Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
|
|
- Radka Romana Marková
- před 7 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 22 Analytická HPLC Kvalitativní analýza Cílem kvalitativní analýzy je identifikovat pík chromatogramu nebo konkrétní složku v eluentu. Pokud je chemické složení zcela neznámé, můžeme využít při identifikaci některou ze speciálních analytických technik. Další možností je získání většího množství materiálu semi-preparativní nebo preparativní HPLC a ten potom analyzovat off-line různými analytickými metodami. Jestliže naopak ve vzorku předpokládáme přítomnost několika komponent, můžeme pro nejjednodušší určení porovnat hodnoty k neznámých píků a referenčních látek, které byly naměřeny za stejných chromatografických podmínek. Jestliže se shodují retenční časy píků, mohlo by se jednat o stejné látky. Nicméně měly by být provedeny ještě další experimenty, aby byla identifikace spolehlivější: a) Referenční látka je přimíchána do vzorku. Zkoumaný pík by měl být vyšší, bez toho aniž by byla přítomna raménka nebo se projevilo rozšiřování píku. Kolona s větším
2 počtem teoretických pater má větší schopnost rozlišit dvě podobné látky se srovnatelným chromatografickým chováním. b) Stejný test by měl být proveden i s jinou mobilní a nejlépe i jinou stacionární fází. Fáze by měly mít diametrálně rozdílné vlastnosti (třeba normální vs reverzní fáze). Pokud sledovaný pík nejeví ani při jedné analýze známky separace, je velmi pravděpodobné, že se jedná o identické látky. Už jsme zmínili, že zkoumaný pík musí být důkladně analyzován, aby mohl být určen s potřebnou jistotou. K dalšímu zlepšení kvalitativní analýzy můžeme dospět i bez větších výdajů následujícími postupy: a) Specifičtější detektor přispívá k identifikaci píku. RI detektor je univerzální a zachytí všechny složky, ale UV detektor dává odezvu jen pro absorbující látky a fluorescenční detektor reaguje jen na fluoreskující sloučeniny. Ještě vyšší specificity (u fluoreskujících látek) může být dosaženo nastavením excitační a emisní vlnové délky. b) Změna zaznamenávané vlnové délky UV detektoru musí být doprovázena stejnou odezvou signálu vzorku i reference. To znamená, že relativní nárůst i pokles by měl být stejný. Poměr absorbancí při dvou vlnových délkách je specifický pro každou látku. c) Poměr signálů UV a za ním zapojeného RI detektoru (nebo jiné dvojice detektorů) je za daných podmínek pro látku charakteristický. Průkaznější, nicméně náročnější, jsou speciální metody. Zejména diodové pole a spřažené techniky s hmotností spektrometrií jsou v kvalitativní analýze využívány. Vlivem použitého rozpouštědla vzorku mohou vznikat píky související se změnou indexu lomu eluentu (tzv. refractive index peaks) a nesmí být zaměňovány za píky analytu (obr. níže). Vždy je lepší vzorek rozpouštět v samotné mobilní fázi, abychom se těmto neočekávaným píkům vyhnuli. Nicméně pokud není možné vzorek rozpouštět v mobilní fázi, můžeme provést slepý pokus s čistým solventem. Porovnání retenčních časů je významně ovlivněno stabilitou průtoku mobilní fáze kolonou a je tak méně citlivé než metoda nástřiku směsi reference se vzorkem.
3 Stopová analýza Jestliže je cílem analýzy kvantitativní nebo kvalitativní analýza látek v nízkých koncentracích, je nezbytná optimalizace chromatografického systému. Při izokratické eluci vždy platí, že je koncentrace v maximu píku c max nižší než koncentrace v nástřiku c i. kde: V i je objem nastříknutého vzorku, V R je retenční objem, V R = t R F, a N je počet teoretických pater kolony. (S gradientovou elucí je c max vyšší než vychází z výpočtu pomocí tohoto vzorce.) Příklad Je nastříknuto 10 µl roztoku s koncentraci zkoumaného analytu 1ppm (10-6 g ml -1 ). Retenční objem odpovídajícího píku je 14 ml. K tomuto píku je vyčíslen počet teoretických pater kolony na Jaká je koncentrace v maximu píku (c max )? Řešení Pro stopovou analýzu je nezbytné získat nejvyšší signál, to znamená nejvyšší možnou koncentraci v maximu píku. Jak toho docílit? Příklad Pro separaci z úlohy výše byla použita kolona o délce 15 cm, vnitřním průměru 4,6 mm a náplní 5 µm. Koncentrace v maximu píku 0,028 ppm poskytla signál 1mV na UV detektoru. Vypočtěte intenzitu signálu při následujících podmínkách (všechny ostatní parametry zůstávají nezměněny). a) délka kolony je 25 cm,
4 b) vnitřní průměr kolony je 3 mm, c) náplň kolony tvoří částice o průměru 3,5 µm. Řešení a) Jestliže je náplň nové kolony identické kvality, je výška teoretického patra H stejná. Proto je počet teoretických pater N, stejně tak retenční objem V R, 25 cm dlouhé kolony 1,7 násobně vyšší (25 : 15 = 1,7). b) odpovídající signálu 0,8 mv. odpovídající signálu 2,4 mv. c) S identickou náplní kolony s částicemi 3,5 µm bude teoretický počet pater 1,4 krát vyšší (5,0 : 3,5 = 1,4). odpovídající signálu 1,2 mv. Je jasné, že nejmenšího ředění a nejvyššího píku je dosaženo, jestliže je použita krátká a hlavně úzká kolona s největším možným počtem teoretických pater. Separační účinnost kolony je důsledkem její kvality, použití dobré náplně, ale nikoliv její délky. Delší kolona dává nižší koncentrace v maximech píků, protože V R stejně jako N jsou úměrné délce kolony L C, tudíž c max závisí na. S danou koncentrací vzorku c i je ředění píků menší s větším objemem nástřiku, vyšším počtem pater a menším retenčním objemem. Dříve zmíněná rovnice může být napsána i jiným způsobem (protože a ):
5 kde: d C je vnitřní průměr kolony, ε je celková porozita, k je retenční faktor, L C je délka kolony, a H je výška teoretického patra. Nyní je nejlepší strategie zřejmá: - Použít kolonu s malým vnitřním průměrem. Dvojnásobné zúžení znamená čtyřnásobné zvýšení c max - Použít krátkou kolonu - Použít náplň kolony s malou výškou teoretického patra. Toho je dosaženo menšími částicemi, výborným plněním a stacionární fází s dobrými vlastnostmi přenosu hmoty. Kolona musí být provozována ve svém van Deemterovském optimu - Eluovat analyt s malým retenčním faktorem Ačkoli jsou preferovány krátké kolony, musí být zároveň dostatečně dlouhé k dosažení dělení směsi. Metoda musí být optimalizována s ohledem na stopové složky. Z rovnice rovněž vyplývá, že látkové množství vzorku (neboli součin c i V i ) by mělo být velké. Může dokonce docházet i k přetížení kolony majoritní složkou pokud není ovlivněno rozlišení stopového píku (obr. níže). Nicméně objem nástřiku je na druhou stranu omezen kvůli rozšiřování píku. Největší objem nástřiku, který způsobí rozšiřování pásů do 9% je dán:
6 Je možný i alternativní způsob zápisu rovnice (protože retenční čas a rychlost průtoku ): Pokud máme k dispozici dostatečné množství vzorku (např. analýzy potravin), je možné nastříknout V i max, i když budou dříve eluované píky široké nebo hlavní složka přetíží kolonu (za předpokladu, že se tím nezmění rozlišení pro stopový analyt). Tím pádem bude koncentrace v maximu píku definována ze spojených rovnic pro c max a V i max : Toto je nejpříznivější situace pro izokratickou eluci (a 9% rozšiřování píků) i přes to, že je čtyřnásobné ředění poměrně velké. Všimněte si, že za těchto podmínek (dostatečné množství analytu a nástřik V i max ) nemají dříve zmíněné požadavky, jako jsou dostatečně krátká a úzká kolona, malá výška teoretického patra a krátký retenční čas, žádný význam. Jestliže V i max neovlivňuje rozlišení, rovnice c max = 0,24c i platí i pro široké, dlouhé a špatně naplněné kolony. Nicméně je vždy žádoucí optimalizovat separační proces, protože tím ušetříme čas a množství potřebného solventu. Ve stopové analýze musíme rovněž vzít v úvahu některé další skutečnosti: a) Vyhýbáme se chvostování. Asymetrické píky jsou širší, a tím pádem i nižší než symetrické píky.
