Charakterizace materiálů I KFY / P224. Martin Kormunda

Transkript

1 Charakterizace materiálů I KFY / P224

2 Přednáška 3 SEM (Scanning Electron Microscopy) TEM (Transmition Electron Microscopy)

3 Mikroskopy

4 Konstrukční princip elektronového mikroskopu Jsou dány vlastnostmi urychlených elektronů Možnost ovlivnění dráhy elektronů elektromagnetickým nebo elektrostatickým polem. Elektronový paprsek se může účinně šířit pouze ve vakuu. Elektronový paprsek je možno pozorovat pouze nepřímo (fluorescenční stínítko, fotografická deska, televizní obrazovka). Druh elektronového mikroskopu (prozařovací, řádkovací) dán interakcí elektronů s preparátem, která se užívá k zobrazení ( prozářené elektrony; vyražené =sekundární elektrony).

5 Interakce elektronů se vzorkem S. Jackson, Metal Oxide Catalyst, ISBN:

6 Mikroskopy - TEM Hitachi H kV Transmission Electron Microscope JEOL2010F Simulátor TEM

7 Proč elektronová mikroskopie Jakýkoliv mikroskop může maximálně rozlišit (přibližně) pouze 2 body ležící od sebe ve vzdálenosti ½ λ (vlnové délky) zdroje osvětlení. Viditelné světlo má λ přibližně 550nm = světelný mikroskop má rozlišovací schopnost přibližně 250nm. Maximální užitečné zvětšení je cca 1000x. Rozlišovací schopnost oka/rozlišovací schopnost mikroskopu=0,25/2, = 1000x Vlnová délka příslušející urychlenému elektronu (60kV) je přibližně 0,005nm (=stotisíckrát kratší než viditelné světlo). 0,25/2, = x Praktická rozlišovací schopnost elektronového mikroskopu je 0,5-0,7 nm, špičkově 0,25-0,3nm, tedy méně než teoretická hodnota (vady elektronoptického systému).

8 TEM Transmisní elektronový mikroskop je možné popsat jako složité technické zařízení, které umožňuje pozorování preparátů do tloušťky 100 nm při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností. Vzhledem k příbuznosti paprskových diagramů lze jej považovat za analogii světelného mikroskopu v procházejícím světle. Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek. TEM potřebuje ke své činnosti i mnoho dalších systémů, které u světelného mikroskopu nejsou, např. vysokonapěťové zdroje, elektroniku k řízení mikroskopu a výkonný vakuový systém pro vyčerpání jeho vnitřních prostor mikroskopu na hodnotu, která zabezpečí střední volnou dráhu elektronu alespoň v délce 3 m.

9 Interakce elektronového paprsku se vzorkem Tenkým vzorkem pod 100 nm část elektronů prochází ( prozáření ) beze změny část elektronů se absorbuje (teplo!) Prozařovací = transmisní elektronový mikroskop TEM (= stínový obraz)

10 Tenký vzorek Při průchodu elektron těsně míjí: atomové jádro = velká úchylka směru, ztráta rychlosti = elastický (pružný) rozptyl zasáhne jiný elektron = malá úchylka ve směru, ztráta velké části rychlosti = neelastický (nepružný) rozptyl = změna vlnové délky = chromatická vada = preparát musí být tenký odstranění uchýlených elektronů = clona mezi preparátem a objektivní čočkou zvětšování kontrastu preparátu = vnášení atomů těžkých kovů (Pb, U, W, Os, ), které mají větší náboj jádra a snáze působí elastický rozptyl.

11 Tlustý vzorek část elektronů se absorbuje (=teplo) část elektronů vyráží z povrchu jiné elektrony (=sekundární elektronzy) s malou energií. Z těch se rekonstruuje obraz = řádkovací = skenovací = rastrovací elektronový mikroskop = SEM.

