Co lze u rostlin manipulovat

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Co lze u rostlin manipulovat"

Marcel Horák
před 9 lety
Počet zobrazení:

2 Obsah přednášky 1) Co lze u rostlin manipulovat 2) Genový knock-out, knock-down, knock-in 3) Klonování sekundárních metabolitů 4) Metody identifikace transgenních rostlin 5) Molecular pharming 6) Protilátky, vakcíny 7) Další produkty GM rostlin

metabolitů 4) Metody identifikace transgenních rostlin 5)

3 Co lze u rostlin manipulovat proteiny strukturní (kolagen) strukturní geny hormony, cytokiny strukturní geny sekundární metabolity geny pro enzymy intenzitu exprese regulační geny

4 Klonování sekundárních metabolitů E1 E2 A B C E3 E4 D1 D2

5 Zvýšení produkce metabolitu D2 E1 E2 A B C E3 E4 D1 D2 vyblokování enzymu E3 E3 = genový knock-out

6 Genový knock-out Odstranění funkce genu výměna genu za jeho nefunkční kopii rekombinací inzerce, delece, záměna inzerční mutageneze mutace vedoucí k nesmyslnému kodonu mutace měnící smysl kodonu, která se projeví ve změně funkce enzymu zablokování funkce genu RNA interferencí

mutageneze mutace vedoucí k nesmyslnému kodonu mutace měnící smysl

7 Biosyntéza isoflavonoidů naringenin chalkoisomerasa CHALKONY hydroxyisoflavonsyntasa KNOCK-OUT isoflavony ZVÝŠENÁ PRODUKCE AURONY FLAVONY FLAVONOLY

8 Vytvoření nového produktu Genový knock-in E1 E2 A B C E3 D1 naklonujeme gen pro enzym E5 E4 D2 E5 E chceme přidat funkční skupinu k metabolitu D2 vytvoříme nový sekundární metabolit E

9 Akumulace flavonolů v rajčatech V dužině plodů rajčat je exprese genů syntézy flavonoidů (pal, chs, chi, f3h, fls) velmi nízká 1. Ektopická exprese vhodných regulačních faktorů 2. Exprese 2-hydroxyisoflavonsyntázy (HIS) 3. Exprese HIS společně s chalkonisomerázou 4. Kombinovaná exprese HIS, genů nebo transkripčních faktorů počátečních fází syntézy a potlačení genů pro konkurenční syntézy

Exprese 2-hydroxyisoflavonsyntázy (HIS) 3. Exprese HIS společně s chalkonisomerázou 4.

10 Akumulace flavonolů v rajčatech Cl Lc Cl, Lc = transkripční faktory CHI = chalkonisomerasa CHS = chalkonsyntasa FLS = flavonolsyntasa Cl, Lc CHI CHS FLS Cl, Lc CHI CH, CHS FLS

11 Zvýšení hladiny proanthokyanidinů Transformace transkripčním faktorem Lc z kukuřice Lc Lc transgenní vojtěška (Madicago sativa) Zvýšená hladiny proanthokyanidů zlepšuje zažívání přežvýkavců píce s vylepšenými vlastnostmi Ovlivněno podmínkami prostředí světelný stres, nízké teploty

hladiny proanthokyanidů zlepšuje zažívání přežvýkavců píce s

12 Změna barvy květů

13 Flavonoidy Obecná struktura flavonoidů A O C B Anthokyany, Flavonoly, Flavony, Katechiny a Flavanoly

14 Anthokyany O OH

15 Anthokyany R R 2 HO O R R 4 OH

16 Změna barvy květů Hydroxylace B kruhu anthokyanů R 1 OH OH HO O + R 2 OH OH OH Flavanon Flavonoid Gen pro F3 5 H 3-3, hydroxyláza + - hydroxyláza specifický cytochrom cihlově (F3 5 H) červené b5 modrá až oranžové barva modré květů a fialové karafiáty, růže

hydroxyláza + - hydroxyláza specifický cytochrom cihlově (F3 5

17 Flavonoly O OH O

18 Flavonoly Quercetin, R 1 = H, R 2 = OH OH OH HO O RH 1 R 2 OH OH O Quercetin, Quercitrin, Myricetin, Rutin

19 Flavanoly a Katechiny Catechin, R 1 = OH, R 2 = H OH HO O OH R 1 OH OH RH 2 monomerní - Catechin, Epikatechin oligomerní - Procyanidin

