REGULACE TRANSLACE. Regulace translace INICIACE TRANSLACE. 1. Translační aparát ribosomální podjednotky. 2. translace- iniciace

Transkript

1 1. Translační aparát ribosomální podjednotky Ribosom je tvořen dvěma nestejnými podjednotkami: SSU + LSU Jádro podjednotky tvořeno vysoce polymérní samouspořádanou rrna Každá ribosomální bílkovina má své dané vazebné místo Ribosomy : jsou translačním aparátem: čtou genetickou informaci + syntetizují odpovídají polypeptid REGULACE TRANSLACE INICIACE TRANSLACE ribosom má 3 funkce: 1. Dekódující zodpovídá za uspořádání AMI v souladu se sekvencí nukleotidů 2. Enzymatickou - zprostředkovává transpeptidázovou reakci (katalyzována peptidyl transferázou) prodloužení polypeptidu 3. Transportní - umožní pohyb podél mrna a průchod trna úloha ribosomálních podjednotek v těchto reakcích: 1 = malá podjednotka 2 = velká podjednotka 3 = obě Regulace translace 2. translace- iniciace 1. Translační aparát 2. Translace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdpnapojení PABP na čepičku Iniciace čepička na 5 UTR = scanovací model platí vždy??? 1

2 2. translace- iniciace, IRES 2. translace- iniciace, IRES Iniciace čepička není u Eukaryont nezbytná IRES další způsob iniciace v eukaryontních buňkách některé eukaryontní mrna bez čepičky, nepoužívají scanovací model jejich 5 UTR oblast obsahuje určitou sekvenci (obdoba SD) = IRES (internal ribosomal entry side = místo vysoké afinity pro vazbu iniciačního komplexu) na toto místo se váže eif4f tento iniciační faktor zcela nezbytný pro IRES přepis charakteristika typické IRES oblasti neznámá, musí zřejmě mít jak primární (sekvenční), tak sekundární (navázané proteiny) strukturní elementy v mrna příkladem jsou stresové mrna i pro IRES systém platí nezbytnost rozvinutí 5 UTR struktury IRES = obdoba iniciace prokaryont 2. translace- iniciace, IRES Prokaryonta: rozpoznání startovacího místa translace zprostředkovává iniciační komplex iniciační komplex = 30S podjednotka + iniciátorová trna (s navázanou aminokyselinou formylmethioninem fmet-trna) + 3 iniciační faktory ( IF1, IF2, IF3) nejčastějším iniciačním kodonem je AUG, ale GUG + UUG nejsou výjímkami iniciační komplex se váže přímo na iniciační kodon, který je umístěn za sekvencí Shine-Dalgarno (SD) SD = 7 purimových nukleotidů jež komplementují Eukaryonta-IRES - přímá vazba 40S podjednotky a cis regulační sekvence v mrna IRES (internal regulační signal) 2. translace- iniciace, stres Okamžitá exprese stresových bílkovin??? 1. mrna kódující stresové bílkoviny nemá čepičku - využívá systém IRES 2. Stresové bílkoviny přímo ovlivňují iniciaci Hsp27 indukovaný stresem v savčích buňkách interakuje přímo s faktorem 4G a tak brání translaci konstitutivních proteinů Hsp27 nereaguje s žádným dalším iniciačním faktorem overexprese Hsp70 udržuje 4G funkční a umožňuje jeho zabudování do4f, podílí se na nastartování proteosyntézy po stresu tyto nálezy zatím jen v živočišných buňkách Hsp101 u rostlin působí jako translační enhancer, je funkčně obdobou TMV vazba Hs101 na mrna vrací funkci 4G a F3 a tím konfigurují 40S komplex pro expresi konstitutivních bílkovin 2

