Přehled základních biotechnologických výrob ve farmacii

Transkript

1

2 Obsah přednášky 1) Dva základní strategické přístupy 2) Produkty klasických výrob 3) Enzymy, antibiotika, steroidy,ostatní 4) Biotransformace 5) Rekombinantní léčiva 6) Hormony, enzymy, cytokiny, protilátky 7) Neproteinové produkty 2

3 Přehled základních biotechnologických výrob ve farmacii Enzymy Polysacharidy Steroidy Antibiotika Antimykotika Vitamíny Alkaloidy Hormony Aminokyseliny Cytokininy

4 Dva přístupy Produkty získané klasickými technikami mikrobiální biotechnologie Produkty rekombinantních technologií

5 Nejčastější produkt = ENZYMY Využití enzymů ve farmacii příprava léčiv - antibiotika, steroidy, aminokyseliny léčiva - digestiva, léčba leukémie, rozpouštění krevních sraženin atd. diagnostické účely

6 Kultivace mikroorganismů Submersním aerobním postupem» suroviny: zdroj uhlíku sacharidy, polysacharidy» zdroj dusíku anorganické soli, amoniak;» přirozené substráty kukuřičné výluhy, rostlinné mouky, kvasničný extrakt» stopové prvky Exoenzymy, endoenzymy

7 Produkty klasické biotechnologie mikroorganismů

8 Příklady enzymů Proteázy trypsin, chymotrypsin, pepsin, chymosin papain, ficin, bromelain bakteriální proteázy (Bacillus) proteázy produkované plísněmi (Aspergillus) α-amylázy, β-amylázy Glukosidázy produkují bakterie (Bacillus) a plísně (Aspergillus)

9 Použití amyláz Medicína usnadnění trávení škrobu při dyspepsii omezení meteorismu před chirurgickým výkonem a v pooperačním období Potravinářství výroba piva, alkoholických nápojů, lihovin zpracování škrobu na glukózové a maltózové sirupy a krystalickou glukózu sirupy s vysokým obsahem fruktózy

10 Lipázy Katalyzují hydrolýzu triacylglycerolů Původ pankreas pšeničné klíčky Aspergillus niger, Rhizopus sp., kvasinky Použití součást digestiv potravinářský průmysl výroba sýrů

11 Penicilinacyláza Hydrolázy štěpící vazby jiné než C-N Mechanismus hydrolýza penicilinu na kyselinu 6-aminopenicilanovou Původ Escherichia coli, Neurospora crassa, Torula sp., Rhodotorulla sp. Použití výroba polosyntetických penicilinů

12 POLYSACHARIDY Dextran Původ Použití bakterie Leuconostoc mesenteroides náhražka krevní plazmy dextransacharáza n x sacharóza (anhydroglukóza)n + n x fruktóza

13 ANTIBIOTIKA Produkty buněk schopné v nízkých koncentracích inhibovat růst jiných buněk Nejčastější producenti G + bakterie rodu Streptomyces Příprava nových ATB modifikací známého ATB, tzv. mutační syntéza Mutace MO produkující ATB + vhodný prekurzor nové ATB

14 Penicilin Mikroorganismus Penicillium notatum inhibice stafylokoků Fleming 1928 izolace surového penicilinu Florey a Chain 1938 P. chrysogenum vyšší množství, submerzní kultivace Mechanismus účinku baktericidní inhibice syntézy buněčné stěny vazbou β-laktamu na enzymy vytvářející peptidoglykan

15 Penicilin G Penicilin G (benzylpenicilin) jádro penicilinů

16 Postup výroby penicilinu 1) Naočkování suspenze spor Penicillium chrysogenum do nutričně bohatého média 2) Kultivace 1 týden při teplotě 24 C 3) Převedení do inokulačního fermentoru 4) Aerobní kultivace 1 až 2 dny nárůst mycelia 5) Naočkování inokula do produkčního fermentoru - kultivace 7 dní živiny prekurzor zdroj C - roztok glukózy, melasa zdroj N - kukuřičné výluhy kyselina fenyloctová