12 Další důležité interakce = vznik rentgenových paprsků = analýza atomového složení preparátu; mikrosonda : buď délka vlny (spektrometr vlnově disperzní vždy jej jeden prvek od Be) nebo velikost energie (spektrometr energiově disperzní EDAX všechny prvky od Na)

13 TEM a optický mikroskop Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek.

14 Kde získat elektrony pro měření Elektronové dělo: funkce: vybavení elektronů, směr, rychlost žhavené wolframové vlákno tvaru V (základní typ) hrot z boritu lanthanu (LaB6) wolframový hrot (autoemisní katoda), nutnost aby elektrony vycházely z co nejmenší plochy fokusační elektroda = Wehneltův válec = (elektrostatická čočka) (stlačuje elektronový svazek do místa těsně před anodou) anoda: potenciální rozdíl mezi katodou a anodou kV (u biologických preparátů obvykle 80 kv). Vysokovoltová elektronová mikroskopie ( kV) = silné objekty, živé objekty

15 Jak ovládat svazek elektronů Zobrazovací systém: elektromagnetické čočky = prstence z velmi čistého, měkkého, železa (= co nejmenší zbytkový magnetismus), zasazené v cívkách napájených stejnosměrným proudem. Dráha elektronu odchylována po spirálovité trajektorii dané směrem magnetických siločar. Otvor v čočce: malé rozměry x přesnost. Nepřesnost: osový astigmatismus. Další zdroj astigmatismu = vrstva zuhelnatělých uhlovodíků v otvorech čoček a clon. Osový astigmatismus: hlavní omezení rozlišovací schopnosti. Korekce: vnější přídatné magnetické pole určeného směru = stigmátor.

16 Vlastnosti elm. čoček pracují pouze ve vakuu pouze spojky lehká fokusovatelnost = změna magnetické hodnoty čočky = změna intenzity proudu v cívce (stabilita proudu v cívce) tvořený obraz se otáčí kolem osy čočky

17 Vady elm. čoček chromatická = kolísání urychlovacího napětí a tím vlnové délky svazku (stabilita vysokého napětí) = změna rychlosti elektronu při průchodu preparátem (neelastický rozptyl) = nutnost tenkého preparátu (50-100nm) sférická = okraj čočky láme jinak než její střed. Řešení = zmenšení úhlové apertury čočky = clony =kovové (Mo, Pt, Au) s otvorem μm

18 Detekce obrazu pro TEM stínítko pokryté ZnS fotografická deska nebo elektronické zpracování obrazu pomocí snímače CCD a obrazovky (počítače)

19 Mikroskop TEM Celková sestava TEM: válec kolona, kde se odehrává tvorba obrazu. Jednotlivé části a ovládací mechanické prvky t. Rozvod vakua a systém ventilů. stůl s elektrickými ovládacími prvky pomocná zařízení: zdroj vysokého napětí, vakuové pumpy

20 Příprava vzorků preparát musí obsahovat drobné částice nebo může být řezem tkání, ale jeho celková tloušťka nesmí přesahovat 100 nm. (Síla preparátu je kompromis: tenký preparát = dobré rozlišení ale malý kontrast, silný preparát obráceně. preparát musí být dostatečně stabilní, aby odolával pobytu ve vakuu a bombardování elektronovým paprskem kontrast preparátu tj. propustnost pro elektrony musí být upravena, aby byla vyhovující plošná velikost preparátu je dána rozměrem (průměr 3mm) kovových (obvykle Cu) terčků s otvory ( síťky ), na které se objekty umisťují.

