SKENOVACÍ ELEKTRO- CHEMICKÁ MIKROSKOPIE. Výukový materiál

Transkript

1 SKENOVACÍ ELEKTRO- CHEMICKÁ MIKROSKOPIE Výukový materiál

2 Tyto materiály vznikly díky finanční podpoře Fondu rozvoje vysokých škol v rámci grantového projektu FRVŠ G4 916/2012 Zavedení techniky skenovacího elektrochemického mikroskopu do výuky oboru analytické biochemie. Řešitel: Mgr. David Kovář Spoluřešitelé: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc., Mgr. Jana Mrázková

3 Verze Materiály jsou průběžně doplňovány. Jakékoliv dotazy, chyby či faktické nedostatky konzultujte, prosím, s autorem kovar@nanobio.cz

4 Obsah Úvodem... 5 I Teorie Stručný úvod do elektrochemických metod Základní elektrochemické pojmy Elektrody Elektrochemický článek Rozdělení elektroanalytických metod Mikroskopie skenující próbou Skenovací tunelovací mikroskopie Mikroskopie atomárních sil Mikroskopie v blízkém optickém poli Skenovací elektrochemická mikroskopie Poziční systém Elektrochemická instrumentace Mikroelektrody Základní charakteristiky Pracovní módy SECM a elektrochemie na ME Výroba mikroelektrod Aplikace metody Použitá literatura II Praktické cvičení Příprava měřených povrchů Příprava mikroelektrod Výroba Charakterizace Průběh měření Vyhodnocení naměřených dat III Practical workshop Preparation of measured surfaces Preparation of microelectrodes Production Characterisation The measurement Data evaluation IV Přílohy Příloha I. Bezpečnostní listy chemikálií používaných ve cvičení

5 Příloha II. Seznam vyučovaných předmětů na PřF MU ve vztahu k předkládané problematice

6 Úvodem Předkládaný text si klade za cíl seznámit čtenáře se základy metodiky skenovacího elektrochemického mikroskopu, nastínit široké pole aplikací a v neposlední řadě jednoduchou formou přiblížit praktické aspekty metody ve cvičení, které je hlavní součástí tohoto výukového bloku. Pojem nanotechnologie je skloňován v posledních letech stále častěji a dopady této vědní disciplíny můžeme pozorovat v každodenním životě. Pro pochopení dějů, které většinou v makrosvětě probíhají naprosto odlišně, musíme často nahlédnout do detailů mikrosvěta. Nástroji, které nám umožňují tyto vědecké výpravy na území lvů jsou často nejrůznější druhy mikroskopií, které s klasickým pojmem optického nebo elektronového mikroskopu mají pramálo společného. V optickém mikroskopu (OM) lze studovaný objekt pozorovat přímo soustavou skleněných čoček. Jiná situace už nastává v případě elektronového mikroskopu (EM), kde jsou fotony nahrazeny proudem elektronů a skleněné čočky pomocí elektromagnetických čoček. Zvětšení dosahuje hodnoty 10 3 v případě OM a 10 6 v případě transmisní EM, přičemž užitečné zvětšení bývá v reálu nižší. Obě uvedené metody poskytují pouze 2D pohled na vzorek a 3D zobrazení je výsledkem časově náročného a pracného procesu skládání řady 2D. Při použití EM již nelze hovořit o přímém pozorování, neboť pozorovaný obraz je výsledkem digitálního zpracování signálu a je nám tedy pouze zprostředkován. Obdobně je signál vyhodnocován u metodik, které využívají sondy (próby) pro skenovaní studovaného povrchu. Právě tyto techniky představují drtivou většinu metodik používaných v nanotechnologiích. Jejich výhodou je dosažení většího zvětšení (až na úroveň atomů a vazeb mezi nimi) a často pseudo-3d zobrazení zkoumaného vzorku. Skenovací elektrochemická mikroskopie svou jednoduchostí a instrumentální nenáročností představuje ideální techniku pro seznámení s těmito metodami. Většina těchto zařízení jsou robustní a drahé přístroje a práce s nimi je vyhrazena akademickým pracovníkům a několika málo vyvoleným studentům, kteří si prostřednictvím nich plní své povinnosti. Hlavní náplní tohoto cvičení je praktické seznámení studentů se zařízením SECM. Studenti tak budou mít příležitost provést vlastní modelové měření: od přípravy vzorku, přes práci s mikroskopem až po finální vyhodnocení dat. Teoretické přednášky a cvičení s demonstrační ukázkou nemohou konkurovat skutečným praktickým cvičením byť by byla sebelépe koncipována. O metodě skenovacího elektrochemického mikroskopu pojednává již druhé vydání poměrně obsáhlé monografie [1] a celá řada rešeršních prací [REF]. Pro potřeby výuky jsou však zbytečně obsáhlé a zejména rešerše neposkytují ideální materiál pro začátečníky. Tento materiál se snaží skloubit teoretický úvod do metody spolu s rešerší o aplikacích samotné metody. Text není zcela vyčerpávající a vzhledem ke svému zaměření snad ani být nemůže. Případné zájemce odkazuje autor na literaturu a jiné elektronické zdroje. Prvá kapitola teoretického textu se věnuje teorii elektrochemických metod. Další kapitola již pojednává o teorii skenovací elektrochemické mikroskopie. Poslední teoretická kapitola stručně shrnuje možnosti použití metody a publikované praktické aplikace. Praktická část je psána jak v českém, tak anglickém jazyce a obsahuje protokoly pro práci ve cvičení. V příloze III lze nalézt seznam předmětů vyučovaných na PřF MU ve vztahu k předkládané problematice, které mohou prohloubit znalosti v dotčených oblastech. 5

