Svět RNA a proteinů REGULACE TRANSLACE. Požadavky kladené na funkční translaci

Transkript

1 Svět RNA a proteinů REGULACE TRANSLACE Požadavky kladené na funkční translaci Bezchybný přepis genetické informace Regulace translace jak převést informaci obsaženou ve struktuře mrna do odlišné struktury proteinů Ø Správně reagovat na proměnlivost v rámci buňky, orgánu a celého organismu Ø Přepisovat kvalitativně se měnící spektra proteinů Ø Přepisovat stejné typy mrna, ale v jiném kvantitativním zastoupení Ø Regulovat přepis konstitutivních i signálních typů proteinů Ø Schopnost vybrat si za velmi nepříznivých podmínek typy proteinů, které jsou pro udržení homeostaze klíčové Ø Schopnost oprav translačních chyb Ø Dokonale sladit translaci a degradaci Ø (Oprava chyb (tmrna) Vysoká míra volnosti všech procesů, regulace na mnoha úrovních 1

2 Regulace translace Jaký je vztah mezi syntézou bílkovin a ontogenezí? Regulace translace syntéza proteinů - mitotická dělení - zvětšování buněk a tvorba buněčné stěny - udržování nezbytného souboru konstitutivních proteinů Rostliny ---přisedlost = kontinuální diferenciace vytváření orgánů v průběhu ontogenese --- fotosyntéza specifické proteiny fotosyntetického aparátu Regulace translace a mitosa Regulace translace svět Prokaryont a svět Eukaryont 2

3 Prokaryonta Eukaryonta Eukaryonta 3

4 Regulace translace Eukaryonta 1. Translační aparát 2. Translace 3. Proteiny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace proteinů v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech 1. Translační aparát Syntéza proteinů potřebuje translační aparát a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory Jen 3-10% celkové RNA tvoří mrna zbytek nekódující RNA, trna, rrna mrna v cytosolu není vždy ihned přepisována Translační regulace genové exprese 4

5 Regulace translace Regulace translace RNA samouspořádávání molekul RNA fyzikálně chemické vlastnosti samouspořádávání RNA molekul do kompaktních partikulí = obrovská konfigurační a tím i funkční mnohotvárnost Ø sekundární struktura RNA, soubor krátkých úseků dvoušroubovic na základě komplementárního párování (trna) Ø terciární uspořádání: izolovaná rrna vytváří kompaktní partikule 16S a po přidání Mg iontů a spermidinu vznikají 40S partikule 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny 1. Translační aparát - mrna a vazebné proteiny na 5 UTR zralá mrna 5

6 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny na 3 UTR 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny mrna vázána na proteiny: Ø mnohonásobně navýšena možnost regulací Vazba proteinů: Ø specifickými rozpoznávacími sekvencemi Ø strukturálními elementy 2 typy interakcí RNA-proteinů v cytosolu Ø součást konstitutivních regulací (housekeeping genes) Ø odpoveď na vnější podněty Ø odpověď na vývojové (vnitřní) podněty 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny proteiny, RNA = jednovláknové lineární molekuly tvořící biopolyméry co umožňuje práci polymérů : Ø nekonvalentní interakce se substrátem nebo receptory Ø reakce katalyzovány přímo makromolekulami nebo připojenými enzymatickými faktory Ø flexibilita = možnost konformačních proměn, rovnováha mezi alternativními stavy a fixace jedné konformace připojením ligantu Ø periodické konformační změny indukované energeticky = periodické změny afinit vazebných míst proměnlivost proteinů: posttranslační modifikace různé funkce, stejné nebo odlišné lokalizace molekulární stroje Funkce : transformace chemické, tepelné, elektrické nebo nukleární energie do energie mechanické, pohybové Ø transportní system mikrotubulů ( tubulin-kinesin, tubulin-dynein) Ø transportní system mitrofilament (actin-myosin) Ø DNA a RNA polymerázy Ø ribosomy Ø aminoacyl t-rna syntetázy Ø myofibrily a další Všechny využívají vysokoenergetické makromolekuly - ATP, GTP 6

