Iontové zdroje. Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 Iontové zdroje Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Elektronová ionizace (Electron ionization, Electron Impact, EI) Dempster, Bleakney, Nier Látka je v plynném stavu a v tomto stavu je ionizována, velmi vhodné pro spojení s GC Kapalné vzorky jsou odpařeny pro získání plynné fáze EI se používá pro látky s bodem varu do 500 C a molekulovou hmotností do ~ 1000 Da, tlak v iontové zdroji je kolem 10-3 Pa Elektrony jsou emitovány z vyhřívaného wolframového nebo rheniového vlákna - filamentu a urychlovány definovaným potenciálem (~obvykle 70V), který je mezi vláknem a anodou Energie elektronů zhruba odpovídá vlnové délce srovnatelné s délkou vazby v organických látkách: λ = h mv 20eV kinetické energie elektronu odpovídá 2,7Å a 70eV 1,4Å a pro magnetický sektor V

3

4 Závislost počtu vytvořených iontů na energii elektronů, široké maximum v oblasti 70 ev

5 Pohyb elektronů je kolmý na směr letu molekul analytu, dochází k předání kinetické energie elektronů molekulám analytu Pro dosažení ionizace ovšem postačuje energie asi 10eV, zbývající energie způsobuje rozsahlou fragmentaci vzniklého iontu Primární reakce: - + M + e M + Vzniká tzv. molekulový ion, jedná se přesně řečeno o ion-radikál 2e -

6

7 Energie elektronů vede k fragmentaci molekulového iontu za vzniku fragmentů

8 Energie je často tak velká, že molekulární pík ve spektru je velmi malý a jsou měřitelné jen dceřinné ionty Izotopové píky..

9 ..

10 Chemická ionizace (Chemical ionization, CI) Látka je ionizována v plynném stavu, velmi vhodné pro spojení s GC Při této technice ionizace vznikající ionty mají jen malou nadbytečnou energii a fragmentace je podstatně omezena, CI je tedy vhodnou komplementární technikou k EI Analyty jsou ionizovány pomocí kolizí s ionty reagenčního plynu, tyto ionty jsou generovány stejně jako v případě EI, tzn. elektrony Tlak v reakční ionizační oblasti je ~ 60 Pa (volná střední dráha letu ~ 0,1 mm), v analyzátoru 10-3 Pa, poměr analyt/plyn 1/ Analyt je ionizován především interakcí s ionty reagenčního plynu Vznikají pozitivně i negativně nabité ionty: dochází k přenosu protonu, abstrakci hydridu, vzniku aduktů a přenosu náboje => vznikají pseudomolekulární ionty

11

12 Přenos protonu Jednou z nejčastějších reakcí mezi analytem a ionizovaným pomocným plynem ve formě GH + je přenos protonu na analyt Důležitá je afinita analytu k protonům ve srovnání k této afinitě pro pomocný plyn Jde o reakci typu kyselina-zásada podle Brönstedovy teorie Pokud je afinita analytu k protonům podstatně větší než u pomocného plynu, je přenos protonu velmi pravděpodobný Různé reagenční plyny se liší protonovou afinitou (PA), methan (PA=5,7eV), isobutan (PA=8,5eV), amoniak (PA=9,0eV) Isobutan a amoniak jsou selektivnější a protonace anayltu je méně exotermická, zatím co v případě mathanu ještě může docházet k fragmentaci, pro isobutan a amoniak je fragmetace daleko menší

13 butyl methacrylate

14 Vznik aduktů V plasmě při chemické ionizaci mohou všechny ionty tvořit asociáty s polárními molekulami Proces je většinou spojen se vznikem vodíkových vazeb Probíhají reakce typu: MH + + M ---> (2M + H) +, M je molekula F + + M ---> (F + M) +, F je fragment Tyto produkty mohou mít velký diagnostický význam pro identifikaci analytu, určení jeho molekulové hmotnosti, je třeba se vždy pokusit logicky vysvětlit jejich přítomnost ve spektru

