Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková

Transkript

1 Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie

2 Obsah 1. Úvod 2. Principy HPLC 3. Instrumentace 4. Úprava vzorku 5. Analýza drog a jejich metabolitů 6. Závěry

3 1. Úvod GC obvykle vyžaduje derivatizaci, bezvodé vzorky HPLC - doplňuje a nyní i nahrazuje GC Výhody 85 % všech látek lze stanovit (tepelně labilních, polárních, nízko- i vysokomolekulárních), přímá analýza bez derivatizace časová úspora, přímý nástřik vodných vzorků Ve spojení s citlivou detekcí MS možnost identifikace a kvantifikace Nevýhody: pomalá difúze v kapalinách, nižší účinnost než GC, vyšší finanční náklady na analýzu (nákladnější přístroj, rozpouštědla)

4 2. Principy HPLC Mobilní fáze: kapalina složení mobilní fáze ovlivňuje separaci Stacionární fáze: chemicky vázané fáze adsorbenty měniče iontů gely (pro SEC) afinitní fáze Vysoká účinnost a rychlost analýzy vysoké tlaky a malé částice s jednotnou velikostí, homogenně naplněné v koloně

5 Chromatogram (kvalita, kvantita, účinnost separace) t R retenční čas, t R redukovaný čas, plocha nebo výška píku, w šířka píku

6 Závislost H na lineární průtokové rychlosti mobilní fáze u H (výškový ekvivalent teoret. patra) = L/n n (počet pater) = 16(t R /w) 2 H A + B/u + Cu B/u A Cu u

7 Závislost H na velikosti částic Čím < velikost částic, tím < H a tím > účinnost separace 8 m 5 m 3 m 2 m

8 Volba kolony Náplně: zcela porézní částice 2-10 m, velikost pórů nm, pravidelného kulovitého tvaru, homogenně naplněné v koloně pelikulární polopropustné (nepropustné jádro, tenká pórovitá vrstva nepórovité rychlá sorpce, malá zátěž, póry 0,2 0,4 nm nedostupné pro solut monolitické kolony, vtištěné polymery Specifický povrch zátěž (dávkování) póry 10 nm 170 m 2 30 nm 100 m 2 nepórovité 0,6 6 m 2 /g

9 Miniaturizace ( HPLC) Zmenšování velikosti částic a průměru kolony Výhody: snížení spotřeby a odpadu rozpouštědel, stacionární fáze a vzorku vyšší účinnost separace vyšší citlivost detekce kompatibilita s MS detekcí Průměr kolony Průtok 4,5 mm 1 ml/min 1 mm 0,047 ml/min 0,25 mm 0,003 ml/min

10 Chemicky vázané fáze Univerzální, vhodné pro biologické vzorky, rychlé ustavování rovnováhy- vysoká separační účinnost Nosič (silikagel, organický polymer) s navázanými funkčními skupinami: alkyly, zejména oktyl, oktadecyl, fenyl nepolární (reverzní) fáze nejvýznamnější (RPLC) normální fáze polární méně používané iontově výměnné skupiny -SO 3 H, - COOH, -NH 2, -N + (R) 3 chirální stacionární fáze (cyklodextriny a další)

11 Struktura chemicky vázaných fází

12 Mobilní fáze Mobilní fáze není inertní, ovlivňuje separaci Možnosti změny složení mobilní fáze jsou prakticky neomezené Obecné požadavky: dobrá rozpustnost pro soluty, kompatibilita s detekcí (UV hrana), toxicita, viskosita, těkavost reverzní fáze voda + organická rozpouštědla (pufry, ph, iontově párová činidla ) retence (log k) ~ obsah org. rozpouštědla nepolární fáze nepolární organické rozpouštědlo + polární modifikátor (<1 %) měniče iontů pufry Izokratická vs. gradientová eluce (obdoba programování teploty v GC)

13 Derivatizace Derivatizací měníme fyzikální a chemické vlastnosti analytů. Hlavní důvody pro převedení analytů na deriváty jsou tyto: zlepšení detekovatelnosti (nejčastěji v kombinaci s fluorescenčním detektorem) zvýšení těkavosti (v GC) zlepšení chromatografických vlastností (např. změna polarity), zlepšení stability analytů, umožnění chirální separace, změna matrice pro lepší separaci.

