CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2010

Transkript

1 CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2010 Výsledky přehlídek a sborník přednášek konference Mléko a sýry Praha leden 2010

2 Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah příspěvků odpovídají autoři. Jiří Štětina, Ladislav Čurda ISBN

3 Celostátní přehlídky sýrů OBSAH Výsledky 13. ročníku Celostátních přehlídek sýrů Čurda Ladislav, Štětina Jiří Výroba syrárskych špecialít na Slovensku Keresteš Ján, Herian Karol Využití senzorické analýzy při hodnocení mléčných výrobků Panovská Zdeňka Přednášky konference Mléko a sýry Co nového v mikrobiologii sýrů. Plocková Milada, Horáčková Šárka Urychlení zrání sýra Cheddar pomocí přídavku enzymatického preparátu. Abrlová Magdaléna, Bavard Alice, Šviráková Eva, Plocková Milada, Kilcawley Kieran Možnosti náhrady tradičních tavicích solí při výrobě tavených sýrů. Černíková Michaela, Hladká Kristýna, Buňka František Technologie výroby syrovátkových nápojů. Tůma Štěpán, Běláková Markéta, Plocková Milada Emulgační vlastnosti syrovátkových bílkovin. Kováčová Renáta, Diblíková Lenka a Štětina Jiří Izolace β-laktoglobulinu pomocí chitosanu. Diblíková Lenka, Čurda Ladislav Vliv hydrolyzátu syrovátkových bílkovin na texturní vlastnosti syrovátkových dezertů. Mihulová Miroslava, Šilhavá Jaroslava, Štětina Jiří Vplyv vnútorných faktorov prostredia na vybranú hygienicky nežiaducu mikroflóru. Medveďová Alžbeta, Valík Ľubomír, Studeničová Adriana, Hybenová Eva Charakterizácia mikroflóry slovenskej bryndze kultivačnými a nekultivačnými metódami. Chebeňová Viera, Kuchta Tomáš, Brežná Barbara, Pangallo Domenico Antiklostridiální aktivita bakterií mléčného kvašení v screeningovém a modelovém pokusu. Němečková Irena, Rohacká Hana, Tůma Štěpán, Blahušová Jana, Solichová Kateřina, Cicvárek Jiří, Roubal Petr, Plocková Milada Aktivita Lactobacillus rhamnosus študovaná v modelových polotvrdých syroch. Kontová Marcela, Drončovský Maroš, Slottová Anna, Greifová Mária, Greif Gabriel, Kološta Miroslav, Tomáška Martin Štúdium antimikrobiálnych vlastnosti laktobacilov izolovaných zo surového mlieka. Greifová Mária, Greif Gabriel, Krajčová Eva, Smetanková Jana, Kontová Marcela Produkcia organických kyselín a biogénnych amínov baktériami NSLAB izolovanými z bryndze. Greif Gabriel, Greifová Mária, Sopčaková Zuzana, Karovičová Jolana, Tomaška Martin Distribuce biogenních aminů během zrání přírodních sýrů eidamského typu a identifikace jejich původců. Buňková Leona, Buňka František, Mantlová Gabriela, Čablová Andrea, Sedláček Ivo, Švec Pavel, Pachlová Vendula, Kráčmar Stanislav