7 I TEORIE 6

8 1 Stručný úvod do elektrochemických metod Vzhledem ke značné nehomogenitě studentů předkládáme stručný úvod do elektrochemie a elektroanalytických metod. Pro neznalé není uvedený přehled zcela kompletní a pro další informace je třeba sáhnout po jiné odborné literatuře. Naopak znalý čtenář jistě promine a následující kapitolu přeskočí. Kapitola však může sloužit jako stručný přehled pro rychlé opakování. 1.1 Základní elektrochemické pojmy Elektrický proud I patří mezi základní jednotky SI. Elektrický proud je roven celkovému množství elektrického náboje, které projde průřezem vodiče za jednotku času. Jednotkou je ampér (A): 1 A je takový proud, který při průchodu dvěma rovnoběžnými přímkovými vodiči, nekonečně dlouhými, zanedbatelného kruhového průřezu, umístěnými ve vakuu ve vzájemné vzdálenosti 1 m, vyvolá mezi těmito vodiči sílu rovnou N (newton) na 1 m délky. Proud v běžných elektrických rozvodech může být stejnosměrný nebo střídavý. Dohodnutý směr toku stejnosměrného proudu je od kladného pólu zdroje k zápornému. Skutečný směr toku elektronů v pevných vodičích je však opačný!!! Elektrický proud se měří ampérmetrem, který se v obvodu zapojuje sériově. Elektrické napětí U je definováno jako práce vykonaná elektrickou silou při přemístění kladného jednotkového elektrického náboje mezi dvěma body v prostoru. Lze ho chápat i jako rozdíl elektrických potenciálů v obou bodech v prostoru. Jednotkou je volt (V): 1 V je takové napětí, které je mezi konci vodiče, do kterého konstantní proud 1 A dodává výkon 1 W. Odpor vodiče je v tomto případě 1 Ω. Jednotka volt je odvozena z jednotek soustavy SI: V (volt) = m 2 kg s -3 A -1. Napětí (součástky) se měří voltmetrem, který se v obvodu zapojuje paralelně. Elektrický náboj Q vyjadřuje velikost schopnosti působit elektrickou silou. Elektrický náboj vyjadřuje určitou vlastnost částic, která je spojována se vznikem vzájemného působení mezi tělesy (částicemi) podobným způsobem jako je hmotnost spojována s existencí gravitačního pole. Přítomnost elektrického náboje je tedy nutná pro vznik elektrického nebo magnetického pole. Jednotkou je coulomb (C). Jednotka odvozená z SI: C (coulomb) = A s. Elektrický náboj se měří pomocí elektrometru, nebo elektroskopu. Elektrický odpor R charakterizuje schopnost elektrických vodičů vést elektrický proud. Velikost odporu je dána materiálem, tvarem i teplotou vodiče. Velikost odporu je přímo úměrná délce vodiče a nepřímo úměrná průřezu vodiče, materiálu a teplotě. Odpor nabývá vždy kladných hodnot. Jednotkou je ohm (Ω). Také je jednotkou odvozenou: Ω (ohm) = V A -1 = m 2 kg s -3 A -2 Elektrická vodivost G je převrácenou hodnotou odporu. Jednotkou je siemens (S): S (siemens) = Ω -1. Siemens je odvozená jednotka: S (siemens) = s 3 A 2 m -2 kg -1 7

9 1.2 Elektrody Elektroda (poločlánek) je soustava tvořená vodivými fázemi (pevnými, kapalnými, plynnými), které jsou ve vzájemném kontaktu. Na styku těchto fází (fázových rozhraních) i uvnitř těchto fází se mohou pohybovat ionty, elektrony i molekuly a mohou zde probíhat reakce (chemické, redoxní) případně výměna nabitých částic výsledkem je pak potenciálový rozdíl mezi fázemi. Vodivost jednotlivých fází je zpravidla odlišná. Jako poločlánek (elektrodu) lze označit i soustavu tvořenou dvěma vodiči - vodičem 1. druhu (přenašečem jsou elektrony kovy) a vodičem 2. druhu (přenašečem jsou ionty elektrolyty). Rozlišujeme několik základních druhů elektrod. V grafickém vyjádření poločlánku vyjadřujeme jednotlivá fázová rozhraní svislou čarou (dle konvence IUPAC). Z hlediska polarizovatelnosti lze elektrody dělit na elektrody polarizovatelné (lze jim udělit z vnějšího zdroje určitý potenciál), a elektrody nepolarizovatelné, jež si udržují svůj potenciál na konstantní hodnotě bez ohledu na zvnějšku vkládané napětí. Jako polarizovatelné elektrody se používají elektrody 1. druhu s malým povrchem. Jako nepolarizovatelné pak elektrody 2. druhu (proto se používají jako referentní) nebo elektrody 1. druhu s velkým povrchem. Jako depolarizátor pak označujeme látku, která se při určitém potenciálu může oxidovat / redukovat (depolarizují elektrodu) a elektrodou může téci proud. Dle konstrukce lze dělit elektrody následujícím způsobem: Elektrody 1. druhu Jsou kovové elektrody (ve formě drátku, tyčinky, plíšku) ponořené do roztoku obsahující ionty téhož kovu. Mohou být zhotoveny i z platiny, která se elektrolyticky pokoví požadovaným kovem. Kovové ionty z roztoku se redukují volnými elektrony z kovové elektrody a dochází k vyloučení elementárního kovu na povrchu elektrody, současně však běží opačná reakce, kdy ionty kovu přechází z elektrody do roztoku. Při prvním ději se elektroda díky úbytku elektronů nabíjí kladně, ve druhém případě se nabíjí záporně v důsledku ztráty kladně nabitých iontů. Nutno podotknout, že oba děje jsou ve vzájemné rovnováze a celkový výsledný náboj elektrody závisí na převládajícím ději. Potenciál elektrody 1. druhu lze popsat Nernstovou rovnicí: E standardní elektrodový potenciál R.... plynová konstanta (8, J.K -1.mol -1 ) F.... Faradayova konstanta (96485 C.mol -1 ) T.... termodynamická teplota z.... počet vyměňovaných elektronů.... aktivita iontů kovu v roztoku. (1.1) Do této kategorie patří i elektrody plynové. Jsou tvořeny plynem, který je v kontaktu se svými ionty obsaženými v roztoku. Méně používanými jsou kyslíková a chlórová elektroda. Nejznámější a patrně také nejdůležitější plynovou elektrodou je vodíková elektroda. Je realizována platinovým drátkem pokrytým elektrochemicky vyloučenou amorfní platinou (platinovou 8

10 černí) ponořeným do roztoku HCl (1,18 M, je pod tlakem 0,1 MPa sycena plynným vodíkem. Amorfní platina katalyzuje následující reakci: ). Standardní vodíková elektroda (SHE) Popis poločlánku je naznačen zde: Obrázek 1: Různé konstrukce standardní vodíkové elektrody Standardní redoxní potenciál vodíkové elektrody je dle definice roven nule při všech teplotách! (1.2) Elektrodový potenciál jakékoliv jiné elektrody je definován jako rovnovážné napětí článku (EMN) tvořeného měřenou elektrodu (jako katodou - vpravo) ) a standardní vodíkovou elektrodou (jako anodou - vlevo). Standardní elektrodové potenciály jsou tabelovány a pro každý druh kovu jsou neměnnou konstantou. V tabulkách jsou tyto hodnoty doplněny ny uvedením formální poloreakce, vyjádře- né jako redukce daného redoxního páru. Při jednotkové aktivitě iontů v roztoku, je potenciál roven standardnímu elektrodovému potenciálu. 9

