REGULACE TRANSLACE. 1. Translační aparát TRANSLAČNÍ APARÁT. 1. Translační aparát iniciační faktory

Transkript

1 1. Translační aparát a) mrna + mrna-vazebné bílkoviny b) trna c) aminokyseliny d) ribosomy e) regulační bílkoviny translační faktory f) translační kompartmenty REGULACE TRANSLACE TRANSLAČNÍ APARÁT 1. Translační aparát iniciační faktory 1. Translační aparát 1. Vázány na komplex trna-ami eif2 2. Vázány na ribosomální podjednotky: 40S = eif1a + eif3 60S = eif6 3. Vázány na mrna, na čepičku: eif4b eif4f = eif4a, eif4g, eif4e a) mrna + mrna-vazebné bílkoviny b) trna c) aminokyseliny d) ribosomy e) regulační bílkoviny translační faktory f) translační kompartmenty ( metoda translace in vitro byla použita v 70. letech pro identifikaci iniciačních faktorů) 1

2 1. Translační aparát kompartmenty 1. Translační aparát kompartmenty Endoplasmatické retikulum Cytoskelet Síť tvořená ER a cytoskeletem 2

3 1. Translační aparát kompartmenty, cytoskelet 1. Translační aparát kompartmenty, cytoskelet Cytoskelet: podílí se na prostorové a časové regulaci translace (in situ lokalizace mrna: vysoké procento mrna spojeno s cytoskelem) interakce cytoskelet mrna: mechanismus jež zajistí vyšší koncentraci všech složek translačního aparátu a tím vyšší účinnost translace zajistí subcelulární lokalizaci mrna v buňce subcelulární ( periferní )lokalizace mrna : vede k asymetrii v buňce, k hromadění určitých typů mrna a tím bílkovin v určitých, specifických buněčných kompartmentech a tím buď: - impuls k diferenciaci buňky - nebo k účinnému transportu bílkovin do organel regulace translace souvisí s regulací mrna lokalizace: cytoskelet se podílí na zablokování mrna syntézy až do okamžiku její správné lokalizace v buňce na cytoskelet se navazují: mrna, komplexy mrnp, jež obsahují jak mrna vazebné bílkoviny, tak složky translačního aparátu jakými jsou elongační faktory, aminoacyltrna- synthetasy nebo ribosomy charakteristické pro dlouživý růst buněk (NERVOVÉ BUŇKY, PYLOVÉ LÁČKY) 1. Translační aparát kompartmenty 1. Translační aparát kompartmenty, cytoskelet Kdy prokázána důležitá role lokalizace specifických mrna v rostlinné buňce : pohyb mrna plasmodesmaty (virové proteiny jež zajišťují pohyb virů směrem do buňky jsou mrna vazebnými bílkovinami a mají přímý kontakt s cytoskeletem putování endogenních mrna mezi buňkami na dlouhé vzdálenosti třídění mrna kodujících zásobní semenné bílkoviny prolaminy jejich vazba k ER v endospermu: (prolamin mrna obsahuje signal pro jeden a více bílkovin jež zprostředkovávají vazbu této mrna k ER a cytoskeletu) putování netranslatovatelných mrna rostoucí pylovou láčkou Úloha myosinu při dopravě nákladu sítí aktinových microfibril 3

4 1. Translační aparát Regulace translace a) mrna + mrna-vazebné bílkoviny b) trna c) aminokyseliny d) ribosomy e) regulační bílkoviny translační faktory f) translační kompartmenty 1. Translační aparát 2. Translace 3. Bilkoviny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech 2. Translace Translace má 3 fáze: iniciaci, elongaci a terminaci Iniciace je klíčovým procesem REGULACE TRANSLACE INICIACE TRANSLACE 4

5 2. Translace - iniciace Nezbytná přítomnost všech složek translačního systému RNA: mrna, trna, rrna, Bílkoviny: ribosomální mrna vazebné regulační (translační faktory) enzymy Aminokyseliny Energetika ATP mrna čtena z 5 na 3 konec Pro zahájení procesu: rrna a ribosomální bílkoviny poskládány do funkčních ribosomálních podjednotek 2. translace- iniciace 2. translace- iniciace Recyklace eif2.gdp Recyklace eif2.gdp 5