3 2. translace- iniciace Hypotéza ribosomálního filtru Iniciace translace ne vždy potřebuje aktivaci mrna vytvořením čepičky A: 40S se váže na vazebná místa na mrna (šedé zony) Iniciace translace využivá scanovací systém nalézání prvního čteného AUG B: pevná vazba mezi 40S a mrna zpomalí nebo až blokuje posun k AUG = regulace translace možnost ribosomálního filtru C: slabší vazba 40S podjednotky, flexibilita, možnost navazovat další podjednotky D: v případě C, více možností 1=pohyb k čepičce 2=reorientace na mrna scanování 3=vazba na další vazebné místo 4=pohyb k AUG pomocí ternárního komplexu Iniciace: scanování x ribosomální filter??? Iniciace: scanování x ribosomální filter??? celá řada poznatků není v souladu se scanovací hypotézou - nebere v úvahu proměnlivost ribosomů - v sekvenci mrna oblasti odpovídající sekvencím rrna -proměnlivost afinity mrna k iniciačním faktorům hypotéza filtru předpokládá přímou vazbu cis regulačních sekvencí v mrna na 40S tyto interakce ovlivněny strukturální proměnlivostí ribosomů během ontogenese rrna-like sekvence nalezeny na mrna v délce 7-14 nukleotidů tyto segmenty jsou GC-typu a jsou komplementární ve 13 oblastech 28S rrna a mohou být využívány systémem IRES buňka může využívat obou systému iniciace a upřednostňovat jednu z nich podle situace v buňce, nebo v celém organismu hypotéza filtru ribosome je regulační struktura, která umožní přeferenční syntézu některých typů mrna filtr je dán existencí specifických interakcí mezi 40S a segmenty mrna interakce = párování basí mezi komplementárními segmenty mrna a rrna vazba mrna a ribosomálních proteinů většina interakcí se 40S, interakce se 60 či 80S nejsou vyloučeny interakce na základě kompeticí různých mrna segmentů o vazbu na rrna filter může také modulovat změny nebo maskování určitých vazebných míst na ribosomech vazebná místa pozměněna: -hererogenitou skladby ribosomu, - interakcemi s proteiny navázanými na ribosome - s mikrorna (21-24 nukleotidů) - fosforylací ribosomálních bílkovin 3

4 Iniciace: scanování x ribosomální filter??? Iniciace: scanování x ribosomální filter??? co mluví ve prospěch filtru heterogenita ribosomů podmíněna geneticky: heterogenita r-proteinů dána: kvalitativními změnami v 6 proteinech kvantitativnimi změnami ve 29 proteinech metylací ve 14 fosforylací u 2 proteinů heterogenita rrna: rrna kodovany mnohočetnými rodinami a substituce a delece mezi jednotlivými rrna geny časté v lidských buńkách nalezeno 35 variant 28S rrna jak by filtr mohl fungovat? silné interakce mezi 4OS a mrna mohou zabránit translaci slabé interakce mohou vést k pohybu 40S: - k čepičce - nebo přímo k AUG pomocí ternárního komplexu s trna hypotéza dovoluje jedné sekvenci působit jako umlčovatel i jako zesilovač podle stavu v buňce co zůstává nepotvrzeno podíl na ribosomy navázaných proteinů na iniciaci translace dopad konfiguračních změn ribosomů na základě proměnlivosti zastoupení jednotlivých r-proteinů variabilita častá i u 5S rrna (u ježovky nalezeny 5SrRNA se 6 rozdílnými nukleotidy v oocytech, se 120 v somatických buńkách) Ribosomální filtr Významná role ve virové patogenezi lidských buněk (roztroušená sklerosa) IRES elementy u napadených buněk mohou umožnit aktivaci několika kodonů a to jak pro polyprotein, tak pro L proteiny (virové typy) Zelená = IRES Bledě modrá = 40S eif2 = červená eif3 = tmavo modrá trna = černá ITAF = bílkovina modulující IRES ve prospěch využívání všech AUG pro různé typy mrna Iniciace: hypotéza ribosomálního filtru nová hypotéza vysvětluje existenci trvale na polysomy navázaných mrna podporou hypotézy je prokázaná heterogenitou ribosomů a složení 5 UTR mrna vysvětlí zesílení i umlčení přepisu podporou je i důkaz IRES sekvence u řady mrna lokalizovaných v buňce excentricky (vedou k morfogenesi) pokud by hypotéza byla prokázána mělo by smysl vnášet ribosomy do nepříbuzných organismů nebo z jednoho vývojového stádia do druhého ribosomy = nový nástroj regulace translace 4