21 Druhy vzorků Totální (drobné částice a organismy), viry, makromolekuly např. DNA, buňěčné komponenty (dosažení kontrastu: stínování šikmo napařenou vrstvou kovu, negativní barvení ) Repliky (otisky povrchových struktur), dosažení kontrastu: stínování šikmo napařenou vrstvou kovu Ultratenké řezy, aplikace histologických technik na EM. (kontrast: vnášení atomů těžkých kovů Pb, U při histochemických reakcích, kde reakční produk je neprostupný pro elektrony)

22 Repliky Metody přípravy otisků patřily k nejvíce užívaným v začátcích elektronové mikroskopie. V poslední době je tato poněkud složitá metoda využívána vzácně, nejčastěji v kombinaci s metodou mrazového leptání. Otisky se dělí na jednostupňové a dvoustupňové, pozitivní a negativní (obr. 1) Jednostupňový pozitivní otisk se utvoří tak, že objekt se ve vakuu nejprve šikmo nastínuje kovem a pak se na něj kolmo napaří silnější krycí vrstva uhlíku. Replika se potom splaví nebo sejme pomocí plastické hmoty. Jednostupňový negativní otisk se připraví tak, že se na objekt kolmo napaří ve vakuu vrstva uhlíku a stínuje se až sejmutá replika. 1- pozitivní jednostupňový otisk, 2- Negativní jednostupňový otisk, 3- Kormunda Pozitivní nepravý jednostupňový otisk (na opačné straně stínovaný), 4Martin Negativní dvoustupňový otisk, 5- Pozitivní dvoustupňový otisk, A- objekt, B- stínovaná vrstva kovu, C- tenká uhlíková replika, D- silná primární replika plastické hmoty, E- silná podkladová vrstva plastické hmoty

23 Preparační technika elektronové mikroskopie totální preparáty: zvláště důležité pro molekulární biologii. Dva druhy preparace: negativní barvení : suspenze částic a roztok barviva (fosfowolframan K nebo Na, /NH4/2MoO4, UAC, 0,5 1%). Při zaschnutí se vytvoří film kontrastující látky kolem částic a částečně i ve strukturách částic-viry preparáty stínované: napaření těžkého kovu (Pt, Au apod ) = zvýrazňování makromolekul např. DNA repliky: otisky povrchů: dnes hlavně jako součást metody mrazového lámání a leptání freeze fracture a freeze-etching. Jinak použití v biologii jen výjimečné, nyní většinou nahrazeno ultratenké řezy tkáněmi: obdoba klasických histologických technik na mnohem jemnější úrovni. Přechod mezi světelnou a elektronovou mikroskopií = polosilné řezy ( tlusťáky ) Všem způsobům preparace je společné nanesení objektů na nosné terčky = síťky (obvykle z Cu) průměr 3mm. Rozměry ok nepřímo udává ME-SH obvykle mezi 100Mesh (otvory 200μm) a 400MESH (otvory 40μm). Objekty se obvykle montují na síťky pokryté tenkou vrstvou nosné folie, pouze řezy je možno montovat přímo.

24 FIB příprava vzorků pro TEM pomocí Ga iontového děla lze obrábět a sledovat přímo v SEM rizace/mikroobrabenifokusovanym-iontovymsvazkem

25 FIB příprava vzorků pro TEM rizace/mikroobrabenifokusovanym-iontovymsvazkem

26 3D rekonstrukce pomocí TEM W kontakt transistoru v 2D a 3D rekonstrukci vzorek je během měření naklápěn a pak sestaven model, v 3D zřetelné změny tloušťky 100 nm de/2804/analytik/tem/litera tur/tem_2006_aipsemiconductortomography_en.pdf

27 3D rekonstrukce - Plazmová polymerace s nanoinkluzemi TEM 0,5 x 0,5 μm n-hexane content 0% AFM 1 x 1 μm J. Matoušek at. all, Vacuum 84 (2010), IF 1%

28 High resolution TEM - HRTEM v současnosti až 0.8A (0.08 nm). pozorujeme difrakční obrazce, které jsou Fourierovou transformací periodického potenciálu tj. složitá teorie, získání obrázku vyžaduje zpětnou matematickou transformaci měřeného signálu Si proměnná tloušťka Ge /Si