4 Analýza množstva probiotických mikroorganizmov v mliečnych nápojoch. Koreňová Janka Sledovanie počtov vybraných probiotických kultúr v syroch holandského typu počas zrenia. Lovayová Viera, Burdová Oľga, Dudriková Eva, Guba Peter, Nemcová Radomíra, Rimárová Kvetoslava Růst bakterií ze stolice kojenců na komerčně dostupných prebioticích. Bunešová Věra, Ročková Šárka, Rada Vojtěch, Vlková Eva Faktory ovlivňující růst bifidobakterií v mateřském mléce. Ročková Šárka, Bunešová Věra, Rada Vojtěch, Nevoral Jiří, Vlková Eva, Maršík Petr, Sklenář Jan Plakátová sdělení: Sledování změny obsahu laktózy během fermentace syrovátkových nápojů. Legarová Veronika, Kouřimská Lenka, Dvořáková Blanka, Gabrielová Alena Analýza rozdílů mezi vybranými technologickými ukazateli kvality mléka u holštýnských krav v konvenčním a ekologickém chovu. Sojková Kamila, Hanuš Oto Vliv hodnoty teplotně-vlhkostního indexu (THI) ve stáji na složení a technologické vlastnosti bazénových vzorků mléka. Falta Daniel, Skýpala Martin, Chládek Gustav Posouzení vlivu vybraných technologických parametrů na syřitelnost kravského mléka. Skýpala Martin, Přibyla Lubomír, Falta Daniel, Chládek Gustav Vliv stádia laktace a skladování na syřitelnost kozího mléka. Šustová Květoslava, Konečná Hana, Krupková Daniela, Ferencová Jana Efektívne využitie krmív na výrobu mlieka ako suroviny pre produkciu kvalitných syrov. Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína, Sudzinová Janka Nové trendy v detekcii falšovania mlieka a syrov. Zeleňáková Lucia, Golian Jozef, Zajác Peter Porovnanie vybranych metod stanovenia alkalickej fosfatázy v mlieku. Golian Jozef, Chovanec Martin, Zajác Peter, Zeleňákova Lucia, Belej Ľubomír Stanovení methylesterů mastných kyselin v mléce. Štoudková Hana, Dračková Michaela, Borkovcová Ivana, Haluzíková Tereza, Pospíšil Jan, Vorlová Lenka Obsahy selenu a jódu v ovčím mléce. Rozenská Lenka, Hejtmánková Alena, Miholová Daniela, Kolihová Dana, Hrdličková Kateřina. 176 Kontrola jakosti másla pomocí NIR spektroskopie. Lužová Táňa, Šustová Květoslava, Králíková Marcela, Hrnčířová Kristýna Spektrofotometrické hodnocení barvy másla a tuků. Jůzl Miroslav, Kozelková Monika, Nováková Lucie, Šustová Květoslava Změny dusíkatých látek v přírodních sýrech v závislosti na podmínkách zrání a skladování. Pachlová Vendula, Buňka František, Buňková Leona, Weiserová Eva, Hladká Kristýna, Kráčmar Stanislav

5 Mlieko ako stabilný zdroj minerálnych prvkov pre tvorbu kostí. Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Hodnocení sladké chuti v mléčných výrobcích. Čmejlová Kateřina, Panovská Zdeňka, Váchová Alena, Řeřichová Jana Vnímání kovové chuti v mléku. Řeřichová Jana, Panovská Zdeňka, Váchová Alena, Čmejlová Kateřina Porovnání hlavních složek mléka z konvenčního a ekologického zemědělství. Kouřimská Lenka, Legarová Veronika, Poděbradská Jana, Vejvodová Zuzana, Hering Pavel Optimalizace vsádkové hydrolýzy laktosy v různých substrátech. Pocedičová Klára, Čurda Ladislav, Diblíková Lenka Hydrolýza syrovátkových bílkovin pepsinem. Diblíková Lenka, Čurda Ladislav, Pocedičová Klára Nekultivačné metódy štúdia mikroflóry potravinárskych výrobkov. Ženišová Katarína, Chebeňová Viera, Brežná Barbara, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico Mikroflóra syrového kozího mléka změny v počtech významných skupin mikroorganismů. Kalhotka Libor, Šustová Květoslava, Kvasničková Blanka, Lužová Táňa, Šárka Havlíková, Záhora Jaroslav Štúdium účinku faktorov prostredia na technologicky nežiaducu mikroflóru. Liptáková Denisa, Medveďová Alžbeta, Píšová Zuzana, Valík Ľubomír, Hybenová Eva Antibiotická rezistencia enterokokov izolovaných z rôznych zdrojov v prvovýrobe mlieka. Čanigová Margita, Krebs-Artimová Anna, Kročko Miroslav, Ducková Viera Druhové zastoupení a rezistence enterokoků izolovaných ze syrového a pasterovaného ovčího mléka. Cupáková Šárka, Dušková Marta, Janštová Bohumíra, Necidová Lenka, Karpíšková Renáta Sledování fyziologických a biochemických charakteristik Listeria monocytogenes in vitro Pechačová Marta, Němečková Irena, Kunová Gabriela, Roubal Petr, Peroutková Jitka Prežívanie vybraných probiotických mikroorganizmov v jogurtoch počas ich skladovania v priebehu ročných období. Lovayová Viera, Burdová Oľga Niektoré metódy selektívneho stanovenia probiotických kultúr mliečnych baktérií. Urdová Katarína, Koreňová Janka Analýza mléčných výrobků slovinského trhu na kvantitativní zastoupení probiotických bakterií rodu bifidobakterium. Burdychová Radka, Šulcerová Hana, Bogovič-Matijašić Bojana, Obermajer Tanja, Rogelj Irena 260 Použití gramova barvení pro detekci autolýzy Lactobacillus helveticus. Ondráčková Iva, Solichová Kateřina, Fiala Jaromír a Milada Plocková Výběr vysoko-autolytických kmenů Lactobacillus helveticus pomocí detekce genů kodujících peptidoglykan hydrolasy. Ondráčková Iva, Valence-Bertel Florence, Plocková Milada a Sylvie Lortal Vliv laktokoků na perzistentní kmeny listerií. Složilová Ivana, Šviráková Eva, Tichovský Petr, Plocková Milada Vliv biochemického potenciálu laktokoků při redukci růstu listerií. Šviráková Eva, Složilová Ivana, Tichovský Petr, Solichová Kateřina, Plocková Milada