14 Kvalitativní analýza k = (t R t M ) /t M (retenční poměr) r 12 = 12 = t R2 /t R1 = k 2 /k 1 (relativní retence, selektivita) Reprodukovatelnost: složení mobilní fáze, pracovní teplota, příprava stacionární fáze

15 Zdroje chyb: Kvantitativní analýza Odběr reprezentativního vzorku Úprava vzorku (nejvýznamnější) Dávkování (1-2 %) Stacionární fáze Instrumentace, zpracování signálu a interpretace

16 Pracovní techniky při vyhodnocování chromatogramů Vnitřní normalizace: xi = (A i / A j ) 100 Absolutní kalibrace mi = (A i /A s ) m s Vnitřní standardizace mi = (RMR sr /RMR ir ) (A i /A s ) (V s / V i ) m s Metoda standardního přídavku m i V V s i A A is i v v i is m 1 s V V s i 1 A plocha m množství V i, V s objemy při ředění v i,v s dávkované objemy vzorku a stand. RMR relativní mol. odezva

17 3. Instrumentace Blokové schéma chromatografu 1 - zdroj mobilní fáze, 2 čerpadlo, 3 dávkovač, 4 - kolona, 5 - detektor, 6,7 - zařízení pro zpracování signálu detektoru

18 Zásobník m.f. uzavřená nádoba, odplynit čerpadla bezpulzní, vysokotlaká, průtoky od l/min po ml/min dávkovače smyčkové (vzorky v l) automatické dávkovače kolony preparativní či analytické, náplňové i kapilární, vnitřní průměr od desítek m po jednotky mm, nerezové či skleněné detektory spektrofotometrický (diode-array) refraktometrický, elektrochemický, fluorescenční, hmotnostní vyhodnocovací zařízení

19 Čerpadlo reciprokační

20 Schéma šesticestného dávkovacího ventilu se smyčkou a - plnění smyčky, b - vymývání smyčky do kolony 1, 4 - připojení smyčky, 2 - přívod mobilní fáze od čerpadla, 3 - připojení kolony, 5, 6 - odpad; nástřik v poloze 4

21 Kolony: náplňové 3 5 mm, ~ 1 ml/min mikronáplňové ~ 1 mm, ~ L/min kapilární ~ 10 m, ~ nl/min Materiály: silikagel (ph 2-8, endcapping) alumina (pro bazické látky) organické polymery Monolitické kolony Vtištěné polymery

22 Monolitické kolony až 97 % objemu kolony zaujímá stacionární fáze (oproti ca 70 % u náplňových kolon) vyšší účinnost separace velká porozita vysoký průtok, rychlé analýzy makropóry 2 m velký průtok, malý tlakový spád mesopóry 13 nm velký povrch pro sorpci analytů na bázi silikagelu nebo organických polymerů

23

24 Detektory UV/VIS nejběžnější, s diodovým polem (DAD), téměř univerzální fluorescenční citlivý, selektivní, derivatizace elektrochemický- citlivý i selektivní, omezené použití hmotnostní nejvyšší vypovídací schopnost (kvalita i kvantita), vysoká citlivost a selektivita

25 UV/VIS detektor (a) schéma, (b) uspořádání mřížky

26 Schéma fluorescenčního detektoru 1, 2 - vstup a výstup mobilní fáze, 3 - excitační záření, 4 - emitované záření, 5 - vnější plášť cely, 6 - optický systém, 7 - cela (5 l), 8 - držák

27 Blokové schéma hmotnostního spektrometru

28 Iontový zdroj - převedení analytu do ionizovaného stavu, fragmentace. Hmotnostní analyzátor rozděluje v prostoru nebo čase směs iontů o různých poměrech hmotnosti ku náboji (m/z), produkovanou v iontovém zdroji. Detektor poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Po digitalizaci převeden do počítače a zpracován do hmotnostních spekter. Hmotnostní spektrometr pracuje za velmi nízkých tlaků - výkonný vakuový čerpací systém. Vstup umožňující převedení vzorku do iontového zdroje. GC-MS nebo HPC-MS vhodné rozhraní (interface) snižující podíl mobilní fáze

29 Iontové zdroje Ionizační energie 7-16 ev Výtěžek ionizace kolem 0,01% Ionizační techniky měkké (nízká fragmentace) a tvrdé (vysoká fragmentace) GC Ionizace elektronem (electron ionization, EI) Chemická ionizace (chemical ionization, CI) HPLC Sprejové ionizační techniky v kapalné fázi, měkké termosprejová ionizace (thermospray, TS) elektrosprejová ionizace (electrospray, ES) chemické ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure chemical ionization, APCI )

