BIOCHEMICKÉ PROFILY MÉNĚ OBVYKLÝCH DRUHŮ KVASINEK

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta BIOCHEMICKÉ PROFILY MÉNĚ OBVYKLÝCH DRUHŮ KVASINEK Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Martina MAHELOVÁ Autor: Veronika KUBACZKOVÁ Brno, duben 2012

2 Jméno a příjmení autora: Veronika Kubaczková Název bakalářské práce: Biochemické profily méně obvyklých druhů kvasinek Pracoviště: Mikrobiologický ústav Fakultní nemocnice u svaté Anny v Brně Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Martina Mahelová Rok obhajoby bakalářské práce: 2012 Souhrn: Nejčastěji izolovaným druhem kvasinek z klinického materiálu je Candida albicans. V posledních letech dochází k nárůstu infekcí způsobených tzv. non-albicans druhy. V 90. letech minulého století byly popsány druhy C. dubliniensis a C. africana, které jsou svými fenotypovými vlastnostmi velmi podobné C. albicans. Tím, že se liší v některých biochemických znacích, je jejich diferenciace možná na základě rozdílné asimilace cukrů. Cílem této práce je srovnání biochemických profilů druhů C. albicans, C. dubliniensis a C. africana získaných z klinického materiálu v laboratořích Mikrobiologického ústavu LF MU a FN u sv. Anny v Brně. Dále pak získané výsledky porovnat s literaturou. Práce je členěna na část teoretickou, která je zaměřena na obecné vlastnosti rodu Candida a jednotlivé druhy a část praktickou obsahující vlastní experiment. Klíčová slova: asimilace sacharidů, biochemické profily, Candida, YNB Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Martiny Mahelové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne Veronika Kubaczková

4 Mé poděkování patří vedoucí mé práce Mgr. Martině Mahelové za odborné vedení, její čas a pomoc, kterou mi poskytla. Především však za její vstřícný přístup a cenné rady. Dále zaměstnancům Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u svaté Anny v Brně, bez jejichž pomoci by realizace praktické části mé práce nebyla možná.

5 Obsah: 1 Úvod... 9 I TEORETICKÁ ČÁST Rod Candida Obecná charakteristika Cytologie Klinická významnost Faktory virulence Adheze Tvorba biofilmu Dimorfismus Germinace Hydrolytické enzymy Kandidové infekce Povrchová kandidóza Invazivní kandidóza Léčba Možnosti identifikace Candida albicans Charakteristika Klinická významnost Candida dubliniensis Charakteristka Klinická významnost Možnosti odlišení C. dubliniensis od C. albicans Růst při zvýšených teplotách Tvorba chlamydospor... 33

6 4.3.3 Růst v přítomnosti chloridu sodného Růst na chromogenních médiích Odlišná morfologie kolonií Asimilace cukrů Odlišení na základě sérologických vlastností Diferenciace na základě genotypických vlastností Fingerprintové metody Sekvenční rozdíly Amplifikace genů Candida africana Charakteristika Klinická významnost II. PRAKTICKÁ ČÁST Cíl práce Materiál a metody Materiál Mikroorganismy Pomůcky Kultivační média, roztoky a chemikálie Přístroje Metody Příprava a uchování kmenů Testování asimilace cukrů Tvorba suspenze Příprava YNB média pro účely testování asimilace cukrů Vlastní pokus Vyhodnocení Výsledky... 51

7 8.1 Charakteristika souboru Testování asimilace cukrů Hodnocení asimilace cukrů Výsledky asimilace cukrů u jednotlivých druhů C. albicans C. dubliniensis C. africana Spolehlivost metody u jednotlivých druhů Schopnost asimilace xylózy u kmenů C. albicans a C. dubliniensis Diskuze Závěr Použitá literatura... 62

8 Seznam použitých zkratek a symbolů: AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome (Syndrom získaného imunodeficitu) ATB antibiotika ATP adenosintrifosfát C. Candida CNS centrální nervová soustava DNA Deoxyribonucleic acid (Deoxyribonukleová kyselina) ER endoplazmatické retikulum ET kanyla endotracheální kanyla G+ grampozitivní FN USA Fakultní nemocnice u sv. Anny HIV Human Immunodeficiency Virus (Virus lidské imunitní nedostatečnosti) IgA imunoglobulin třídy A LF MU Lékařská fakulta Masarykovy univerzity McF Mc Farland NaCl chlorid sodný pb párů bází PCR polymerázová řetězová reakce ph potential of Hydrogen (potenciál vodíku) PVC polyvinylchlorid rdna ribozomální deoxyribonukleová kyselina RNA Ribonucleic acid (Ribonukleová kyselina) rrna ribozomální ribonukleová kyselina SDA Sabouraudův dextrózový agar TTC trifenyltetrazolium chlorid XYL xylóza

9 1 Úvod Kvasinky rodu Candida jsou příležitostnými a klinicky významnými patogeny. Vyskytují se jako komenzální mikroorganismy a jsou součástí přirozené mikroflóry zdravého člověka. Nacházejí se v malém množství ve střevě, na kůži, v dutině ústní či ve vagíně dospělých žen. Při rozvratu symbiózy mezi kvasinkami a ostatními mikroorganismy v lidském těle se z nepatogenních kvasinek stávají původci infekčních onemocnění. Nejvýznamnějším a nejčastěji izolovaným druhem z klinického materiálu je Candida albicans. Tato oportunně patogenní kvasinka je schopna způsobit onemocnění v rozsahu od jednoduchých kožních infekcí až po život ohrožující kandidémie. Je tedy původcem jak povrchových tak systémových kandidóz. V posledních letech dochází k nárůstu infekcí způsobených tzv. non-albicans druhy. Mezi ně patří i C. dubliniensis a C. africana, které byly popsány v 90. letech minulého století. Tyto druhy jsou svými fenotypovými vlastnostmi velmi podobné C. albicans. Z důvodu těchto podobností docházelo k jejich chybné identifikaci a druhy byly mylně označovány jako C. albicans. Jednotlivé druhy je možné odlišit na základě jejich různých fenotypových vlastností. Kvasinky se navzájem liší mimo jiné v některých biochemických znacích. Této skutečnosti se využívá pro jejich vzájemné odlišení. Kandidy mají rozdílnou schopnost asimilovat různé druhy cukrů jako jediný zdroj uhlíku. Každá z kvasinek má tedy svůj charakteristický asimilační profil. Např. C. dubliniensis není schopna asimilovat xylózu a v některých případech trehalózu na rozdíl od C. albicans. C. africana zase není schopna utilizovat např. glukosamin či trehalózu. 9

10 I TEORETICKÁ ČÁST 2 Rod Candida 2.1 Obecná charakteristika VĚDECKÁ KLASIFIKACE Říše: Fungi Oddělení: Ascomycota Řád: Saccharomycetales Čeleď: Saccharomycetaceae Rod: Candida ( Rod Candida je řazen mezi kvasinkové mikromycety. Jako mikromycety jsou označovány houby mikroskopických rozměrů (Votava a kol., 2003). Kandidy patří k dimorfním (bifázickým) houbám. V závislosti na podmínkách vnějšího prostředí je jim umožněno vyskytovat se ve formě blastokonidií, což jsou buňky kulatého nebo oválného tvaru o velikosti 3 až 10 µm, nebo ve formě vláken. Tato vlákna se nazývají pseudohyfy a vznikají z protáhlých blastokonidií, které tvoří větvené řetízky. C. albicans a C. dubliniensis jako jediné z rodu Candida vytvářejí pravé hyfy (Moyes a kol., 2012), ty jsou složené z více buněk tvořících septa (Greenwood a kol., 1999). Z kvasinek, které jsou nalézány v klinickém materiálu, jsou kandidy nejvýznamnější a nejčastější (Votava a kol., 2003). Kvasinky střídají pohlavní a nepohlavní způsob rozmnožování. S tím souvisí vytváření sexuálních (teleomorfy) a asexuálních (anamorfy) stádií. Pohlavní způsob množení je uskutečňován prostřednictvím spor (Votava a kol., 2003). Většina z nich se však množí nepohlavně, procesem označovaným jako pučení (Greewood a kol., 1999). V takovém případě z povrchu kvasinky vzniká nová dceřiná buňka, která se buď okamžitě od mateřské buňky oddělí, nebo v této podobě zůstává delší dobu (Obr. 1). Kandidy jsou aerobní růstově nenáročné mikroorganismy. Jako kultivační médium se používají běžné půdy, krevní nebo světle zbarvený Sabouraudův agar s 2 až 4 % glukózy 10

11 či jinými cukry (dextróza, maltóza) jako zdrojem uhlíku. K agaru se dále přidávají antibakteriální látky, ty mají za úkol potlačit růst doprovodné bakteriální flóry. Přidává se např. chloramfenikol a v laboratořích, ve kterých se vyskytují rezistentní kmeny bakterií, mohou být použity např. amikacin s vankomycinem. Za optimální kultivační teplotu se považuje 28 až 30 C, dobře však rostou i při 37 C. Kandidy tvoří většinou lesklé, vypouklé kolonie bělavé až smetanové barvy. Délka kultivace je obvykle 48 hodin (Votava a kol., 2003; Greenwood a kol., 1999). Světelnou mikroskopií se odečítají kandidy ze zhotoveného a Gramem obarveného preparátu. Pod mikroskopem vidíme oválné nebo kulaté G+ buňky, často pučící a tvořící pseudomycelia. Buňky kvasinek jsou pod mikroskopem mnohem patrnější ve srovnání s buňkami bakterií, které průměrně dosahují 1 až 3 µm. Přítomné pseudomycelium nemusí být hned ukazatelem infekce, k jeho vzniku mohlo dojít během transportu odebraného vzorku (Greenwood a kol., 1999). Obr. 1: Pučení kvasinky ( Cytologie Kandidy jsou jednobuněčné eukaryotické mikroorganismy, jejichž buňka obsahuje obalené organely, stavba buňky je znázorněná na obrázku č. 2. Buněčná stěna má silnou a pevnou strukturu, která dává buňce tvar a chrání ji před mechanickými vlivy a změnami osmotického tlaku. Propouští různé sloučeniny mimo makromolekuly jako jsou polysacharidy a proteiny (Šilhánková, 2002). Tvoří ji strukturní polysacharidy, chitin, chitosan, glukany a mannany. Vnější vrstva strukturních polysacharidů zahrnující především mannany a mannoproteiny se významně podílí na imunologických vlastnostech kvasinek, neboť tyto látky mají funkci antigenů, které umožňují serotypizaci kandid (Calderone, 2002). Jako stálé 11