7 b) Gradientovou elucí jsou píky zužovány, a proto jsou i vyšší. Jestliže není možné eluovat složku ve stopové koncentraci při nízkém retenčním faktoru, je doporučováno využít gradientovou eluci. Může být použit skokový gradient, který je při správném načasování jednoduchým a efektivním řešením. c) Měli bychom použít detektor s nejnižším možným detekčním limitem. Detektory na principu měření obecných vlastností, jako index lomu aj., nejsou pro stopové analýzy vhodné. Používanější jsou detektory fluorescenční, elektrochemické, nebo UV detektory, se kterými můžeme maskovat interferující nečistoty volbou vhodné vlnové délky. Podobného efektu se dá docílit i pomocí MS detekce sledováním charakteristického iontu. Zlepšení meze detekce až o několik řádů můžeme dosáhnout derivatizací analytů. Při stopových analýzách může být občas přesnější kvantifikace pomocí výšky píku, než integrací jeho plochy. Ačkoli je pro kvantitativní analýzu nezbytný poměr signálu k šumu alespoň 10, pro kvalitativní analýzu je postačující poměr lepší než 3. Při stopové analýze je nejdůležitější správná příprava vzorku (pokud to jde i s obohacením/zkoncentrováním analytu). Samotná HPLC poskytuje účinné možnosti zakoncetrování. Pokud má rozpouštědlo malou eluční sílu, je vzorek zachycen a koncentrován přímo na vstupu do kolony. Jestliže je potom použit eluent s vysokou eluční silou, omezuje se rozšiřování píků a koncentrace v maximu píků jsou vysoké. Tento postup je nejefektivnější pokud se dá provozovat při k = 0, tzn. s rozpouštědlem na čele. Tato technika je označováno jako vytěsňovací chromatografie (displacement chromatography). Například se podařilo krát obohatit fenoly ve vodách na stacionární fázi styren-divinylbenzenu. Pro oddělení hlavního analytu od stopových látek může být využita technika přepínání kolony (column switching). Limity stanovitelnosti a detekce budou rozebírány i v jiné části textu. Kvantitativní analýza Signál detektoru je v HPLC mnohem více závislý na vlastnostech specifické složky než v plynové chromatografii. Například absorpce UV je funkcí molárního absorpčního koeficientu, který se pohybuje pro různé látky od 0 až po l mol -1 cm -1. Absorpční
8 koeficient se rovněž liší pro jednotlivé látky homologických řad. Z tohoto důvodu je nezbytné vytvořit kalibrační závislost pro každou stanovovanou látku. Kalibrace může být provedena třemi různými metodami: externím (vnějším) standardem, interním (vnitřním) standardem a standardním přídavkem (viz obrázek dole). Celý postup je zde vysvětlen na jednobodové kalibraci, i když je v každém případě lepší provádět kalibraci alespoň na tři nebo více bodů. V takovém případě potom nejsou výpočty prováděny jednoduchou trojčlenkou, jak je uváděno níže, ale pomocí regresní analýzy kalibračního grafu. Kalibrační závislost by měla být lineární a měla by procházet počátkem souřadnicového systému. Jestliže používáme ke kvantifikaci starší kalibraci, je možné, že se současné chromatografické podmínky liší od těch minulých, a tím roste systematická chyba měření. Pro kvantitativní analýzu můžeme využít plochy i výšky píků, v následujícím textu slovem signál budeme označovat obě možnosti. Modelovým příkladem bude stanovení glukózy v limonádách. Obsah glukózy předpokládáme asi kolem 5 g l -1. Tři kalibrační postupy v tomto případě budou následující: a) Metoda externího standardu. Připravíme roztok standardu o známé koncentraci 6 g l -1 (není důležité, aby byla přesně 6,000 g l -1, ale musí být přesně známa). Plocha píku tohoto roztoku S std byla 5400 a plocha píku neznámého vzorku S vz byla 3600.
9
10 b) Metoda interního standardu. Ke vzorku i ke standardu (z odstavce a) přidáme stejné množství jiné látky, která není přítomna ve vzorku. Například přidáme fruktózu (obsah v obou roztocích 10 g l -1 ). Plochy píků pro glukózu jsou stejné, jako v předchozím případě. Plochy píků fruktózy jsou pro oba roztoky stejné, rovny Z uvedených měření je možné vypočítat poměr signálů, který udává i poměr obsahu složek. c) Metoda standardního přídavku. Do vzorku je přidáno známé množství analytu. V tomto případě tedy přídavek glukózy 5 g l -1. Plochy píků jsou 3600 pro samotný vzorek a 8100 pro vzorek s přídavkem. Metoda externího standardu je nejjednodušší a měla by být použita jen pro jednodušší analýzy. Nástřik musí být v tomto případě proveden s dobrou reprodukovatelností, proto je doporučován nástřik vzorku s využitím zcela naplněné smyčky. Při vícebodové kalibraci není vhodné nastřikovat různé objemy vzorku a referenčních standardů (např. 10, 20, 30, 40 a 50 µl), protože není možné zajistit dostatečnou přesnost a správnost těchto nástřiků. Je výhodnější připravit množství kalibračních roztoků s různými koncentracemi a nastříknout pokaždé stejný objem (pomocí zcela naplněné smyčky nebo alespoň stejným postupem, kterým byl dávkován vzorek). V případě kalibrace na vnitřní standard odchylky v objemu nástřiku nejsou podstatné. Tato metoda je preferována, pokud je příprava vzorku složitá. Přídavek standardu probíhá před samotnou úpravou vzorku. Výběr vhodného vnitřního standardu není jednoduchý. Musí být dostatečně čistý, s přesně definovaným složením a podobnými vlastnostmi, jaké má analyt zejména ohledně úpravy vzorku, chromatografické separace a samozřejmě konečné detekce. Navíc by měl být pík standardu v chromatogramu vmezeřený mezi ostatními píky, ne na začátku ani na konci záznamu.
