (2) Nesignifikantní rozdíl od prevalence v endemické oblasti (Fisherův test, p>0,05). (3) Signifikantní rozdíl od prevalence v endemické oblasti (Fisherův test, p<0,05). 8

9 16 pozitivních vzorků zjištěných testem Platelia Lyme IgM bylo rovněž testováno pomocí komerčních EIA souprav používaných v Evropě (CE značené) a použitím metody Western blot. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce: Vzorek EIA analýza Western blot (1) Vzorek EIA analýza Western blot (1) Syfilis Negativní Negativní Leptospiróza Pozitivní Pozitivní CMV Negativní Negativní Malárie Neurčitý NT EBV Pozitivní Pozitivní Malárie Pozitivní NT EBV Pozitivní Negativní Malárie Neurčitý NT EBV Pozitivní Negativní Malárie Pozitivní NT EBV Pozitivní NT Malárie Negativní NT EBV Pozitivní Neurčitý Malárie Negativní NT Leptospiróza Negativní Pozitivní Toxoplazmóza Pozitivní Negativní (1) NT: netestováno kvůli nedostatečnému objemu vzorku. Byla hlášena zejména skutečnost, že pacienti s malárii nebo pacienti infikováni Epstein Barrovým virem nebo jinými druhy spirochet (leptospiróza, atd ) mohou potenciálně vykazovat falešně pozitivní reakce s diagnostickými soupravami pro stanovení protilátek proti Borrelia burgdorferi. Tato skutečnost by se měla vzít v úvahu při interpretaci výsledků získaných pomocí těchto testů. 10 OMEZENÍ TESTU Diagnózu infekce Borrelia burgdorferi lze stanovit pouze na základě kombinace klinických a biologických dat. Výsledek jednotlivého testu detekce IgM anti-borrelia burgdorferi protilátek neposkytuje dostatečný důkaz pro diagnózu infekce Borrelia burgdorferi sensu lato. Pokud je sérologie pozitivní nebo neurčitá (sporná), doporučujeme otestovat vzorek pomocí konfirmační metody, např. Western-Blot (9). 11 KONTROLA KVALITY VÝROBCE Všechna vyráběná činidla jsou připravovány podle našeho systému jakosti, počínaje příjmem surovin, konče komerčním využitím produktu. Každá šarže je podrobená kontrole jakosti a je uvolněná pro trh pouze tehdy, když splňuje předem definovaná akceptační kritéria. Bio-Rad uchovává záznamy spojené s výrobou a kontrolami každé jednotlivé šarže. 12 LITERATURA 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: Center for Disease Control and Prevention Lyme disease United States, Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: Hubalek, Z., Halouzka, J Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: Reed, K. D Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: Stanek, G., Strle, F Lyme borreliosis. Lancet. 362: Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): Wilske, B Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3:

10 10

11 11

12 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)