11 1.2.2 Elektrody 2. druhu Jsou kovové elektrody potažené málo rozpustnou solí tohoto kovu ponořené do roztoku dobře rozpustné soli se společným aniontem. Aktivita kovového kationtu je pak dána součinem rozpustnosti málo rozpustné soli. Nernstova rovnice má proti předchozímu případu mírně odlišný tvar: (1.3) Ks.... součin rozpustnosti málo rozpustné soli.... aktivita aniontu Elektrody 2. druhu jsou využívány jako referátní elektrody. Mezi nejčastější patří elektroda argentchloridová tvořena stříbrným drátkem pokrytým elektrolyticky vyloučeným chloridem stříbrným vnořeným do roztoku chloridových iontů. Kalomelová elektroda je tvořena rtutí (do níž je ponořen svodný platinový drátek) s vrstvičkou chloridu rtuťnatého (kalomelu) a je taktéž vnořena do roztoku chloridových iontů Elektrody 3. druhu Jako elektrody 3. druhu označujeme oxidačně-redukční elektrody realizované ušlechtilým kovem (Pt, Au), nebo grafitem (uhlíková elektroda) ponořeným do roztoku obsahující redukovanou i oxidovanou formu dané látky. Potenciál těchto elektrod je odvislí od vzájemného poměru aktivit obou forem látky (Ox + ze Red). Nernstova rovnice je ve tvaru: kde: a jsou aktivity složek daného redoxního páru Iontově selektivní elektrody (1.4) Jako iontově selektivní elektrody (ISE) označujeme ty, které vykazují selektivitu jen vůči určitým iontům. Jedná se o membránové elektrody. Tyto membrány mohou být tuhé (málo rozpustné sloučeniny jako Ag 2 S, AgCl, LaF 3 ) nebo kapalné (porézní destička s kapalným iontoměničem). Membrána odděluje vnitřní roztok definované koncentrace analyzovaných iontů od vnějšího roztoku vzorku. V důsledku rozdílných koncentrací iontu na obou stranách membrány dochází k přenosu elektrického náboje membránou. Mechanismus iontové výměny zajišťuje výměnu iontů mezi vzorkem a membránou a to bez změny oxidačního čísla. Na obou stranách membrány se tak vytváří tzv. membránový (Donnanův) potenciál. Tento potenciál je na vnitřní straně konstantní a rozdíl obou potenciálů tak určuje pouze koncentraci sledovaného iontu ve vzorku. Tvar Nernstovi rovnice je následující: /.... není standardní, pro každou elektrodu je individuální.... aktivita iontů ve zkoumaném roztoku / (1.5) 10

12 1.3 Elektrochemický článek Elektrochemický článek (cela) je tvořený minimálně dvěma elektrodami (poločlánky). Je záoxidaci nazývána anodou (potenciál EA) kladním prvkem všech elektroanalytických metod. Dle konvence IUPAC je elektroda, na níž dochází k a v článku se zakresluje vlevo. Redukce pak probíhá na katodě (potenciál EK) a ve schématu se zakresluje vpravo. Elektromotorické napětí článku E E (EMN) je rovno rozdílu potenciálů katody a anody: Elektrody obsahující kapalnou fázi (roztok elektrolytu) musí být propojeny pomocí solného můstku umožňující ující vodivé spojení. Solný můstek tak brání promíchání roztoků u jednotlivých elektrod!!! V anotaci článku to vyjádříme zdvojeným fázovým rozhraním mezi roztoky. 1.4 Rozdělení elektroanalytických metod Elektroanalytické metody dělíme na základě měřících přístupů do dvou hlavních kategorií. Ty se dále dělí dle zvolených kriterií. V následujících podkapitolách budou stručně představeny základní elektroanalytické metody včetně použití v klinické praxi, ale i například v analytické chemii. Na následujících schématech je patrné dělení elektroanalytických metod. Elektrochemickým článkem neprochází el. proud Potenciometrie Metody založené na elektrodovém ději Ox + ne - <--> Red Elektrochemickým článkem prochází el. proud Analyt je elektrolýzou kvantitativně přeměňován Koncetrace analytu se elektrolýzou prakticky nemění Voltametrie (polarografie) Amperometrie Elektrogravimetrie Coulometrie Obrázek 2: Dělení elektroanalytických metod založených na elektrodovém ději 11

13 Metody založené na měření elektrických vlastností roztoků Měří se vodivost roztoků Měří se kapacita Konduktometrie Dielektrometrie Obrázek 3: Dělení elektroanalytických metod založených na měření elektrických vlastností roztoků Potenciometrie Elektrochemický článek užívaný v potenciometrii se skládá ze dvou elektrod. Měrné (indikační) elektrody,, jejíž potenciál je závislý na koncentraci stanovované látky (iontu) a refe- rentní elektrody,, jejíž potenciál je za daných podmínek konstantní. Měření je prováděno za nulového procházejícího proudu (užívá se voltmetr s vysokým vstupním odporem). Měrnou elektrodou může být buď ď kovová elektroda ponořená do analyzovaného roztoku, v němž jsou obsaženy ionty tohoto kovu (viz elektrody 1. druhu kapitola 1.2.1) nebo tzv. iontově- selektivní elektroda (ISE) založená na měření membránového potenciálu (viz kapitolu 1.2.4). Nejznámější a patrně ě i nejrozšířenější jší membránovou elektrodou je skleněná elektroda použíhodnot EMN (nutná kalibrace pro vaná pro měření ph. Stanovujeme-li koncentraci sledované látky (iontu) přímo z přepočet et na koncentraci) jedná se o přímou potenciometrii. Sledujeme-li li změny napětí článpotenciometrickou titraci. ku v závislosti na přídavku titračního činidla, jedná se o Přímá potenciometrie Rovnovážný (absolutní) potenciál kovové elektrody E závisí na aktivitě ě iontů kovu v roztoku podle Nernstovy rovnice: (1.6) E 0 standardní elektrodový potenciál z náboj kovového iontu M a aktivita iontu kovu (je přímo úměrná jeho koncentraci) T termodynamická teplota (v Kelvinech) F Faradayova konstanta C mol -1-1 R plynová konstanta 8,314 J K -1 mol Pro praktická měření se obvykle zavádějí některá zjednodušení. Protože měření probíhá ve zředěných roztocích, nahrazuje se aktivita iontu jeho analytickou koncentrací. Dále se pak nahrazuje přirozený logaritmus logaritmem dekadickým a předpokládá se, že teplota roztoku je konstantní a rovná teplotě ě laboratorní 25 C (T=298 K). Výsledný vztah pak je 12

14 ,!" #$ % (1.7) V tomto tvaru je 0,059/z konstantní a tato konstanta je směrnicí kalibrační přímky. Zároveň vidíme z rovnice, že přímé stanovení pomocí ISE není vhodné pro ionty s vyšším nábojem, neboť se pak hodnota směrnice výrazně snižuje. V ideálním případ má směrnice této závislosti pro 25 C a z=1 hodnotu 59,2 mv Voltametrie Elektrochemický článek ve voltametrii se skládá ze dvou elektrod (pracovní a referentní), častější a univerzálnější je použití tříelektrodového uspořádání (pomocná elektroda). Pří tříelektrodovém uspořádání potřebujeme navíc potenciostat, takže se relativně navýší pořizovací náklady. Na pracovní elektrodu je vkládáno lineárně rostoucí napětí ( E/ t = konst.). Měřenou veličinou je procházející proud v závislosti na tomto potenciálu. Je-li v blízkosti elektrody látka, která je při dosažení jisté hodnoty potenciálu nastaveném na elektrodu schopna tuto elektrodu depolarizovat tzn., že tato látka se oxiduje nebo redukuje, dochází v průběhu tohoto redoxního děje k průchodu elektrického proudu elektrochemickým článkem. Jedná se o základní elektrochemickou metodu, kterou lze detekovat celou řadu anorg. či org. látek ve vodných, organických či směsných rozpouštědlech. Ze získaných naměřených dat lze určit počet přenesených elektronů, reverzibilitu elektrodové reakce, stabilitu případných meziproduktů, podrobný mechanismus děje, měřit kinetiku a celou řadu dalších parametrů. Polarografie Objevena roku 1922 profesorem Jaroslavem Heyrovským (1959 Nobelova cena za chemii) Její zavedení do elektrochemické praxe způsobilo celosvětovou revoluci v oblasti elektrochemické analýzy. Voltametrické metody s pomalým nárůstem potenciálu, kdy se na elektrodě stačí ustavit rovnováha odpovídající okamžitému potenciálu (měří se výhradně limitní difuzní proud, tj. proud úměrný koncentraci analytu danou pouze difuzí k povrchu elektrody) se historicky nazývají polarografie: voltametrie na rtuťové kapající elektrodě nebo rotující diskové elektrodě. 13