11 Standardní přídavek je elegantní metoda pokud máme k dispozici neomezené množství vzorku. Umožňuje analýzu kalibrovat za realistických podmínek se všemi intercedenty, tedy v aktuální matrici. Metody standardního přídavku a vnitřního standardu mohou být navzájem kombinovány. Definovat, jak často je třeba provádět kalibraci, je důležitou součástí validace analytických postupů. Je rovněž nezbytné zvážit možné chyby v kalibračních křivkách. V obrázku níže je vidět rozdíl mezi konstantní systematickou odchylkou a úměrnou systematickou odchylkou. V prvním případě kalibrační křivka neprochází počátkem. Odchylka může být pozitivní (jako v tomto grafu), ale i negativní. Při použití metody standardního přídavku tento typ chyby nemůžeme určit! Křivka s úměrnou chybou má odlišný sklon, který může být větší nebo menší. Oba typy odchylek se mohou objevovat současně a mohou být odhaleny určením výtěžnosti. Pro nalezení meze stanovitelnosti (LOQ) bylo navrženo mnoho metod. Musí být definována nejnižší koncentrace analytu, kterou je potřeba stanovit s požadovanou správností a opakovatelností. Nejpragmatičtějším přístupem je stanovit si horní limit standardní nejistoty opakovatelnosti a najít jej experimentálně. Mělo by být analyzováno nejméně šest různých koncentrací v okolí očekávaného LOQ a každá koncentrace stanovena nejméně šestkrát.
12 Příklad Bylo analyzováno šest roztoků různých koncentrací s matricí, každý z nich desetkrát. Požadavek na opakovatelnost je specifikován maximální relativní standardní nejistotou 10%. Byla zjištěna následující data: c [ppm] ,38 4,06 5,48 5,52 5,70 6,12 4,30 5,18 5,44 4, ,09 9,36 11,29 9,92 10,76 10,50 9,35 11,38 10,21 12, ,05 13,21 18,76 17,45 16,05 14,68 14,19 14,03 17,59 15, ,86 19,36 20,87 18,97 18,37 19,82 17,90 18,25 23,42 22, ,59 24,22 20,33 27,41 26,54 25,99 24,63 26,90 23,55 22, ,03 28,82 32,32 27,84 31,86 31,37 26,96 25,47 30,91 33,09 Jaký je LOQ? Řešení c [ppm] Průměr x Standardní nejistota s(x) RSD [ppm] [ppm] [%] 5 5,14 0,71 13, ,4 1,31 12, ,9 1,82 11, ,8 2,00 10, ,4 2,37 9, ,0 2,54 8,5 Požadovaná odchylka je nalezena při LOQ rovném 20 ppm. Limit stanovitelnosti záleží na vlastnostech analytu, které zaznamenává detektor a hodnotě k. Mez detekce (LOD) je rovna 30% LOQ, to znamená, že v úloze by byl LOD = 7 ppm. Gradiendová eluce může být zdrojem dalších chyb, proto je při kvantitativní analýze doporučováno pracovat s elucí izokratickou. Mimo to je nezbytné, abychom udrželi průtok (pro určení ploch píků) nebo složení mobilní fáze (pro určení výšek píků) konstantní (bude ukázáno později v níže uvedeném obrázku).
13 Vzorek by měl být rozpuštěn v mobilní fázi, protože pokud se liší rozpouštědlo a mobilní fáze může být analýza méně přesná; je rovněž možné, že odezva detektoru je silně závislá na rozpouštědle. Závěrem je třeba říci, že kvantitativní analýza nesmí být prováděna, pokud je přetížena kolona a pokud odezva detektoru není v lineární oblasti kalibrační závislosti. Je třeba prověřit tyto okolnosti pro všechny experimenty. Správnost může být zlepšena termostatováním kolony. Dále bychom si měli uvědomit, že není možné dělat kvantifikaci asymetrických píků. Ověření analytických výsledků můžeme provést několika způsoby. Výtěžnost Pro zjištění možných chyb výsledků plynoucí z úprav vzorků nebo ze samotné matrice je nezbytné určit funkci výtěžnosti a hodnotu výtěžnosti. Postup (výtěžnost přípravy vzorku) a) Analýzou čistého referenčního materiálu, který nebyl podroben postupu zpracování vzorku (nebo byl vynechán krok úpravy). Vyčíslíme kalibrační přímku: Kde: y = signál x 0 = hmotnost nebo koncentrace referenčního analytu a 0 = úsek na ose y b 0 = směrnice přímky b) Čistý referenční analyt je zpracován stejným postupem jako vzorek. Řešení plyne z kalibrační funkce: Kde x p je hmotnost nebo koncentrace analyzovaného referenčního materiálu po zpracování. c) Vypočítané hodnoty x p vyneseme do grafu proti příslušným hodnotám x 0 a následně určíme funkci výtěžnosti:
14 Kde index p vyjadřuje, že jde o parametr veličiny po zpracování vzorku. d) Následně vypočítáme hodnotu výtěžnosti (recovery rate): V ideálním případě by funkce výtěžnosti měla mít lineární průběh s úsekem a p = 0 a směrnicí b p = 1. Pokud a p 0 je v postupu konstantní systematická chyba a jestliže je b p 1 postup úpravy vzorku obsahuje úměrnou systematickou chybu. Funkce i hodnota výtěžnosti mohou být určeny pro každý krok postupu úpravy vzorku zvlášť. To nám dovolí jednoduše nalézt kritické části postupu a zaměřit se na jejich optimalizaci. Následně můžeme stejnou metodiku použít i pro určení matricových efektů se vzorky obohacenými přídavkem standardu. Příklad Následující plochy píků byly naměřeny pro roztok aflatoxinu bez úprav vzorku. 10 ng ng ng ng 9628 Stejné měření bylo provedeno po extrakci vzorku na pevnou fázi. Získaná data byla následující: 10 ng ng ng ng 9050 Vypočítejte funkci i hodnotu výtěžnosti. Posuďte funkci výtěžnosti. Řešení a) Kalibrační křivka získaná lineární regresí je:
15 b) Tato funkce má úsek na ose y (konstantní systematickou chybu). Důvod tkví pravděpodobně v samotné HPLC separaci a měl by být nalezen a odstraněn později. Analogicky je x(20)=17,3 ng, x(30)=27,4 ng a x(40)=37,6 ng. c) Funkce výtěžnosti je nalezena lineární regresí bodů [x p ; x 0 ] tedy [7,2; 10], [17,3; 20], [27,4; 30] a [37,6; 40]: Směrnice je téměř ideální, je zde pouze 1% úměrná systematická chyba. Na ose y je patrné konstantní systematické vychýlení. Znamená, že nalezený obsah aflatoxinu bude nižší o 2,91 ng. Z toho plyne, že extrakce na pevnou fázi musí být zlepšena. d) Kvůli této chybě je hodnota výtěžnosti závislá na absolutní hmotnosti vzorku: Analogicky je RR(20)=86,5%; RR(30)=91,3% a RR(40)=93,7%. Odhad výšky a plochy píku pro kvantitativní analýzu Pro dobře rozlišené píky jsou plocha i výška úměrné koncentraci analytu. Proto je možné vybrat pro kvantifikaci libovolný z těchto parametrů. Obecně je integrace píku přesnější, ale mělo by to být otestováno v rámci validace konkrétní metody. Pro stopovou analýzu je naopak lepší posuzovat výšky píků, protože při nízkém poměru signál/šum je integrace obtížná. Při kvantifikaci píků narážíme na dva hlavní problémy, kterým je třeba věnovat pozornost: vliv vnějšího parametru na výšku a plochu a chyby pocházející z překryvu píků. Vliv retence a rychlosti toku na výšku a plochu píku Vlivy těchto parametrů na kvantifikaci ukazuje obrázek níže. a) Při izokratické separci je výška píku silně ovlivněna retencí (%B solventu). Rychle eluované píky jsou úzké a vysoké (vysoký %B), ale píky s delší retencí jsou nízké a
16 široké (nízký %B). Pro kvantifikaci pomocí výšky píku je nutné, aby bylo složení mobilní fáze stejné při kalibračních měřeních a analýzách (například u namíchaných eluentů z důvodu vypařování složky s nižším bodem varu během dne). Výška je minimálně ovlivněna změnami v průtoku a je řízena van Deemterovou rovnicí. b) Plochy píků, při použití koncentračně citlivých detektorů, jsou silně ovlivněny změnami průtoku mobilní fáze. Pokud analyt protéká pomalu detekční celou, bude i jeho pík v chromatogramu široký, ale výška píku je ovlivněna pouze koncentrací v maximu, proto bude i plocha píku velká. Na druhou stranu pokud analyt protéká rychle, bude plocha jeho píku malá. Z tohoto důvodu je pro kvantifikaci pomocí plochy píků nutné použít čerpadla, které poskytují stabilní průtok mobilní fáze, dokonce, i když se mění odpor. Plocha píku je minimálně ovlivněna %B.