17 Růstová křivka výroba penicilinu Nárůst mycelia Akumulace penicilinu primární metabolity ph = 6! primární i sekundární metabolity

18 Izolace penicilinu 1) Odstranění mikrobiálních buněk pomocí rotační vakuové filtrace 2) Extrakce penicilinu do organického rozpouštědla 3) Re-extrakce do vodné fáze 4) Purifikace opakovanou extrakcí organické rozpouštědlo voda 5) Přídavek draselných iontů krystalická draselná sůl penicilinu G 6) Izolace filtrací nebo centrifugací 7) Výsledný produkt se usuší

19 Deriváty penicilínu G 6-aminopenicilanová kyselina = výchozí produkt penicilinacylasa z E. coli kyselina 6-aminopenicilanová O H N O N S penicilin G C H 3 C H 3 C O O H N H 2 O N S C H 3 C H 3 C O O H + O O H kyselina fenyloctová O M e O M e O N H O N S methicilin C H 3 C H 3 C O O H N H 2 O N H O N S C H 3 C H 3 C O O H H O O C O N H O N S C H 3 C H 3 karbenicilin C O O H ampicilin

20 Další antibiotika I Cefalosporiny - Cephalosporium acremonium Tetracykliny - Streptomyces Aminoglykosidy (streptomycin) - Streptomyces griceus Makrolidy (erythromycin) - Streptomyces erythreus (Saccharopolyspora erythreus) Linkosamidy (linkomycin) - Streptomyces lincolnensis

21 Další antibiotika II Amfenikolová antibiotika (chloramfenikol) - Streptomyces venezuelae Polypeptidová a glykopeptidová - polymyxin B, Colistin, Bacitracin, Vancomycin - Bacillus Ansamycinová (rifampin) - semisyntetické odvozené od rifamycinu B - Streptomyces mediterranei

22 Postup výroby streptomycinu 1) Naočkování suspenze spor Streptomyces griseus do počátečního nutričně bohatého média, kultivace při 28 C 2) Nastartování růstu kultury a nárůst mycelia 3) Převedení do inokulačního fermentoru 4) Naočkování inokula do produkčního fermentoru, dokonalá aerace, 10 dní, výtěžek 1g/litr živiny zdroj C - roztok glukózy, NaCl zdroj N - sojová mouka

23 Antimykotika Griseofulvin Penicillium Nystatin Streptomyces noursei Amfotericin B Streptomyces nodosus C H 3 O O H O H O H H O O O H O H O H O H O C H 3 C H 3 H C O O H H O C H 3 O O H O N H 2

24 STEROIDY fyziologický účinek závisí na přesné poloze substituentů v základním skeletu chemická syntéza je velmi náročná Biotransformace steroidů 1) Kultivace mikroorganismu - nárůst biomasy 2) Přidání steroidu, následná biotransformace 3) Izolace do organického rozpouštědla 4) Purifikace chromatograficky a krystalizací

25 Příklady biotransformací I 11α-hydroxylace příprava 11-a-progesteronu Rhizopus nigricans, R. arrhizus, Aspergillus ochraceus 11β-hydroxylace příprava kortisolu Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana

26 Příklady biotransformací II 16a-hydroxylace příprava 16a-hydroxy-9a-fluoroprednisolonu (triamcinolon) Streptomyces roseochromogenes dehydrogenace mezi C1-C2 Bacillus lensus, Arthrobacter simplex výroba prednisonu, prednisolonu, triamcinolonu, 6-methylprednisolonu, dexamethasonu

27 Zdroje NÁMELOVÉ ALKALOIDY Claviceps purpurea (pěstování na žitě) Claviceps paspali (submerzní kultivace) Sklerocia paličkovice nachové na žitu Výtrusnice na sklerociu