6 Iniciace translace aktivace aminokyselin Iniciace translace aktivace aminokyselin Aminoacyl-tRNA syntetáza: Každá t-rna má svou aminoacyl-trna syntetázu (aars) Katalyzuje vazbu mezi t-rna a odpovídající aminokyselinou Proces je dvoustupňový: 1. aminokyselina + ATP + aminoacyl-amp + Ppi specifický enzym hydrolyzuje ATP a kovalentně váže alfa-karboxylovou skupinu aminokyseliny k 5 fosfátu AMP 2. aminoacyl-amp + trna + aminoacyl-trna + AMP aktivovaná aminokyselina je napojena na volnou hydroxylovou skupinu terminální ribosy na 3 konci trna Přesnost přepisu genetického kodu = navázání odpovídajících aminokyselin na odpovídající trna a to zprostředkovává odpovídající aars Aminoacylace trna Vytvoření makroergické vazby mezi trna a odpovídající aminokyselinou Iniciace translace aktivace aminokyselin Rozpoznání trna aa-trna synthetasou Aminoacyl-tRNA synthetasy Funkce a) Přenos informace b) Chemická aktivace (charging) Průběh reakce 1) Rozpoznání aminokyseliny 2) Aktivace aminokyseliny (aa + ATP <-> aa~amp + PPi) 3) Rozpoznání vhodných trna 4) Přenos aminokyseliny na trna (aa~amp + trna aa <-> aa~trna aa + AMP) Zachování makroergické vazby trna Gln trna Asp trna Ser trna identifikační elementy hlavní a pomocné Kontrola: antikodon Frekvence chyb: 10-6 vyjímečně akceptorové rameno Chybová frekvence při translaci: (chybné rozpoznání kodonu) Synthetasa prověřuje trna i mrna Prověření vazby trna:trna synthetasy kinetické AMI:tRNA synthetasy - chemické aars mají katalytická místa a hydrolysou uvolňují nevhodně napojenou aminokyselinu 6

7 Iniciace translace aktivace aminokyselin Aminoacyl-tRNA synthetasy multifunkční enzym (několik domén) Rozpoznává celou rodinu isoakceptorů 2. translace- iniciace Recyklace eif2.gdp každá aminokyselina má svou synthetasu Iniciace translace aktivace 40S podjednotky Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky Stabilita zásoby ribosomálních podjednotek zajištěna fyziologickou koncentrace solí ( K, Cl a Mg iontů) Aktivace 40S podjednotky vazbou příslušných iniciačních faktorů: 40S = eif3 a eif1a eif3 (65 kda) stabilizuje a koordinuje navazování další faktorů eif2, eif4b a eif4f eif1a (17 kda) se podílí na stabilizaci zásoby 40S podjednotek a na připravovaném spojení s 60S podjednotkou Inhibice předčasného spojení 40S a 60S: iniciační faktor na 60S (eif6 25 kda) 7

8 Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky 2. translace- iniciace Recyklace eif2.gdp Iniciace translace -ternární + preiniciační komplex Iniciace translace ternární + preiniciační komplex Aktivace 40S ribosomální podjednotky: Vazba eif3 + eif1a Ternární komplex: Met-tRNA + eif2:gtp + Met-tRNA Preiniciační komplex: Ternární omplex + 40S ribosomální podjednotka aktivovaná eif3 + eif1a 8

9 Iniciace translace -ternární + preiniciační komplex 2. translace- iniciace specifita vazby zajištěna faktorem eif2 eif2 tvořen 3 podjednotkami: alfa = 36kDa beta = 38 kda gama = 52 kda eif2 nejprve váže GTP komplex eif2-gtp váže iniciátorovou trna = ternární komplex: eif2-gtp-met trna místem vazby GTP i Met-tRNA je gama podjednotka ternární komoplex se navazuje na 40S podjednotku, kde už jsou navázány eif3 a eif1a (vazba eif2 na ribosomální podjednotku velmi slabá vazba ternárního komplexu velmi silná závisí na dostatku ATP: nukleosid difosfát kinasa: regenerace GDP na GTP eif3 stabilizuje vazbu ternárního komplexu na povrchu 40S podjednotky Recyklace eif2.gdp Iniciace translace aktivace mrna Iniciace translace vazba preiniciačního komplexu na aktivovanou mrna Vazba 4 iniciačních faktorů : eif4b (70 kda) eif4e (25 kda), eif4g (174 kda), eif4a (46 kda) = komplex eif4f eif4b zvyšuje aktivity eif4g a eif4a eif4g a eif4a mají motivy pro vazbu na jednořetězcovou mrna eif4a patří mezi DEAD bílkoviny (helikázy, mají sekvenci asp-glu-ala-asp, váží ATP ), odstraňuje smyčky na 5 UTR, připravuje jednovláknovou mrna pro scanování Navázáním eif4b a komplexu eif4 F je čepička 5 UTR- aktivována a připravena pro navázání preiniačního komplexu 9