6 Nežiaduce mikroorganizmy v syroch holadského typu s obsahom probiotických kultúr počas zretia Poľáková Lucia, Dudriková Eva, Lovayová Viera Antibakteriální a antioxidační aktivita esterů fenolických kyselin. Merkl Roman, Hrádková Iveta, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír Rejstřík autorů

7 CONTENS Results of 13 th National Cheese Competition Čurda Ladislav, Štětina Jiří The production of cheese specialities in Slovakia Keresteš Ján, Herian Karol Using sensory analysis for evaluation of dairy products Panovská Zdeňka What s new in cheese microbiology Plocková Milada, Horáčková Šárka Acceleration of Cheddar cheese ripening using enzymatic preparation addition Abrlová Magdaléna, Bavard Alice, Šviráková Eva, Plocková Milada, Kilcawley Kieran Possibility of substition of traditional emulsifying salts during processed cheese production Černíková Michaela, Hladká Kristýna, Buňka František Technology of whey drink production Tůma Štěpán, Běláková Markéta, Plocková Milada Emulsifying properties of whey proteins Kováčová Renáta, Diblíková Lenka a Štětina Jiří β-lactoglobulin isolation by chitosan Diblíková Lenka, Čurda Ladislav Influence of whey protein hydrolysates on the texture properties of whey desserts Mihulová Miroslava, Šilhavá Jaroslava, Štětina Jiří The effect of intrinsic factors on selected undesirable hygienic microflora Medveďová Alžbeta, Valík Ľubomír, Studeničová Adriana, Hybenová Eva Characterization of microflora of traditional Slovakian bryndza cheese by culture and non-culture methods Chebeňová Viera, Kuchta Tomáš, Brežná Barbara, Pangallo Domenico Anticlostridial activity of lactic acid bacteria in screening and model experiment Němečková Irena, Rohacká Hana, Tůma Štěpán, Blahušová Jana, Solichová Kateřina, Cicvárek Jiří, Roubal Petr, Plocková Milada Activity of Lactobacillus rhamnosus studied in model semi-hard cheeses Kontová Marcela, Drončovský Maroš, Slottová Anna, Greifová Mária, Greif Gabriel, Kološta Miroslav, Tomáška Martin Study of antimicrobial properties of lactobacilly isolated from raw milk Greifová Mária, Greif Gabriel, Krajčová Eva, Smetanková Jana, Kontová Marcela Production of organic acids and biogenic amines by bacteria (NSLAB) isolated from sheep cheese (bryndza) Greif Gabriel, Greifová Mária, Sopčaková Zuzana, Karovičová Jolana, Tomaška Martin Distribution of biogenic amines during the ripening of Edam-cheese and identification of their sources Buňková Leona, Buňka František, Mantlová Gabriela, Čablová Andrea, Sedláček Ivo, Švec Pavel, Pachlová Vendula, Kráčmar Stanislav Enumeration of probiotics bacteria in fermented dairy drinks Koreňová Janka