30 Schéma iontového zdroje ES

31 Schéma iontového zdroje APCI

32 Analyzátory Magnetický hmotnostní analyzátor Kvadrupólový analyzátor Iontová past (ion-trap) Průletový analyzátor (time of flight, TOF)

33 Interface Rozhraní s pohybujícím se kovovým páskem (moving belt interface) sprejové ionizace většina těkavých látek odvedena mimo MS bez interface mikrohplc - přímý vstup MS/MS-LC systém se třemi kvadrupóly: První pro výběr mateřského iontu, do druhého se přivádí pod tlakem inertní plyn a slouží jako kolizní cela pro řízenou fragmentaci mateřského iontu, skenováním třetího kvadrupólu se rozdělí vzniklé dceřiné ionty

34 Rozhraní (interface) s pohybující se kovovou smyčkou

35 Hybridní tandemový hmotnostní spektrometr s dvojicí kvadrupólů a průletovým hmotnostním analyzátorem

36 Požadavky na HPLC-MS systém Kolona malý průměr, malé průtokové rychlosti přímý převod do MS (bez interface) Mobilní fáze těkavá, omezit obsah solí, protože snižují výtěžek ionizace a zanášejí iontový zdroj Vhodnější methanol než acetonitril, vyšší výtěžek ionizace

37 4. Úprava vzorku přečištění, zakoncentrování Kapalné vzorky (moč, serum, sliny): extrakce kapalinou (LLE) extrakce tuhou fází (SPE) nejběžnější materiály: chemicky vázané fáze, ionexy, SEC fáze, vtištěné polymery, atd. mikroextrakce na vláknech nebo v kapiláře (SPME) Tuhé vzorky (tkáně, vlasy): Soxhlet zrychlená extrakce rozpouštědly (ASE) extrakce ultrazvukem extrakce nadkritickými tekutinami (SFE)

38 SPME Solid phase microextraction

39 a-spme extrakce, b-desorpce v GC, c-desorpce v HPLC

40 Přímé spojení SPME v kapiláře s HPLC a) extrakce

41 b) Desorpce

42 Příprava vtištěných polymerů

43 5. Analýza drog a jejich metabolitů Analýza tělních tekutin Analýza krve - deproteinizace extrakce rozpouštědly (LLE) extrakce tuhou fází (SPE, SPME) přečištění extraktu na měničích iontů zakoncentrování odpařením vlastní analýza HPLC-ESI (API)-MS

44 Analýza vlasů Odběr vzorku velká variabilita (místo odběru, stáří, pohlaví) mg vzorku dekontaminace vlasů (kosmetické přípravky, prach a pod.) extrakce, přečištění extraktu, zakoncentrování vlastní analýza

45 (A) Chromatogram extraktu z krve oběti předávkované amobarbitalem (B) hmotnostní spektrum této látky

46 Rychlá HPLC-ESI-MS identifikace a kvantifikace významných nox Podmínky analýzy Gradientová eluce metanolem s 0,1% HCOOH Monolitická kolona Chromolith Detekce ESI-MS Doba analýzy 5 min. včetně stabilizace Všech 14 látek (neutrální, bazické, kyselé) jsou účinně ionizovány pozitivní ESI Detekční limity 10,0 až 50,0 ng/ml (K. Pihlainen et al., J. Chromatogr. A, 994 (2003) )

47 (I) amfetamin, (II) 3,4-MDMA, (III) buprenorfin, (IV) clenbuterol, (V) salbutamol, (VI) LSD, (VII) metandienon, (VIII) nandrolon, (IX) stanozolol, (X) testosteron, (XI) morfin, (XII) fenobarbital, (XIII) psilocybin, (XIV) temazepam

48 MS MS spektra amfetaminu a 3,4-MDMA

49 A p-oh-ap, B p-oh-ma, C norefedrin D, efedrin, E AP; F 3,4- methylendioxyamfetamin (MDA), G 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA), H MA, I methoxyfenamin, J DMA. K dibenzylamin (I.S.)

50 Rekonstruovaný iontový chromatogram (1) psilocybin (2) morfin (3) salbutamol (4) amfetamin (5) 3,4-MDMA (6) clenbuterol (7) LSD (8) fenobarbital (9) buprenorfin (10) temazepam (11) nandrolon, (12) metandienon (13) testosteron (14) stanozolol

51 Analýza amfetaminů Mikroextrakce monolitickou kapilárou on-line s HPLC (UV detekce) pro analýzu amfetaminu, methamfetaminu a jejich methylendioxy- derivátů v moči D.L ng/ml. Vysoká reprodukovatelnost (RSD < 2.9%) v rozsahu g/ml, doba analýzy 25 min. (Yi F. et al., J.Chromatogr.A, 1074 (2005) 9 16.)