28 VITAMÍNY esenciální živočišné nutriční faktory Výroba chemická syntéza izolace z přírodního materiálu mikrobiální biosyntéza biotransformace

29 Vitamíny vyráběné biotechnologicky riboflavin (B 2 ) kobalamin (B 12 ) kyselina askorbová (C) ergosterol (D 2, D 3 ) provitamín A provitamín D

30 Chemická syntéza AMINOKYSELINY Izolace z přírodních zdrojů Enzymové přeměny - kultivace MO obsahujících příslušný enzym - separace buněk - k buňkám se přidá substrát určený pro enzymovou přeměnu Biosynteticky - kultivace mikroorganismu - izolace AMK z kultury

31 Producenti aminokyselin Bakterie přirozeně se vyskytující - Corynebacterium - Brevibacterium - Micrococcus Rekombinantní kmeny - Escherichia coli - Serratia marcescens

32 Rekombinantní léčiva

33 Typy rekombinantních léčiv lídrem jsou USA (Food and Drug Administration) desítky léčiv, všechny na bázi proteinů hormony enzymy hematopoetické růstové a koagulační faktory cytokiny a interferony protilátky a jejich deriváty vakcíny další produkty

34 Rekombinantní hormony alterace sekvence aminokyselin změny farmakokinetiky rozdílné biologické účinky širší léčebné postupy

35 Rekombinantní hormony byly první r Goeddel a kol. - produkce inzulínu a somatotropinu pomocí Escherichia coli r inzulín - první klinicky použitý rekombinantní hormon (USA) r somatotropin

36 Příprava rekombinantních hormonů Bakterie (Escherichia coli) Kvasinky (Saccharomyces cerevisiae) Savčí buňky

37 Lispro (HUMALOG) Analoga inzulínu obrácené pořadí lysinu a prolinu v pozici B28 a B29 produkce v Escherichia coli krátce působící inzulín Aspart (NOVORAPID) substituce prolinu kyselinou asparagovou v pozici B28 Saccharomyces cerevisiae krátce působící inzulín

38 Glargin (LANTUS) adice 2 argininů k C-konci řetězce B a náhrada asparaginu glycinem na A21 Escherichia coli prodloužený účinek Další typy inzulínu Detemir odstranění threoninu na B30 a acylace (kys. myristová) lysinu na pozici B29 prodloužený účinek

39 Výhody oproti lidským krátkodobě působícím inzulínům rychlejší a pravidelnější vstřebávání z podkoží nejlépe napodobují prandiální sekreci léčba nemocných od 3 let kratší biologický účinek nižší riziko hypoglykémie

40 Další hormony vyráběné biotechnologicky Glukagon (E. coli, S. cerevisiae) Somatotropin (E. coli) Folitropin FSH (ovariální buňky čínského křečka)

41 Glukagon Polypeptidový hormon (29 AMK) Účinky glykogenolytické hyperglykemizující relaxace hladké svaloviny GIT Příprava Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Indikace hypoglykémie radiologická vyšetření inhibice pohybu GIT

42 Somatotropin Druhově specifický polypeptid (191 AMK) Účinky stimulace růstu zvyšuje proteosyntézu snižuje proteokatabolismus Indikace poruchy růstu Příprava Escherichia coli (od konce 80. let)

43 Folitropin folikulostimulační hormon (FSH) Dvě podjednotky alfa (92 AMK), beta (111 AMK) Produkce ovariální buňky čínského křečka Indikace anovulační cykly amenorea poruchy spermatogeneze urofollitropin

44 Rekombinantní enzymy Příprava léčiv antibiotika, steroidy, aminokyseliny Léčiva digestiva (rozpouštění krevních sraženin, léčba leukémie) Diagnostické účely Taq polymeráza

45 Hematopoetické a růstové faktory Epoetin α (165 AK, glykosylovaný) Účinky stimulace tvorby krevních buněk Příprava savčí buňky Indikace léčba anémie