10 2. translace- iniciace 2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG Recyklace eif2.gdp pohyb 40S podél mrna od 5-3 = scanování 1. AUG většinou použit jako iniciátor translace antikodon iniciátorové trna rozhoduje o výběru AUG pro výběr 1. AUG je rozhodující sekvence kolem kodonu kritická u živočichů: -3 a +4 kritická u rostlin jen +4 nebyl nalezen žádný specifický protein řídící scanování scanovácí aktivitace přímo úměrná počtu smyček na 5 UTR mechanismus pohybu iniciačního komplexu po mrna neobjasněn?? eif4a - může být tím motorem, jež aktivuje mrna, počet kopií eif4a 5-10krát vyšší než počet kopií eif4b a eif4f?? eif2 - se beta podjednotkou váže na rrna malé podjednotky = součást AUG selekčního procesu 2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG co podstatným způsobem ovlivňuje proces scanování: struktura 5 UTR smyčky charakter iniciačního kontexu, volba 1. AUG mini-orf = snížená účinnost přepisu, reiniciace = 40S nedisociuje po terminaco stop kodonem, další AUG z ORF = leaky scaning dostupnost iniciačních faktorů eif2 vážící trna se podílí se na hledání iniciačního kodonu fosforylace eif2 zajišťuje jeho pevnou vazbu na eif2b, jeho recyklace zastavena, jeho nedostatek pro další iniciaci (u rostlin tato funkce dosud nepotvrzena) u rostlin existence 2 forem na čepičku vázaného komplexu eif4f: eif4f nebo iso-ei4f, to skýtá možnost výběru = regulační funkce 4F (24 kda kda v poměru 4:1) má vyšší afinitu k monometylované čepičce iso-4f (28 kda + 80 kda v poměru 1:1) má vyšší afinitu k dimetylované čepičce smyčka v 5 UTR stabilizuje vazbu 4F a iso formu destabilizuje 3.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG Výběr z více AUG iniciačních kodonů Leaky scanning 10

11 2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG 2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG spojení ribosomálních podjednotek Scanování ukončeno, navázání antikodonu trna na AUG startovací kodon připojení 60S blokují iniciační faktory navázané v iniciačním komplexu na 40S na uvolnění se podílí eif5 (50 kda), který odváže eif1a a eif3 eif5 hydrolysuje GTP v ternárním komplexu eif2-gtp-met-trna a tato konformační změna uvolní iniciační faktory ze 40S eif5 je in vitro schopen hydrolyzovat ATP i GTP, ale za in vivo podmínek působí jako aktivátor GTPázy další faktor eif5a (17 kda se specifickou posttranslační modifikací lysinu na N-(4-amino-2-hydroxybutyl)lysin funkce eif5a: asistuje při připojení 6OS a při přemístění obou jednotek z bodu A do kapsy bodu P 2. translace- iniciace Recyklace eif2.gdp 1. Translační aparát mrna a vazebné bílkoviny na 3 UTR Poly-A konec = stimuluje translaci = kooperace PABP + bílkovinných faktorů navázaných na čepičku 3 UTR cytoplamatický polyadenylační element (CPE) = místo vazby CPEB Komplex: CPEB-Maskin-eIF4E = inhibice translace Fosforylace CPEB = navázání PAB (poly (A)polymerázy= prodloužení poly(a) = vazba dalších PABP = odstranění Maskin proteinu a aktivace translace 11

12 Iniciace translace scanování kruhová struktura mrna Iniciace translace vazba iniciačních faktorů na PABP jakou roli hraje fosforylace PABP v iniciaci translace??? Iniciace translace vazba PABP Vazba mrna na ribosom a scanování vyžaduje PABP Poly(A) má nejméně 1 PABP vazebné místo PABP jsou fosforylovány, míra fosforylace se mění, má regulační funkci (heterogenní míra fosforylace) fosforylace určuje afinitu vazby PABP-mRNA, PABP PABP a PABP- 4G - 4E, PABP-4B kompetice mezi 4G a 4E o PABP1 a složitá konfigurace jejich společné vazby podmíněna fosforylací všech tří typů proteinů PABP ovlivňují funkční aktivitu mrna: Minimální aktivita fosforylace 4G a defosforylace 4E umožní přímo vazbu 4G na mrna PABP1 je volné pro vazbu na eif4e a vázané 4E se nemůže navázat na mrna Maximální aktivita fosforylace 4E vázané na PABP1,disociace 4E a její vazba na mrna, vazba PABP1 na 4G,vazba 4G a PABP na mrna Iniciace translace vazba PABP Vazebná doména pro PABP u rostlin nalezen u 4E, zatím ne u 4G kruhové uspořádání mrna molekuly potvrzeno PABP se váže i na 4B (u rostlin druhově specifická) = zvýšení translační účinnosti pokud je 4B fosforylován (časné fáze vývoje semen) u živočichů tato vazba spojena s apoptosou ( caspasae-3 + proteása odbourávají 45 N-terminálních AMI 4B faktoru a tím zmizí místo vazby pro PABP = inhibice proteosyntesy za apoptosy) vysoká hladina fosforylace 4A se podílí na účinnosti proteosyntézy víc než fosforylace ostatních složek 4F (nízká fosaforylace za stresu) zvýšení afinity vazby PABP a helikasové aktivity zajištěno nejen vazbou s 4E, 4G, ale i s kompletním 4F translační účinnost ovlivněna i koncentrací PABP (ježovka v prvním rýhování, jen 1 PABP) dostatek PABP přednostně přepisovány čepičkované, výrazně polyadenylované mrna se strukurovanou 5 UTR míra fosforylace iniciačních faktorů a PABP selektivně ovlivňuje jejich vzájemné interakce, ovlivňuje intensitu translace 12