15 Obrázek 4: Historicky náčrt polarografu jak byl zkonstruován J. Heyrovským E I t E Obrázek 5: Voltametrie charakterizovaná změnou potenciálu na čase (vlevo); Závislost proudu na vloženém potenciálu v přítomnosti depolarizátoru (vpravo) Cyklická voltametrie Základní dynamická voltametrická metoda. Na pracovní elektrodu je od počáteční hodnoty E in vkládán rychle se měnící lineárně rostoucí potenciál do koncové hodnoty E fin, odtud potenciál klesá stejnou rychlostí až do výchozí hodnoty E in. Závislost napětí na čase má typický trojúopakovat, proto cyklická voltametrie. Pro elektrody o malé ploše se používají rychlosti změny potenciálu v rozmezí 20 mv/s 1 V/s. helníkový průběh. Tento proces lze libovolně Proudová odezva má dvě ě větve: dopřednou a zpětnou. Elektrodový děj se na obou větvích projeví nesymetrickým píkem, vznikajícím součtem esovité křivky rovnovážné závislosti 14

16 proudu na potenciálu a poklesem proudu způsobeným vyčerpáním analytu v těsné blízkosti elektrody. Nutnou podmínkou je tedy schopnost analytu oxidace/redukce v oblasti vkládaných potenciálů (pro daný typ elektrody a rozpouštědla) a jeho dostatečná koncentrace (ideálně v rozmezí M M). Studovaný roztok musí být dostatečně vodivý a musí potlačit vliv migrace (pohyb částic v el. poli) studované látky. Používá se přídavek základního elektrolytu, což je anorg. či org. sůl, jejíž žádná složka nesmí být elektrochemicky aktivní. E I Red Ox + z e - > < t Ox + z e - Red Obrázek 6: Cyklická voltametrie: cyklická změna potenciálu v čase (vlevo); ideální tvar CV voltamogramu s dopřednou a zpětnou vlnou s charakteristickýmu píky (vpravo) E Pohyb molekul analyzované látky je v důsledku: konvekce mechanické míchání vzorku (třepáním, mícháním, ) migrace pohyb molekul vlivem elektrického pole difuze pohyb molekul v důsledku difuze Při voltametrických studiích je žádoucí první dva vlivy eliminovat (roztok nebudeme míchat; přidáme elektrolyt o vhodné koncentraci), aby pohyb molekul k povrchu elektrody byl pouze v důsledku difuze (odtud limitní difuzní proud). Mimo klasickou voltametrii (polarografii) a cyklickou voltametrii existuje celá řada modifikací, které umožňují mnohem citlivější detekci: Tast polarografie Polarografie se superponovaným sinosovým napětím (A.C. polarografie) Square wave polarografie Pulsní polarografie Diferenční pulsní polarografie (voltametrie) Rozpouštěcí (stipping) voltametrie Případného zájemce odkazuji na kterékoliv elektrochemické skriptum, nebo internet Amperometrie Jedná se o odvozenou voltametrickou metodu, díky tomu můžeme použít stejnou instrumentaci. Potenciál se nemění v čase jako je tomu u voltametrie, ale jeho hodnota je nastavena jako konstantní a v čase se nemění. Měří se závislost proudu tekoucí elektrodou na čase. Hodnota 15

17 vloženého potenciálu je volena tak aby elektrodou tekl v přítomnosti analytu (depolarizátoru) limitní proud, jehož velikost je úměrná koncentraci analytu. Vhodná konstrukce měřících cel umožňuje detekci elektrochemicky aktivních látek v plynné i kapalné fázi. 16

18 2 Mikroskopie skenující próbou V poslední době neustále skloňovaný pojem nano(bio)technologie přináší nové poznatky téměř do všech odvětví lidského zájmu. Dle definice, nanotechnologie zkoumá objekty o ve- likosti menší než 100 nm (dle některých méně než 1000 nm) až řádově po velikost atomů. Abychom tyto objekty mohli vytvářet a studovat, musíme ovládat instrumentaci o vhodném rozlišení, při kterém se vzorek (zejména biologického původu) nachází pokud možno v (pseudo)fyziologickém ologickém prostředí. Často využívané techniky elektronové mikroskopie (SEM, TEM) sice poskytují kvalitní rozlišení, avšak za cenu ztráty fyziologických podmínek (biologické vzorky je nutné pokovit). Oproti tomu techniky známé jako mikroskopie skenující sondou (SPM; scanning probe microscopy) poskytují stejné i lepší rozlišení a mnohdy je lze využít i v kapalinách (ve fyziologickém roztoku). Techniky SPM využívají interakce sondy (pró- by) se zkoumaným povrchem a tuto interakci převádějí na měřitelný signál. Sonda skenuje povrch rastrovacím pohybem, tedy řádek po řádku (režim line-by-line). První představenou technikou SPM byla skenovací tunelovací mikroskopie (STM; scanning tunelling microscocenu. Následoval rozvoj těchto py) za kterou její autoři Binning a Rohrer obdrželi Nobelovu technik až do současnosti, kdy existují desítky technik a jejich kombinací postavených na nejuvádí jen zlomek metod různějších interakcích sondy se zkoumaným povrchem. Tabulka 1 používaných v praxi. Obrázek 8: Obecné schéma mikroskopu skenujícího sondou. Sonda zprostředkovává informaci o vlastnos- tech zkoumaného povrchu. Interakce sondy s povrchem je převáděna na měřitelný signál, který je dále zpracováván. SPM techniky mohou pracovat ve dvou základních režimech: skenování vzorkem a skeno- vání sondou. Zpětná vazba pak kontroluje vzájemný pohyb a uplatňuje se při volbě jiných dvou režimů: skenovaní v konstantní výšce a skenování při konstantní hodnotě ě měřené veličiny. 17

19 Obrázek 9: Schéma profilometru, který zkonstruoval Schmalz v roce Ačkoliv je za první SPM techniku považována STM, myšlenka studovat hrubost povrchů pomocí ostrého hrotu je poněkud starší. Pionýrskou metodou byla konstrukce profilometru (stylus profilometer) Schmalzem v roce 1929 [2]. Svou podstatou se jedná o předchůdce AFM. Tenký hrot se pohyboval po povrchu v ose X. Malé zrcátko na povrchu hrotu odráželo úzký svazek zaostřeného světla na fotografický papír. Vzorek se pohyboval spolu s fotopapírem a vychylování hrotu na drsném povrchu vedlo k záznamu na fotopapír. Předchůdcem STM byl topografiner [3, 4], který pracoval v nekontaktním módu. Vodivý hrot skenoval ve vzdálenosti 100 nm od vodivého povrchu. Dosahoval rozlišení 3 nm vertikálně a 400 nm horizontálně, což se v podstatě blíží rozlišení optické mikroskopie. Kvůli problémům se zpětnou vazbou a udržením správné pozice hrotu docházelo k výraznému rušení, což se nepodařilo vyřešit. Práce však nastínila možnost tunelování a otevřela ř příležitost k vytvoření STM. 18