12 struktury na buněčné stěně vznikají jizvy po pučení dceřiných buněk a jejich separaci od mateřské buňky. Přetrvávají po celý vývoj buňky a ovlivňují tzv. architekturu její stěny. Jizva na dceřiné buňce se jmenuje jizva zrodu. Cytoplasmatická membrána je složená z lipidů, glykoproteinů a steroidních látek, na rozdíl od živočišné buňky neobsahuje cholesterol, ale ergosterol (Votava a kol., 2003). Její tloušťka se pohybuje kolem 7,5 až 8 nm. Umožňuje příjem látek potřebných pro buňku a transport látek z buňky zpět do prostředí. Volně jí prochází pouze malé molekuly bez náboje, čímž se vytváří osmotické rozhraní mezi buňkou a vnějším prostředím (Šilhánková, 2002). Cytoplasma je tekutá složka vyplňující vnitřní prostor buňky. Nachází se v ní důležité organely a další buněčné struktury. V počáteční fázi pučení obsahuje buňka více malých vakuol, které s růstem splývají v jednu velkou vakuolu. Vakuola je ohraničena membránou zvanou tonoplast a obsahuje hydrolytické enzymy, kterými rozkládá poškozené organely. V cytoplasmě se nachází endoplazmatické retikulum, které u kvasinek vytváří lamely, cisterny a tubuly podobně jako u rostlinných a živočišných buněk. Na jeho povrchu jsou přítomny ribozomy, které syntetizují proteiny, jedná se o tzv. drsné ER. Jako hladké je označováno endoplasmatické retikulum bez ribozomů, které syntetizuje lipidy. Dalšími organelami jsou mitochondrie ohraničené dvěma fosfolipidovými membránami, vnější a vnitřní. Na vnitřní membráně, kterou tvoří přepážky, tzv. kristy, dochází k respiračním procesům a oxidativní fosforylaci za vzniku energeticky bohatého ATP. Tyto organely obsahují vlastní genetickou informaci a jsou soběstačné v proteosyntéze. Mitochondrie téže buňky se obyčejně značně liší tvarem i velikostí. V cytoplasmě se také nachází Golgiho aparát, soustava měchýřků a cisteren uložených rovnoběžně vedle sebe. Jejich funkcí je transport stavebních komponent buněčné stěny z cytoplasmy přes cytoplasmatickou membránu. Další součástí je cytoskelet, síť proteinových vláken složených především z mikrotubulů, umožňující pohyb organel v buňce. Mimo tyto strukturní organely se v cytoplasmě nacházejí zrnka zásobních látek, především volutinu a glykogenu, meziprodukty metabolismu, některé aminokyseliny a ionty anorganických látek (Šilhánková, 2002). Buňky kvasinek obsahují pravé jádro obalené dvojitou jadernou membránou s póry, které se mitoticky dělí (Bednář a kol., 1996). Ve světelném mikroskopu je viditelné pouze po speciálním obarvení. Obsahuje genetickou informaci ve formě DNA. Kvasinkové chromozómy jsou tvořeny chromatinem, který se skládá z nukleozomálních histonů H2A, H2B, H3 a H4. Rozlišení jednotlivých chromozómů je velmi složité a to i po použití 12

13 elektronové mikroskopie (Šilhánková, 2002). V jádře je obsaženo také jadérko srpkovitého tvaru uložené těsně pod jadernou membránou a pólové tělísko dělícího vřeténka, které je velmi důležité při procesu jaderného dělení. Obr. 2: Schéma průřezu buňkou kvasinky ( 2.2 Klinická významnost Faktory virulence Kvasinky rodu Candida jsou označovány jako potenciálně patogenní mikromycety. Vyskytují se jako komenzální mikroorganismy a běžně tvoří součást střevní a ústní mikroflóry zdravého člověka. Za určitých okolností, např. při poruše obranyschopnosti makroorganismu nebo narušení rovnováhy mikrobiální flóry, dochází k nárůstu jejich virulence, což vede ke vzniku onemocnění (Jacobsen a kol., 2012). Tato problematika je blíže popsaná v kapitole Kandidové infekce. Míra virulence u různých druhů tohoto rodu je variabilní (Bednář a kol., 1996) Adheze Pro patogenitu kandid jsou významné některé vlastnosti, zejména schopnost adheze k hostitelským buňkám, což jim umožňuje kolonizaci povrchů. Přilnavost kvasinek je zprostředkována pomocí tzv. adhezinů, což jsou povrchové glykoproteiny. Patří mezi ně proteiny Als, které jsou kódovány skupinou genů ALS (aglutinin-like sequence) 13

14 a epiteliální adhezin Hwp1 (Moran a kol., 2012). Patogenní druhy kandid adherují daleko rychleji a pevněji, než ty nepatogenní. Adherují na epitel, endotel a na fibrin. Další látkou umožňující tuto schopnost u C. albicans je mananprotein, který na povrchu buněk dokáže vytvářet fibriální vrstvu, dále chrání kandidy před fagocytózou, čímž zvyšuje jejich virulenci. Kmeny, které nemají tuto strukturu, nejsou schopny adherovat a tím ani vyvolat onemocnění u hostitele (Bednář a kol., 1996) Tvorba biofilmu Velmi významným faktorem virulence je schopnost kandid adherovat k povrchům a vytvářet na nich souvislou vrstvu, tzv. biofilm (Bednář a kol., 1996). Biofilm představuje jedno nebo více druhovou komunitu uloženou v ochranné extracelulární hmotě, kterou buňky samy produkují. Tvorba biofilmu na površích různých materiálů představuje trvalý zdroj kontaminace (Tournu a kol., 2011). Kandidy jsou schopny především vytvářet biofilm na površích hostitele, ale mají také schopnost kolonizovat povrchy zdravotnických materiálů, jako jsou např. močové a centrální venózní katétry, cévní kanyly či endoprotézy, což často vede ke vzniku kandidémie. Buňky ve formě biofilmu jsou značně odolnější vůči obranným mechanismům imunitního systému a antimykotickým látkám. Tato skutečnost přispívá k rozvoji nozokomiálních nákaz (Vediyappan a kol., 2010). Vznik biofilmu se skládá z několika fází. První krok zahrnuje adhezi kvasinek k povrchu. Poté následuje tvorba hyf a proliferace, což vede ke vzniku více vrstev přisedlých buněk různých morfologií. Dalším krokem je zrání, jehož výsledkem je komplex buněk zakotvený v extracelulárním polymerním materiálu. Tvorba biofilmu tvořeného buňkami rodu Candida je minimální ve statickém stavu ve srovnání s dynamickým prostředím (Al-Fattani a kol., 2006). Poslední krok, uvolňování buněk z biofilmu, hraje klíčovou roli ve vzniku a rozvoji invazivních infekcí (Uppuluri a kol., 2010) Dimorfismus Dimorfismus neboli schopnost přepínání mezi kvasinkou a růstem ve formě hyf patří k nejvíce diskutované a nejlépe prostudované vlastnosti virulence kandid. Obě tyto morfologické podoby mají odlišné funkce v různých fázích vývoje nemoci. Hyfy hrají hlavní roli v adhezi, invazi a tvorbě biofilmu, zatímco buňky kvasinek jsou pravděpodobně důležité pro šíření a počáteční kolonizaci povrchů (Jacobsen a kol., 2012). Vláknité formy jsou více invazivní a mají schopnost prorůstat tkáněmi a tím napadnout více orgánů. Jsou tedy 14

15 pokládány za virulentnější formu (Bednář a kol., 1996). Na obrázku č. 3 jsou histologické fotografie, na nichž je patrná invaze C. albicans ve formě hyf. Kvasinky i hyfy se nacházejí v infikovaných orgánech. V závislosti na orgánu převládá jedna z forem, např. v infikovaných ledvinách jsou kvasinky převážně ve formě hyf, naopak je tomu u jater nebo sleziny (Jacobsen a kol., 2012). Přechod mezi kvasinkami a růstem ve formě hyf je přísně regulován sítí signálních drah v reakci na podněty prostředí. Mezi významné regulátory tohoto procesu patří Ras1, Efg1, CPH1, Tec1 a Rim101 (Biswas a kol., 2007). Méně pozornosti je věnováno faktorům, které umožňují přechod z hyfy k buňce, jedná se o Nrg1 nebo Tup1 (Murad a kol, 2001). Obr. 3: Histologické fotografie morfologie C. albicans během interakce s buňkami hostitele (A) Snímek ze světelné mikroskopie, jaterní tkáň s invazí hyf C. albicans. (B) Snímek z elektronové mikroskopie, hyfa penetruje epiteliální buňku dutiny ústní. (C) Snímek z fluorescenční mikroskopie, interakce lidského makrofágu s C. albicans, červeně jsou znázorněny makrofágy, růžově extracelulární hyfy C. albicans, modře intracelulární hyfy C. albicans. Šipkami jsou označeny hyfy pronikající makrofágem k úniku. (Jacobsen a kol., 2012) Germinace Také germinace je spojována s invazivním průnikem kandid do tkání, kvasinky, které se nacházejí v krevním oběhu, ve velmi krátkém časovém úseku začínají tvořit zárodečné klíčky (Fradin a kol., 2005). Klíčící buňky mají lepší schopnost adherence ke tkáním a svou germinací se také mohou uvolnit z fagocytu po ingesci (Bednář a kol., 1996). 15

16 Fagocytující buňky tvoří první linii obrany při infekci, které kvasinky musí čelit. Pomocí produkce zárodečných klíčků a hyf jsou schopny zničit membránu fagocytu, usmrtit jej a uniknout (Fradin a kol., 2005). Vyšší úroveň exprese SOD5 (kódování extracelulární superoxidismutázy) umožňuje kvasince ve formě hyfy působit proti oxidativnímu vzplanutí fagocytu, čímž tak přežije útok makrofágu, monocytu nebo neutrofilu (Frohner a kol., 2008). Tvorba zárodečných klíčků je důležitou taxonomickou vlastností, kterou se vyznačují z rodu Candida pouze C. albicans a C. dublinensis (Rimek a kol., 2008) Hydrolytické enzymy Jedním z faktorů, který výrazně přispívá v procesu virulence, je produkce hydrolytických enzymů. Mezi tři nejvýznamnější extracelulární hydrolytické enzymy, které jsou produkovány některými druhy rodu Candida, patří sekretované asparátové proteinázy (Sap), fosfolipázové enzymy a lipázy (Naglik a kol., 2003). Sap (secreted apartyl proteinase) jsou kódovány skupinou deseti sap genů. Proteinázy narušují epiteliální vrstvy, degradují proteiny hostitele včetně molekul, které chrání sliznice, např. mucin a sekreční IgA (De Repentigny a kol., 2000). Během těchto činností kvasinky získávají dusík, který je potřebný pro jejich růst (Naglik a kol., 2003). Exprese jednotlivých sap genů je u různých druhů infekce odlišná. Např. při orální kandidóze dochází k expresi genů sap1 až sap7 (Naglik a kol., 1999). Několika studiemi bylo prokázáno, že nejvíce virulentní druhy rodu Candida jako je C. albicans, C. tropicalis a C. parapsilosis produkují in vitro více proteináz než méně virulentní druhy. Nejvíce produkovaným proteinem in vitro je Sap2 (Naglik a kol., 2003). Dalšími významnými enzymy podílejícími se na virulenci jsou fosfolipázy (Pl), které umožňují kvasinkám invazi do tkání (Ghannoum, 2000). Příkladem může být jejich keratolytický účinek, který jim umožňuje invazi do kůže (Bednář, 1996). Buněčné membrány jsou složeny z fosfolipidové dvouvrstvy a právě proti těm fosfolipázy působí, to vede k dysfunkci membrán, nebo rovnou k jejich narušení. Jednotlivé fosfolipázy jsou rozděleny do čtyř skupin- A, B, C a D podle toho, jakou konkrétní chemickou vazbu jsou schopny hydrolyzovat (Ghannoum, 2000). Posledními enzymy, které patří do skupiny extracelulárních hydroláz, jsou lipázy. Lipázy jsou schopné štěpit tuky a získávat z nich potřebné živiny pro svůj růst, čímž zároveň narušují tukovou složku hostitele. Patří do skupiny karboxylových ester hydroláz a jejich 16