7 1. Translační aparát 1. Translační aparát cytoskelet a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) aminokyseliny d) ribosomy e) regulační bílkoviny translační faktory 1. Translační aparát cytoskelet Kdy prokázána důležitá role lokalizace specifických mrna v rostlinné buňce : Ø pohyb mrna plasmodesmaty, virové proteiny jež zajišťují pohyb virů směrem do buňky = mrna vazebné bílkoviny a mají přímý kontakt s cytoskeletem Ø putování endogenních mrna mezi buňkami na dlouhé vzdálenosti Ø třídění mrna kodujících zásobní semenné bílkoviny prolaminy jejich vazba k ER v endospermu: (prolamin mrna obsahuje signal pro jeden a více bílkovin jež zprostředkovávají vazbu této mrna k ER a cytoskeletu) 1. Translační aparát cytoskelet Buněčné funkce cytoskeletu Ø architektura buňky = platforma pro putování a lokalizaci mrnp, signálních molekul Ø buněčná polarita Ø asymetrické oddělení složek podílejících se na vývojových změnách na úrovni buňky Molekulární funkce cytoskeletu Ø pohyb v buňce ( chromozómy při mitoze, organely, váčky) Ø adheze Ø migrace Ø lokalizace signálních molekul Ø uspořádávání translačního aparátu + regulace translace Kryoelektronová tomografie=3d vizualizace v nm rozlišení Kim S Coulombe PA, 2010, Mol.Cell Biol. 11, (příklady z živočišné i rostlinné říše) Ø putování netranslatovatelných mrna rostoucí pylovou láčkou 7

8 1. Translační aparát cytoskelet Ø Síť tvořená ER a cytoskeletem Ø Cytoskelet Ø Endoplasmatické retikulum Ribozomy Eukaryot ve 3 základních uspořádáních: 1. volné, spojeny s cytoskeletem (mrnp) 2. vázáné na membrány 3. translačně regulované mrnp komplexy (prosomy?) Proměnlivost v závislosti na typu buňky, tkáně, stádiu diferenciace Rychle rostoucí tkáně vyšší podíl volných ribosomů ( 60% mladé listy 78% retikulocyty) Diferencované buňky vyšší podíl mebránově vázaných (75% jaterní buňky) obecně syntéza sekrečních bílkovin (stěnové bílkoviny u rostlin) 1. Translační aparát cytoskelet Cytoskelet jednotlivé jeho složky mají své specifické funkce: Ø Tubulin = podílí se na transportu Ø Aktin - na MF (mikrofilamenta) se váží polyribozomy - impuls s tvorbě mikrofilament eif2 - recyklace - na IF (intermed. filamenta ) se váží prosomy Prosomy: mají podobu 20S nebo 26S( přítomny soubory ATPáz, proteáz, aktivátorů a inhibitorů) 1: jsou komplexem multikatalytických proteináz (MCP complexes) 2. asociují s netranslatovatelnými mrnp ( trans-faktory), připoutávají mrna k cytoskeletu = skladování genetické informac 2. Translace - recyklace eif2.gdp Další funkce eif2 je podmíněna změnou vazby eif2:gdp na eif2:gtp eif2:gdp musí navázat další faktor eif2b (guanidin nukledotid exchange faktor) fosforylace eif2b zintensivní vazbu faktorů, komplex eif2:eif2b:gdp je stabilní = dramatický pokles iniciace a brání vytvoření eif2:gtp 8

9 1. Translační aparát cytoskelet Cytoskelet jednotlivé jeho složky mají své specifické funkce: Ø Tubulin = podílí se na transportu Ø Aktin - na MF (mikrofilamenta) se váží polyribozomy - impuls s tvorbě mikrofilament eif2 - recyklace - na IF (intermed. filamenta ) se váží prosomy Prosomy: mají podobu 20S nebo 26S( přítomny soubory ATPáz, proteáz, aktivátorů a inhibitorů) 1: jsou komplexem multikatalytických proteináz (MCP complexes) 2. asociují s netranslatovatelnými mrnp ( trans-faktory), připoutávají mrna k cytoskeletu = skladování genetické informac 1. Translační aparát cytoskelet 1. Translační aparát cytoskelet Cytoskelet: Ø podílí se na prostorové a časové regulaci translace (in situ lokalizace mrna: vysoké procento mrna spojeno s cytoskelem) interakce cytoskelet mrna: Ø mechanismus jež zajistí vyšší koncentraci všech složek translačního aparátu a tím vyšší účinnost translace Ø zajistí subcelulární lokalizaci mrna v buňce subcelulární ( periferní ) lokalizace mrna : Ø k hromadění určitých typů mrna a bílkovin v určitých, specifických buněčných kompartmentech a to vede k asymetrii v buňce: - impuls k diferenciaci buňky - nebo k účinnému transportu bílkovin do organel Úloha myosinu při dopravě nákladu sítí aktinových microfibril 9