5 2. Translace modifikace iniciace fosforylace regulace translace = regulace iniciace = regulace aktivity iniciačních faktorů počet fosforylací koreluje s účinností translace zvýšený počet fosforylací = zvýšená účinnost translace míra poklesu translace neodpovídá ekvivaletně míře fosforylace, 80-95% pokles translace = 15-25% fosforylace F2 fosforylace 4F zvyšuje kompetivnost mrna při obsazování translačního aparátu, hlavně méně aktivních typů mrna existují výjímky: - fosforylace eif2 nebo její alfa podjednotky = ztráta aktivity ( za stresu, při virové infekci)!!!- defosforylace a tím recyklace eif2 = aktivace translace 2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdpnapojení PABP na čepičku Iniciace čepička na 5 UTR = scanovací model platí vždy??? 2. Translace modifikace iniciace RiP inhibitory = cytotoxické proteiny, ribosomální jedy RIP = ribosome inactivating proteins = stop proteosyntézy mají N-glykosidásovou aktivitu, štěpí glykosidickou vazbu 28S rrna v 60S podjednotce = neschopnost vazby ribosomu na eef2 Přirozená obrana rostlinné buňky proti virovým infekcím Celosia cristatae) REGULACE TRANSLACE Ricinus communis ELONGACE + TERMINACE 5

6 a)cryoelectron mikroskopická podoba E.coli ribosomů b) Počítačový model 70S ribosomu Znázorněná místa A (růžová), P (zelená) a E (žlutá) na ribosomu Nascentní polypeptidový řetězec je zanořen do tunelu ve velké podjednotce, poblíž akceptorového ramínka trna v P místě, proti místu kde se velká podjednotka váže na malou podjednotku Ternus termophilus Ribosom je základní složkou translační mašinerie Ribosom obsahuje 4 vazebná místa pro RNA: 1 místo pro mrna (při iniciaci) 3 místa pro trna: Místa P A E (při elongaci) Molekuly trna jsou pevně drženy v místech P a A pouze při dokonalém párování kodón-antikodón translačně funkční místa ribosomu viditelná na interfázi podjednotek A= modrá, P= žlutá, E= zelená, 16S rrna=modrozelená, 23S rrna=purpurová, 5S= růžová ribosomální bílkoviny na povrchu 6

7 Funkčnost ribosomů : labilní napojování podjednotek + konfigurační proměnlivost obou podjednotek 2. Translace - elongace 3D anatomie ribosomu Elongace: Postupné přidávání aminokyselin k rostoucímu řetězci bílkovin Využívání 3 míst na ribosomu A = aminoacyl-trna vazebné místo P= peptidyl- trna vazebné místo E = exit trna vazebné místo 2 elongační faktory: eef1, eef2 (GTPázy, tzv. G proteiny) eef1 nalézá správnou adresu pro aa-trna na A místě ribosomu eef2 nezbytný pro translokaci z místa A do místa P pokud do místa A připutuje komplex aminoacylt-rna.ef1 alfa.gtp s nevhodným antikodónem ---je rychle odplaven (test spolehlivosti na úrovni ribosomů) 7

8 Elongace začíná nalezením prvního AUG a zformováním ribosomu Aktivovaný methionin v ternárním komplexu se váže na malou podjednotku ribosomu v místě P = začátek syntézy bílkoviny: Navázání 60S pomocí faktoru eif5.gtp --- následná hydrolýza GTP a uvolnění eif6 i eif5 ireversibilní spojení 40S a 60S do funkční podoby 80S po dobu translace dané molekuly mrna Elongace má 3 fáze: První krok elongace = vstup 2. aminoacyl t-rna do ribosomu vždy v podobě ternárního komplexu s navázaným elongačním faktorem faktorem v aktivované formě EF1 alfa.gtp vždy na místo A, přesně na odpovídající kodón mrna a antikodón trna 8

9 2. Translace elongace Úloha elongačních faktorů eef1: 2 elongační faktory: eef1 eef2 EF1A + EF1B Elongace má 3 fáze: První fáze elongace = vstup 2. aminoacyl t-rna do ribosomu eef1a: alfa, beta, gama podjednotky eef1 alfa : kódována mnohočetnou genovou rodinou exprese regulována vývojově, hormonálně a stresem na hladině transkripce a stability mrna v rámci rostlinných druhů vysoká sekvenční homologie GTP z komplexu EF1 alfa je hydrolyzován: hydrolýza GTP = konformační změny ribosomu a tyto změny umožní: - pevnou vazbu aminoacyl t-rna v místě A -uvolnění EF1 alfa.gdp z komplexu - polohu aminoacylovaného 3 konce t-rna v místě A blízko 3 konce Met t-rna 9