17 fyziologickou úlohou je hydrolyzovat triglyceridy na diglyceridy, monoglyceridy, mastné kyseliny a glycerol (Khedidja a kol., 2011) Kandidové infekce Infekce způsobené různými druhy rodu Candida se nazývají kandidózy. Mikroorganismy tohoto rodu jsou prvořadými původci povrchových a systémových endogenních mykóz (Votava a kol., 2003). Kandidóza je onemocnění, které je rozšířené po celém světě. Frekvence jednotlivých druhů vyizolovaných z klinického materiálu, je geograficky odlišná (Pfaller a kol., 2010). Klasickým a nejčastějším původcem je Candida albicans, která je izolovaná z 80 až 90 % veškerých případů kandidóz (Kwon-Chung a kol., 1993). Dalšími významnými patogeny jsou tzv. non-albicans druhy, patří mezi ně C. tropicalis, C. parapsiolosis, C. glabrata či C. krusei (Pfaller a kol., 2007). Ostatní druhy rodu Candida jsou izolovány zřídka. Kandidy jsou součástí přirozené mikroflóry zdravého člověka. Vyskytují se v malém množství ve střevě, na kůži, v dutině ústní či ve vagíně dospělých žen, aniž by člověku škodily (Votava a kol., 2003). Pokud dojde k rozvratu symbiózy mezi kvasinkami a ostatními mikroorganismy v lidském těle, do té doby nepatogenní kvasinky se přemění na invazivní formu. Dochází k jejich přemnožení, prorůstání sliznicemi, což vede ke vzniku onemocnění a různých zdravotních komplikací. Kandidóza se tedy nejčastěji vyskytuje jako oportunní infekce u osob s různými predispozicemi. Mezi nejběžnější predispoziční faktory patří zejména AIDS, hematologická maligní onemocnění, imunosuprese, zavedení intravenózních či jiných katétrů, dlouhodobé užívání ATB, kortikosteroidů či cytotoxická chemoterapie. K přemnožení kvasinek dochází také v období těhotenství. Dalším podstatným faktorem je porucha specifické imunity buněčného typu a přirozené imunity. Jedná se o nízký počet neutrofilů, tzv. neutropenie, poruchy ve funkci T- lymfocytů, či defekty ve fagocytóze (Greenwood a kol., 1999). Kandidózu považujeme za typický projev při imunodeficitech vrozených i získaných. Přehled faktorů je uveden v tabulce č. 1. Jedná se tedy o infekce tzv. sekundární, to znamená, že vznikají u osob oslabených nemocí, u osob s nedostatečnou obranyschopností. Ke vzniku infekce však dochází i u zcela zdravých jedinců a to vysoce virulentními kmeny C. albicans, v takovém případě hovoříme o primární mykóze (Bednář a kol., 1996). První historická zmínka o tomto onemocnění je datována ke čtvrtému století př. n. l. V této době Hippokrates ve své knize Epidemics popsal afty v dutině ústní. Ty se vyskytovaly 17

18 u dvou pacientů trpících velmi závažným základním onemocněním (Kwon-Chung a kol., 1993). První izolace kandidy byla provedená v roce 1884 ze sputa od pacienta s tuberkulózou (Akpan a kol., 2002). Tab. 1: Faktory způsobující přemnožení kandid a kandidózu (Greenwood a kol., 1999) 1. stavy přirozené vnímavosti (dětství, stáří, těhotenství) 2. změny místní bakteriální flóry (např. po podání antibiotik) 3. změny na epitelu (např. vlhkem, traumatem) 4. defekty T- lymfocytů (primární nebo sekundární při onemocnění, např. při AIDS nebo po imunosupresi) 5. neutropenie (primární nebo sekundární při onemocnění) 6. endokrinní onemocnění (např. diabetes mellitus) 7. jiné stavy (např. nedostatek železa nebo zinku) Povrchová kandidóza Povrchová kandidóza je obecně nejběžnější ze všech druhů mykóz a patří mezi onemocnění, které je světově značně rozšířené. Postihuje především kůži, nehty, sliznici úst a pochvy. Infekce sliznic patří mezi nejčastější projevy povrchové kandidózy. Projevují se tak, že se na sliznici tvoří ohraničené bílé skvrny. Tyto skvrny však mohou i splývat a tím vytvářet pseudomembrány tvarohového vzhledu (Greenwood a kol., 1999). Mezi infekce sliznic řadíme kandidózu dutiny ústní a vagíny. Orální kandidóza je běžnou oportunní infekcí dutiny ústní. Výskyt onemocnění se liší v závislosti na věku a predispozičních faktorech (Akpan a kol., 2002). Při kandidóze dutiny ústní se na bukální sliznici a tvrdém patře tvoří bílé skvrny, které ke sliznici adherují, lze je ale setřít ve formě bílého povlaku. Dalšími příznaky bývá zarudlá a bolestivá okolní sliznice, v některých případech může být infekcí zasažen i jazyk. Kandidóza dutiny ústní bývá také označována jako trush či soor, tento výraz bývá překládán do češtiny jako moučnivka. Tento typ kandidózy se nejčastěji vyskytuje u kojenců, starých osob nebo u pacientů se sníženou 18

19 obranyschopností, včetně lidí s onemocněním AIDS (Greenwood a kol., 1999). Vzhled orální kandidózy u pacientů nakažených HIV je ukazatelem klinické progrese k onemocnění AIDS (Kwon-Chung a kol., 1993). Vznik orální kandidózy může způsobit zhoršená funkce slinných žláz, užívání drog, kouření, strava s vysokým obsahem sacharidů či onemocnění jako je diabetes mellitus, Cushingův syndrom či malignity (Akpan a kol., 2002). Dále se může infekce rozvíjet jako léze pod protézou u pacientů s umělým chrupem, nebo výsev kandidózy na jazyku u některých osob při antibiotické léčbě (Greenwood a kol., 1999). Jestliže byla zvolena odpovídající a efektivní léčba, pak má onemocnění dobrou prognózu. K možnému relapsu ve většině případů dochází kvůli neschopnosti vyřešit predispozici, která vedla ke vzniku infekce, nebo nedokonalému vyčištění protézy (Akpan a kol., 2002). Vulvovaginální kandidóza (VVC) představuje nepříjemnou a velmi častou infekci genitálního traktu, jenž postihne během života více než tři čtvrtiny žen. Některé z nich se s touto infekcí potýkají opakovaně, což se označuje jako rekurentní vulvovaginální kandidóza (Zeng a kol., 2011). Nejohroženější skupinou jsou postpubertální ženy mající diabetes mellitus, užívající širokospektrální antibiotika, či ženy v třetím trimestru těhotenství. Na vzniku VVC má vliv i užívání hormonální antikoncepce (Kwon-Chung a kol., 1993). V typických případech se projevuje bílými lézemi na epitelu vulvy, stěnách pochvy a cervixu, dále dyspareunií, pálením a vaginálním výtokem krémového charakteru či pálením při močení. Za nejvýznamnější příznak je považováno svědění, které je důležité při porovnávání VVC s infekcemi pochvy jiných etiologií. Kůže v okolí vulvy je bolestivá, sliznice bývá zarudlá a oteklá (Martins a kol., 2012). Povrchovou kandidózu dále můžeme dělit na infekce kůže a nehtů. Kandidóza kůže se nejčastěji vyskytuje v podpaží, tříslech, na perineu, pod prsy, mezi prsty a také jako dermatitida pod plenkami u dětí. Tedy na místech, kde často dochází k vlhkému zapaření (Greenwood a kol., 1999). Tato infekce bývá častá u starých a obézních osob, částečně také u pacientů s diabetem mellitus nebo po antibiotické léčbě (Kwon-Chung a kol., 1993). Kožní kandidóza má velmi rychlý nástup a přetrvává tak dlouho, dokud oblast postižení zůstává vlhká. Povrchová kandidóza se může vyskytnout také na penisu po styku s ženou trpící vaginální kandidózou, u mužů bývá označována jako kandidová balanitida (Chen a kol., 2011). Infekce může také postihnout vnitřní ucho, což ovšem nebývá příliš časté. Také dochází k infekci nehtového lůžka, především při častém máčení rukou např. při mytí nádobí. Sekundární invaze kandid je doprovázená odbarvením postranního okraje nehtu (Greenwood a kol., 1999). 19

20 Chronická kandidóza kůže a sliznice je velmi vzácná forma kandidózy objevující se v dětském věku. Onemocnění přechází v perzistující, někdy v granulomatózní infekci úst, kůže a nehtů (Greenwood a kol., 1999). Dochází k rozsáhlým postižením kůže a sliznic a hlubší invazi kvasinek do tkání (Bednář a kol., 1996). Typické pro tuto formu infekce jsou afty v dutině ústní, které vznikají po léčbě ATB. Infekce přetrvává v ústech a pomalu se šíří kůží, nehty, vlasy, jícnem, v případě dívek postihuje vagínu (Kwon-Chung a kol., 1993). Někteří pacienti trpící touto formou infekce mají defekt ve funkci T-lymfocytů a neutrofilů, které se významně podílejí na obranyschopnosti proti kvasinkovým infekcím (Greenwood a kol., 1999) Invazivní kandidóza Jedná se o nejtěžší formu infekce, která je způsobena kvasinkami rodu Candida. Invazivní kandidóze je přičítána až 40% úmrtnost (Pfaller a kol., 2007). Dělíme ji na lokální a systémovou. Kvasinky rodu Candida se šíří invazí do tkání nebo hematogenní cestou (Bednář a kol., 1996). Lokální kandidóza, jinak také nazývaná jako orgánová, bývá lokalizovaná na určitých místech, například v močovém ústrojí, dutině břišní či plicích (Greenwood a kol., 1999). Klinicky se poté projevuje jako záněty jícnu, gastrointestinální kandidózy, pneumonie, záněty močového ústrojí, které zahrnují cystitidy, ledvinové abscesy či pyelonefritidy (Kwon- Chung a kol., 1993). Systémová kandidóza je ještě vážnější varianta invazivní kandidózy, neboť se kvasinky dostávají do krve a jsou šířeny po celém těle, tím dochází k rozvoji sepse neboli tzv. kandidémii. Místy diseminace mohou být různé orgány, např. ledviny, játra, mozkové meningy, srdeční chlopně, bronchy (Greenwood a kol., 1999). Klinickým projevem pak je kandidémie, chronická diseminovaná (hepatosplenická) kandidóza, endokarditida, meningitida, artritida, osteomyelitida, endoftalmitida, která bývá důležitým ukazatelem invazivní kandidózy, projevuje se bílými lézemi v oku. (Kwon-Chung a kol., 1993). Klinické projevy u kandidóz jsou shrnuty v tabulce č. 2. Infekce krve neboli kandidémie je spojená s vysokou úmrtností, uvádí se okolo 40 až 50 %, ale také značně prodlužuje dobu hospitalizace pacienta (De Rosa a kol., 2009). U kriticky nemocných pacientů je frekvence úmrtnosti vyšší v případě onemocnění, které je způsobené non-albicans kmeny ve srovnání s C. albicans (Dimopoulos a kol., 2008). Kandidémie bývá zjištěna v konečných stádiích těžkých chorob, jako např. u hematoblastóz. Dále bývá především u pacientů po operacích a při imunosupresi (Bednář a kol., 1996). 20

21 K velmi častému rozvoji tohoto onemocnění dochází po transplantaci solidních orgánů, přibližně 20 % pacientů má během prvních dvou týdnů po zákroku pozitivní krevní test (Calderone, 2002). Infekce krve vznikají z kontaminovaných infuzních roztoků, venózních a močových katétrů, na nichž jsou adherované kvasinky ve formě biofilmu. U některých pacientů kandidémie pomine spontánně nebo po odstranění kontaminovaného katétru, což bývá v mnoha případech jednodušší a účinnější metodou, namísto užívání antimykotických léčiv určených k usmrcení kvasinek nebo zastavení jejich růstu (Greenwood a kol., 1999; Cheng a kol., 2005). Jako další predispoziční faktory se uvádí užívání širokospektrých antibiotik, celková parenterální výživa, léčba kortikosteroidy, neutropenie, trombocytopenie, maligní onemocnění, nedávný operační zákrok dutiny břišní či těžké popáleniny (Odds a kol., 2007). Za posledních deset let je rod Candida uváděn jako významný a rozvíjející se nozokomiální patogen krevního řečiště (Baddley a kol., 2008). Uvádí se, že kandidémie představuje 8 % všech případů nozokomiálních nákaz (Pfaller a kol., 2007). Kandidémie může být příčinou již zmíněné endokarditidy, jenž mívá fatální průběh. Během posledních let se zvyšuje množství případů tohoto onemocnění a i přes agresivní antimykotickou a chirurgickou léčbu je úmrtnost stále vysoká (Baddley a kol., 2008). Postihuje narkomany nebo pacienty, kteří podstoupili transplantaci srdeční chlopně (Kwon- Chung a kol., 1993). Mezi další příčiny řadíme předchozí operace, intravenózní katétry, užívání antibiotik, základní onemocnění srdce, či imunosupresivní léčbu. Klinická manifestace není odvislá od toho, zda onemocnění bylo způsobeno C. albicans či nonalbicans druhy. Nejběžnějšími projevy jsou horečka neznámého původu, plicní edém, či hematurie. Nejčastějšími původci jsou C. albicans a C. parapsilosis, následuje C. glabrata a C. tropicalis (Baddley a kol., 2008). Sepse způsobené kvasinkami rodu Candida jsou klinicky nerozeznatelné od bakteriálních infekcí (Cheng a kol., 2005). Příznaky kandidémie jsou doprovázeny horečkou, v nejtěžších případech také šokem nebo diseminovanou intravaskulární koagulací (Kwon-Chung a kol., 1993). Diagnostika invazivní kandidózy je značně obtížná, neboť nemá, mimo endoftalmitidu, žádný zřetelný klinický obraz. Laboratorní diagnostika je komplikovaná především tou skutečností, že Candida albicans je komenzálem a v těle se vyskytuje i mimo infekci. Kandidémie jsou nejčastěji způsobeny C. albicans, ale poměr způsobených infekcí non-albicans kmeny stále narůstá (Cheng a kol., 2005). Dominantně izolovaným druhem je C. glabrata, za ní následuje C. parapsilosis a C. tropicalis (Odds a kol., 2007). 21