20 Modrá růže? Gen pro F3 5 H (flavonoid hydroxyláza) + specifický cytochrom b5 změna barvy červené v tmavě fialovou? Zatím se to nikomu nepovedlo, vakuoly růží jsou kyselé Firma Florigene to zkouší 20 let

21 Modré růže přesto vykvetly! V roce 2004 japonská pivovarnická firma Suntory Gen pro delfinidin Vývoj stál 28 milionů USD, růží se prodá za 10 miliard

22 Aurony žlutá barva květů 1) Společná exprese dvou genů - auresidinsyntasa - chalkon 4 -Oglukosyltransferasa O O CH R OH 2) Potlačení biosyntézy flavonoidů

23 Bílá barva květů Potlačení genů pro chalkonsyntázu flavonoidy se vůbec nevyskytují bílé, bezbarvé květy Absence flavonoidů ovšem znamená zvýšenou citlivost rostliny na fytopatogeny

25 Identifikace transgenních rostlin A. Molekulární detekce transgenu B. Exprese transgenu C. Dědičnost transgenu

26 Molekulární detekce transgenu 1) DNA blot Southern blot analýza sondou připravenou z transgenu 2) Polymerázová řetězová reakce sekvence specifické pro transgen např. rekombinantní brambory v praktiku

27 Southern Blot transgenního čiroku cdna sondou genu bar

28 Exprese transgenu 1) Stanovení aktivity reportérového genu 2) Stanovení množství přepisované RNA nebo hladiny proteinu metodou northern nebo western blot 3) Test enzymové aktivity

29 Stresem regulovaná exprese chimérického genu na bázi GFP Control Cold Salt Dark ABA

30 Dědičnost transgenu Funkční inzerce v jednotlivém lokusu je fenotypicky ekvivalentní dominantní alele, je tedy dědičná podle Mendelových pravidel I. Restrikční fragmenty - DNA polymorfismy transgenu II. Fenotyp viditelný v potomstvu

32 Molecular farming aplikace technik molekulární biologie na syntézu komerčních produktů u rostlin zvýšená produkce látek pro rostlinu přirozených proteiny karbohydráty a rostlinné oleje sekundární metabolity tvorba látek pro rostlinu úplně nových

33 Proteiny použitelné v medicíně protilátky vakcíny ostatní významné proteiny

34 Příprava rostlinných protilátek Základní strategie přípravy protilátek spočívá v konstrukci producentů jednotlivých podjednotek v různých liniích rostlin jejich následném křížení a vyhledání producentů celých imunoglobulinů

35 Protilátky produkované rostlinami první příklad v roce 1989 myší imunoglobulin IgG1 1. linie 2. linie gen pro těžký řetězec γ F1 gen pro lehký řetězec κ oba řetězce v množství až 1,3% celkového proteinu v listech

36 Protilátky produkované rostlinami imunoglobuliny nesly nativní signální sekvenci ta je nasměrovala do ER, což bylo nezbytné pro efektivní sbalení proteinu a jeho stabilitu podmínky v ER umožnily vytvoření disulfidických můstků na procesu sbalování se podílely i chaperony podíl imunoglobulinu v F1 generaci byl vyšší než podíl jednotlivých řetězců v rodičovských liniích

37 Využití rostlinných protilátek sekreční siga z Nicotiana tabacum proti zánětu zubů Streptococcus mutans rozpoznává adhesin I/II, kterým se S. mutans váže na povrch buněk prevence kolonizace 4 výchozí transgenní linie, trojí křížení

38 scfv proteiny V L a V H části imunoglobulinu spojené vhodným linkerem

39 scfv proteiny připravují se s využitím vektoru na bázi viru tabákové mozaiky (tobamovirus TMV) exprese scfv je řízena virovým promotorem kódující sekvence protilátky je umístěna po směru transkripce za vedoucí sekvencí pro α-amylázu z rýže zacílení proteinu do extracelulárních prostorů v rostlině