10 výjímečnost eef1 alfa podjednotky: katalyzuje vazbu aminoacyl-t-rna k ribosomům reguluje přesnost + rychlost elongace přítomna v buňce až do 1-5% celkových bílkovin její exprese koreluje s rychlostí růstu bez ohledu na vysokou konstitutivní hladinu snižuje aktivační energetickou barieru mezi konformačními stavy ribosomů váže se na mikrofilamenta a mikrotubuly zvyšuje podíl F aktinu vazba na cytoskelet: kompartmentace translace na cytoskeletu regulace transportu translokace aktivace mrna i mrnp Elongace má 3 fáze: Druhá fáze elongace = transpeptidace esterická vazba aminokyseliny v místě P se štěpí a peptidylový Aminoskupina acylované trna v místě A reaguje s carboxyl- terminál C peptidyl-trna v místě P Peptidyltransferázová reakce: je katalyzovaná velkou podjednotkou ribozomu = přesná orientace atomů, jež spolu musí reagovat E.coli 50S: zbavena téměř všech bílkovin a přesto peptidylová reakce in vitro bez omezení proběhla = zřejmá úloha rrna (ribozymu) zajišťuje prostorovou orientaci i organizaci translačního aparátu Úloha elongačních faktorů elongační faktor eef1b eef1b: alfa, beta, gama podjednotky celková znalost minimální nezbytná složka recyklace komplexu eef alfa.gdp fosforylace eef1b alfa inhibuje tvorbu eef1ab komplexů a tím inhibuje recyklaci eef1 alfa faktoru 10

11 Elongace má 3 fáze: Třetí fáze elongace = translokace ribosom se posune (translokuje) podél vlákna mrna přesně o 1 kodón trna Met bez aktivovaného methioninu se pohybuje k místu E na ribosomu 2. trna aminokyselina kovalentně vázaná na dipeptid se pohybuje na místo P V tomto okamžiku je konformace ribosomu s volným místem A = post state připravenost přijmout další komplex aminoacylt-rna.ef1 alfa.gtp další aminokyselina se přidá na C-konec rostoucího polypeptidu dle posloupnosti kodódů tento proces se opakuje až po stop kodón 2 elongační faktory: eef1, eef2 eef2 katalyzuje GTP-dependentní translokaci peptidyl-trna na ribosomu z místa A na P = posun mrna o 3 nukleotidy = uvolnění deacylované trna z místa P člen velké rodiny GTPáz nepotřebuje recyklační faktor pro výměnu GDP na GTP pre-translokační ribosom upřednostňuje vazbu eef2 post-translokační ribosom vazbu na eef1 alfa u rostlin neprokázán podíl fosforylace na funkčnosti Úloha elongačních faktorů 1. v místě P je vázána trna Met (později rostoucí polypeptidový řetězec) 2. trna nesoucí další aminokyselinu se váže v místě A na základě párování kodón-antikodón 3. karboxylový konec peptidového řetězce odštěpen od trna v místě P (přerušení makroergické vazby mezi trna a aminokyselinou) 4. spojen peptidovou vazbou s volnou aminoskupinou aminokyseliny v A místě = centrální reakce translace a je katalyzována peptidyltransferázovou aktivitou, která je součástí ribosomu, jeho větší podjednotky 5. malá podjednotka ribosomu se posune o 3 nukleotidy 6. trna se uvolní z místa E 11

12 2. Translace - elongace Přesnost translace stabilita vazby při iniciaci translace --- pouze mnohočetnými interakcemi mezi SSU a mrna stabilizace vazby při elongační fázi --- trna v místě P a v místě A pouze přímou interakcí na úrovni 3 nukleotidů mrna kodón trna antikodón 2. Translace elongace Elongace umožní postupné navazování dalších ribosomů vysoká flexibilita molekuly ribosomální bílkoviny L1 Vznikají polysomální struktury její funkčnost zajišťuje účinnou translaci terciární struktura L1 ribosomálního bílkoviny L1 se váže na: V. domenu 23S rrna (zodpovídá za odstraňování deacylované trna z ribosomu) ribosomální bílkoviny S9, S2 S10 mrna 12

13 Poly(A)-vazebné bílkoviny, eif4e a eif4g vytváří kruhovou strukturu mrna Syntéza bílkovin na polysomech Polysomální komplexy ribosomy polysomy 13