22 Tab. 2: Klinické projevy kandidóz (Upraveno podle: Kwon-Chung a kol., 1993) Povrchové kandidózy Orální Kožní Vaginální Balanitidy Chronické mukokutánní infekce Invazivní kandidózy LOKÁLNÍ Ezofagitidy Infekce GIT Infekce močového traktu Pneumonie SYSTÉMOVÉ Kandidémie Endokarditidy Meningitidy Endoftalmitidy Chronické diseminované (hepatosplenické) kandidózy Léčba Léčiva kvasinkových infekcí lze obecně dělit na specifická antimykotika, která působí přímo v metabolismu kvasinky, nebo na nespecifická antimykotika, která jsou považována za protiplísňová antiseptika. Podle způsobu použití dále na lokální a systémová (Votava, 2005). Aby však byla léčba úspěšná, je nutností odhalit důvody onemocnění, tedy predispoziční faktory (Greenwood a kol., 1999). Výběr vhodné antimykotické léčby závisí na mnoha kritériích, náleží k nim např. závažnost nemoci, místo infekce či současná léčba jinými léky (De Rosa a kol., 2009). Podle chemické stavby se současná systémová specifická antimykotika dělí na imidazoly, triazoly, polyenová a ostatní antimykotika. Imidazoly se používají na léčbu systémových kandidóz, inhibují syntézu ergosterolu, základní složku buněčné membrány kvasinek. Většina z nich je vhodná pouze pro lokální léčbu, neboť v těle podléhají rychlému 22

23 rozkladu. U povrchových chronických mykóz nereagujících na jinou léčbu se perorálně podává ketokonazol (Votava, 2005). Triazoly také inhibují syntézu ergosterolu, mají však mnohem lepší farmakokinetické vlastnosti. Itrakonazol a flukonazol je využíván v léčbě systémových a povrchových mykóz, ale také jako profylaxe u imunodeficientních pacientů (Votava, 2005). Flukonazol je nejrozšířeněji užívaným azolovým léčivem v případě VVC (Martins a kol., 2012). U pacientů, kteří byli dříve vystaveni léčbě azolovými sloučeninami, je vyšší pravděpodobnost nákazy non-albicans kmeny, které si během předchozí léčby či profylaxe k azolům získali rezistenci (Baddley a kol., 2008). Jedná se především o flukonazol, ke kterému si nejčastěji vytváří rezistenci C. krusei či C. glabrata (Cheng a kol., 2005). Jako účinná a bezpečná léčba invazivních kandidóz se prokázal nově vyvinutý varikonazol (Baddley a kol., 2008). Polyenová antimykotika patří mezi toxické látky, které jsou využívány jen výjimečně. Váží se na ergosterol, čímž naruší permeabilitu buněčné stěny a cytoplasmatické membrány kvasinky (Votava, 2005). V případě závažných systémových mykóz se nitrožilně podává amfotericin B. U infekční endokarditidy způsobené rodem Candida je tradiční antimykotickou terapií amfotericin B s následnou léčbou flukonazolem k potlačení kvasinkové infekce z důvodu recidivy onemocnění. Ve většině případů je dále doporučen chirurgický zákrok (Baddley a kol., 2008). Mezi ostatní systémová antimykotika je řazen flucytosin. Aktivně proniká do buněk, kde inhibuje syntézu RNA a částečně i DNA. Rychle na něj však vzniká rezistence, v kombinaci s amfotericinem B se jeho účinek zesiluje (Votava, 2005). Mezi nově vyvinutá antimykotická léčiva patří echinokandiny a pneumokandiny. Inhibují syntézu beta-glukanu, nezbytné látky tvořící integritu buněčné stěny kvasinek, což pak vede k její lýze. Echinokandiny jsou hojně využívány jako účinná léčba invazivních kandidóz, především endokarditidy a kandidémie (Baddley a kol., 2008). Také jsou jimi léčeny pacienti v kritickém stavu a pacienti s infekcemi způsobenými rezistentními druhy kandid k azolovým preparátům (De Rosa a kol., 2009). Mezi takto rezistentní kandidy patří již zmíněná C. krusei, která je odolná k více antimykotikům a echinokandiny jsou v boji s tímto patogenem nejúspěšnější (Pfaller a kol., 2005). Jako antimykotika k lokální léčbě jsou určeny především deriváty imidazolu, v dermatologii se nejčastěji využívají bifonazol, clotrimazol, ekonazol, ale i systémově použitelný ketokonazol a mikonazol. Ze skupiny polyenových antimykotik se lokálně používají nystatin a natamycin, který je indikován u kožních a slizničních kandidóz 23

24 (Votava, 2005). V některých případech vaginální kandidózy je mimo lokální terapii, použitím např. čípků, či masti, nutná i léčba celková, neboť významným rezervoárem kandid může být i střevo (Votava a kol., 2003). Zanedbáním této skutečnosti dochází k rekurentním vulvovaginitidám (Kwon Chung a kol., 1993). K lokální léčbě, ale i profylaxi infekcí kůže a nehtů se používají antimykoticky účinkující látky, které mají spíše antiseptický charakter. Mezi tato léčiva řadíme Mycoseptin či Nitrofungin (Votava, 2005). 2.3 Možnosti identifikace Správná identifikace jednotlivých druhů rodu Candida je velice důležitá. Určení druhu je klíčové pro volbu následné léčby, která by měla být co nejefektivnější. Některé druhy kandid nejsou citlivé vůči všem antimykotickým látkám, a proto jejich správnou identifikací můžeme zvolit adekvátní léčbu. Ovšem ne všechny identifikační metody jsou stoprocentně spolehlivé. Některé druhy rodu Candida jsou si natolik fenotypicky podobné, že v mnoha případech docházelo k jejich nesprávnému určení. Odlišení jednotlivých druhů je možné na základě jejich rozdílných fyziologických a morfologických vlastností. Příkladem může být schopnost tvorby zárodečných klíčků v lidském séru, což je standardní laboratorní metoda sloužící k identifikaci C. albicans. Tuto vlastnost sdílí také C. dubliniensis a C. stellatoidea (Williams a kol., 2011). Mezi další metody odlišení patří např. schopnost tvorby chlamydospor či pravých hyf. V posledních letech jsou k identifikaci používány diferenciační chromogenní média. Tato média obsahují chromogenní substráty, které jsou štěpeny druhově specifickými enzymy. Odlišení jednotlivých klinicky významných kandid je založeno na rozdílném vzhledu a barvě kolonií. Takovýchto identifikačních souprav je na trhu celá řada, např. CHROMagar Candida, Pagano-Levin agar, Albicans ID nebo Candichrom albicans (Williams a kol., 2011). Na médiu CHROMagar Candida (CHROMagar, Paříž, Francie) C. dubliniensis tvoří tmavě zelené kolonie na rozdíl od C. albicans, která roste ve formě světle zelených kolonií (Byadarahally Raju a kol., 2011). C. parapsilosis roste ve formě bílých kolonií, C. glabrata tvoří lesklé kolonie levandulové barvy, C. krusei drsné růžové a C. tropicalis modré kolonie (Madhavan a kol., 2011). C. africana na tomto médiu vykazuje mírně nazelenalý nádech a zpožděný růst (Tietz a kol., 2001). Velký vliv na zbarvení kolonií má teplota a délka inkubace. 24

25 C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. dubliniensis C. krusei Obr. 4: Kolonie různých druhů rodu Candida na médiu CHROMagar Candida v kombinaci s Paulovým agarem po 48 hodinové inkubaci při teplotě 37 C (Sahand a kol., 2005) Obr. 5: Kolonie C. albicans (první fotografie), C. dubliniensis (druhá fotografie) a C. africana (třetí fotografie) na médiu Candida ID 2 (Romeo a Criseo, 2008) 25

26 Na konvečních pevných médiích je velice obtížné odlišit kolonie C. albicans, C. dubliniensis a C. africana. Tuto skutečnost výrazně ulehčují komerčně dostupné chromogenní agary Candida ID 2 (biomerieâ'ux, Marcy-l Etoile, Francie). Na tomto selektivním a diferenciálním médiu C. albicans obvykle tvoří kolonie tmavě modré barvy, C. dubliniensis světle tyrkysové kolonie a C. africana roste ve formě bílých kolonií (Alonso- Vargas a kol., 2008; Romeo a Criseo, 2009) (Obr. 5). Významná možnost identifikace jednotlivých druhů rodu Candida je na základě jejich rozdílných biochemických vlastností. Mezi tyto vlastnosti patří schopnost kandid fermentovat (zymogram) a utilizovat cukry jako jediný zdroj uhlíku a dusíkaté látky (auxanogram). Každá z kvasinek má svůj charakteristický asimilační profil (Votava a kol., 2003). Jednou z identifikačních souprav, která umožňuje identifikovat jednotlivé druhy na základě odlišné schopnosti asimilace cukrů, je CANDIDAtest 21 (Erba-Lachema, Brno, Česká republika). Tato sada umožňuje identifikaci 34 druhů pomocí 21 biochemických testů. Dalším identifikačním testem je např. VITEK 2 systém (biomeâ'rieux, Marcy-l Etoile, Francie). Využívá se rozdílné schopnosti kandid asimilovat různé druhy cukrů jako jediný zdroj uhlíku. Např. C. dubliniensis není schopna asimilovat xylózu či methyl-d-glukosid na rozdíl od C. albicans. (Gales a kol., 1999). V příapadě trehalózy vykazuje variabilní asimilaci (Sullivan a kol., 2003). C. africana zase není schopná asimilovat N-acetylglukosamin, glukosamin, stejně jako trehalózu (Romeo a Criseo, 2008). Dalším příkladem může být C. glabrata, která je schopna utilizovat trehalózu, ale ne sacharózu (Lopez a kol., 2001). Identifikace je také možná pomocí sérologických metod, jako jsou např. aglutinační a precipitační reakce (Bednář a kol., 1996). Součástí buněčné stěny kvasinek jsou polysacharidy mannany a glukany, ty slouží jako povrchové antigeny, které jsou specifické pro jednotlivé druhy kandid (Calderone, 2002). Testy slouží k detekci polysacharidových antigenů v séru. Konečná identifikace druhů rodu Candida je možná pomocí molekulárně biologických metod. Identifikace na základě analýzy genetické variability je mnohem spolehlivější než metody, které jsou založené na fenotypových vlastnostech (Madhavan a kol., 2011). Jedná se např. o rozdíly v délce restrikčních fragmentů, délce amplifikovaných fragmentů (Byadarahally Raju a kol., 2011), dále o rozdílné DNA a RNA sekvence (Ells a kol. 2009). Kandidy lze od sebe odlišit také pomocí amplifikace některých genů, které jsou u každého druhu rozdílné (např. hwp1 nebo phr1). 26