10 1. Translační aparát cytoskelet Regulace lokální translace v axonech Translačně regulované mrnp komplexy Ø cytoskelet se podílí na zablokování mrna syntézy až do okamžiku její správné lokalizace v buňce Ø na cytoskelet se navazují: Ø mrna, Ø komplexy mrnp, jež obsahují Ø mrna vazebné proteiny i mirna Ø složky translačního aparátu : elongační faktory, ribosomy aminoacyltrna- synthetasy NERVOVÉ BUŇKY, PYLOVÉ LÁČKY charakteristické pro dlouživý růst buněk role tubulinu i aktinu Lin AC, Holt CE, 2008 Regulace lokální translace v axonech 1. Translační aparát cytoskelet cytoskelet uspořádávání translačního aparátu + regulace translace Ø narušení F-aktinu pokles translace (křeček stres ) Ø zvýšení polymerace aktinu-nárůst translace (poraněné hlízy brambor) Ø narušení F-aktinové sítě mutací eef1a (F308L, S405P) hromadění 80S ribozomů, pokles polyzomů, blokace iniciace (kvasinky) eef1- ve 2 formách: 1. eef1a.gtp = translačně aktivní = vazba na aminoacyl-trna = transport do místa A na ribosomu 2. eef1a-vázán an aktin = translačně neaktivní (70% u Dictyostelium) 2 modulující podjednotky: eef1balfa, eef1bgama eef1balfa: exchange factor eef1bgama: struktura umožňující vazbu na cytoskelet (intermediátní filamenta keratinu karcinogeneze) Důkazy existence stociometrické rovnováhy mezi: aminoacyl-trna eef1a eef1balfa - eef1bgama - cytoskeletem = cytoskelet se přímo podílí na regulaci elongace a tím i iniciace 10

11 Elongační faktor versus cytoskelet model organizace translačního aparátu a cytoskeletu hladina keratinu v buňkách epitelu = marker karcinogeneze 1. Translační aparát a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory 11

12 1. Translační aparát - trna trna = adaptér zajišťuje přímé spojení mezi sekvencí aminokyselin v bílkovině a genetickou informací v mrna 1. translační aparát úpravy trna Je tvořena nukleotidy Je syntetizována ve dvou krocích: Ø Ø přepisována z trna genů akceptorové rameno syntetizováno později (může byt obnoveno i během životnosti molekuly) 1) sestřih 5 -konce 2) sestřih 3 -konce 3) dodatečná syntéza CCA sekvence v 3 konci 4) sestřih intronu 5) modifikace nukleotidů 1. translační aparát trna strukturní modifikace 1. translační aparát - modifikace nukleotidů trna Inosin Deaminace A Queuosin Excise G, inserce Q 12

13 1. translační aparát - trna 1. translační aparát - posttranskripční modifikace trna Struktura trna: 80 popsaných nukleotidových derivátů (2001) Ø 5 terminální fosfátová skupina Ø akceptorový stonek se 7 basemi na základě párová 5 - a 3 terminálních nukleotidů Ø CCA konec rozpoznává trna Ø D rameno se 4 basemi stonku a lístku často obsahuje dihydrouridin Ø T rameno se stonkem o 5 basích často obsahuje pseudouridin Ø base mimo antikodon jsou často modifikovány, především metylacemi Ø první antikodonová base bývá modifikována na inosin (z adeninu) nebo na pseudouridin (z uracilu) Význam: Ø specificita aminoacylace Ø rozpoznání kodónu Ø 3D struktura molekuly Ø zvýšení povrchu trna (dostupnost pro enzymy) 1. translační aparát - trna 1. translační aparát - trna Ø Struktura trna: Primární = pořadí nukleotidů Sekundární = tvar jeteloivého listu (díky párování basí) Terciární = helix ve tvaru L (interakce basí ze vzdálených míst) Ø 61 kodonů + 3 stop kodony Ø 20 (22) aminokyselin (selenocystein v živočišných buňkách: stop kodón UGA) mrna se sekvencí SECIS = selenocystein incorporation signal za UGA nebo 3 UTR (pyrrolyzin u archaebakterií a Desulfitobacterium hafniense: stop kodón UAG Ø 1 aminokyselina kódována více triplety (synonyma) = kód je degenerovaný Ø výběr mezi kodóny vzácně či běžné využívané = kodónový dialekt Ø každá trna se specifickou aminokyselinou má specifický kodón Ø pro přenos 1 aminokyseliny - více trna (synonymní kodóny) akceptorové rameno se napojí na na TpsíC rameno a vytváří helix, po napojení D smyčky se jetelový list uspořádává do funkční podoby L-helixu 13