20 Tabulka 1: Přehled některých mikroskopií skenujících próbou metody AFM, MFM, SNOM, SECM jsou dostupné i na našem pracovišti Technika STM Scanning Tunneling Microscopy NSOM/SNOM/NFSOM Near-field scanning optical microscopy AFM Atomic force microscopy MFM Magnetic Force Microscopy BEEM Ballistic electron emission microscopy ESTM Electrochemical scanning tunneling microscope SECM Scanning electrochemical microscopy MRFM Magnetic resonance force microscopy CFM Chemical force microscopy Rok objevu (1984) Skenovací tunelovací mikroskopie Technika byla vyvinuta v laboratořích IBM počátkem 80. let 20. století. Využívá tunelového průchodu elektronu mezi kovovou sondou a vodivým povrchem (limitující podmínka). Navíc je nutné pracovat v hlubokém vakuu, i když tuto podmínku lze s rozvojem elektroniky do jisté míry obejít. Elektrony v kovech mají menší energii než elektrony ve vakuu. Vakuum tak vytváří energetickou bariéru, ve které dochází k částečnému překrytí vlnových funkcí atomů vzorku a sondy. Aplikace napětí poruší symetrii bariéry a dojde k průchodu proudu. Z uvedeného tedy vyplívá, že není skenována přímo topografie, ale jen statistické rozložení vlnových funkcí atomů. Velikost měřeného proudu je ovlivňována vzdáleností sondy od povrchu. 19

21 Obrázek 10: Schéma interakce STM hrotu se vzorkem. Čárkovaně je naznačen tunelový efekt. Manipulace s atomy pomocí STM je sice možná, je však v počátcích a praktické využití zatím nenalézá. Na stránkách IBM můžete nalézt galerii struktur 1, které byly vytvořeny. Prozatím se jedná spíše o demonstrační ukázky. Obrázek 11: V roce 1990 demonstrovali vědci z IBM možnost manipulace jednotlivých atomů pomocí STM. Na kovovém povrchu sestavili z jednotlivých atomů Xe akronym firmy IBM. [5] 2.2 Mikroskopie atomárních sil Mikroskopie atomárních sil (AFM; atomic force microscopy) využívá interakce mezi atomy zkoumaného povrchu a sondy. Interakcí atomů vzniká přitažlivá nebo odpudivá síla, která způsobuje vychylování nosníku (cantilever) sondy. Přitažlivá síla je uplatňována van der Wa- alsovými silami zatímco odpudivé síly mají svou podsatu v Pauliho vylučovacím principu. Přitažlivé síly tak působí ve větších vzdálenostech, zatímco odpudivé síly v menších. Vychýji opticky pomocí laserového snímače, čímž dochází lení nosníku je snímáno nejčastěji k převodu interakce na měřenou veličinu. inu. Metoda není omezena vlastnostmi povrchu lze skenovat vodiče, nevodiče č či biologické materiály. Díky shora uvedeným principům lze metodu provádět v následujících režimech:

22 Kontaktní mód hrot je v jemném kontaktu se zkoumaným povrchem. Nosník se ohýbá a měřený signál poskytuje přímou informaci o topografii vzorku. V průběhu měření může dojít k poškození hrotu. Nekontaktní mód hrot se pohybuje v určité vzdálenosti nad povrchem. Sleduje se změna amplitudy kmitajícího hrotu v důsledku přitahování a oddalování od povrchu. S využitím zpětné vazby lze udržet nosník v konstantním ohnutí a zaznamenávat dorovnání v ose z. Poklepový mód kombinuje předchozí dva módy V roce 2009 se vědcům z IBM podařilo zobrazit strukturu pentacenu za pomoci nekontaktního módu AFM [6]. Struktura byla získána za hlubokého vakua a teploty kolem 5 K, použitý hrot byl modifikovaný oxidem uhelnatým. V roce 2012 se pak stejnému týmu podařilo detailně zobrazit meziatomové vazby v molekulách hexabenzocoronenu a fullerenu C60 [7]. Obrázek 12: Vědcům z IBM se v roce 2009 podařilo zobrazit molekulu pentacenu (dole) pomoci nekontaktního módu AFM a hrotem modifikovaným oxidem uhelnatým (vlevo nahoře). Stejnému týmu se v roce 2012 podařilo zobrazit jednotlivé meziatomové vazby ve velkém rozlišení (vpravo nahoře). 2.3 Mikroskopie v blízkém optickém poli Světlo, které se šíří prostorem může interagovat s určitým objektem v tzv. blízkém nebo dalekém poli. Klasická optická mikroskopie využívá dalekého pole. Rozlišení je dáno Rayleighovým kritériem a v praxi je rovno cca polovině použité vlnové délky. Optická mikroskopie tedy dosahuje rozlišení přibližně 200 nm. Oproti tomu mikroskopie blízkého pole využívá krátké vzdálenosti sondy od měřeného povrchu. Vzdálenost musí být menší než vlnová délka 21

23 použitého záření. Navíc se používá sonda, jejíž numerická apertura je menší než výše uvedená vlnová délka. Takto malá výstupní numerická apertura dává vzniknout bariéře, kterou světelné záření nemůže překonat. Dochází k jevu podobnému úplnému odrazu světla a současnému vybuzení evanescentní vlny. Analogicky s elektronovým tunelováním v případě STM tu hovoříme o tzv. optickém tunelování. Opět lze pracovat v několika režimech: Osvitový transmisní mód - sonda je zdrojem záření, dochází k zaostření paprsku hrotem. Prošlé světlo je sbíráno inverzním mikroskopem pod vzorkem Osvitový reflexní mód - sonda je opět zdrojem. Odražené světlo je snímáno fotodetektorem v okolí sondy. Sběrný transmisní mód - vzorek je prosvětlován zdrojem světla. Sonda slouží výhradně pro sběr prošlého světla. Sběrný reflexní mód - vzorek je osvětlován se shora. Sonda slouží pro sběr odraženého světla od neprůhledného vzorku. Nutno podotknout, že SNOM pracuje pouze v nekontaktním módu, jinak by mohlo dojít k poškození sondy. Používají se sondy s aperturou v rozmezí nm. Tato hodnota je zároveň mezním rozlišením pro metodu, ačkoliv teoretické rozlišení je bez omezení. 22