27 3 Candida albicans C. albicans je nejvýznamnější a nejlépe prostudovanou kvasinkou rodu Candida. V polovině 19. století byla Bennettem vytvořena ilustrace mikroskopické struktury kvasinky, která byla získána ze vzorku sputa z plic pacienta s tuberkulózou. Autoři se domnívají, že tento nákres znázorňuje právě kvasinku C. albicans. Jako nový druh byla popsána v roce Od té doby byla známá pod více než 100 různými názvy, mezi její synonyma patří např. Oidium albicans, Monilia albicans či Endomyces albicans. (Kwon-Chung a kol., 1993). V roce 1938 byly ze stěrů z pochvy vyizolovány kmeny C. albicans, které měly neobvyklé fyziologické vlastnosti. Nebyly schopny utilizovat sacharózu jako jediný zdroj uhlíku, na kukuřičném agaru tvořily málo chlamydospor a nebyly patogenní pro králíky. Pro své vlastnosti byly tyto kmeny navrženy jako samostatný druh a pojmenovány jako Monilia stellatoidea. O rok později tato kvasinka byla přejmenována na Candida stellatoidea. Na konci 80. let 20. století bylo však zjištěno, že nový druh kvasinky je geneticky téměř shodný s C. albicans, a proto mnoho autorů usilovalo o jejich sjednocení do jednoho druhu. Nyní je C. stellatoidea rozdělena do dvou odlišných genetických typů na základě elektroforetické karyotipizace, na typ I a typ II. Typ I C. stellatoidea není považován za žádnou mutantní formu C. albicans, zatímco typ II představuje druh C. albicans s mutantním genem důležitým pro utilizaci sacharózy (Romeo a Criseo, 2011). C. albicans se vyskytuje ve dvou odlišných sérotypech, Jedná se o sérotyp A nebo B. U zdravých jedinců se sérotypy A a B vyskytují přibližně stejně často, zatímco sérotyp B je častěji nalézán u imunokompromitovaných jedinců (Votava a kol., 2003). 3.1 Charakteristika C. albicans je dimorfní, diploidní kvasinka bez schopnosti podstoupit meiózu a vytvořit haploidní buňku (Tietz a kol., 2001). Vyskytuje se ve třech odlišných morfologických podobách a to ve formě blastokonidií, pseudohyf a pravých hyf (Tietz a kol., 2001). V jaké formě budou kvasinky růst, záleží na vnějších podmínkách. Jedná se hodnotu ph, chemické složení růstového média, inkubační teplotu a hustotu inokula. Blastospory se tvoří v médiu s nízkým ph a obsahem glukózy jako zdrojem uhlíku nebo v případě velké hustoty inokula (>10 6 buněk/ml) a kultivaci při teplotě 27

28 nižší než 35 C. Naopak na médiu s ph vyšším než šest dochází k růstu kvasinek ve formě hyf (Kwon-Chung a kol., 1993). Na Sabouraudově agaru tvoří při 25 C krémově bílé hladké a lesknoucí se kolonie. Kolonie jsou tvořeny kulovitými nebo oválnými blastokonidiemi, jenž dosahují velikosti kolem 3 až 6 µm (Votava a kol., 2003). Dále roste při 30, 37 ale také při 42 C (Tietz a kol., 2001). C. albicans produkuje rezistentní buňky, tzv. chlamydospory, na rýžovém agaru nebo na žlučovém médiu. Chlamydospory jsou kulaté, silnostěnné, velikosti okolo 7 až 10 µm a jsou umístěny na koncích i po stranách hyf (Bednář a kol., 1996). Schopnost tvorby chamydospor je velmi důležitým taxonomickým kritériem. Tato vlastnost, do objevení C. dubliniensis, byla charakteristická pouze pro C. albicans (Sullivan a kol., 1995). Mezi další schopnost této kvasinky patří germinace. Tvorba zárodečných klíčků je pozorována v prvních hodinách kultivace. Jsou to tenké vláknité útvary pučící z blastokonidií bez zaškrcení v místě, kde opouštějí svou mateřskou buňku (Votava a kol., 2003). Germinace se zjišťuje po naočkování kmene do lidského séra nebo albuminu. Zárodečné klíčky se tvoří po tři hodinové inkubaci. (Kwon-Chung a kol., 1993). Jako všechny kvasinky, tak i C. albicans využívá při svém metabolismu glukózu a jako většina kandid ji kvasí za tvorby CO 2 (Votava a kol., 2003). C. albicans asimiluje aminocukry, štěpí glukózu, maltózu, sacharózu a neštěpí laktózu (Tietz a kol., 2001; Bednář a kol., 1996). Dále utilizuje xylózu a methyl-d-glukozid (Gales a kol., 1999). 3.2 Klinická významnost Candida albicans je nejvýznamnějším houbovým patogenem, který je nejčastěji izolován z klinických vzorků v rámci rodu Candida. (Romeo a Criseo, 2011). V této kapitole je okrajově shrnuta klinická významnost tohoto druhu, další informace o jednotlivých nemocích jsou uvedeny v kapitole Kandidové infekce. C. albicans je lidským komenzálem. Za normálních okolností kolonizuje povrchy sliznic trávicího traktu či dutiny ústní zdravého člověka, aniž by působila zdravotní komplikace. Pokud dojde k narušení rovnováhy mezi kvasinkou a ostatními mikroorganismy čí oslabení obranyschopnosti pacienta, stává se C. albicans nejčastějším původcem řady onemocnění (Votava a kol., 2003). 28

29 Tato oportunně patogenní kvasinka je schopna způsobit onemocnění v rozsahu od jednoduchých kožních infekcí až po závažné kandidémie (Zomorodian a kol., 2011). Je původcem povrchových a systémových kandidóz. Způsobuje např. infekce dutiny ústní, které bývají nejčastěji u pacientů s oslabenou imunitou, především u pacientů s AIDS, naproti tomu velmi časté vaginální kandidózy vznikají i u pacientů bez zjevných známek poruch imunity (Jacobsen a kol., 2012). Velkým rizikem je C. albicans pro hospitalizované pacienty, kteří jsou náchylní ke vzniku systémové kandidózy, jenž je značně ohrožuje na životě. V takovémto případě se C. albicans šíří krevním řečištěm a může docházet k rozvoji infekce i v několika vnitřních orgánech současně (Jacobsen a kol., 2012). Až z 65 % je právě tato kvasinka příčinou kandidémie (Sullivan a kol., 2003). Rezistence C. albicans na některá antimykotická léčiva se zvýšila v posledních dvou desetiletích (Zomorodian a kol., 2011). Jedná se především o azolová antimykotika, která měla nižší cytotoxicitu a vysokou účinnost, a proto byla používána při léčbě infekčních kandidóz. Nicméně, dlouhodobé užívání těchto léčiv vedlo k rozvoji rezistence u C. albicans a dalších druhů (Jacobsen a kol., 2012). 29

30 4 Candida dubliniensis C. dubliniensis je nedávno popsanou oportunně patogenní kvasinkou patřící do rodu Candida. V roce 1995 byla identifikována Sullivanem a jeho spolupracovníky jako nový druh ze vzorků dutiny ústní od irských pacientů infikovaných virem HIV, u nichž docházelo k návratům orálních kandidóz (Romeo a Criseo, 2011). Kvasinka byla poté pojmenována po městě Dublin a univerzitě (University of Dublin), na které došlo k její identifikaci (Sullivan a kol., 1995) Retrospektivní studie ukázaly, že v minulosti byly kmeny C. dubliniensis běžně označovány jako C. albicans, a to z důvodů velmi podobných fenotypových vlastností (Chowdhary a kol., 2011). Jedná se především o schopnost tvorby chlamydospor a zárodečných klíčků, které do objevení C. dubliniensis byly typické pouze pro C. albicans (Faggi a kol., 2005). Z důvodů mylné identifikace mohlo docházet k podcenění výskytu tohoto druhu a tím i jeho klinického významu (Chowdhary a kol., 2011). Použitím C. albicans specifické DNA sondy 27A byly získány zřejmé rozdílnosti od klasických kmenů C. albicans. Byly použity další genetické testy, které na základě srovnání sekvencí nukleotidů ve V3 variabilní oblasti velké podjednotky rdna dokázaly, že se jedná o dva zcela odlišné druhy (Sullivan a kol., 2003). Případy mylné identifikace sahají až do roku V té době byl v Holandsku jeden izolát C. dubliniensis identifikován jako C. albicans (Odds a kol., 1998), k dalšímu takovémuto zjištění došlo v případě 14 kmenů, které v roce 1957 byly chybně označeny jako C. stellatoidea a uloženy v Britské národní sbírce patogenních hub (Sullivan a kol., 1995). V současné době je na trhu vyvinuto několik identifikačních souprav sloužících k odlišení mezi těmito dvěma druhy na základě fenotypových vlastností. Jednotlivé fenotypové testy nejsou však dostatečně specifické a spolehlivé. Nejčastěji používané fenotypové testy zahrnují stanovení barvy kolonií a jejich morfologie pomocí rozdílných kultivačních médií. Stále platí, že nejspolehlivější identifikace je pomocí molekulárních metod, k nimž patří např. polymerázová řetězová reakce (Chowdhary a kol., 2011). 30

31 4.1 Charakteristka C. dubliniensis, tak jako C. albicans, má schopnost vyskytovat se ve formě blastokonidií, pseudohyf a pravých hyf (Tietz a kol., 2001). Kvasinka tvoří hyfy na Paulově agaru při teplotě 30 C po 48 až 72 hodinové inkubaci (Al-Mosaid a kol., 2003). Na Staibově agaru C. dubliniensis tvoří dvojice, trojice nebo seskupení chlamydospor na koncích krátkých rozvětvených hyf (Al Mosaid a kol., 2001). Také velmi dobře roste na Sabouraudově (dextrózovém) agaru při 30 až 37 C, na kterém tvoří krémově bílé kolonie, které jsou podobné těm, které tvoří C. albicans (Sullivan a kol., 1995). Tato kvasinka není však schopna růstu při teplotě 42 až 45 C, čehož se využívá při odlišení tohoto druhu od C. albicans (Pinjon a kol., 1998). C. dubliniensis má velmi podobný asimilační profil jako C. albicans, také je schopna asimilace amino cukrů (Tietz a kol., 2001). Nedokáže však utilizovat methyl-d-glukosid, laktát nebo xylózu (Gales a kol., 1999). Asimilace trehalózy je variabilní (Sullivan a kol., 2003). Na komerčně dostupném chromogenním agarovém médiu CHROMagar Candida po 48 hodinovém růstu při 37 C tvoří C. dubliniensis tmavě zelené kolonie, které jsou snadno odlišitelné od jiných druhů rodu Candida (Faggi a kol., 2005). 4.2 Klinická významnost Tato celosvětově rozšířená oportunně patogenní kvasinka je převážně izolována z dutiny ústní od pacientů s onemocněním AIDS a osob infikovaných virem HIV. Infekci tedy způsobuje především u imunokompromitovaných jedinců (Sullivan a kol., 2003). Přestože C. dubliniensis způsobuje infekce i u zdravých osob, jsou tyto případy relativně vzácné, s odhadovanou prevalencí nižší než 5 % (Fotedar a kol., 2003). Tyto skutečnosti naznačují, že ve většině případů imunitní systém v součinnosti s normální mikrobiální flórou zabraňuje přemnožení této kvasinky. U osob infikovaných HIV nebo s onemocněním AIDS je obranyschopnost organismu oslabená (poškození T-buněčné imunity), tudíž jsou takto znevýhodněné osoby mnohem náchylnější k infekcím způsobených C. dubliniensis (Sullivan a kol., 1998). Ačkoli byla C. dubliniensis prvně izolovaná z dutiny ústní, několik studií poukazuje na to, že tato kvasinka byla získána i z jiných anatomických míst, např. z respiračního traktu, 31