14 1. translační aparát - trna a genetický kód 1. translační aparát - trna a genetický kód Ø 61 kodonů + 3 stop kodony Ø 20 aminokyselin trna u Prokaryot trnas u Eukaryot 31 typů trna = minimum base = bezchybné párování 3. base = kolísavé párování = wooble = nestandardní párování 3 nukleotidu mrna 5 nukleotidu trna antikodonu = flexibilita antikodonové smyčky 2 kodony zcela přesné: AUG methionin UGG tryptofan 1 aminokyselina = víc než 1 trna Ø 5 isoforem-trna pro Leu (E.coli) 1 trna = může párovat více kodonů Ø trna pro Phe čte UUU i UUC 1. Translační aparát - trna 1. Translační aparát molekuly trna: Ø procházejí sestřihem a modifikací basí Ø obojí má funkční důležitost Ø charakteristické konečné uspořádání od jetelového listu do L-helixu - výsledkem dipolových interakcí bazí ve dvouvláknových úsecích molekuly - stabilizací vazeb vodíkovými můstky mezi basemi a fosfátovými skupinami a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory Ø z celé molekuly vazebně přístupná pouze 2 funkční místa: a) 3 koncová sekvence CCA = místo vazby aminokyseliny b) antikodón ve smyčce oproti stonku = vazba kódon- antikodón 14

15 Aminokyseliny - genetický kód Aminokyseliny = velmi malé biomolekuly, mw. 135 daltonů 1. Translační aparát a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory 70S ribosom 1.Translační aparát- ribosomy Ribosomy: velké ribonukleoproteinové továrny na proteiny tvořeny kovalentně vázanými r-bílkovina a rrna Prokaryonta poskládáný ribosom: pouze ve spojení s mrna Eukaryonta 80S ribosom 1. Translační aparát-syntéza ribosomálních proteinů Transport RPmRNA z jádra Ø TOP (5 -terminal oligopyrimidine úsek) pravděpodobná funkce při exportu Translace Ø krátký 5 -UTR (40 nt) Ø omezená sekundární struktura Ø RPmRNA oscilují: stav represe nebo translačně regulované aktivace Ø v případě aktivace je translace téměř na maximu účinnosti Uvolnění nascentních RP z ribosomu Ø lokalisace polysomů syntetisujících RP v blízkosti jaderných pórů Ø silná RNA-vazebná kapacita, úloha HSP70 Ø okamžitý transport do jádra a do jadérka 15

16 1. Translační aparátvlastnosti a funkce ribosomálních proteinů ribosomální proteiny L, S: Ø molekulová hmotnost: L proteiny 12 4 kda S proteiny 61 5 kda Ø extremně basické ph 8.5 a výše Ø jsou v ribosomu většinou v jediné kopii většina r-proteinů a všechny rrna mají části svých molekul na povrchu ribosomu 1. Translační aparát-ribosomy Proteiny přítomné v ribosomu ve stoichiometrických množstvích 1. translační aparát ribosomy Vytváření ribosomů je mnohostupňový proces a probíhá v kompartmentech: Ø jadérka Ø nukleoplasmy Ø cytoplasmy vytváření ribosomálních podjednotek = spolupráce nejméně 200 typů proteinů (včetně ribosomálních) + RNA molekul výsledkem je rovnováha v zastoupení obou typů molekul RP E.coli 16