17 Překrývající se píky Překryv píků je významným zdrojem chyb při kvantifikaci. Důvod je zcela zřejmý (viz obrázek níže).
18 Pokud integrátor rozdělí dva píky vertikální přímkou, jejich části přesahují a stávají se tak součástí druhého píku. Ani rozdělení podle tečen místo vertikální přímky nevede k přesné ploše píku (tato metoda je často používaná jako tzv. rider peaks ). Obrázek níže ukazuje vliv integrace pro různá rozlišení, asymetrie a pořadí eluce píků. Vlivy s ohledem na plochy píků mohou být shrnuty v několika bodech: a) S Gausovskými (symetrickými) píky je velký pík zvětšen a malý je naopak zmenšen nehledě na pořadí, ve kterém jsou eluovány. Pouze pokud jsou oba píky symetrické i stejně velké nedopouštíme se rozdělením svislou přímkou žádné chyby. b) Pokud píky chvostují je plocha prvního z nich znevýhodněna a druhý je naopak zvětšen nehledě na poměr velikostí signálů. c) Poměr relativních chyb je nepřímo úměrný k poměru ploch píků. To znamená, že jsou malé píky ovlivněny více. Zde je několik rad, jak se vyhnout těmto chybám:
19 a) Dosáhněte úplného rozlišení píků! Nezbytná hodnota rozlišení závisí na poměru velikostí píků. Pro píky srovnatelné velikosti postačuje rozlišení R = 1,5, ale není dostatečné pro rozdělení píků s poměrem velikostí 20:1 a více. b) Určení výšky píku je v některých případech přesnější než integrace. Kvantifikace pomocí výšky píků je téměř prosta chyb i v případě chvostování, kdy je malý pík eluován před větším. c) Vyhněte se chvostování. Chvostování snižuje rozlišení a má negativní vliv na integraci malých píků před většími. Chvostování můžeme zabránit snížením mimokolonového objemu v přístroji, dobrým naplněním kolony, použitím vhodné stacionární a mobilní fáze, rozpuštěním vzorku ve vhodném rozpouštědle a nepřetěžování kolony.
20 Chyby při integraci Elektronické integrátory a datové systémy jsou nepostradatelné, ale z jejich používání vyplývají i chyby, které mohou být přehlédnuty. K seznámení s touto problematikou může pomoct kniha sepsaná Dysonem 1 nebo jiné souhrnné práce. Mohou se objevit různé druhy chyb, nejzávažnější jsou prezentovány v následujícím obrázku. 1 N. Dyson, Chromatographic Integration Methods, Royal Society of Chemistry, London, 2nd edn, 1998.
21 Druhy chyb a) Nedostatek datových bodů. Ke správnému popisu tvaru píku je potřeba zaznamenat minimálně 10 bodů. Jestliže je sběr datových bodů příliš pomalý, nebude možné správně určit výšku ani plochu píku. Vyhlazování původních dat pomocí integrátoru není v tomto případě správné řešení. Rychlost sběru dat se může a někdy i musí měnit během záznamu chromatogramu. b) Příliš vysoká časová konstanta. Pomalá elektronika detektoru nebo integrátoru zkresluje výstupní signál. Platí, že plocha píku je téměř neovlivněna, výška je
22 zmenšena a chvostování vzroste. Bude zegistrováno snížení rozlišení mezi sousedícími píky. c) Vysoko položená prahová hodnota signálu (treshold). Integrátor rozezná pík, pokud je signál výš než základní linie. Treshold by měl být správně nastaven a musí být nad hodnotou šumu. V každém případě je plocha i výška píku zmenšena, pokud je treshold nastaven přliš vysoko. d) Velký šum. Není možné provádět správnou integraci, pokud je malá hodnota podílu signál/ šumu. Výsledky budou nahodilé dokonce, i když bude použit datový systém dovolující definovat základní linii až po dokončení analýzy. Pro dobrou integraci píku by měl byt podíl signál/šum alespoň 10. e) Drift základní linie. Integrátor obvykle počítá s přímou základní linií. Jestliže je skutečná základní linie zakřivená, bude vypočtená plocha menší než skutečná. f) Neúplné rozlišení. Nákres ukazuje pouze dva nejčastější problémy. Je lepší použít rozdělení tečnami nebo kolmicí? S výjimkou ideálních případů je důsledkem špatného rozlišení vždy chyba v integraci. Asymetrie píků je dokonce ještě zásadnější. V řadě případů nejsou chyby v integraci kompenzovatelné nástřikem standardů a určením kalibračních faktorů, protože roztoky standardů jsou obvykle méně složité než reálné vzorky. Detekční vlnová délka Pokud používáme klasický UV detektor, musíme zvolit určitou vlnovou délku pro záznam chromatogramu (samozřejmě to není potřeba při využití detektoru s diodovým polem diode array detector). Je potřeba zohlednit několik skutečností: a) UV spektra různých složek vzorku, hlavně vlnové délky jejich absorpčních maxim; b) molární absorpční koeficienty v maximech a při vlnové délce, která nakonec bude vybrána k záznamu chromatogramu; c) retenční faktory různých složek. Při izokratické eluci jsou píky postupně širší, a proto i nižší; d) důležitost jednotlivých složek vzorku (v některých případech je třeba kvantifikovat pouze jedinou složku).
23 Čím jsou píky nižší, tím více je ovlivňuje šum. Tím je zhoršena přesnost a pravděpodobně i správnost kvantitativní analýzy. Proto by měly být píky důležitých komponent eluovány co nejdříve a detekovány ve svých absorpčních maximech. Obecně platí, že při detekci na kratších vlnových délkách je analýza méně robustní, je větší nebezpečí, že se objeví tzv. systémové píky. Základní linie je při gradientové separaci náchylnější k driftování. Je nutné vhodnost zvolené vlnové délky ověřit na daném přístroji a provádět pravidelně testy aparatury, abychom byli schopni zaručit dlouhodobou správnost. Dokonce i malá odchylka od správné vlnové délky může znamenat zásadní chybu v analytických výsledcích. V chromatogramech níže by měla být správná vlnová délka pro stanovení nitropenty (poslední pík) 214 nm, což je absorpční maximum látky. Pokud je vlnová délka změněna na 216 nm důsledkem chyby v nastavení nebo nezaregistrovanou změnou v optice přístroje, poklesne plocha píku nitropenty na 85% skutečné hodnoty, zatímco ostatní píky tak podstatně ovlivněny nejsou. Derivatizace Detekce je největší problém spojený s HPLC. Pokud nemůžeme použít citlivý detektor (např. fluorescenční), je detekční limit mnohem vyšší než v plynové chromotografii s plamenovým ionizačním detektorem. Derivatizační reakce jsou vhodným nástrojem pro zvýšení detekčního limitu v kapalinové chromatografii.