40 Využití scfv proteinů k léčbě lymfomů B-buněk vznikají individuálně specifické antigeny velmi rychlé vytvoření specifických protilátek za 6-8 týdnů v roce 2003 testován na 16 pacientech

41 Příklady rostlinných protilátek Aplikace Rostlina Protilátka Sig. sekvence Zubní zánět Tabák siga myší IgG Zubní zánět Tabák IgG myší IgG Nádor tlustého střeva Tabák IgG myší IgG Herpes simplex Sója IgG Lymfom Tabák scfv extensin z tabáku α-amyláza z rýže Embryonální karcinom Obilniny scfv myší IgG

42 Vakcíny produkované rostlinami snaha produkovat jedlé vakcíny levná prevence střevních chorob v rozvojových zemích využití snadno dostupných zdrojů původně tabák, přechod na rajčata, banány a obiloviny problémy s dávkováním a prostupováním trávicím traktem (rozklad proteinů v žaludku)

43 Příklady rostlinných vakcín Původce Rec protein Rostlina Množství Vibrio cholerae podjednotky CtoxA a B Tabák 0,001% SLP Hepatitida B povrchový protein Brambory 0,3% TSP Virus vztekliny glykoprotein Rajčata 1% TSP Slintavka a kulhavka virový epitop VP1 Vojtěška/ Arabidopsis N/A Prasečí koronavirus virový glykoprotein Tabák/kukuřice 0,2% TSP Psí parvovirus peptid z kapsidu VP2 Arabidopsis 3% SLP TSP = total soluble protein, SLP = soluble lipoprotein

44 Další produkty GMO rostlin Glukocerebrosidasa Lidský sérový albumin Hormony Cytokiny Strukturní proteiny

45 Glukocerebrosidasa Gaucherova choroba dědičné onemocnění při kterém se cerebrosidy akumulují v lysozymech v důsledku deficience glukocerebrosidasy Gaucherova choroba vede k otokům sleziny a jater a vážným poškozením kostí, může být extrémně vysilující a bolestivá Cerebrosidy se purifikují z lidských placent (spotřeba tun placent na roční léčbu jednoho pacienta) Levnější je produkce v kulturách savčích buněk a předpokládá se, že rostlinná produkce výrobu ještě zlevní

46 První použitelný rostlinný produkt Květen 2012 Obchodní název: Elelyso Enzym: taligluceráza alfa Produkuje: GM kultura mrkve Výrobce: Protalix BioTherapeutics, Izrael Pfizer, USA Schválen FDA pro léčbu Gaucherovy choroby 46

47 Lidský sérový albumin léčba popálenin, cirhózy, aj. exprese v tabáku a bramborách pod kontrolou promotoru 35S dvě formy s různými signálními sekvencemi lidská, nesprávně sbalený extracelulární protein PR-S z tabáku, sbalený správně

48 Další příklady biofarmaceutik - I Rec. protein Původ Rostlina Aplikace protein C člověk tabák antikoagulant hirudin pijavice canola antikoagulant somatotropin člověk tabák β-interferon člověk rýže/tuřín/tabák růstový hormon hepatitida B a C hemoglobiny člověk tabák krevní náhrady kolagen člověk tabák kolagen

49 Další příklady biofarmaceutik - II Rec. protein Původ Rostlina Aplikace α1-antitrypsin člověk rýže cystická fibróza aprotinin (inhibitor trypsinu) člověk kukuřice transplantace laktoferrin člověk brambory antimikrobiální účinky ACE člověk tabák/rajčata hypertenze enkefalin člověk Arabidopsis opiát trichosanthin-α Trichosanthes kirilowii Tabák HIV terapie nádory

50 Kde se dozvím víc?

51 Shrnutí přednášky 1) Co lze u rostlin manipulovat 2) Genový knock-out, knock-down, knock-in 3) Klonování sekundárních metabolitů 4) Metody identifikace transgenních rostlin 5) Molecular pharming 6) Protilátky, vakcíny 7) Další produkty GM rostlin

Podobné dokumenty

doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.

doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Konference Klonování a geneticky modifikované organismy Parlament České republiky, Poslanecká sněmovna 7. května 2015, Praha Výroba léků rekombinantních léčiv Výroba diagnostických