15 Přenos náboje Vzácné plyny, dusík, oxid uhelnatý poskytují reakce: Xe + e - ---> Xe +. +2e - Xe +. + M ---> M +. +Xe Výsledkem je iont-radiál podobně jako při EI ionizaci, ale má nižší energii a dochází k méně rozsáhlé fragmentaci Tyto plyny se ale běžně pro CI nepoužívají

16 Pomocné/reagenční plyny Methan Při zavedení mathanu do iontového objemu (ion volume) je primární reakce s elektrony obvyklá, tedy: CH 4 + e - ---> CH e - Tento iont fragmentuje především následujícími rekacemi: CH > CH3 + + H. CH > CH H2 ale vedle těchto dějů probíhá především reakce s molekulami methanu: CH CH4 ---> CH CH 3. a CH CH 4 ---> C 2 H H 2 Iont C 3 H 5 + vzniká reakcemi: CH CH 4 ---> C 2 H H 2 + H. C 2 H CH 4 ---> C 3 H H 2

17

18 Analyty většinou poskytují reakci: M + CH > MH + + CH 4 ale pokud je analyt nasycený uhlovodík RH, je pozorována abstrakce hydridu: RH + CH > R + + CH 4 + H 2 kromě toho dochází v případě polárních látek i ke vzniku aduktů: M + CH > (M + CH 3 ) + Vznik všech těchto molekulových specií/pseudomolekulárních iontů má diagnostický význam a může pomoci při určení molekulové hmotnosti studované molekuly

19 Isobutan C 3 H 3 + Většinou dochází k protonaci analytu, ale polátní látky poskytují také adukty s t-butyl iontem, tj. vzniká (M+57) +, a s C 3 H 3 +, tj. vzniká iont (M+39) + Isobutan je neefektivní pro ionizaci uhlovodíků

20 EI CI - methan CI - isobutan

21 Amoniak Ion-radikál vznikající primárním procesem reaguje s molekulou amoniaku: NH NH3 ---> NH NH 2. Následně dochází k reakci za vzniku iontu 35: NH NH 3 ---> (NH 4 + NH 3 ) +

22 V případě tohoto plynu bazické látky a speciálně amniny poskytují přenos protonu: RNH 2 + NH > RNH NH 3 Polární látky schopné tvořit vodíkové vazby a nemající bazické vlastnosti tvoří adukty typu (M+1) + a (M+18) + Nepolární látky, jako nasysecné uhlovodíky, nejsou efektivně ionizovány, také aromatické uhlovodíky, ethery a látky dusíkaté odlišné od aminů jsou jen málo ionizovány

23 Porovnání CI a EI spekter - alifatický alkohol CI EI

24 Particle Beam, PB Vznikl jako LC-MS obdoba GC-MS Klasické rozhraní V prvním kroku odstranění solventu Následně přenos solutu v plynné fázi do iontového zdroje a ionizace elektrony, ionizace chemická nebo FAB Klíčové části rozhraní jsou generátor aerosolu, desolvatační komora, momentový separátor Iontový zdroj je vyhříván na několik set C pro udržení analytu v plynné fázi Možnost tvorby knihoven spekter podobně jako v GC/MS s EI a srovnání s databazí Jedině PB produkuje EI spektra, velká reprodukovatelnost a bohatá strukturní informace

25 Pro látky do molekulové hmotnosti Da univerzální detekce Citlivost je často podstatně nižší ve srovnání s ES, APCI a technikou GC-MS, a je v oblasti jednotek ppm

26

27 Poskytovaná informace: * informace o struktuře (fragmentace, EI) * informace o molekulové hmotnosti (molekulový iont, CI) Použití: * malé iontové, polární i nepolární látky, <1000 Da Ionizační mody: * EI, CI, FAB