14 A dekodovací centrum s kodonem mrna vybírá aminoacyl-trna aminoacyl-trna v místě A, peptidyl-trna v místě P ester vázaný na peptidu se odštěpí, peptidylový zbytek se váže na volnou aminoskupinu aminoacyl-trna a tím je v místě A peptidyltrna prodlouženo o aminokyselinu P peptidyl transferázové centrum posunuje komplex mrna-trna o jeden kodon a tím posun trna z místa A na P a z místa na P na E E místo uvolnění deacylované trna translokace = změna dvou konformačních stavů ribosomů: pre-state a post-state konformační stavy odděleny vysokou aktivační energií elongační faktory eef1, eef2 snižují barieru aktivační energie, zrychlují elongační reakci a určujíjejísměr: eef2.gtp zajišťuje opačnou reakci, pre-post transici eef1.gtp katalyzuje post-pre transici, cytoskelet distribuce mrna v buňce nenáhodná, specifická cytoskelet = asymetrická síť pro regionální distribuci, funkční kompartmentaci a tím specifikaci existuje frakce polysomů vázaná na cytoskelet - translace probíhá na cytoskeletu - cytoskelet-membránovém systému viz Svět bílkovin 9 každá mrna svou specifickou elongační rychlost, průměrná rychlost = 5 AMI /sec doba vytváření bílkoviny = transit time = elongace + terminace (stanovení = poměr frakcí polysomální : cytosolické frakci) zpomalení pohybu ribosomů podél mrna = zvýšení počtu (density) ribosomů na mrna stimulace proteosyntézy při konstantním profilu polysomů zvýšením elongační rychlosti 14

15 2. translace - terminace rozdílná elongační rychlost u různých mrna za stejných podmínek: struktura 5 a 3 UTR oblasti neuniformní, specifická distribuce mrna a iniciačních faktorů ve specifických kompartmentech vytvářených cytoskeletální sítí struktura vytvářeného nascentního polypeptidu počet ko-translačních modifikací ( N-glykosylací ) rozdílná afinita iniciačních faktorů k určitým mrna volba preferovaných nebo vzácných kodonů volených trna Terminační faktory RF: erf1 tvarově podobný trna, váže se na místo A rozezná stop kodóny erf3 funguje jako komplex erf3.gtp oba faktory katalyzují štěpení peptidyl-trna a tím uvolňují kompletní bílkovinný řetězec Bacterie: RF1, RF2 = obdoba erf1 RF3 = obdoba erf3 inhibitor elongace a tím i inhibitor translace: CH = cykloheximid 2. translace - terminace 2. Translace - terminace Terminace = ukončení translace, uvolnění polypeptidového řetězce z ribosomu konečný stupeň translace nezbytné molekulární signály pro rozhodnutí o osudu komplexu: mrna-ribosom-trna-peptidyl stop kodóny: UAA UAG UGA nezbytná přítomnost uvolňovacích faktorů RF (release factors) 15

16 2. translace terminace, stop triplety 2. translace terminace jsou triplety UAA, UGA a UAG skutečně terminačními signály? RF = release faktor dekodovací mechanismus pro AMI kodony je triplet :triplet mezi mrna a trna (kodon:antikodon) terminační signál není dekodován trna, ale proteinem RF1(+RF3) část RF musí rozeznat STOP sekvenci v mrna existuje alternativní translace, kdy není stop kodon rozeznán a je využit jiný terminační signál je větší než UAA, UGA a UAG, +1 base za terminačním signálem rozhodující u všech organismů u rostlin je využíván UGA ve 46%, UAA ve 28% (u dvouděložných) +1 C jen 6%, +1 A 41% base za 4. nukleotidem ovlivňují účinnost terminace Disociace ribosomálních podjednotek a jejich stabilizace navázáním stabilizačních faktorů: 60S (eif6), 40S (eif3) RF výjimečnými faktory, mají současně kontakt s : mrna, s ribosomem, trna 2. Translace - terminace Disociace ribosomálních podjednotek a možnost okamžité reasociace na téže molekule mrna s využitím bílkovinných faktorů: PABP, eif4e a EIF4G 2. translace - terminace ribosom se setká s terminačním kodonem UAA, UGA, UAG v místě A RF1 dekoduje příslušný terminační signál na mrna terminační faktor se naváže na ribozom peptidyl-trna je hydrolyzována RF3 asistuje, (vytváří se uvolňovací komplex RF1.RF3.GTP) uvolnění polypeptidu recyklace ribosomů, mrna, trna a všech translačních faktorů přepis genetické informace z mrna do sekvence aminokyselin syntéza bílkoviny dovršena 16

17 Regulace translace 1. Translační aparát 2. Translace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech Děkuji za pozornost Přijďte zase příště na kus řeči o translaci 17