24 Derivatizace je definovaná změna analytu pomocí chemické reakce a může být provedena před nástřikem (předkolonová derivatizace), nebo mezi kolonou a detektorem (pokolonová derivatizace). Předkolonová derivatizace Výhody a) Mohou být libovolně zvoleny reakční podmínky b) Reakce může být pomalá c) Derivatizace může sloužit i jako čistící a procesní krok d) Přebytek činidla může být odstraněn Nevýhody a) Během delší reakční doby se mohou tvořit vedlejší produkty b) Reakce by měla být kvantitativní c) Různé složky vzorku získají derivatizací podobné vlastnosti. To může vést ke snížení chromatografické selektivity. Pokolonová derivatizace: reakční detektory V tomto případě je činidlo přidáno do eluentu proudícího z kolony. Obecně by měl mít roztok činidla vysokou koncentraci, aby bylo ředění omezeno na minimum. Reakční cela je vyhřívána, protože reakce většinou probíhají rychleji při vyšší teplotě. Výhody a) Reakce nemusí proběhnout kvantitativně b) Může být zařazen jiný detektor před derivatizací, tzn. kolona UV detektor reakce s fluorescenčním činidlem fluorescenční detektor c) Může být použit vysoce specifický detektor (např. imunoassay) d) Je možné analyzovat látky, které dávají po reakci identické produkty (např. formaldehyd), protože separace je předřazena detekci Nevýhody
25 a) Reakce musí probíhat v použité mobilní fázi, což může být omezující b) Samo činidlo by nemělo být detekovatelné. Postkolonová derivatizace s cílem zlepšit UV detekci je prakticky vyloučena, protože všechna používaná činidla silně absorbují v UV oblasti. Třemi nejvýznamnějšími typy reakčních detektorů jsou: a) Otevřené kapiláry. Čím je kapilára užší, tím pozorujeme menší rozšiřování píků; průměr 0,3 mm je vhodný. Obrovskou výhodou je použití specificky prohnuté (spletené) kapiláry (knitted tube), aby došlo k dobrému promísení, a tím minimalizaci rozšiřování píků. Kapiláry jsou vhodné k reakcím, které proběhnou do 1 min (pro knitted tube až 5 min). b) Plněné (bed) reaktory. V podstatě se jedná o kolony, které jsou plněny neporézním materiálem (např. skleněné kuličky). Neporézní náplň je zcela nezbytná, protože umožňuje vznik různých proudů, a tím mísení. Reaktory jsou vhodné pro derivatizace, které probíhají mezi 0,5 a 5 minutami. Náplně v kolonách mohou být opatřeny vrstvou katalyzátoru nebo imobilizovaného enzymu, a tím se aktivně účastnit reakce. c) Segmentované systémy. Tok kapaliny je segmentován, tzn. rozdělen do menších zón, mezi kterými jsou bubliny nebo nemísitelná kapalina. Reakce probíhají pomalu (až 30 minut) a segmentací je zabráněno rozšiřování píků. Fáze jsou poté separovány před detektorem, ale může být využito i elektronické potlačení vzniklého šumu. Neočekávané píky: host peaks a systémové píky Kdykoli je možné, že se v chromatogramu objeví nečekané pozitivní nebo i negativní píky. Jestliže se tyto píky nedají reprodukovat, říkáme jim tzv. ghost peaks. Je nezbytné je eliminovat, i když to může být zdlouhavé a časově náročné. Důvodem pro vznik neočekávaných píků mohou být nejrůznější příčiny: bubliny v detektoru, nečistoty v mobilní fázi, rozdělení složek mobilní fáze, vymývání stacionární fáze z kolony (column bleeding), nedosažení rovnováhy během gradientových elucí, zbytky z předchozích nástřiků a mnoho dalších. Přesně reprodukované neočekávané píky jsou tzv. systémové píky. Objevují se v případě, že je mobilní fáze směsí několika složek a použitý detektor reaguje na složky s různou citlivostí, například máme-li v mobilní fázi stopové množství aromátů a detekce je prováděna při 254
26 nm. Při nepřímé detekci musíme s objevením systémových píků počítat vždy, dokonce i když je přechod od přímé na nepřímou detekci plynulý. K neočekávaným píkům můžeme rovněž dospět, pokud ke snížení limitu detekce použijeme detekce na nižší vlnové délce než obvykle. Neidentifikované systémové píky významně ovlivňují kvalitativní a kvantitativní analýzu (identifikace může být obtížná, protože systémové píky mohou být dokonce neviditelné!). Mohou způsobit zmenšení píků a zdvojení píků. Plochy individuálních píků závisí na jejich relativní poloze vzhledem k systémovým píkům! Proto v obr. dole nejsou plochy píků racemické směsi bupivakainu ekvivalentní.
CHROMATOGRAFIE ÚVOD Společný rys působením nemísících fází: jedna fáze je nepohyblivá (stacionární), druhá pohyblivá (mobilní).
CHROMATOGRAFIE ÚOD Existují různé chromatografické metody, viz rozdělení metod níže. Společný rys chromatografických dělení: vzorek jako směs látek - složek se dělí na jednotlivé složky působením dvou
VíceHPLC - Detektory A.Braithwaite and F.J.Smith; Chromatographic Methods, Fifth edition, Blackie Academic & Professional 1996 Colin F. Poole and Salwa K.
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - Detektory - I Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 HPLC - Detektory A.Braithwaite and F.J.Smith; Chromatographic Methods, Fifth
VícePLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC)
PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC) Dělení látek mezi stacionární a mobilní fázi na základě rozdílů v těkavosti a struktuře (separované látky vykazují rozdílnou chromatografickou afinitu) Metoda vhodná pro látky:
VícePříprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 23 Preparativní chromatografie je používána pro separaci látek, které jsou určeny pro další zpracování. Množství získávané
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení dekochinátu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie
VícePrůtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny)
Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny) 1. Přímé měření: analyzovaná kapalina většinou odvětvena + vhodný detektor 2. Kapalinová chromatografie (HPLC) Stanovení po předchozí separaci 3.
VíceKALIBRACE. Definice kalibrace: mezinárodní metrologický slovník (VIM 3)
KALIBRACE Chemometrie I, David MILDE Definice kalibrace: mezinárodní metrologický slovník (VIM 3) Činnost, která za specifikovaných podmínek v prvním kroku stanoví vztah mezi hodnotami veličiny s nejistotami
VíceL 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie
L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 8. Výsledky kruhových testů V rámci ES byly provedeny kruhové testy, při nichž až 13 laboratoří zkoušelo čtyři vzorky krmiva pro selata, včetně jednoho
VícePříprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 16 Iontová chromatografie Iontová chromatografie je speciální technika vyvinutá pro separaci anorganických iontů a organických
VíceMonitoring složek ŽP - instrumentální analytické metody
Monitoring složek ŽP - instrumentální analytické metody Seznámení se základními principy sledování pohybu polutantů v životním prostředí. Přehled používaných analytických metod. Způsoby monitoringu kvality
VíceKonfirmace HPLC systému
Mgr. Michal Douša, Ph.D. Obsah 1. Měření modulové... 2 1.1 Těsnost pístů tlakový test... 2 1.2 Teplota autosampleru (správnost a přesnost)... 2 1.3 Teplota kolonového termostatu... 2 1.3.1 Absolutní hodnota...
VíceUNIVERZITA PARDUBICE Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie. Nám. Čs. Legií 565, Pardubice.