52 Amfetamin (PA), methamfetamin (MPA), 3,4-methylendioxoamfetamin (MDA), 3,4-methylendioxomethamfetamin (MDMA)

53 Analýza vzorku s PA,MDA,MPA, MDMA (1 g/ml) s SPME (a) a přímý nástřik (b)

54 Analýza moči 3 osob podezřelých ze závislosti na amfetaminech

55 Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího DMA 4 MA 5 AP 6 DMA-N-oxid 7 DMA

56 Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího selegilin 1 - SG-N-oxid 2 desmethylselegilin 3 ethylamfetamin 4 MA 5 - AP

57 Struktura Fen, Norf a N-Fen N-Fen v čínských přípravcích k hubnutí Fen a Norfmetabolity, škodlivé účinky, zakázané

58 A extrakt vlasů, B extrakt vlasů se 100 pg/mg norfenfluraminu a 230 pg/mg fenfluraminu, C - extrakt 1 vlasu pacienta (HPLC s fluorescenční detekcí po derivatizaci)

59 Stanovení meprobamatu ve vlasech Předběžná úprava: 1 M HCl přes noc při 60 o C Extrakce: LL s fosfátovým pufrem (ph 5,5) a chloroformem Analytická metoda: HPLC-MS nebo GC-MS pro derivatizaci s trimethylfenylamonium hydroxide Měřené koncentrace 3,32 and 4,21 ng/mg (2 osoby) DL 0,2 ng/mg [28] Dávka: 400 mg 4,27 6,08 ng/mg. 800 mg 8,54 13,01 ng/mg 1200 mg 11,89 17,64 ng/mg

60 Sulfonylmočovinové antidiabetikum glibenclamid

61 Extrahovaný iontový chromatogram m/z 221, celkový iontový chromatogram a hmotnostní spektrum ethylglukuronidu (metabolit ethanolu)

62 Tetrodoxin - toxin z ryby ježíka

63 Stanovení halucinogeních aminů Psilocybin (4-fosforyloxy-N-dimethyltryptamin) Psilocin (4-hydroxy-N,N-dimethyltryptamin) HPLC s elektrochemickou detekcí, + 1,0 V (Ag/AgCl), mobilní fáze 0,1 M fosfátový pufr, ph 3, v/v ethanolu Obsah v houbě Psilocybe bohemica Šebek Psilocybin 0,57 % Psilocin 0,061 %

64 HPLC analýza extraktu houby Psilocybe bohemica Šebek s UV a elektrochemickou detekcí (R.Kysilka a spol., J.Chromatogr. 320, 414 (1985))

65 Antiepileptika HPLC-MS (API-ES positive) kafein, fenylethylmalonamid,ethosuximid, primidon, fenobarbital, methylfenylsukcimid, karbamazepinepoxid, fenoytoin,karbamazepin)

66 HPLC-UV analýza Ginko biloby (SPE C18, gradientová eluce methanol-h 3 PO 4 -voda

67 HPLC-DAD analýza extraktu rostliny Ephedra Sinica Stamp (extrakce etherem, gradientová eluce acetonitril, H 3 PO 4,voda)

68

69 Chirální separace Důležité ve farmaceutickém průmyslu, ale i při stanvoení metabolitů Derivatizace s chirálním činidlem v kombinaci s nechirální stacionární fází Chirální stacionární fáze chemicky vázaný cyklodextrin, ergotalkaloidy, albumin atd.

70 Extase (ADAM, E, XTC) MDMA 3,4-methylendioxymethamfetamin 1912 vyvinuto firmou Merck jako anoretikum, neuvedeno na trh euforické a stimulující účinky enantimery, S + forma je potentnější než R - forma chirální separace s chemicky vázanou fází (cyklodextrin)

71 Extrahovaný chromatogram (A) moči a MS spektra L-AP (B) a L-MA (C) 1, D-AP; 2, L-AP; 3, D-MA, 4 L-MA

72 Závěry HPLC-MS stává rutinní metodou v analytické toxikologie Umožňuje identifikaci a stanovení drog a jejich metabolitů ve stopových koncentrací ve složité matrici Miniaturizace usnadňuje spojení HLPC-MS Nové stacionární fáze: zrychlení analýzy, vyšší selektivita

73 Doporučená literatura V. Pacáková, K. Štulík, Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, SNTL, Praha K.Štulík a kol., Analytické separační metody, Karolinum, Praha 2004

74