17 1. Translační aparát- ribosomy 1.Translační aparát- ribosomy Jadérko je místem: Ø Syntézy pre-rna, sestřihu (výjímkou je 5S rrna:syntéza v jádře) Ø Uskládávání ribosomálních podjednotek z rrna a ribosomálních proteinů Pre-rRNA se v jadérku objevuje ve formě 4 vláken Ø ribosomální proteiny procházejí jaderným porem z cytoplasmy, z jádra pokračují do jadérka Ø pre-rrna + r-proteiny = zahájení setřihu rrna Ø formování podjednotek Ø vyputování podjednotek do jádra a jadernými pory do cytoplasmy nedostatečná biogenese ribosomů pokles translace (stres, hladovění) biogeneze ribosomů za minutu: 1500 kvasinky, 7500 HeLa buňky paní Henrieta Lacks HeLa buňky Translační aparát- ribosomální proteiny RP Biogenese ribosomů (R) Ø zdroj heterogenity ribosomů = bílkoviny + snornp jadérka: - standartní R - část R se sníženou účinností pro určitý typ mrna - heterogenita R tak vysoká, že přepisuje jen určité mrna - některé RP mají fukci mimo R Důsledky narušení biogenese: Ø narůstající údaje na lidských buňkách (postupná idenfikace molekulární podstaty mnoha onemocnění) Ø relativně nižší hladina embryonální letality a vysoká hladiná závažných onemocnění Ø stále nejasný vztah mezi biogenesí R a karcinogenesí Freed EF et al. When ribosomes go bad: diseases of ribosome biogenesis, Mol. BioSyst 6, ,

18 Chyby při biogenezui ribosomů a jejich dopad v podobě závažných onemocnění Translační aparát- RP Kódování ribosomálních proteinů kvasinky: 2 geny - 2/3 z nich duplikována se stejnou funkci, u několika jinou rostliny: malé genové rodiny (2 7 členů), podobnost sekvencí aminokyselin je %, liší se posttranslačními modifikacemi = heterogenita ribosomů Ø koordinace exprese, funkční specifita jednotlivých členů?? 2 geny RBS5, 1: vysoká hladina exprese v proliferujících buňkách prýtu a kořene 2: nízká hladina v buňkách kde probíhá diferenciace 2 geny RBL23a, 23aA: snížená hladina(rnai) =výrazné vývojové defekty 23aB: žádné fenotypové následky mutace různých genů kódujících RP- ribosomální proteiny se podílejí na regulaci vývoje rostlin analýza embryonálních vývojových mutantů (EMBRYO-DEFECTIVE) = mutace RB S6, S11, L2, L8, L23, L19, L40, (vyšší nebo nižší hladiny exprese RB) další typy mutací: zpožděné kvetení, morfologie listů, děloh, kondiční fenotyp: projev až pod vlivem UV. savčí buňky: 1 gen (pseudoknoty, alternativní sestřih) Byrne ME, A role of the ribosome in developmen,trends in Plant Science 14, , 2009 Warmer JR, MaIntosh KB, How common are extraribosomal function of ribosomal proteins? Mol Cell , Translační aparát- vlastnosti RP preferenční syntéza: Ø S14 v endospermu, S13 + L2 v rychle rostoucích tkáních, S15 při mitose, L27, L34 po poranění, L34 po aplikaci hormonů regulace syntézy Ø translačně regulována exprese S4, S6, L3, zřejmě i dalších RP postranslační modifikace Ø fosforylace S6 po stresu(u Eukaryot) Ø acetylace Eco L7, L12, L10, a celou řadu dalších Úloha RP mimo ribosomy? 1. Translační aparát- úloha RP nezastupitelná role: stavba, stabilita, opora rrna, funkce ribosomu S1 (61 kda)!!! Ø iniciace translace Ø interakce mrna a S9 Ø přivádí mrna na ribosom Ø jediná zásobní v cytosolu L2 poblíž PT domény rrna Ø tvorba peptidové vazby Ø velice konservativní L6, L7/L12, S12, S4, S5 Ø přesnost translace Ø snad ochrana citlivých oblastí rrna L11 A místo Ø vazba trna k A místu Ø iniciace translokace S5 Ø translokace trna z A do P místa L9 P místo Ø konformace trna v P místě L1 E místo Ø uvolnění deacylované trna z RS L5, L18 a L25 se váží na 5S rrna 18