28 Termosprej (Thermospray, TS) Vyvinut pro LC-MS, Blakney a Vestal, 1983, tedy před ES a APCI Srdcem je thermospray vaporizer Skrz vyhřívanou kapiláru proudí mobilní fáze z kolony Jemným a přesným nastavením teploty je možno odpařit veškerou kapalinu na konci kapiláry Teplota se upravuje podle potřeby velmi jemně v reálném čase Odpařená kapalina se nachází v komoře sprejovací komoře, kde je snížen tlak ( 10 torr) Odpařený ionizovaný solut je vnesen do analyzátoru přes kónickou štěrbinu/otvor Omezením TS je fakt, že mobilní fáze musí být vodná a musí obsahovat vhodný pufr pro dosažení ionizace analytů K dosažení ionizace širší palety látek byl TS doplněn filamentem nebo jiným příslušenstvím, např. corona discharge

29 Kompatibilní s průtoky do 1 ml/min Poměrně malá spolehlivost a reprodukovatelnost ionizace Aplikačně se překrývá s APCI, ale APCI a ES jsou modernější

30

31 Poskytovaná informace: * informace o struktuře, při užití MS/MS * informace o molekulové hmotnosti Použití: * malé ionty a polární molekuly do <2 000 Da Ionizační mody: * Therospray Ionization TSI * Filament on a discharge CI * polarita positivní/negativní

32 Fast Atom/Ion Bombardment (FAB) a CF-FAB (Continuous flow) Vzorek musí být rozpuětěn v netěkavé kapalné matrici: glycerol, m-nitrobenzyl alkohol, thioglycerol Jedno z nejpřímějších rozhraní mezi LC a MS Efluent je zaváděn přímo do oblasti velmi nízkého tlaku přes sondu při malém průtoku ~ 10 µl/min Kapalina se odpařuje přímo v iontovém zdroji, někdy je sonda zahřívána pro zamezení mrznutí a zlepšení odpařovacího procesu FAB je desorpční technika k desorpci dochází nárazem rychlých atomů nebo iontů (5-8 KeV pro Xe, Ar, a 30 KeV pro Cs + ) na tenkou vrstvu kapaliny na výstupu ze sondy Kinetická energie atomů/iontů se přenese na solut a ten je desorbován z povrchu a přenesen do analyzátoru

33 Probíhá reakce: Ar (rychlý) +. + Ar (pomalý) ---> Ar (pomalý) +. + Ar (rychlý)

34

35 Volba matrice je velmi podstatná, ovlivňuje ionizaci FAB umožňuje ionizaci polárních látek s poměrně vysokou molekulovou hmotností, asi do 10 kda, je tak možno získat spektra poměrně velkých peptidů a nukleotidů Spektra lze měřit po relativně dlouhou dobu ve stop-flow režimu a lze provést více MS experimentů postupně FAB spektra obsahují interference na všech m/z, efekt matrice

36

37 Ionizace za atmosférického tlaku (Atmospheric pressure ionization, API) 1) Elektrosprej (Electrospray ionization, ESI; Electrospray, ES) 2) Chemická ionizace za atmosférického tlaku (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) 3) Fotoionizace za atmosférického tlaku (Atmospheric Pressure Photoionization, APPI)

38 Elektrosprej (Electrospray, ES) Tvorba iontů za atmosferického tlaku, vhodné rozhraní pro LC-MS Přenos iontů do analyzátoru do oblasti sníženého tlaku přes systém štěrbin Kapilárou protéká mobilní fáze, na kapiláře je vložen vysoký elektrický potenciál několik tisíc voltů (2-6 kv) Tvoří se kónický meniskus na konci kapiláry a formuje se sprej nabitých kapiček solventu a analytu Probíhá odpařování solventu a tvorba iontů analytu Ionty mají často velký náboj, to umožňuje měřit vysokomolekulární látky až MDa Velký vliv mobilní fáze na vznik iontů, nutná optimalizace podmínek ES Průtoky mobilní fáze 1-10 µl/min, ale běžná modifikace pro vysoké průtoky do 1 ml/min ESI není univerzální iontový zdroj, nepolární látky nepodléhají ionizaci Vznikají především ionty typu [M+H] +, [M+Na] +, [M+K] + v pozitivním modu a ionty typu [M-H] - negativním modu