24 3 Skenovací elektrochemická mikroskopie Myšlenka obdobné metody k STM z aplikací elektrochemie byla realizována již koncem 80. let minulého století. Skupina kolem prof. A. J. Barda, zkonstruovala elektrochemický mikropovrchem [8]. Ačkoliv ne- skop, který využíval mikroelektrodu (ME) pro měření interakce s závisle na sobě pracovala i skupina kolem prof. Engströma [9]. Je právě ě skupině prof. Barda připisováno prvenství, neboť ť právě tato skupina dokázala přijatelně ě vysvětlit teorie ohledně aplikace mikroelektrod a zavedla a teoreticky rozvinula pojem zpětné vazby [10]. Sondou je v tomto případě ř ě mikroelektroda, která je umístěna ve výšce Z a pohybuje se nad zkoumaným povrchem v osách X a Y. Záznam měřeného proudu pak poskytuje celou řadu informací (topografii, elektrochemickou aktivitu, prostupnost iontů ů přes membrány, atd.). Díky tomu lze analyzovaný povrch pozorovat v pseudo-3d s mikrometrovým rozlišením, při některých metodách (kombinace AFM/SECM) dokonce s nanometrovým až atomárním rozlidosahují hodnoty na až pa. Zkoumaným povrchem pak může být prakticky jakýkoliv povrch (vodič, izolant, polovodič, šením. Proudy měřené pomocí ME jsou velmi nízké a řádově biologický materiál, membrána apod.). V literatuře e se pro zkoumaný povrch používá označení substrát, ale v kombinaci s měřením enzymové aktivity se toto jeví jako matoucí a v dalším textu bude užíváno termínu zkoumaný povrch. Anglický výraz scanning electrochemical ectrochemical microscopy je zastoupen zkratkou SECM a ozna- čuje jednak metodu skenovací elektrochemická mikroskopie a také přístroj skenovací elektro- chemický mikroskop. V literatuře se můžeme setkat i s označením chemický mikroskop. Více jak dvacetiletá historie techniky přinesla řadu možností využití. Široké uplatnění nalézá technika zejména v (bio)chemii, biologii a materiálových vědách. Postupný nárůst zájmu stran uživatelů je spojen s výrobou a prodejem komerčních zařízení. Řada vědeckých týmů však využívá vlastní řešení, podobně jako v našem případě. V následujícím textu budou popsány základní součásti mikroskopu SECM. Jádrem každého mikroskopu jsou mikroelektrody, kterým bude věnována samostatná kapitola 4. Obrázek 13: Obecné schéma uspořádání skenovacího elektrochemického mikroskopu. ME - mikroelekektrodové měřící uspořádání s troda je pohybována pozičním systémem ve 4D. Schéma vyobrazuje tříelektrodové referenční ní elektrodou R a pomocnou elektrodou C. (Bi)potenciostat zajišťuje hodnotu potenciálu pracovní elektrody. 23

25 3.1 Poziční systém Přesné pohyby elektrody v těsné blízkosti povrchu zkoumaného vzorku v navzájem kolmých rovinách (x, y, z) jsou zajištěny polohovacím systémem. Pohyb ME musí být reprodukovatelný a pohyb v jedné ose musí být nezávislý na pohybu ve zbylých dvou osách. Hrubý pohyb v řádech mikrometrů je zajištěn pomocí krokových motorů, piezoelektrické elementy (PZ) zajišťují jemný posun v řádech nanometrů. To, který pohybový element využijeme, záleží na požadované velikosti skenované oblasti. Nutnou podmínkou je velikost elektrody, neboť rozlišení je dáno právě ě touto hodnotou. Pro ME o velkých průměrech je plně dostačující využití krokových motorů takto lze s výhodou skenovat velké oblasti. Naopak ME s malým průměrem rem budou vyžadovat jemnější posun zaru elektrody záleží i rozsah skenované oblasti. Obvykle se jako nejmenší rozsah volí jišťovaný piezoelektrickými elementy. Na průměru dvojnásobek tohoto průměru ů ru (2 d). Nejvyšší rozsah je limitován použitým polohovacím zaří- zením a také časovými možnostmi, nemalou roli hraje i stabilita zkoumaného vzorku a po- stupné stárnutí ME. Pro názornost, oblast 100d x 100d skenovaná rychlostí 8,3d/s vyžaduje přibližně hodinu času. Pro ME obvyklé velikosti 1-25 um se skenovaná oblast běžně volí v rozmezí čtverečních čních µm při maximální rychlosti 50 µm/s zde nalézají uplatnění zejména polohovací systémy s krokovými motory. Významnou roli hraje uchycení ME na rameno polohovacího systému. Přídavné anti-vibrační zařízení má smysl pouze u ME malých průměrů, které jsou polohovány PZ. Vibrace zvyšují měřený šum a snižují kvalitu signálu a rozlišení. V našem případě je jako polohovací zařízení použit mikromanipulátor MP-285 firmy Sutter Instrument, který pro pohyb ve třech osách využívá jednotky poháněné krokovými motory. Detail mikromanipulátoru je znázorněn na Obrázek 14. Obrázek 14: Mikromanipulátor MP-285 firmy Sutter Intsrument Rozsah pohybu je 25 mm v každé ose. Jemný pohyb zařízení umožňuje teoretické rozlišení (bez ohledu na ME) 0,2 µm v hrubém posuvu a 40 nm v jemném posuvu. 24

26 3.2 Elektrochemická instrumentace Základní instrumentaci tvoří potenciostat a elektrody spolu s elektrochemickou celou. Funkcí potenciostatu je nastavení a kontrola potenciálu mezi referentní (R) a pracovní elektrodou (W). Druhou funkcí potenciostatu je měření proudu s dostatečnou citlivostí. Proud v případě tříelektrodového uspořádání prochází mezi pracovní a pomocnou elektrodou (A). Na potenciostat je kladena řada požadavků. Odezva potenciostatu musí být dostatečně rychlá, aby byla zachycena každá změna v průběhu chemické reakce a potenciostat tak mohl včas zareagovat. Dostatečná přesnost měření je zvláště důležitá s ohledem na práci s mikroelektrodami a měřenými proudy v řádech pa. Kvalitu potenciostatu a jeho signálu ovlivňuje hlavně konstrukce, proto se volí takové konstrukční provedení, aby byl vliv elektronického šumu pokud možno nejmenší. 25

27 4 Mikroelektrody V úvodu do elektrochemických metod (kapitola 1) byla popsána role pracovní elektrody. Technika SECM využívá jako pracovní elektrodu tzv. mikroelektrodu (ME). Tento zvláštní typ vyniká oproti klasickým elektrodám (makroelektrodám) celou řadou odlišných vlastností a výhod. V literatuře se ovšem můžeme setkat i s označením ultramikroelektroda (UME), označujícím mikroelektrodu menších rozměrů. Pojem UME odráží spíše historický vývoj výroby (dosažení menších průměrů) a formování elektrochemického názvosloví, obecně však není důvod zavádět jiné označení než mikroelektroda. Ostatně oficiální definice IUPAC [11] zahrnuje pouze pojem mikroelektroda. Dle této definice je mikroelektrodou taková elektroda, jejíž rozměr je za daných experimentálních podmínek menší nebo roven tloušťce difuzní vrstvy (δ) a dochází tak k ustálení rovnovážného stavu. I přes definici je pojem UME stále užíván a to i dokonce v aktualizovaném vydání knihy Scanning electrochemical microscopy [1]. 4.1 Základní charakteristiky Mezi základní charakteristiky patří poloměr elektrody. Hodnota RG představuje bezrozměrné číslo poměru průměru elektrody a šířky jejího izolantu & '()/ (1.8) Měřený proud je v tomto případě do jisté míry nezávislý na poloměru izolantu elektrody r(g). Poměr rychlosti pohybu elektrochemicky aktivní látky O k povrchu ME je poměrně vysoká (cca Dc/a) tzn., že proud není ovlivněn pohybem kapaliny (mícháním). K ustálení proudu v případě ME dochází poměrně rychle a proto můžeme skenovat při vysokých rychlostech. * /+ (1.9) Získaný voltamogram má typický průběh (Obrázek 15) a je odlišný od klasického CV voltamogramu, na který jsme zvyklí u makroelektrod (Obrázek 16). 4.2 Pracovní módy SECM a elektrochemie na ME Pro pochopení základního principu metody SECM je nutné znát teorii a elektrochemické pochody na malých elektrodách. V úvodu do elektrochemických metod již byla zmínka o společném znaku rtuťové kapající elektrody, rotující diskové elektrody a mikroelektrody. Pokud je mikroelektroda ponořena v roztoku redox-aktivní látky a zároveň je dostatečně vzdálena od povrchu (dvacetinásobek poloměru elektrody), prochází elektrodou faradický proud čistě v důsledku prosté difůze. V případě diskové kruhovité elektrody má difuzní vrstva polokulovitý tvar. Velikost proudu pro plochou elektrodu kruhového tvaru o poloměru a je dána rovnicí 1.,,-.+% (1) 26