32 krve, CNS, vagíny, moče či kůže a to jak v případě HIV pozitivních tak i HIV negativních pacientů (Fotedar a kol., 2003). Na rozdíl od C. albicans je C. dubliniensis zřídka nalézána v mikroflóře dutiny ústní zdravých jedinců. V případech invazivních kandidóz je C. dubliniensis izolována především od pacientů s neutropeniemi a po transplantacích solidních orgánů. Poměrně vysoká prevalence tohoto druhu je také u pacientů se stomatitidou, diabetem a cystickou fibrózou. C. dubliniensis je původcem také infekčních endokarditid či meningitid (Fotedar a kol., 2003). C. dubliniensis je obvykle nalézána v klinickém materiálu v kombinaci s jinými druhy kvasinek, zejména C. albicans. (Sullivan a kol., 2003) Drtivá většina kmenů C. dubliniensis je citlivých na všechna běžně používaná antimykotika. U klinických izolátů byla pozorována snižující se citlivost k azolovým léčivům (Sullivan a kol., 2003). Bylo zjištěno, že kmeny C. dubliniensis jsou schopny si rychle vyvinout odolnost vůči těmto preparátům (např. flukonazol) in vitro. Pokud by tato schopnost byla prokázána in vivo, může to z části objasnit vznik těchto infekcí u osob infikovaných HIV a s onemocněním AIDS, kteří jsou právě tímto antimykotikem často léčeni (Sullivan a Coleman, 1998). 4.3 Možnosti odlišení C. dubliniensis od C. albicans Jak již bylo zmíněno v předchozí kapitole, oba tyto druhy kvasinek spolu velmi úzce souvisí. Mají podobné fyziologické vlastnosti, a proto jejich odlišení není zcela jednoduché. Diferenciace je založená na základě jejich fenotypových vlastností. Tyto metody však samy o sobě nejsou stoprocentně spolehlivé a mohou vést k nesprávnému určení druhu (Ells a kol., 2009). K identifikaci nebo odlišení jednotlivých druhů kvasinek je nutné použít kombinaci několika fenotypových metod. Vědci neustále pracují na vyvinutí takové metody, která by byla vhodná do rutinních klinických laboratoří, kde je nutné denně zpracovat velké množství klinických vzorků. Ideálem je metoda, která by byla finančně nenáročná, rychlá, jednoduchá a hlavně maximálně přesná. Nejspolehlivější identifikace je pomocí molekulárně biologických metod, jako je např. polymerázová řetězová reakce. Ta je však finančně dosti nákladnou a časově náročnou metodou, která pro diagnostiku velkého množství klinických vzorků v běžných 32

33 mykologických laboratořích není vhodnou a v mnohých případech ani dostupnou variantou (Chowdhary a kol., 2011) Růst při zvýšených teplotách Jak již bylo uvedeno v předešlé kapitole, kmeny C. dubliniensis rostou při 30 až 37 C, nejsou však schopny růst při vyšších teplotách (42 až 45 C) na rozdíl od C. albicans (Sullivan a kol., 1995). Této rozdílné tolerance se plně využívá k diferenciaci mezi těmito dvěma druhy (Ells a kol., 2009). Ovšem tato jednoduchá metoda není stoprocentní, neboť na základě různých studií byl prokázán částečný růst kmenů C. dubliniensis při teplotě 42 C po 48 hodinové kultivaci. Po dvou dnech inkubace při teplotě 45 C neprokázal růst ani jeden z izolátů (Ells a kol., 2009). Na druhou stranu jiní autoři po svých pokusech uvedli, že ani růst C. albicans při vysokých teplotách není spolehlivý, část kmenů nebyla schopna růst při 42 C natož při 45 C. Pincus a kolektiv uvedli, že tyto proměnlivé výsledky mohou být způsobeny špatnou regulací teploty během inkubace a rozdíly ve složení kultivačních médií (Ells a kol., 2009) Tvorba chlamydospor Oba druhy, jak C. albicans tak C. dubliniensis, jsou schopny tvořit chlamydospory. I když právě tato vlastnost byla v jejich identifikaci zavádějící, bylo zjištěno, že se jejich chlamydospory liší svým uspořádáním (Ells a kol., 2009). C. dubliniensis tvoří dvojice, trojice nebo seskupení chlamydospor na koncích krátkých rozvětvených hyf na rozdíl od C. albicans, která tvoří jedinou chlamydosporu na vrcholu prodloužené hyfy (Sullivan a kol., 1995). Jejich morfologie je znázorněná na obrázku č. 6. Opět ani tato metoda jejich odlišení na základě formace chlamydospor není spolehlivá. Práce Sullivana, Ellepola a jejich spolupracovníků ukázala, že kmeny C. dublinensis po kultivaci na kukuřičném Tween agaru nejsou schopny tvořit stále stejné formace chlamydospor (Ellepola a kol., 2003). Dokonce bylo zjištěno, že některé kmeny C. albicans byly schopny tvořit chlamydospory uskupené ve dvojicích nebo trojicích. Navíc je tato metoda značně náročná a zdlouhavá. Mnozí autoři dospěli k závěru, že tato vlastnost nemůže být použita k diferenciaci těchto dvou druhů (Ells a kol., 2009). 33

34 a) b) c) Obr. 6: Morfologie chlamydospor C. albicans a C. dubliniensis a) C. dubliniensis tvořící dvojice chlamydospor na koncích krátkých rozvětvených hyf b) C. albicans tvořící jedinou chlamydosporu na vrcholu prodloužené hyfy c) Příklad C. dubliniensis tvořící téměř identickou jedinou terminální chlamydosporu jako na obrázku (b) (Ellepola a kol., 2003) Růst v přítomnosti chloridu sodného C. albicans má vyšší schopnost zvládat nepříznivé podmínky vnějšího prostředí než C. dubliniensis. Příkladem je růst při již zmíněných vyšších teplotách nebo v přítomnosti NaCl. Na tomto základě byla vyvinuta jednoduchá a nenáročná metoda sloužící k jejich odlišení. Využívá se neschopnosti C. dubliniensis růst na Sabouraudově dextrózovém agaru s obsahem 6,5 % NaCl (Ells a kol., 2009). Při dalších pokusech bylo zjištěno, že malé procento kmenů C. dubliniensis v přítomnosti NaCl vyrostlo, i když tomu bylo jen ve velmi malé míře (Chowdhary a kol., 2011) Růst na chromogenních médiích Chromogenní média slouží k odlišení klinicky významných druhů rodu Candida. Mezi ně patří široce využívaný a komerčně vyráběný CHROMagar Candida, který obsahuje kombinaci chromogenních substrátů, které jsou štěpeny druhově specifickými enzymy. Diferenciace C. dubliniensis a C. albicans na tomto chromogenním médiu je založena na tvorbě barevně rozdílných kolonií po kultivaci při 37 C po dobu 48 hodin (Ells a kol., 34

35 2009). C. albicans na tomto médiu vytváří světle zelené kolonie na rozdíl od kolonií C. dubliniensis, které jsou tmavě zelené. Pokud je délka kultivace prodloužena na 72 hodin, je barva kolonií C. dubliniensis výraznější (Ells a kol., 2009). Po provedení několika studií bylo zjištěno, že inkubační teplota hraje důležitou roli v konečné barvě a vývoji kolonií, proto by teplota 37 C měla být dodržena a nemělo by docházet k jejímu kolísání (Odds a kol., 2000). Během inkubace při 30 C kmeny C. dubliniensis mohou vytvářet kolonie s různými odstíny zelené, nebo může dojít k případu, kdy některé kmeny C. albicans jsou schopny tvorby tmavě zelených kolonií (Ells a kol., 2009). Dalším chromogenním médiem je Albicans ID2 nebo Candida ID2, jenž obsahují substráty hexosaminidázy. Ani v případě těchto identifikačních systémů není zaručená stoprocentní přesnost. Kmeny C. dubliniensis mohou přijít o schopnost tvorby zřetelně tmavě zelených kolonií po jejich dlouhodobém zamražení (Ells a kol., 2009). Další možností odlišení těchto kvasinek je na základě schopnosti redukovat trifenyltetrazolium chlorid, který je součástí agarového média. Tradičně se tato metoda využívala k identifikaci C. tropicalis. C. albicans snížit TTC nedokáže a na médiu tvoří bílé až světle růžové kolonie, kdežto C. dubliniensis tuto schopnost má a vytváří kolonie kaštanové barvy. Byla hodnocena míra využití tohoto média k odlišení mezi C. dubliniensis a C. albicans, získané výsledky byly uspokojivé. K pokusu bylo však použito malé množství vzorků (Ells a kol., 2009) Odlišná morfologie kolonií C. dubliniensis a C. albicans lze od sebe odlišit i pomocí různých kultivačních médií, na kterých jsou schopny tvořit kolonie různých morfologií. Jedním z takovýchto médií je Paulův agar, který obsahuje extrakt ze slunečnicových semínek (Al-Mosaid a kol., 2003). Po 48 až 72 hodinové kultivaci izoláty C. dubliniensis na tomto agaru rostly ve formě krémově šedých drsných kolonií s hyfálními okraji a tvořily chlamydospory, zatímco C. albicans byla schopna tvořit pouze hladké stejně zbarvené kolonie. Kombinace stejných objemů CHROMagaru Candida a Paulova agaru zvyšuje rozdíly mezi těmito dvěma druhy. V takovémto případě C. dubliniensis tvoří tmavě zelené drsné kolonie a C. albicans zase hladké kolonie světle zeleného zbarvení (Sahand a kol., 2005). 35

36 Dalším médiem, na kterém C. dublinensis tvoří kolonie s hyfálními okraji a chlamydospory je tzv. tabákový agar. Bylo však zjištěno, že tabákový agar není vždy vhodný pro odlišení těchto dvou druhů, neboť i C. albicans je na tomto médiu schopna tvorby chlamydospor (Ells a kol., 2009). Staibův agar, který byl původně používán pro odlišení Cryptococcus neoformans od ostatních druhů kvasinek z klinického materiálu, lze také použít pro diferenciaci mezi C. albicans a C. dubliniensis na základě tvorby chlamydospor (Ells a kol., 2009). C. dubliniensis tvoří drsné kolonie, hyfy a chlamydospory, kdežto C. albicans tvorby chlamydospor není schopná. Ne vždy jsou ale výsledky testů takto jednoznačné, v některých případech ne všechny kmeny C. dubliniensis tvoří chlamydospory (Al Mosaid a kol., 2001). V posledních letech dochází k nárůstu použití médií s rostlinnými extrakty, jedná se např. o agar z rajčatové šťávy, či média obsahující výtažky ze sezamových a lněných semínek, rozmarýnu nebo oregana (Ells a kol., 2009) Asimilace cukrů Kvasinky rodu Candida mají schopnost asimilovat celou řadu cukrů jako jediný zdroj uhlíku. Jejich rozdílné asimilační profily slouží k identifikaci jednotlivých druhů. Jelikož C. albicans a C. dubliniensis mají velmi podobné fyziologické vlastnosti, tak i jejich asimilační profily se od sebe výrazně neliší (Sullivan aj., 1995). Výjimkou je však neschopnost C. dubliniensis utilizovat methyl-d-glukosid, xylózu, laktát nebo v některých případech D-trehalózu, neboť její asimilace je variabilní. Těchto skutečností se využívá pro jejich vzájemné odlišení. Nejspolehlivější diferenciace mezi oběma druhy jsou testy, které jsou založeny na utilizaci XYL. Studie prokázaly, že právě tento sacharid není schopno asimilovat největší procento kmenů C. dubliniensis (Khan a kol., 2012). Výsledky asimilace závisí na identifikačních systémech, které jsou pro diferenciaci použity. Na trhu je k dispozici celá škála takovýchto biochemických souprav. Každý systém poskytuje rozdílné výsledky. Příkladem může být utilizace D-trehalózy. Při prováděných studiích na identifikačním systému VÍTEK 2 ID-YST ani jeden z kmenů C. dubliniensis nebyl schopen asimilovat TRE, kdežto na médiu ID32C byla až polovina testovaných kmenů schopna utilizace tohoto cukru (Ells a kol., 2009). 36