19 1. Translační aparát- úloha RP mimo ribosom 2. Translace - ribosomykyselé P-proteiny S3 Ø DNA-UV-endonukleasová aktivita Ø reparace DNA Ø snad signalizační funkce při propojení reparace DNA se zráním RS a iniciací translace Ø zpětná vazba - kontrola vlastní syntézy Ø některé RP jsou i transkripčními faktory Ø važí se na vlastní transkript blokují sestřih S3a Ø overexprese v nádorových buňkách Ø váže další bílkoviny důležité pro transkripční regulaci Ø overexprese = inhibice diferenciace Ø vyřazení = stimulace diferenciace, inhibice buněčného růstu L7 Ø inhibice translace specifických mrna in vitro Ø regulace translace v souvislosti s kontrolou proliferace zralých lymfocytů kyselé (P) ribosomální proteiny: pi přímá regulace translační aktivity Ø cyklují: vázány na ribosomy po fosforylaci, uvolněny do cytosolu po defosforylaci Ø víc jak v jedné kopii na ribosom, skladovány v cytosolu P-proteiny: P1, P2, P0 fylogeneticky konservovány Ø E. coli : L7, L12, L10 (acetylovány) Ø P1 (m.w.11.5), P2 (11.1), P0 (36.5) Ø P1+ P2 kodovány 2 geny, (rozdíl v acetylaci prvního N-serinu) Ø P1 protilátka- reakce s bílkovinou m.w = P0 funční struktura: podélný stonek P1 homodimer + P2 homodimer + PO = pentamerní komplex mw.150 kda (rost. buňky: + P3 mw 12.2 funkce nejasná) 1. translační aparát ribosomy 1. translační aparát ribosomy ribosomy jsou nejen strukturou na které translace probíha, ale podílejí se aktivně na celém procesu jejich úloha v syntéze bílkovin nezastupitelná Podílejí se na přesné orientaci všech složek translačního aparátu: Ø mrna Ø trna nesoucí specifickou aminokyselinu spolu s antikodonem Ø GTP Ø proteinových faktorů pro iniciaci, elongaci a terminaci Základní údaje o struktuře ribosomů z 60. let, funkční úloha zůstávala nejasná Posledních 15 let intensivní studium prokaryontního(eukaryontního) ribosomu první trojrozměrná struktura až 2000 Ribosomy Nobelova cena za chemii 2009 velká podjednotka má klíčovou roli strukturuje peptidyl-transferázové centrum 19

20 PROKARYOTA xxx EUKARYOTA mají stejnou funkci v obou říších, zprostředkovávají stejný soubor chemických reakcí Ø liší se velikostí podjednotek a tím i velikostí ribosomů 70S 80S Ø Počet ribosomů v buňce (E.coli) až mil. (jaterní buňka) několik mil. (rostlinné buńky) Ø Velikost ribosomů 20-30nm 40-50nm 25 až 30% obsahu eukaryontní buňky připadá na ribosomy vysoká biogenese u rostoucích buněk potřebují k tomu až 60% celkové buněčné transkripce rostlinné ribosomy jsou menší než savčí a mají výšší heterogenitu 37-62% tvoří rrna, zbytek proteiny (RP) 1.Translační aparát- ribosomy Ribosomální podjednotky: Bakterií (70S), Eukaryot (80S), Mitochondrií (55-77S) Velká podjednotka 50S 60S 39S 23S 28S 16S rrnas 5S 5S 5S 5.8S proteiny Malá podjednotka 30S 40S 28S rrnas 16S 18S 12S proteiny Eukaryota: velká podjednotka protáhlejší malá podjendotka strukturovanější rozdíly dány přidáním dalších RNA segmentů i r-proteinů Eukaryontní ribosom A: ES=extension segments (rrna = zelená, RB=žlutá) B: ES7 + ES 39 + specificky eukaryontní bílkoviny 1.Translační aparát- ribosomy Stejná funkce jako u Prokaryot, ale větší podjednotky: více rrna = expansion segments of rrna více bílkovin = expansion segments of RP immuno EM, Xray, NMR modelování, mutace, řada onemocnění, cryo-em rekonstrukce rostlinných a houbových 80S ribosomů : lokalizace 3 funkčně specifickych erp: RACKI, S19e v malé podjednotce L30e ve velké podjednotce celkem lokalizace 49 erp (33 ve velké a 16 v malé podjednotce) zbývá 31 nejasných Armache JP et al. 2010, PNAS 20