28 Přičemž platí, že D je difuzní koeficient reaktantu O, F je pak Faradayova konstanta. Dále platí, že proud je přímo úměrný koncentraci c, poloměru elektrody a a počtu elektronů n. Rovnice 1 se liší pro různé tvary elektrody a byla odvozena pro celou řadu základních tvarů. 0,012 0,010 0,008 I [µa] 0,006 0,004 0,002 0,000-0,002-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 U [mv] Obrázek 15: Cyklický voltamogram platinové mikroelektrody (25 µm) - ferrokyanidu draselného (3 mm) při rychlosti polarizace 50 mv s I [ma] ,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 U [V] Obrázek 16: Cyklický voltamogram sítotiskové elektrody se zlatou pracovní elektrodou - ferrokyanidu draselného (3 mm) při rychlosti polarizace 50 mv s

29 Měření je uskutečňováno v několika možných módech. V prvém z nich je elektrochemicky aktivní reaktant (redox-reaktant) generován na mikroelektrodě (tip) a detekován pomocí substrátu (TG/SC; tip generation-substrate collection). Produkt redukce vznikající na ME je tak například zpětně oxidován na substrátu. Tento děj je obdobný reakci probíhající na rotující diskové elektrodě. Tento mód je užíván metodou SECM zejména při studiu homogenních chemických reakcí. Ve většině případů je povrch substrátu mnohem větší než povrch hrotu. Efektivita měření dosahuje téměř 100% pro stabilní přeměnu. Podobně lze použít opačné uspořádání, kdy je reaktant generován substrátem, jenž je zpracováván na ME (SG/TC; susbtrate generation-tip collection) toto uspořádání je častější a využívá se zejména ke studiu imobilizovaných enzymů, kdy se na ME měří produkt enzymové reakce. V případě SG/TC je odezva menší v důsledku menšího povrchu hrotu. Skenování substrátu v ose z však poskytuje informaci o koncentračním profilu. Pokud je skenován povrch v ploše XY získáme informaci o aktivních spotech. V případě, že ME je v těsné blízkosti nevodivého povrchu, dochází k uplatnění negativní zpětné vazby. Při přibližování ME k povrchu dochází k postupnému snížení procházejícího proudu v důsledku omezení difuze redox-aktivní látky k povrchu elektrody. Difuze je bráněna samotným nevodivým povrchem, ale také izolantem obklopujícím elektrodu. Čím blíže bude ME povrchu, tím menší proud bude procházet., /,,- (2) Výrazný nárůst proudu pak můžeme pozorovat v případě vodivých povrchů, kdy dochází k zacyklení molekul redox-aktivní látky mezi ME a zkoumaným povrchem. Látka je na tomto povrchu regenerována a může opětovně reagovat na povrchu ME. Dochází k zacyklení redoxreaktantu mezi ME a povrchem za současného masivního nárustu proudu. Hovoříme o tzv. pozitivní zpětné vazbě., 0,,- (3) Vynesením měřeného proudu v závislosti na vzdálenosti ME od povrchu získáme tzv. přibližovací křivku (approach curve) znázorněnou schematicky na obrázku níže. V literatuře se můžeme setkat i z kombinací obou měřících přístupů. Např. aktivita GOX byla měřena v kombinovaném režimu pozitivní zpětné vazby a SG/TC. 28

30 4.3 Výroba mikroelektrod Obrázek 17: Schematicky znázorněné přibližovací křivky Tradiční mikroelektrody se vyrábějí zatavením tenkých drátků (Pt, Au, C) do skleněných kané kapiláry je pak zbroušen do konického tvaru a povrch elektrody je vyleš- pilár. Hrot skleněné těn. Skleněný ný povrch kapiláry lze navíc pokovit (Au, Ag) a využít jako kombinovanou elek- hrotu kovového drátku lze zmenšit díky elektrochemickému odleptání např. v hydroxidu sodném nebo chlori- trodu pracovní či i pseudoreferentní. Obvyklé průměry ry kovových drátků se pohybují v rozmezí 5 25 µm. Průměr du vápenatém. Drátek se pak zataví výše uvedeným způsobem, nebo zalije do plastu případně pryskyřice. Výroba kvalitních sub-mikrometrových ME není triviální záležitost. Zatavení drátků lze reali- zovat i bez následného zbroušení skleněné kapiláry, jak uvádějí autoři publikace [12] a jak je uvedeno na Obrázek 18. Využitím speciálních přístrojů (puller) lze vyrobit ME tavením za současného tažení kapiláry. Puller se také používá pro výrobu mikrokapilár a intově-selektivních mikroelektrod. Iontově- selektivní mikroelektrody jsou v podstatě kapiláry s velmi úzkým hrotem, které jsou naplněny ionoforem. Modernějšími postupy py lze vyrobit kombinované SECM/AFM hroty, které dosahují miniaturzkoumaného povrchu. ních rozměrů a dovolují v reálném čase měřit odlišné charakteristiky Velmi hrubé povrchy lze měřit za pomoci tzv. "soft stylus prób". Technicky se jedná o miniaturní pružný polyethylenový nosič s vrstvičkou uhlíkového inkoustu. Nutno poznamenat, že toto je jediný případ kontaktního módu. Ve všech ostatních případech se v SECM využívá výhradně nekontaktní mód. 29

31 Obrázek 18: Obrázek pořízený optickou mikroskopií (a c) a SEM (d) mikroelektrody zbroušene velice jemně pouze v laterálním směru. [12] 30