37 4.3.7 Odlišení na základě sérologických vlastností Jedním z dalších způsobů odlišení těchto dvou druhů rodu Candida je bezesporu pomocí antigenů, které jsou součástí jejich buněčné stěny. Antigeny, které byly získány od C. dubliniensis, po vpravení do laboratorního zvířete vedly k tvorbě druhově specifických polyklonálních protilátek (Ells a kol., 2009). Detekcí těchto protilátek bylo možno diagnostikovat invazivní kandidózu, která byla způsobena právě tímto druhem. Hybridizací in vitro poté byly získávány monoklonální protilátky, které jsou mnohem specifičtější (Marot- Leblond a kol., 2004). Na základě využití dvou monoklonálních protilátek pracuje tzv. imunochromatografický membránový test (ICM albi-dubli test). Jedna z protilátek se váže na glykoprotein, který je součástí buněčných stěn obou kvasinek. Druhá protilátka se váže výhradně k proteinu, jenž je na povrchu hyf C. albicans (Marot-Leblond a kol., 2004). Bylo zjištěno, že v přesnosti tohoto testu hraje velmi významnou roli povaha inkubačního média. Nejpřesnější výsledky byly získány použitím médií SDA, CHROMagar Candida a CandiSelect. Naopak nejvíce nepřesné výsledky byly získány pomocí média ID Candida (Ells a kol., 2009). Další metodou sloužící k odlišení C. dubliniensis a C. albicans je latexová aglutinace neboli také aglutinace na nosičích. Jedná se o rychlou a rutinně prováděnou sérologickou metodu sloužící k průkazu antigenu nebo protilátky. Na povrchu latexové částice je navázaná specifická protilátka (antigen) proti danému antigenu (protilátce). Pokud je v námi testovaném séru přítomen specifický antigen (protilátka), po jeho smíchání s latexovými částicemi dojde k pozitivní reakci, při níž reaguje antigen s protilátkou za vzniku viditelných imunokomplexů (Votava, 2005). Identifikace C. dubliniensis je možná pomocí komerčního latex aglutinačního testu (Bichro-dubli Fumouze, Fumouze Diagnostics, France), který obsahuje latexové kuličky potažené specifickou protilátkou proti antigenu na povrchu buněčné stěny tohoto druhu. Tento test je vysoce citlivý a specifický (Ells a kol., 2009). 37

38 4.3.8 Diferenciace na základě genotypických vlastností Na základě srovnání genomů obou druhů bylo zjištěno, že jsou si velmi podobné, i když mezi nimi existují některé významné rozdíly. Tyto rozdíly jsou zodpovědné např. za odlišnou virulenci, která je daleko větší u kvasinky C. albicans (Moran a kol., 2012). Odlišení C. dubliniensis od C. albicans je prováděno pomocí různých genetických technik (Ells a kol., 2009). Několik z nich bude v této kapitole zmíněno Fingerprintové metody Mezi nepoužívanější techniky patří odlišení na základě polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism). Pomocí enzymů dochází k naštěpení genomu testovaných druhů, vlivem rozdílů v sekvenci DNA vznikají DNA restrikční fragmenty lišící se svou délkou v závislosti na druhu kvasinky. Silnou stránkou analýzy RFPL je možnost kombinace s jinými molekulárními technikami jako je PCR (Neppelenbroek a kol., 2006). Sullivan a jeho spolupracovníci provedli RFLP analýzu využívající krátké oligonukleotidové primery, které byly zaměřeny na mikrosatelitní oblasti, a tak nalezli dostatečné rozdíly pro odlišení C. dubliniensis od C. albicans (Sullivan a kol., 1995). Další technika diferenciace je na základě polymorfismu náhodně amplifikované DNA (RAPD, Randomly Amplified Polymorphic DNA). Součástí této analýzy je PCR amplifikace DNA cílové genomové sekvence pomocí krátkých primerů (Neppelenbroek a kol., 2006). Metoda AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), založená na polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů, kombinuje postupy jak RFLP tak PCR. Provádí se v několika krocích a je založena na detekci fragmentů DNA získaných štěpením restrikčními endonukleázami prostřednictvím PCR amplifikace (Neppelenbroek a kol. 2006; Soll, 2000) Sekvenční rozdíly Identifkace a následné odlišení C. dubliniensis od C. albicans je možné také na základě sekvenčních rozdílů v regionu rdna v oblasti 25S. Oba druhy se významně liší počtem nukleotidů v oblasti V3 (Ells a kol., 2009). Právě tato skutečnost byla Sullivanem a jeho spolupracovníky využita při identifikaci tehdy nového druhu C. dubliniensis (Sullivan a kol., 1995). 38

39 Dále byly nalezeny odlišnosti mezi transponovatelnými introny v oblasti 25S rdna (Ells a kol., 2009). Amplifikací této oblasti vznikají dva PCR produkty C. albicans (o velikosti 450 pb nebo 840 pb) v závislosti na genotypu izolovaného vzorku, na druhou stranu C. dubliniensis tvoří pouze jeden PCR produkt (o ve1ikosti 1080 pb). Oliveirem a jeho spolupracovníky byl navržen způsob odlišení mezi oběma druhy a to pomocí fluorescenčních peptidových DNA sond, které napodobují sondy nukleových kyselin (Ells a kol., 2009). Tyto sondy mají výhodu, neboť jsou hydrofobní a tím snadno prostupují skrz buněčnou membránu, čímž nedochází v průběhu fluorescenční in situ hybridizace k porušení buňky. Sonda C. albicans se váže v oblasti 26S rdna a sonda C. dubliniensis v oblasti 18S rdna. Bylo prokázáno, že tyto sondy jsou stoprocentně selektivní a specifické (Al-Mosaid a kol., 2003). Další způsob identifikace je na základě sekvenčních rozdílů v ITS (internal transcribed spacer) regionech. Malá velikost ITS regionů a přítomnost konzervovaných sekvencí usnadňuje PCR amplifikaci a sekvenování. V genomu jsou tyto jaderné markery obsaženy v mnoha kopiích a jejich variabilní oblasti poskytují dostatečné množství fylogeneticky informativních znaků. Pro odlišení C. dubliniensis od C. albicans byly použity sekvenční rozdíly mezi regiony ITS-1 a ITS-2 pomocí fluorescenčních sond v oblastech rdna 18S a 5,8S (Ellepola a kol., 2003). Sekvence ITS-1 je variabilnější než ITS-2 (Ells a kol., 2009) Amplifikace genů Obě kasinky lze od sebe odlišit také pomocí amplifikace některých genů, které jsou u každého druhu rozdílné. Mezi takové to geny řadíme např. hwp1 gen (hyphal wall protein 1), který je zodpovědný za expresi HWP1 proteinu (Ells a kol., 2009). Ten má velmi významnou roli ve virulenci kandid, neboť jim umožňuje schopnost adheze k povrchům (Moran a kol., 2012). Pro srovnání, PCR produkt u C. albicans byl o velikosti 941 pb, zatímco C. dubliniensis tvořil menší produkt o velikosti 569 pb (Romeo a Criseo, 2008). Gen act1 C. dubliniensis byl porovnáván s genem act1 u C. albicans. Bylo zjištěno, že exony těchto genů jsou totožné z 97,9 %, introny jsou identické pouze z 83,4 %, čehož se využívá pro odlišení pomocí PCR (Ells a kol., 2009). Tento gen kóduje aktin, což je strukturní protein. Aktin je jedna z nejhojnějších intracelulárních bílkovin eukaryotických buněk. Je součástí cytoskeletu buňky, určuje její tvar a při dělení umožňuje zaškrcení a oddělení dceřiných buněk. Bylo zjištěno, že aktin izolovaný z kvasinky a γ-aktin člověka se shodují ve více než 90 % aminokyselin (Murray a kol, 2002). 39

40 Dalším genem je phr1, který je zodpovědný za expresi proteinu PHR1. Rozdíly v sekvenci tohoto genu a jeho homologů C. dubliniensis složí k rozlišení mezi těmito dvěma druhy pomocí jednoduché techniky PCR (Ells a kol., 2009). Po amplifikaci DNA těchto dvou druhů s primery kódujícími sekvenci phr1 genu izoláty C. albicans tvořily fragment o velikosti 1,6 kb, kdežto izoláty C. dubliniensis netvořily žádný produkt. Protein PHR1 hraje klíčovou roli v sestavě buněčné stěny. Geny jsou regulovány ph, pokud je ph 5,5 nebo vyšší, dochází k expresi phr1, pokud je však okolní ph kyselé, dochází k expresi genu phr2. Delece těchto genů způsobuje defekty v morfogenezi a virulenci (Calderon a kol., 2010). Zelené kolonie na CHROMagaru Candida a tvorba zárodečných klíčků Kultivace při 45 C + růst - růst C. albicans tvorba chlamydokonidií na Staibově agaru - chlamydokonidie + chlamydokonidie C. albicans C.dubliniensis specificképrimery (PCR) Žádná amplifikace amplifikace C. albicans C. dubliniensis Obr. 7: Schéma postupu diferenciace C. dublinensis od C. albicans (Faggi a kol., 2005) 40

41 5 Candida africana V posledních letech byly objeveny nové atypické kmeny C. albicans v klinických vzorcích. Mezi takovéto kmeny byly zařazeny i izoláty získané ze vzorků od pacientů z Madagaskaru, Angoly a Německa, které byly v roce 1995 studovány a následně nazvány jako atypické kmeny C. albicans pocházející z Afriky (Romeo a Criseo, 2011; Tietz a kol., 1995). Tyto kmeny pocházely především od pacientek s vulvovaginálními kandidózami a další kmeny byly získány také ze Španělska a Itálie. Na základě morfologických, biochemických a fyziologických charakteristik, které se zřetelně lišily od typických izolátů C. albicans, byla kvasinka v roce 2001 navržena jako nový druh rodu Candida pod názvem Candida africana. Jedná se tedy o nedávno popsanou oportunně patogenní kvasinku (Romeo a Criseo, 2008). Všechny zkoumané kmeny se vyznačovaly pomalým růstem, měly atypický profil asimilace cukrů, nebyly schopny asimilovat amino sacharidy a netvořily chlamydospory, což je důležitý identifikační znak druhu C. albicans (Romeo a Criseo, 2011). Taxonomická situace C. africana a jejího fylogenetického vztahu s jinými druhy rodu Candida je však stále sporná a v současné době zůstává předmětem diskuse (Romeo a Criseo, 2011). Někteří autoři totiž tvrzení, že C. africana je novým druhem rodu Candida, zpochybňují (Khlif a kol., 2009). Odkazují na fylogenetické studie založené na srovnání sekvencí rdna C. africana a C. albicans, které prokázaly úzkou souvislost mezi oběma kvasinkami (Alonso Vargas a kol., 2008). Na základě těchto skutečností je jimi C. africana považována pouze za variantní formu C. albicans, která netvoří chlamydospory (Tietz a kol., 2001). Na druhou stranu analýzou DNA pomocí fingerprintových metod bylo zjištěno, že C. africana má odlišnou genomovou organizaci od C. albicans. K identifikaci C. africana byly použity genetické metody využívající sekvenování ribozomální DNA, PCR a analýzu polymorfismu kodominantních nukleotidů DNA. Rozdíly byly nalezeny především v přítomnosti polymorfismů u 13 fragmentů DNA, které byly u C. africana odlišné až z 33 % od C. albicans (Romeo a Criseo, 2009). 41