UNIVERZITA PARDUBICE Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie Nám. Čs. Legií 565, 532 10 Pardubice 15. licenční studium INTERAKTIVNÍ STATISTICKÁ ANALÝZA DAT Semestrální práce VYUŽITÍ TABULKOVÉHO
VíceVysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Teorie HPLC Praktické
VíceČást 2, Základní principy HPLC
Část 2, Základní principy HPLC Chromatografická separace Chromatografie je dělící proces, při kterém dochází k distribuci látkek obsažených ve vzorku mezi dvěma fázemi. Jedna fáze, umístěná v koloně, je
VíceMetody separace. přírodních látek
Metody separace přírodních látek (5) Chromatografie; základní definice a klasifikace ruzných metod; kapalinová chromatografie, plynová chromatografie, přístrojová technika. Chromatografie «F(+)d» 1897
VíceVysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapalinová chromatografie (LC) 1.1. Teorie kapalinové
VíceOPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI
Středoškolská technika 212 Setkání a prezentace prací středoškolských studentů na ČVUT OPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI Eliška Marková
VícePři reálném chromatografickém ději nikdy nedojde k ustavení rovnováhy mezi oběma fázemi První ucelená teorie respektující uvedenou skutečnost byla
Teorie chromatografie - III Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 4.3.3 Teorie dynamická Při reálném chromatografickém ději nikdy nedojde k ustavení rovnováhy mezi oběma
VíceChyby spektrometrických metod
Chyby spektrometrických metod Náhodné Soustavné Hrubé Správnost výsledku Přesnost výsledku Reprodukovatelnost Opakovatelnost Charakteristiky stanovení 1. Citlivost metody - směrnice kalibrační křivky 2.
VíceZáklady fotometrie, využití v klinické biochemii
Základy fotometrie, využití v klinické biochemii Základní vztahy ve fotometrii transmitance (propustnost): T = I / I 0 absorbance: A = log (I 0 / I) = log (1 / T) = log T Lambertův-Beerův zákon A l = e
VíceCS Úřední věstník Evropské unie L 54/89
26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89 c) při vlnové délce mezi 230 a 320 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra
VíceDETEKTORY pro kapalinovou chromatografii. Izolační a separační metody, 2018
DETEKTORY pro kapalinovou chromatografii Izolační a separační metody, 2018 Detektory v kapalinové chromatografii Typ detektoru Zkratka Měřená veličina Refraktometrický detektor RID index lomu Spektrofotometrický
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení nepovolených doplňkových látek Zn-bacitracinu,
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení obsahu semduramicinu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) v koncentračním
VíceAnalýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie
Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Kofein (obr.1) se jako přírodní alkaloid vyskytuje v mnoha rostlinách (např. fazolích, kakaových bobech, černém čaji apod.) avšak nejvíce je spojován
VíceSPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá
Extrakce na pevné fázi (SPE) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Extrakce na pevné fázi (SPE) (Solid Phase Extraction) SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků,
VíceSeparační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip
Plynová chromatografie (GC) - princip Plynová chromatografie (Gas chromatography, zkratka GC) je typ separační metody, kdy se od sebe oddělují složky obsažené ve vzorku a které mohou být převedeny do plynné
VíceSTANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ
STANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ 1 Úkol Separovat a metodou kalibrační křivky stanovit azobarviva (methyloranž - MO, dimethylová žluť - DMŽ) ve směsi metodou
VíceCS Úřední věstník Evropské unie L 54/85
26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/85 F. STANOVENÍ DICLAZURILU 2,6-dichlor-alfa-(4-chlorofenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3-H)yl)benzenacetonitril 1. Účel a rozsah Tato metoda
VíceVYUŽITÍ A VALIDACE AUTOMATICKÉHO FOTOMETRU V ANALÝZE VOD
Citace Kantorová J., Kohutová J., Chmelová M., Němcová V.: Využití a validace automatického fotometru v analýze vod. Sborník konference Pitná voda 2008, s. 349-352. W&ET Team, Č. Budějovice 2008. ISBN
VíceDerivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra
Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Teorie: Derivační spektrofotometrie, využívající derivace absorpční křivky, je obecně používanou metodou pro zvýraznění detailů průběhu záznamu,
VíceAnalytické znaky laboratorní metody Interní kontrola kvality Externí kontrola kvality
Analytické znaky laboratorní metody Interní kontrola kvality Externí kontrola kvality RNDr. Alena Mikušková FN Brno Pracoviště dětské medicíny, OKB amikuskova@fnbrno.cz Analytické znaky laboratorní metody
VíceAplikace AAS ACH/APAS. David MILDE, Úvod
Aplikace AAS ACH/APAS David MILDE, 2017 Úvod AAS: v podstatě 4atomizační techniky: plamenová atomizace (FA), elektrotermická atomizace (ETA), generování těkavých hydridů (HG), určené pro stanovení As,
VíceChromatografie. Petr Breinek
Chromatografie Petr Breinek Chromatografie-I 2012 Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální dělení složek analyzované směsi mezi dvěma fázemi. Pohyblivá fáze (mobilní), eluent Nepohyblivá
VíceVYUŽITÍ TEPELNÉHO ZMLŽOVAČE V AAS
1 VYUŽITÍ TEPELNÉHO ZMLŽOVAČE V AAS JAN KNÁPEK Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta MU, Kotlářská 2, Brno 611 37 Obsah 1. Úvod 2. Tepelný zmlžovač 2.1 Princip 2.2 Konstrukce 2.3 Optimalizace
Vícepřesnost (reprodukovatelnost) správnost (skutečná hodnota)? Skutečná hodnota použití různých metod
přesnost (reprodukovatelnost) správnost (skutečná hodnota)? Skutečná hodnota použití různých metod Měření Pb v polyethylenu 36 různými laboratořemi 0,47 0 ± 0,02 1 µmol.g -1 tj. 97,4 ± 4,3 µg.g -1 Měření
VícePříprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 20 Zajištění kvality Laboratorní analýzy mají smysl pouze pokud vedou ke spolehlivým výsledkům. Ve vědecké terminologii je
VíceProblémy v kapalinové chromatografii. Troubleshooting
Problémy v kapalinové chromatografii Troubleshooting Problémy v HPLC Většinu problémů, které se vyskytují při separaci látek na chromatografické koloně můžeme vyčíst již z pouhého průběhu základní linie,
VíceSKUPINOVÁ ANALÝZA MOTOROVÝCH NAFT
VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta technologie ochrany prostředí Ústav technologie ropy a alternativních paliv SKUPINOVÁ ANALÝZA MOTOROVÝCH NAFT Laboratorní cvičení ÚVOD Snižování emisí
VíceLaboratorní práce č. 8: Elektrochemické metody stanovení korozní rychlosti
Laboratorní práce č. 8: Elektrochemické metody stanovení korozní rychlosti Cíl práce: Cílem laboratorní úlohy Elektrochemické metody stanovení korozní rychlosti je stanovení korozní rychlosti oceli v prostředí
VíceVysokoúčinná kapalinová chromatografie
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací
VíceL 54/80 CS Úřední věstník Evropské unie