46 Cytokiny a interferony Účinky imunomodulační účinky Příprava Escherichia coli Interleukin IL-2 Indikace terapie nádorových onemocnění Interferony α, β, γ

47 Protilátky první příklad v roce 1989 myší imunoglobulin IgG1 1. linie 2. linie gen pro těžký řetězec γ F1 gen pro lehký řetězec κ oba řetězce v množství až 1,3% celkového proteinu v listech

48 Příklad úspěšné rostlinné protilátky sekreční siga z Nicotiana tabacum proti zánětu zubů Streptococcus mutans rozpoznává adhesin I/II, kterým se S. mutans váže na povrch buněk prevence kolonizace 4 výchozí transgenní linie, trojí křížení

49 Hepatitida B Rekombinantní vakcíny Obchodní název: Recombivax Produkuje: Saccharomyces cerevisiae Výrobce: Merck, i další výrobci Lidský papillomavirus (6, 11, 16, 18) Obchodní název: Gardasil Produkuje: Saccharomyces cerevisiae Výrobce: Merck

50 První použitelný rostlinný produkt Květen 2012 Obchodní název: Elelyso Enzym: taligluceráza alfa Produkuje: GM kultura mrkve Výrobce: Protalix BioTherapeutics, Izrael Pfizer, USA Schválen FDA pro léčbu Gaucherovy choroby 51

51 Neproteinové produkty

52 Fomivirsen (Vitravene) Fomivirsen Obchodní název: Vitravene Produkuje: umělá syntéza Výrobce: Isis Pharmaceuticals, Inc. antivirové léčivo určené k léčbě zánětu sítnice vyvolanému infekcí CMV u imunohandicapovaných pacientů (např. pacienti s AIDS), aplikuje se intravitreálně

53 Fomivirsen licencován FDA v srpnu mer 5 - gcg TTT gct CTT CTT CTT gcg 3 nukleotidy spojené fosforothionátovou vazbou (rezistence k nukleázám) blokuje translaci virové mrna

54 Pegaptanib (Macugen) Obchodní název: Macugen Produkuje: umělá syntéza Pegaptanib Výrobce: EyeTech Pharmaceuticals (OSI Pharmaceuticals), Pfizer (mimo USA) anti-angiogenetikum pro léčbu vlhké formy věkem podmíněné makulární degenerace (VPMD) licencován v roce 2000, FDA schválen v roce 2004

55 Pegaptanib pegylovaný anti-vegf aptamer, ssdna, která se specificky váže k VEGF 165 protein, který hraje rozhodující úlohu v angiogeneze a zvyšuje permeabilitu krevních vlásečnic (tyto dva patologické procesy jsou zodpovědné za ztrátu zraku při VPMD) aplikuje se intravitreálně Podrobnosti najdete na stránkách Evropské lékové agentury

56 Budoucnost? Transgenní rostliny Transgenní organismy DNA vakcíny Interferující RNAi Genová terapie Problematika GMO nebo žhavá současnost?

57 Shrnutí aktuálních technik 1) Výroba a testování léčiv - bakterie a kvasinky 2) Produkce protilátek a šlechtění rostlin - buněčné a tkáňové kultury, hybridomy 3) Orgány pro transplantace - celé organismy 4) Šlechtění hospodářských zvířat, záchrana ohrožených druhů - celé organismy 5) Genové terapie (nedědičná změna genetického kódu člověka) viry 6) Léčba dědičných chorob, řešení pro bezdětná manželství klonování člověka

58 Shrnutí přednášky 1) Dva základní strategické přístupy 2) Produkty klasických výrob 3) Enzymy, antibiotika, steroidy,ostatní 4) Biotransformace 5) Rekombinantní léčiva 6) Hormony, enzymy, cytokiny, protilátky 7) Neproteinové produkty 59