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48 ES Iontový zdroj fy Waters (instument Q-Tof-micro)

49

50 Výpočet molekulové hmotnosti polypeptidu/proteinu z ESI+ spektra z 1 m 1 = M + z 1 m p z 1 je náboj iontu ve spektru s hodnotou m/z odpovídající m 1, M je molekulová hmotnost polypeptidu a m p je hmotnost protonu Sousední iont ve spektru směrem vyšší hodnotě m/z s hodnotou m 2, nese z 1 1 nábojů, takže platí: m 2 (z 1-1) = M + (z 1-1)m p Takže platí vztahy: z 1 = (m 2 - m p )/(m 2 m 1 ) M = z 1 (m 1 - m p )

51

52

53 Poskytovaná informace: * molekulová hmotnost * strukturní informace při technice CID, MS/MS Použití: * makromolekuly nesoucí náboj v roztoku * malé jednou nabité ionty Ionizační mody: * polarita pozitivní/negativní

54 Chemická ionizace za atmosferického tlaku (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) Tvorba iontů za atmosferického tlaku Rozhraní podobné ES, ale mechanizmus vzniku iontů je jiný Mobilní fáze je sprejována do vyhřívané komory (400 C) Mobilní fáze je odpařena a teprve v plynné fázi dojde ke vzniku iontů analytu, zprostředkovaně pomocí elektronů z discharge needle Dochází k interakci mezi elektrony a zplyněnou mobilní fází a dalšími plyny za vzniku H 3 O + (H 2 O) n iontů Následně interagují tyto klastry s analyty a jejich protonaci APCI je vhodný pro ionizaci léčiv a řady metabolitů Citlivost, robusnost, spolehlivost, menší citlivost vzhledem chemickým interferencím ve srovnání s ES řadí tento proces k velmi používaným v oblasti farmaceutických aplikací

55

56

57 Poskytovaná informace: * molekulová hmotnost < 2000 amu * strukturní informace při technice CID, MS/MS Použití: * ionizovatelné, polární i nepolární látky Ionizační mody: * polarita pozitivní/negativní

58 Fotoionizace za atmosferického tlaku (Atmospheric pressure photoionization, APPI) Tvorba iontů za atmosferického tlaku Rozhraní podobné APCI Mobilní fáze je sprejována do vyhřívané komory (400 C) Mobilní fáze je odpařena a teprve v plynné fázi dojde ke vzniku iontů analytu proudem fotonů s úzce vymezeným ionizačním potenciálem Cílem je přednostně ionizovat širokou paletu analytů, ale přitom vyvolat minimální ionizaci rozpouštědla APPI je vhodný pro ionizaci podobných látek jako jsou ionizovány APCI, ale APPI je schopna navíc ionizovat i velmi málo polární látky, polyaromáty aplikací

59

60 Rozsah použitelnosti různých ionizačních technik

61 Desorpce laserem za spoluúčasti matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) Měřený vzorek je dispergován v prostředí vhodné matrice, která je primárně ionizována laserem a absorbovaná energie je sekundárně přenesena z matrice na analyt a tím jej ionizuje Příprava vzorku většinou spočívá ve smíchání vzorku rozpuštěného v solventu s vhodnou matricí rozpouštěnou také v rozpouštědle, následně je solven odpařen a vzniknou směsné krystaly analytu a matrice Mohou se užívat různé lasery, v UV oblasati dusíkový (λ=337nm), Nd:YAG (λ=266 nebo 355nm), dále v IR oblasti Er:YAG (λ=2.94µm), CO 2 (λ=10.6µm) Výběr matrice závisí na použitém laseru a na typu analytu, matrice musí silně absorbovat použitou vlnovou délku, musí snadno sublimovat, nesmí podléhat chemickým reakcím a musí být stabilní za vakua

62

63

64 Fragmentace nebývá rozsáhlá Vznikají především jednou nabité ionty, adukty Možnost fragmentace post-source decay (PSD), probíhá v letové trubici analyzátoru MALDI obvykle využívá analyzátor typu TOF, MALDI-TOF

65