21 1. Translační aparát- ribosomy Výsledky analýz Prokaryontních ribosomů ribosom tvořen 2 nestejnými podjednotkami: (SSU) +(LSU) Spojení podjednotek labilní, jen funkční při translaci rrna samouspořádávají se do kompaktních struktur tvoří jádro podjednotek a na ně se navazují ribosomální bílkoviny ribosomální bílkoviny - kolem 80 výrazně basických bílkovin váží se na rrna a mezi sebou navzájem malá podjednotka plochá, protáhlá: h=head, cl=cleft, pl=platform velká podjednotka hemisférická, se 3 výraznými výstupky: cp=centrální (5S rrna), L1 (L1 bílkovina), St = stalk-stonek (L7/L12) oblast interfáze je víceméně plochá, s IC = interfase canyon (hlubokou prohlubní) 1.Translační aparát- ribosomy Proč trojrozměrná rekonstrukce, detekce funčních míst a jejich úloha v translaci až nyní? Komplexnost struktury - několik typů rrna a víc jak 50 r-bílkovin (první studie obdobné jako u virových partikulí) Prohlubeň (canyon) ve velké podjednotce se prohloubí po spojení podjednotek v tunel a vzniklý prostor místem interakce s trna, mezi kodonem a antikodonem a) Vazba imet-trna v místě P (zelená), b) vazba EF-G GDP (fialová), c) připojení komplexu Sec61 pro přenos nascentní bílkoviny do membrán (červená) a) + b) E. coli, c) kvasinka ribosomy mají nepravidelný tvar!!! nové přístupy : - 2-D elektroforéza - několik typů chromatografií (SEC, HPLC, FPLC) - X-ray krystalografie - NMR - elektronová mikroskopie - kryoelekronová mikroskopie - mutační analýzy - modelování 21

22 1.Translační aparát- ribosomy 1. translační aparát - funkční domény 23S rrna Skládání ribosomálních podjednotek 1. translační aparát ribosom (E.coli) Terciární struktury bílkovin a jejich lokalizace v podjednotkách velká podjednotka malá podjednotka 1. translační aparát ribosomy Napojení ribosomálních bílkovin a rrna N,C= konce bílkovin, P= putativní trna-vazebné místo, R= aktivní místa 22

23 1. translační aparát ribosomy Topografie r-bílkovin na intaktních ribosomálních podjednotkách E.coli (imuno-em analýza vazeb protein-protein) Pohyb dvou volně spojených podjednotek nezbytné pro funkci ribosomu: pulsating ribosome contraction SSU pohyblivost mezi hlavou a tělem LSU pohyblibost - L1 vypouklina + stonek L7/L12 malý rotační pohyb SSU a LSU podél osy (v oblasti interfáze) 2.Translace - ribosomy Translační aparát ribosomy flexibilita L1 bílkoviny = vysoká účinnost tranlace Pohyblivost ribosomů Ø pohyb trna, mrna + rostoucího polypeptidového řetězce Ø konformační změny obou podjednotek Ø změny flexibility jejich domén Ø Ø Ø 3D struktura ukázala vazebná místa: V. doména 23S rrna (=exit, uvolnění deacylované trna z ribosomu) r-proteinů: S9, S2, S10 mrna 23

24 1. Translační aparát ribosomy 1. Translační aparát ribosomy Ribosom Jádro podjednotky tvořeno vysoce polymérní samouspořádanou rrna Ø Každá ribosomální bílkovina má své dané vazebné místo Ø Ribosomy : jsou translačním aparátem: čtou genetickou informaci + syntetizují odpovídají polypeptid ribosom má 3 funkce: 1. Dekódující zodpovídá za uspořádání AMI v souladu se sekvencí nukleotidů navazování příslušných aminoacyl-trna 2. Enzymatickou - zprostředkovává transpeptidázovou reakci = prodloužení nově vznikajícího polypeptidu (katalyzována peptidyl transferázou) 3. Transportní - umožní pohyb podél mrna a průchod trna úloha ribosomálních podjednotek v těchto reakcích: 1 = malá podjednotka 2 = velká podjednotka 3 = obě podjednotky 24

25 Děkuji za pozornost Přijďte zase příště na kus řeči o translaci 25