L 54/80 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 7.1.2 Detektor diodového pole Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií: a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být
VíceÚloha 1: Lineární kalibrace
Úloha 1: Lineární kalibrace U pacientů s podezřením na rakovinu prostaty byl metodou GC/MS měřen obsah sarkosinu v moči. Pro kvantitativní stanovení bylo nutné změřit řadu kalibračních roztoků o různé
VíceÚstřední komise Chemické olympiády. 55. ročník 2018/2019 NÁRODNÍ KOLO. Kategorie E. Řešení praktických částí
Ústřední komise Chemické olympiády 55. ročník 2018/2019 NÁRODNÍ KOLO Kategorie E Řešení praktických částí PRAKTICKÁ ČÁST 50 BODŮ Úloha 1 Stanovení Ni 2+ a Ca 2+ ve směsi konduktometricky 20 bodů 1) Chemické
VíceLABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie
LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) C Použití GC-MS spektrometrie Vedoucí práce: Doc. Ing. Petr Kačer, Ph.D., Ing. Kamila Syslová Umístění práce: laboratoř 79 Použití GC-MS spektrometrie
VíceStudijní materiál HMF_1 1. Hydroxymethylfurfural a jeho stanovení v potravinách 2. Kapalinová chromatografie (HPLC, UPLC)
Studijní materiál HMF_1 1. Hydroxymethylfurfural a jeho stanovení v potravinách 2. Kapalinová chromatografie (HPLC, UPLC) V Brně dne 20. 11. 2011 Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. 1. Hydroxymethylfurfural
VíceVícefázové reaktory. Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor. Zuzana Tomešová
Vícefázové reaktory Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor Zuzana Tomešová 2008 Probublávaný reaktor plyn - kapalina - katalyzátor Hydrogenace méně těkavých látek za vyššího tlaku Kolony naplněné
VícePožadavky kladené na úřední laboratoře v oblasti kontroly potravin
SZPI Požadavky kladené na úřední laboratoře v oblasti kontroly potravin Petr Cuhra (VŠCHT, 1.2.2013) Státní zemědělská a potravinářská inspekce Za Opravnou 6, Praha 5, petr.cuhra@szpi.gov.cz www.szpi.gov.cz
VíceVysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz 1 Sylabus přednášky: Validace chromatografické metody: Správnost Přesnost Linearita Mez detekce
VíceKalibrace a limity její přesnosti
Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie Kalibrace a limity její přesnosti Semestrální práce Licenční studium GALILEO Interaktivní statistická analýza dat Brno, 2015
VícePříprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 4 - Nástřik vzorku Dávkovače vzorků/injektory Dávkování vzorků je jednou z klíčových záležitostí v HPLC. Ani nejlepší kolona
VíceVYHODNOCOVÁNÍ CHROMATOGRAFICKÝCH DAT
VYHDNCVÁNÍ CHRMATGRAFICKÝCH DAT umístění práce: laboratoř č. S31 vedoucí práce: Ing. J. Krupka 1. Cíl práce: Seznámení s možnostmi, které poskytuje GC chromatografie pro kvantitativní a kvalitativní analýzu.
VíceTeorie chromatografie - I
Teorie chromatografie - I Veronika R. Meyer Practical High-Performance Liquid Chromatography, Wiley, 2010 http://onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/9780470688427 Příprava předmětu byla podpořena projektem
Více215.1.10 SKUPINOVÁ ANALÝZA MOTOROVÝCH NAFT
215.1.10 SKUPINOVÁ ANALÝZA MOTOROVÝCH NAFT ÚVOD Snižování emisí výfukových plynů a jejich škodlivosti je hlavní hnací silou legislativního procesu v oblasti motorových paliv. Po úspěšném snížení obsahu
VíceVOLBA OPTIMÁLNÍ METODY
VOLBA OPTIMÁLNÍ METODY Jak nalézt z velkého množství metod nejlepší ( fit for purpose ) postup? (c) David MILDE Jak na to? 1. Identifikovat problém požadovaná informace (kvalitativní či kvantitativní analýza,
Vícevzorek1 0.0033390 0.0047277 0.0062653 0.0077811 0.0090141... vzorek 30 0.0056775 0.0058778 0.0066916 0.0076192 0.0087291
Vzorová úloha 4.16 Postup vícerozměrné kalibrace Postup vícerozměrné kalibrace ukážeme na úloze C4.10 Vícerozměrný kalibrační model kvality bezolovnatého benzinu. Dle následujících kroků na základě naměřených
VíceSEMESTRÁLNÍ PRÁCE X. Aproximace křivek Numerické vyhlazování
KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE FAKULTY CHEMICKO TECHNOLOGICKÉ UNIVERSITA PARDUBICE - Licenční studium chemometrie LS96/1 SEMESTRÁLNÍ PRÁCE X. Aproximace křivek Numerické vyhlazování Praha, leden 1999 0 Úloha
Více06. Plynová chromatografie (GC)
06. Plynová chromatografie (GC) Plynová chromatografie je analytická a separační metoda, která má výsadní postavení v analýze těkavých látek. Mezi hlavní výhody této techniky patří jednoduché a rychlé
VíceSPEKTROSKOPICKÉ VLASTNOSTI LÁTEK (ZÁKLADY SPEKTROSKOPIE)
SPEKTROSKOPICKÉ VLASTNOSTI LÁTEK (ZÁKLADY SPEKTROSKOPIE) Elektromagnetické vlnění SVĚTLO Charakterizace záření Vlnová délka - (λ) : jednotky: m (obvykle nm) λ Souvisí s povahou fotonu Charakterizace záření
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip
VíceAgilent 5110 ICP-OES vždy o krok napřed
analytická instrumentace, PC, periferie, služby, poradenství, servis Agilent 5110 ICP-OES vždy o krok napřed IntelliQuant Jedinečný nástroj pro rychlé a snadné semi-kvantitativní analýzy. V rámci rutinních
VíceAplikační rozsah chromatografie
Chromatografické metody II. Aplikační rozsah chromatografie Chromatografie Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) LPC Střednětlaká (4 Mpa) FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) HPLC Ultravysokotlaká
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení diclazurilu, halofuginonu, lasalocidu, maduramicinu, monensinu, narasinu, nikarbazinu, robenidinu,
Víceisolace analytu oddělení analytu od matrice (přečištění) zakoncentrování analytu stanovení analytu (analytů) ve vícesložkové směsi
SEPARAČNÍ METODY Využití separačních metod isolace analytu oddělení analytu od matrice (přečištění) zakoncentrování analytu stanovení analytu (analytů) ve vícesložkové směsi Druhy separačních metod Srážení
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení diclazurilu, halofuginonu, lasalocidu, maduramicinu, monensinu,
VíceKvantitativní fázová analýza
Kvantitativní fázová analýza Kvantitativní rentgenová (fázová) analýza Založena na měření intenzity charakteristických linií. Intenzita je ovlivněna: strukturou minerálu a interferencemi uspořádáním aparatury
VíceAgilent 5110 ICP-OES vždy o krok napřed
analytická instrumentace, PC, periferie, služby, poradenství, servis Agilent 5110 ICP-OES vždy o krok napřed FACT Jedinečný nástroj pro korekce spektrálních interferencí. V dokonalém světě by ICP-OES spektrometry
VíceGelová permeační chromatografie
Gelová permeační chromatografie (Gel Permeation Chromatography - GPC) - separační a čisticí metoda - umožňuje separaci skupin sloučenin s podobnou molekulovou hmotností (frakcionace) - analyty jsou po
VíceULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UPLC) ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UHPC)
ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UPLC) ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UHPC) Pokroky v moderních separačních metodách, 2012 Eva Háková CHARAKTERISTIKA UPLC Nová, velmi účinná separační
VícePlynová chromatografie
Plynová chromatografie Kvalitativní a kvantitativní analýza Základní přednáška RNDr. Radomír Čabala, Dr. Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie ZS2008 Kat.anal.chem.
VíceZajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu
Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu Š.Dušková, I.Šperlingová, L. Dabrowská, M. Tvrdíková, M. Šubrtová duskova@szu.cz sperling@szu.cz Oddělení pro hodnocení expozice chemickým látkám
VíceValidace sérologických testů výrobcem. Vidia spol. s r.o. Ing. František Konečný IV/2012
Validace sérologických testů výrobcem Vidia spol. s r.o. Ing. František Konečný IV/2012 Legislativa Zákon č. 123/2000 Sb. o zdravotnických prostředcích ve znění pozdějších předpisů Nařízení vlády č. 453/2004
VíceLineární regrese. Komentované řešení pomocí MS Excel
Lineární regrese Komentované řešení pomocí MS Excel Vstupní data Tabulka se vstupními daty je umístěna v oblasti A1:B11 (viz. obrázek) na listu cela data Postup Základní výpočty - regrese Výpočet základních
VíceVYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE ZADÁNÍ ÚLOHY
VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHOMATOGAFIE ZADÁNÍ ÚLOHY Metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie separujte směs s-triazinových herbicidů, sledujte vliv složení mobilní fáze na separaci. Proveďte kvalitativní
VícePŘÍRUČKA ŘEŠENÝCH PŘÍKLADŮ
1999-2011 PŘÍRUČKA ŘEŠENÝCH PŘÍKLADŮ EFFIVALIDATION 3 EffiChem your validation software Lesní 593, 679 71 Lysice http://www.effichem.com 2/57 EffiChem můţe vlastnit patenty, podané ţádosti o patenty, ochranné
VíceNo. 1- určete MW, vysvětlení izotopů
No. 1- určete MW, vysvětlení izotopů ESI/APCI + 325 () 102 (35) 327 (33) 326 (15) 328 (5) 150 200 250 300 350 400 450 500 ESI/APCI - 323 () 97 (51) 325 (32) 324 (13) 326 (6) 150 200 250 300 350 400 450
VíceUNIVERZITA PARDUBICE
UNIVERZITA PARDUBICE Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie Vedoucí studia a odborný garant: Prof. RNDr. Milan Meloun, DrSc. Vyučující: Prof. RNDr. Milan Meloun, DrSc. Autor práce: ANDRII
VíceTrendy v moderní HPLC
Trendy v moderní HPLC Josef Cvačka, 5.1.2011 CHROMATOGRAFIE NA ČIPECH Miniaturizace separačních systémů Mikrofluidní čipy Mikrofabrikace Chromatografické mikrofluidní čipy s MS detekcí Praktické využití
VíceKlinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie
Klinická a farmaceutická analýza Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1 Sylabus přednášky: Validace Validační parametry Validace bioanalytické
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu selenu v minerálních krmivech a premixech metodou optické emisní spektrometrie
VíceTeorie transportu plynů a par polymerními membránami. Doc. Ing. Milan Šípek, CSc. Ústav fyzikální chemie VŠCHT Praha
Teorie transportu plynů a par polymerními membránami Doc. Ing. Milan Šípek, CSc. Ústav fyzikální chemie VŠCHT Praha Úvod Teorie transportu Difuze v polymerních membránách Propustnost polymerních membrán
VíceParametry metod automatické fotometrické analýzy
Parametry metod automatické fotometrické analýzy Každá metoda prováděná automatickým biochemickým analyzátorem má v softwaru řídícího počítače nadefinované parametry: číslo (aplikační kód) metody název
VíceKalibrace a limity její přesnosti
Univerzita Pardubice Fakulta chemicko technologická Katedra analytické chemie Licenční studium chemometrie Statistické zpracování dat Kalibrace a limity její přesnosti Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě
VíceVyužití faktorového plánování v oblasti chemických specialit
LABORATOŘ OBORU I T Využití faktorového plánování v oblasti chemických specialit Vedoucí práce: Ing. Eliška Vyskočilová, Ph.D. Umístění práce: FO7 1 ÚVOD Faktorové plánování je optimalizační metoda, hojně
VícePrincipy chromatografie v analýze potravin
Principy chromatografie v analýze potravin živočišného původu p Ivana Borkovcová Ústav hygieny a technologie mléka FVHE VFU Brno, borkovcovai@vfu.cz Úvod, základní pojmy chromatografické systémy dělení
VíceABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRÁLNÍ METODY
ABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRÁLNÍ METODY 1 Fyzikální základy spektrálních metod Monochromatický zářivý tok 0 (W, rozměr m 2.kg.s -3 ): Absorbován ABS Propuštěn Odražen zpět r Rozptýlen s Bilance toků 0 = +
VícePříprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 9 Adsorpční chromatografie: Chromatografie v normálním módu Tento chromatografický mód je vysvětlen na silikagelu jako nejdůležitějším
VíceStandardní operační postup
Standardní operační postup CHOL_1 Stanovení cholesterolu v potravinách metodou HPLC V Brně dne 20. 3. 2011 Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. 1. Princip Po alkalické hydrolýze (saponifikaci, zmýdelnění)
VíceStanovení manganu a míry přesnosti kalibrace ( Lineární kalibrace )
Příklad č. 1 Stanovení manganu a míry přesnosti kalibrace ( Lineární kalibrace ) Zadání : Stanovení manganu ve vodách se provádí oxidací jodistanem v kyselém prostředí až na manganistan. (1) Sestrojte
VíceKlinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie
Klinická a farmaceutická analýza Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1 Spojení separačních technik s hmotnostní spektrometrem Separační
VíceEvropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY
Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického
VíceVOLBA OPTIMÁLNÍ METODY
VOLBA OPTIMÁLNÍ METODY Jak nalézt z velkého množství metod nejlepší ( fit for purpose ) postup? Jak na to? 1. Identifikovat problém požadovaná informace (kvalitativní či kvantitativní analýza, ). 2. Nalézt
VícePokročilé praktikum. Plynová chromatografie - Kvalitativní a kvantitativní analýza. Teoretická část
Pokročilé praktikum Plynová chromatografie - Kvalitativní a kvantitativní analýza Teoretická část 1 Kvalitativní analýza Kvalitativní analýzou vzorku rozumíme určení složení vzorku, neboli zjištění, ze
VíceÚvod k biochemickému. mu praktiku. Vladimíra Kvasnicová
Úvod k biochemickému mu praktiku Vladimíra Kvasnicová organizace praktik pravidla bezpečné práce v laboratoři laboratorní vybavení práce s automatickou pipetou návody: viz. aplikace Výuka automatická pipeta
VíceTeorie chromatografie - II
Teorie chromatografie - II Příprava předmětu byla podpořena projektem OPP č. CZ.2.17/3.1.00/33253 2.2 Interakce mezi molekulami Mezi elektroneutrálními molekulami působí slabé přitažlivé síly, které sdružují
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU A A VITAMÍNU E METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU A A VITAMÍNU E METODOU HPLC 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení vitamínu A a vitamínu E v krmivech a premixech. 2 Princip
VíceOptimalizace podmínek měření a práce s AAS
S (KT & Geochemie) Optimalizace podmínek měření a práce s S Teoretický základ úlohy: 1: OPTIMLIZCE PRCOVNÍCH PODMÍNEK Jedním z prvních úkolů při práci s atomovým absorpčním spektrometrem (S) je vždy nalezení
Více1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I
1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené
VíceKurz 1 Úvod k biochemickému praktiku
Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Pavla Balínová http://vyuka.lf3.cuni.cz/ Důležité informace Kroužkový asistent: RNDr. Pavla Balínová e-mailová adresa: pavla.balinova@lf3.cuni.cz místnost: 410 studijní
Více