29 Mikroskopy - SEM

30 Rozdíly

31 Princip Elektronový paprsek se vytváří stejně jako v TEM. Fokusuje se soustavou čoček do co nejmenší stopy (průměr 5-10nm), která dopadá na pozorovaný preparát. Pomocí vychylovacích cívek elektronový paprsek přejíždí po povrchu pozorovaného preparátu v řádcích. Dopadem primárního paprsku jsou z preparátu vyráženy sekundární elektrony. Ty jsou přitahovány k detektoru a dopadají na scintilátor s fotonásobičem. Elektrický signál z fotonásobiče je zesílen a určuje intenzitu elektronového paprsku na obrazovce. Primární paprsek po preparátu a paprsek obrazovky běží synchronně.

32 Interakce elektronů s povrchy Typická vzdálenost atomů v pevné látce 0.4 nm = 4 A

33 SE SE mají nízkou energii proto se musí urychlit předpětím cca 10 kv z bližších míst je jich více než z vzdálenějších proto topografický kontrast, každý bod 10 až 1000 elektronů. SE

34 BSE BSE závisí na středním atomovém čísle vzorku. Obraz v odražených elektronech je schopen odlišit oblasti s různým prvkovým složením. Např. uhlík bude tmavý. BSE

35 Zrno z FeOx prášku SE sekundární elektrony BSE zpětně odražené elektrony

36 Tenké vrstvy a povrchové struktury D = o, total gas flow 7 sccm

37 Často kombinace SE + BSE Překrystalizované vlákno žárovky

38 Biologické vzorky SE - Křídlo mouchy

39 Tkaniny a filtry, membrány

40 Volba urychlovacího napětí Používá se mnohem nižší urychlovací napětí než u TEM (SEM obvykle 20 kv, TEM obvykle 80kV). Důvod je, aby se sekundární elektrony uvolňovaly co možná blízko povrchu objektu.

41 Vzorky velikost objektů až několik cm objekt musí být dokonale vysušen a preparován tak, aby povrchové struktury byly co nejlépe zachovány povrch objektu musí být pokryt vodivou vrstvou, která je souvislá, věrně sleduje detaily povrchu a nemaskuje je vodivá vrstva na povrchu preparátu musí umožňovat co největší zisk vyzářených sekundárních elektronů (ne uhlík)

42 Mrazová fixace Je stejně jako při použití chemického způsobu přípravy preparátů prvním a velmi důležitým krokem přípravy. Většina živých organismů obsahuje více než 70 % vody nerovnoměrně rozdělené do membránami ohraničených oblastí. Chceme-li tedy biologický vzorek dobře mrazově zafixovat, musíme vycházet především z vlastností vody, které jej tvoří. Při zmrazování voda vykazuje řadu anomálií, kterými se odlišuje od ostatních látek a které celý proces znesnadňují: - její objem ve zmrazeném stavu je zhruba o 9 % větší než v kapalném stavu - její hustota není nejvyšší v bodě tuhnutí, ale v kapalném stavu při teplotě 277 K - má anomálně vysoký bod tání (273 K), bod varu (373 K) a kritickou teplotu (647 K) - má vysoké vypařovací teplo a dielektrickou konstantu, která přispívá k její roli univerzálního rozpouštědla v biochemických reakcích - je známa řada krystalických forem ledu Tyto anomálie jsou do značné míry způsobeny přítomností intermolekulárních vazeb vodíkových můstků a van der Waalsových sil. V praxi znamenají nebezpečí poškození Martin Kormunda se objemem nebo tvořícími se ultrastruktury v důsledku potrhání buněk zvětšujícím krystaly.

43 Typ ledu v závislosti na rychlosti chlazení Robards a Sleyter, 1985

44 Další časté vybavení SEM Pro určení prvkového složení: spektrometr vlnově disperzní nebo EDAX

45 Literatura Tescan JEOL Wikipedia

46 Příště Schůzka v 17:00 na KBI Za Válcovnou 1000/8