42 5.1 Charakteristika Kvasinka je tvořená sférickými nebo oválnými buňkami o velikosti 3-5ˣ2-7 µm (Tietz a kol., 2001). Buňky mohou být jednotlivé, ve dvojicích nebo ve skupinách, příležitostně jsou pozorovány pseudohyfy s kulatými blastosporami (Romeo a Criseo, 2009). Pseudomycelium je přítomné u některých kmenů po 3 až 10 denní inkubaci na rýžovém nebo Tween-80 agaru. Velmi významnou vlastností je, že netvoří chlamydospory na kukuřičném agaru. Produkce chlamydospor je závislá na proteinu Efgl, který reguluje přechod mezi kvasinkovou a hyfální formou. Pokud kvasinky tento protein nemají, nejsou schopny chlamydospory tvořit (Romeo a Criseo, 2009). Na druhou stranu C. africana tvoří zárodečné klíčky a to v čerstvém lidském séru po 4 hodinové inkubaci při 37 C. Roste pomalu při 37, 30 ale ne při 42 C (Tietz a kol., 2001). Kolonie na glukózovém Sabouraudově agaru jsou malé, krémově zbarvené, jemné, hladké a jejich okraje netvoří mycelium. Kolonie C. africana jsou k nerozeznání od těch tvořených C. albicans a C. dublinsiensis. (Romeo a Criseo, 2009). Velmi důležitou vlastností kvasinek je rozdílná asimilace sacharidů, podle které lze od sebe rozlišit jednotlivé druhy rodu Candida. C. africana je charakterizována následujícím asimilačním profilem. Kmeny nejsou schopny asimilovat N-acetylglukosamin, glukosamin a organickou kyselinu DL-laktát. Dále pak trehalózu, ribózu, arabinózu, sorbózu, rhamnózu, laktózu, melibiózu, celobiózu, rafinózu, erythrózu, glycerol a eskulin. Kmeny však asimilují jako zdroj uhlíku D-xylózu, glukonát, glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu, palatinózu, mannitol a sorbitol. Asimilace methyl-d-glukosidu je variabilní (Romeo a Criseo, 2008). 5.2 Klinická významnost Většina diagnostických laboratoří používá fenotypové identifikační systémy, které ne vždy umožňují odlišení mezi blízce příbuznými druhy rodu Candida (Romeo a Criseo, 2011). Proto jsou kmeny C. africana mylně označeny jako kmeny C. albicans a je tedy pravděpodobné, že výskyt a šíření této kvasinky zůstává stále neznámý a může být podceňován (Romeo a Criseo, 2009). Je velmi zajímavé, že většina kmenů C. africana byla získána z ženského genitálu, což svědčí o specializaci těchto atypických kmenů způsobovat především záněty pochvy (Tietz a kol., 1995). Kromě toho je také možné, že C. africana může být spojována s širším klinickým spektrem, neboť jeden z izolátů byl objeven v hemokultuře pacienta z Chile 42

43 (Odds a kol., 2007). Vaginální infekce způsobené kmeny C. africana byly hlášeny pouze u zcela zdravých žen a nejsou zatím známy žádné zprávy o izolaci této kvasinky od imunokompromitovaných pacientů (Romeo a Criseo, 2011). Bylo provedeno několik studií a pokusů, zdali jsou kmeny C. africana schopny tvorby biofilmu na PVC površích (Romeo a kol., 2011). Experiment prokázal, že C. africana není schopná produkce biofilmu v podmínkách in vitro (Romeo a Criseo, 2011). Bylo také zjištěno, že kmeny C. africana se zdají být citlivé vůči běžně užívaným antimykotikům (Tietz a kol., 2001). K dnešnímu dni byla C. africana získána pouze z klinických vzorků, i když v roce 1977 byly popsány atypické kmeny C. albicans netvořící chlamydospory. Tyto kmeny, které byly izolovány ze Severního moře, pravděpodobně mohly představovat první izolaci C. africana z oblasti životního prostředí (Romeo a Criseo, 2009) 43

44 II. PRAKTICKÁ ČÁST 6 Cíl práce Cíl této práce je uveden v následujících bodech: Srovnání biochemických profilů druhů C. albicans, C. dubliniensis a C. africana získaných z klinického materiálu v laboratořích Mikrobiologického ústavu LF MU a Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Následné porovnání získaných výsledků s literaturou. 44

45 7 Materiál a metody 7.1 Materiál Mikroorganismy V praktické části bylo zkoumáno 102 kmenů kvasinek rodu Candida, které byly získány v laboratořích Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Konkrétně se jednalo o 55 kmenů C. albicans, 43 kmenů C. dubliniensis a 4 kmeny C. africana. Kmeny byly získány z různých klinických materiálů v letech 2008 až 2011 a následně byly uchovávány v 1 ml GSB při - 80 C. Všechny izoláty byly dourčeny již dříve pomocí druhově specifické PCR Pomůcky Bakteriální kličky Běžné laboratorní sklo Kahan Latexové rukavice (Sempercare, Rakousko) Nastavitelná automatická pipeta µl (BIOHIT, Finsko) Petriho misky plastové (průměr 9 cm) Pipetovací nadstavec Pipetus junior (Hirschmann laborgerate, Německo) Skleněná pipeta (10 ml) Skleněné zkumavky s víčkem (10 ml) Stojan na zkumavky Špičky k automatické pipetě na µl (BIOHIT, Finsko) Zkumavky 10 ml plastové (MEUS, Itálie) Zkumavky 50 ml plastové (MEUS, Itálie) Kultivační média, roztoky a chemikálie Chromagar Candida (CHROMagar, Francie; katalogové číslo CA222) Složení: agar (15 g/l), pepton (10,2 g/l), chromogenní mix (22 g/l), chloramfenikol (0,5 g/l) Médium bylo připraveno dle návodu výrobce: 47,7 g směsi se rozpustí v 1l destilované vody, povaří se a autoklávuje. 45

46 Sabouraudův agar (Sabouraud-4% maltose agar; Merck KGaA, Německo) Složení: maltóza (40 g/l), pepton (10 g/l), agar (15 g/l) Médium bylo připraveno dle návodu výrobce: 65 g směsi se rozpustí v 1l destilované vody povařením, autoklávuje se 15 min. při 121 C. Glycerol sérový bujon (GSB) Připravován v technickém úseku laboratoří Mikrobiologického ústavu LF a FN u sv. Anny v Brně. Složení: 40 ml koňského séra (ZOO servis, Dvůr Králové, ČR), 50 ml mozko-srdcové infúze (BHI; Hi-Media, Mumbai, Indie), 10 ml glycerolu (Kulich s.r.o., Hradec Králové, ČR). YNB (Yeast Nitrogen Base) 6,7 g YNB (BD, USA) se rozpustí ve100 ml destilované vody a sterilizuje se filtrací, doplní se do litru 2% sterilní agarózové suspenze, která se vaří 1-2 min. Sterilní destilovaná voda Připravována v technickém úseku laboratoří Mikrobiologického ústavu LF a FN u sv. Anny v Brně. Cukerné disky a cukry Fruktóza (Merck, Německo) Glukóza (Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Česká republika) Innositol (Merck, Německo) Maltóza (Lach-Ner, Neratovice, Česká republika) Manitol (Merck, Německo) Ribóza (Sigma- Aldrich,Česká republika) Sacharóza (FAGNOR, Olomouc, Česká republika) Trehalóza (Sigma- Aldrich, Česká republika) Xylóza (Sigma- Aldrich, Česká republika) 46

47 7.1.4 Přístroje Autokláv-parní sterilizátor CHIRANA AUT 26/II (Chirana Group, Česká Republika) Denzitometr ( DensiLAmeter II, EMO Brno) Lednice (VESTFROST, Francie) Mrazák (Sanyo, Japonsko) Termostat (BT 120, Laboratorní přístroje, Praha, Česká republika) Vodní lázeň GFL (UNIMED, Praha, Česká republika) Vortex mixer (Labnet, USA) 7.2 Metody Příprava a uchování kmenů Zamražené kmeny kvasinek, které byly uchovávány v GSB, byly pomocí bakteriální kličky vyočkovány na média CHROMagar Candida. Kmeny byly následně kultivovány při 37 C po dobu 48 hodin (Obr. 8). Pro dlouhodobé skladování kmenů bylo nutné narostlé kolonie z chromagarů vyočkovat do zkumavek se šikmě nalitým Sabouraudovým agarem, kmeny byly pak kultivovány v termostatu při 37 C po dobu 48 hod. Kmeny ve zkumavkách byly poté uchovávány v ledničce při teplotě 5 C. Pro následnou práci s kmeny bylo vždy nutné narostlé kolonie ze zkumavek přeočkovat na média CHROMagar Candida. Obr. 8: Naočkované kmeny C. dubliniensis na chromagaru po 48 hodinové inkubaci 47

48 7.2.2 Testování asimilace cukrů Tvorba suspenze Do umělohmotných zkumavek o objemu 10 ml byly pomocí sterilní skleněné pipety napipetovány 3 ml sterilní destilované vody. Nad plamenem vyžíhanou bakteriální kličkou byly přeneseny narostlé kolonie kvasinek z chromagarů do zkumavek se sterilní destilovanou vodou. Pomocí denzitometru byly vytvořeny suspenze o hustotě 5,0 McF (Obr. 9). Tato suspenze byla následně pomocí vortexu zhomogenizována. Obr. 9: Zkumavky se suspenzemi, denzitometr ukazující hustotu suspenze 5 McF Příprava YNB média pro účely testování asimilace cukrů YNB je speciální médium s obsahem dusíku určené pro kultivaci kvasinek. Toto médium bylo připravováno z komerční směsi v technickém úseku laboratoří Mikrobiologické ústavu FN u sv. Anny. 6,7 g YNB bylo rozpuštěno ve 100 ml destilované vody, sterilizováno filtrací a následně doplněno na 1 litr 2,0% agarové suspenze, která byla autoklávována. Alikvoty (cca 20 ml) tohoto média byly rozděleny do zkumavek o objemu 50 ml. Po ochlazení byly zkumavky s YNB uloženy v lednici při teplotě 5 C po dobu maximálně 6 týdnů. 48

49 Vlastní pokus Před použitím bylo nutné zkumavky s YNB, které byly uloženy v lednici, vložit do vroucí vodní lázně, aby se agar rozpustil, následně se nechal ochladit na teplotu 45 až 55 C. Automatickou pipetou byl napipetován do zkumavky 1 ml předem připravené suspenze příslušného kmene. Médium se suspenzí bylo promícháno a směs se nalila do plastové Petriho misky, která byla označená číslem příslušného kmene. Stejně se postupovalo u dalších kmenů. YBN v Petriho miskách se nechalo ztuhnout při pokojové teplotě, poté se na jeho povrch umístily cukerné disky (trehalóza, xylóza) nebo jednotlivé cukry (fruktóza, glukóza, inositol, maltóza, manitol, ribóza a sacharóza). Při každém provedení pokusu byla zhotovena i negativní kontrola, Petriho miska s médiem YNB bez suspenze kvasinek, která sloužila pro kontrolu čistoty média. Misky byly poté vloženy do termostatu a byly kultivovány při teplotě 30 C po dobu 48 hodin (Obr. 10). Obr. 10: Petriho miska s YNB, suspenzí kvasinek a cukernými disky (trehalóza, xylóza) a cukrem ribózou před inkubací Vyhodnocení Po vyjmutí misek z termostatu byl hodnocen růst kmenů kvasinek kolem jednotlivých cukerných disků a cukrů. Pokud byl patrný růst kolem určitého cukru, znamenalo to, že je daný kmen schopen tento cukr asimilovat (Obr. 11, 12). Původně byl odečet růstu prováděn každý druhý den po dobu 7 dní. Pozorování narostlých kvasinek bylo zkráceno na 2 popř. 4 dny. Po delší době kultivace bylo odečítání nejasné a docházelo k rozrůstání kvasinek po celé Petriho misce, což značně komplikovalo hodnocení. 49

50 Obr. 11: Hodnocení asimilace cukrů (Na fotografii jsou patrné mírné zóny narostlých kvasinek kolem cukerných disků trehalózy a xylózy. V okolí ribózy, ve spodní části misky, není patrná asimilace.) Obr. 12: Hodnocení asimilace cukrů (Na Petriho misce je patrný silný nárůst kmene C. albicans kolem fruktózy, glukózy a manitolu, kde je nárůst nejvýraznější.) 50