13 2. translace- iniciace Iniciace - Recyklace eif2.gdp Recyklace eif2.gdpnapojení PABP na čepičku Iniciace - Recyklace eif2.gdp 2. translace-recyklace eif2.gdp k zahájení translace je nezbytné změnit eif2 uvolněné z iniciačního komplexu do formy vážící GTP a tím zahájit čtení dalšího kodonu vazba eif2-gdp je asi 100 krát silnější než eif2-gtp k překonání tohoto problému další faktor eif2b eif2b = recyklační faktor 13

14 2. Translace - recyklace eif2.gdp Další funkce eif2 je podmíněna změnou vazby eif2:gdp na eif2:gtp eif2:gdp musí navázat další faktor eif2b (guanidin nukledotid exchange faktor) fosforylace eif2b zintensivní vazbu faktorů, komplex rif2:eif2b:gdp je stabilní = dramatický pokles iniciace a brání vytvoření eif2:gtp 2. translace- iniciace Recyklace eif2.gdpnapojení PABP na čepičku Iniciace čepička na 5 UTR = scanovací model platí vždy??? 2. translace- iniciace, IRES 2. translace- iniciace, IRES Prokaryonta: rozpoznání startovacího místa translace zprostředkovává iniciační komplex iniciační komplex = 30S podjednotka + iniciátorová trna (s navázanou aminokyselinou formylmethioninem fmet-trna) + 3 iniciační faktory ( IF1, IF2, IF3) nejčastějším iniciačním kodonem je AUG, ale GUG + UUG nejsou výjímkami iniciační komplex se váže přímo na iniciační kodon, který je umístěn za sekvencí Shine-Dalgarno (SD) SD = 7 purimových nukleotidů jež komplementují Eukaryonta-IRES - přímá vazba 40S podjednotky a cis regulační sekvence v mrna IRES (internal regulační signal) 14

15 2. translace- iniciace, IRES 2. translace- iniciace, stres Iniciace čepička není u Eukaryont nezbytná IRES další způsob iniciace v eukaryontních buňkách některé eukaryontní mrna bez čepičky, nepoužívají scanovací model jejich 5 UTR oblast obsahuje určitou sekvenci (obdoba SD) = IRES (internal ribosomal entry side = místo vysoké afinity pro vazbu iniciačního komplexu) na toto místo se váže eif4f tento iniciační faktor zcela nezbytný pro IRES přepis charakteristika typické IRES oblasti neznámá, musí zřejmě mít jak primární (sekvenční), tak sekundární (navázané proteiny) strukturní elementy v mrna příkladem jsou stresové mrna i pro IRES systém platí nezbytnost rozvinutí 5 UTR struktury IRES = obdoba iniciace prokaryont stres vyvolává okamžitou represi translace konstitutivních typů mrna, mrna jsou z translačního aparátu odstraněny do stres granulí buňka se brání vzniku proteinových agregací exprese specifických stresových proteinů HSP + shsp : HSP součást chaperonů pro konstitutivní proteiny za stresu jejich overexprese shsp exprese za stresu (14-35 kda) u savců 1-3 typy u rostlin široká škála až 30 typů bílkovin až 3% celkových bílkovin shsp v cytosolu, ER, mitochondriích i chloroplastech 2. translace- iniciace, stres Okamžitá exprese stresových bílkovin??? 1. mrna kódující stresové bílkoviny nemá čepičku - využívá systém IRES 2. Stresové bílkoviny přímo ovlivňují iniciaci Hsp27 indukovaný stresem v savčích buňkách interakuje přímo s faktorem 4G a tak brání translaci konstitutivních proteinů Hsp27 nereaguje s žádným dalším iniciačním faktorem overexprese Hsp70 udržuje 4G funkční a umožňuje jeho zabudování do4f, podílí se na nastartování proteosyntézy po stresu tyto nálezy zatím jen v živočišných buňkách Hsp101 u rostlin působí jako translační enhancer, je funkčně obdobou TMV vazba Hs101 na mrna vrací funkci 4G a F3 a tím konfigurují 40S komplex pro expresi konstitutivních bílkovin Děkuji za pozornost Přijďte zase příště na kus řeči o translaci 15