32 5 Aplikace metody Zobrazování Zobrazování pomocí metodiky SECM je možné pomocí dvou režimů. Při obou ME skenuje dvojrozměrnou plochu X-Y kartézské soustavy. V prvém a častějším režimu je měřen proud ME při konstatní výšce ME od zkoumaného povrchu. Změna velikosti proudu pak odráží topografii zkoumaného povrchu. Ve druhém režimu je na ME udržována konstantní hodnota proudu a vzdálenost ME se mění v ose z v závislosti na topografii. Tento režim vyžaduje elektronickou zpětnou vazbu 2. V obou uvedených režimech je samozřejmě možné měřit vodivé i nevodivé povrchy. Rozlišení je dáno průměrem ME, ale i průměrem jejího izolantu (a and d). Využitím tohoto skenování je "chemické zobrazování", pomocí něj je možné stanovit rozdíly v rychlostech reakce v různých lokalitách zkoumaného povrchu. S výhodou lze studovat biologické materiály (enzymové spoty) nebo povrchy z aktivní a pasivní stranou. Charakterizace tvaru ME Tvar mikroelektrody je obtížné stanovit běžnými zobrazovacími technikami, jako jsou optická nebo elektronová mikroskopie. Elektroda může být v izolantu různě deformována, přičemž nejčastěji může být zapuštěna, nebo naopak může jemně vystupovat pod/přes okraje jejího izolantu. Elektrody o průměru menším než 1 um je zvláště obtížné charakterizovat. V těchto případech není efektivní ani proměření voltamogramu. Všechny ME vykazují typický tvar voltamogramu ze kterého nelze určit jakoukoliv závislost na průměru ME. Naproti tomu proměření přibližovací křivky (závislost it versus d) může odhalit zahloubení elektrody do izolantu. Heterogenní kinetika Pomocí přibližovací křivky nebo voltamogramu lze určit rychlost přenosu elektronů reakce probíhající na elektrodě. Rychlost přenosu hmoty je při malých elektrodách vysoká. Díky tomu lze měřit rychle probíhající reakce bez nežádoucího ovlivnění rychlosti přenosu hmoty. Lze tak hrubě odhadnout k0 (cm/s) která je přímo úměrná D/d, kde D je difuzní keficient (cm2/s). Např. k0 pro oxidaci ferocenu na Pt mikroelektrodě průměru 1um a vzdálenosti 0,1um má hodnotu 3,7cm/s. Značnou výhodou je použití malých hrotů a velmi malých proudů pro odstranění vlivu nekompenzovaných odporů. (resistance effectes). Homogenní kinetika Studium aktivity imobilizovaných enzymů Pomocí SECM byla studována řada enzymů, které byly různým způsobem imobilizovány na pevné povrchy. Oyamatsu a jeho tým studovali aktivitu diaforasy [13] Proteomika Jako zajímavé řešení se jeví použití SECM při detekci elektroforeticky dělených proteinů barvených stříbrem [14]. Proteiny separované na SDS-PAGE byly elektricky blotovány 2 Zde má zpětná vazba zcela jiný význam. 31

33 (electroblotting) na PVDF 3 membránu a obarveny stříbrem. Pro skenování byla použita platinová ME průměru 20 µm. Obrázek 19: Vlevo: Schématické uspořádání detekce stříbrem barvených proteinů Vpravo: SECM sken proužku blotovaného BSA (10 mg/ml) barveného stříbrem. Měřeno v 1 mm [Os(bpy) 3 ]Cl 2 pomocí 20µm Pt ME rychlostí 50 µm/s. [14] Single cell analysis Kombinovaný hrot AFM-SECM lze použít pro studium jednotlivých buněk a dokonce i organel [15, 16] Respirace HeLa buněk a její ovlivnění buněčnými jedy, jako KCN nebo etanol, bylo též předmětem zájmu [17]. Na základě této studie lze konstatovat, že SECM je citlivější než fluorescenční techniky využívající Calcein při kontrole působení léčiv a jiných látek. V tomto případě byla použita platinová ME o průměru 5 µm. Obrázek 20: Respirační aktivita HeLa buněk (a) před podáním a po podání 200 µg/ml Antimycinu A v časech (b) 30 min, (c) 60 min, a (d) 90 min. [17] 3 PVDF poly(vinyliden difluorid) 32

34 (Bio)energetika Zajímavě shrnuje trendy z oblasti výzkumu energetiky zejména palivových článků a baterií následující recenze [18]. Přehledně je zpracován vývoj uplynulých let a je mapováno využití techniky SECM právě v této oblasti s důrazem na využití kovových nanočástic. Využití techniky SECM lze nalézt i v bioenergetice, respektive studiích zabývajících se získáváním obnovitelné energie. Jedním ze směrů bioenergetiky je získávání energie přeměnou slunečního záření spojeného s nárůstem biomasy a jejím dalším zpracováním. Tato přeměna se děje pomocí fotosyntézy. Pomyslná účinnost je však velmi nízká (cca 27%), protože energie fotonu je z velké části ztracena při tvorbě meziproduktů fotosyntézy. Přímé odčerpávání elektronů pomocí velmi ostré mikroelektrody ukazuje zajímavý směr pro další rozvoj vysoko účinné metody sloužící k získávání obnovitelné energie [19]. Obrázek 21: Schematické znázornění přímého odčerpávání elektronů při fotosyntéze [19] 33

35 Obrázek 22: Potvrzení odčerpávání elektronů při fotosyntéze [19] Leptani skloviny Kyselé leptání nebo eroze materiálů je taktéž zkoumána napříč různými disciplínami a výjimkou není ani zubní lékařství. Narušování zubní skloviny v důsledku bakteriální produkce kyseliny mléčné je jedním z nejčastějších lidských onemocnění. Rychlost s jakou dochází k porušení skloviny, nebo zkoumání vhodných ochranných prostředků je v zájmu moderní medicíny. Technika SECM byla v tomto případě použita ke kvantitativnímu studiu kyselého rozpouštění skloviny [20]. Obrázek 23: Vyleptaná hovězí sklovina v důsledku galvanostaticky generovaných protonů (100 na) po dobu (a) 20 s a (b) 300 s. Obrázky byly pořízeny pomocí interferometrie v bílém světle (WLI). Lokální oxidace polystyrenu Lokálně oxidovaný polystyren, který může sloužit jako vhodný nosič pro buňky, nebo k dalším imobilizacím byl rovněž vyroben za pomocí SECM [21, 22]. 34

36 Litografie Elektrochemické rozpouštění (leptání) kovových povrchů hraje důležitou roli při studiu korozivních jevů [23], ale také při výrobě miniaturních integrovaných obvodů. Druhý zmíněný případ je užíván při leptání povrchů. Techniky přesného leptání kovů byly použity např. na mědi [24] nebo polovodičích [25] již v počátcích užívání metody. Demonstrace litografického použití SECM byla použita při anodickém rozpouštění měděného povrchu [26]. Obrázek 24: Chemické leptání měděného povrchu elektricky generovaným IrCl 6 2- pomocí SECM [27] Obrázek 25: SEM povrchu GaAs leptaný elektrochemicky generovaným bromem. Průměr ME 50 µm. [25] Koroze a její předcházení spadá spíše do oblasti materiálové chemie, ale za zmínku patří výhradní uplatnění SECM v této oblasti. Neméně důležitá je i ochrana povrchů proti korozi v uvedeném článku je příklad ochrany mědi pomocí 2-mercaptobenzimidazolu zkoumaná pomocí SECM [28]. Leptání lze využít i při vzorkování (micropatterning) tedy vytváření matic bodů, které jsou přístupné imobilizaci nejrůznějších molekul. Tímto způsobem lze vytvořit jednoduchá pole (microarrays) na kterých lze studovat např. katalytickou nebo enzymovou aktivitu. Ufheil a jeho tým využili leptání niklové masky vytvořené na zlatém povrchu [29]. Na zpřístupněné zlato se navázala SAM vrstva 11-merkaptoundekanové kyseliny sloužící pro další imobilizaci. 35