8 Monitoring selected of probiotic cultures in the Dutch-type cheeses during ripening Lovayová Viera, Burdová Oľga, Dudriková Eva, Guba Peter, Nemcová Radomíra, Rimárová Kvetoslava Growth of infant faecal bifidobacteria on prebiotic Bunešová Věra, Ročková Šárka, Rada Vojtěch, Vlková Eva Factors affecting the growth of bifidobacteria in human milk Ročková Šárka, Bunešová Věra, Rada Vojtěch, Nevoral Jiří, Vlková Eva, Maršík Petr, Sklenář Jan Posters: Monitoring of fermentation process of cheese whey and mixtures of cheese whey and milk Legarová Veronika, Kouřimská Lenka, Dvořáková Blanka, Gabrielová Alena The analysis of the differences between the selected technological parameters of the milk quality in Holstein cattle in the conventional and the ecological system of the breeding Sojková Kamila, Hanuš Oto The effect of stable temperature-humidity index (THI) on milk content and technological properties in bulk tank milk samples Falta Daniel, Skýpala Martin, Chládek Gustav The effect of chosen milk technological parameters on the rennet coagualtion time of cow milk Skýpala Martin, Přibyla Lubomír, Falta Daniel, Chládek Gustav The effect of lactation and storage period for renneting of goat milk Šustová Květoslava, Konečná Hana, Krupková Daniela, Ferencová Jana Effective utilisation of food for production of milk as a raw material for quality cheese production Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína, Sudzinová Janka New trends in detection of milk and cheese adulteration Zeleňáková Lucia, Golian Jozef, Zajác Peter Comparison of selected methods determination of alcaline phosphtase in milk Golian Jozef, Chovanec Martin, Zajác Peter, Zeleňákova Lucia, Belej Ľubomír Determination of fatty acids methyl esters in milk Štoudková Hana, Dračková Michaela, Borkovcová Ivana, Haluzíková Tereza, Pospíšil Jan, Vorlová Lenka Contents of selenium and iodine in sheep milk Rozenská Lenka, Hejtmánková Alena, Miholová Daniela, Kolihová Dana, Hrdličková Kateřina. 176 The butter quality control by using of NIR spectroscopy Lužová Táňa, Šustová Květoslava, Králíková Marcela, Hrnčířová Kristýna Spectroscopy assessment butter and fat colour Jůzl Miroslav, Kozelková Monika, Nováková Lucie, Šustová Květoslava Changes of nitrogenous substances in nature cheese depending on ripening and storage condition Pachlová Vendula, Buňka František, Buňková Leona, Weiserová Eva, Hladká Kristýna, Kráčmar Stanislav

9 The milk as a stable source of minerals for building of bones Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Evaluation of sweet taste in milk products Čmejlová Kateřina, Panovská Zdeňka, Váchová Alena, Řeřichová Jana Perception of metallic taste in milk Řeřichová Jana, Panovská Zdeňka, Váchová Alena, Čmejlová Kateřina Comparison of the main milk components from conventional and organic farming Kouřimská Lenka, Legarová Veronika, Poděbradská Jana, Vejvodová Zuzana, Hering Pavel Optimization of lactose hydrolysis in different substrates in batch process Pocedičová Klára, Čurda Ladislav, Diblíková Lenka Whey protein hydrolysis with pepsin Diblíková Lenka, Čurda Ladislav, Pocedičová Klára Non-cultivure methods studying the microflora of food products Ženišová Katarína, Chebeňová Viera, Brežná Barbara, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico The Microflora raw goat s milk changes in counts significant groups microorganisms Kalhotka Libor, Šustová Květoslava, Kvasničková Blanka, Lužová Táňa, Šárka Havlíková, Záhora Jaroslav The effect of environmental factors on technological undesirable microflora Liptáková Denisa, Medveďová Alžbeta, Píšová Zuzana, Valík Ľubomír, Hybenová Eva Antibiotic resistance of enterococci isolated from different sources in dairy farm Čanigová Margita, Krebs-Artimová Anna, Kročko Miroslav, Ducková Viera Species distribution and resistance of enterococci isolated from raw and pasteurized sheep's milk Cupáková Šárka, Dušková Marta, Janštová Bohumíra, Necidová Lenka, Karpíšková Renáta Monitoring of physiological and biochemical characteristic of Listeria monocytogenes in vitro Pechačová Marta, Němečková Irena, Kunová Gabriela, Roubal Petr, Peroutková Jitka Survival selected probiotic microorganisms in yogurt during storage behavior annual period Lovayová Viera, Burdová Oľga Some methods for selective determination of probiotic dairy bacteria Urdová Katarína, Koreňová Janka Analysis of milk product from slovenian market for the quantitative occurance of probiotic bacteria Burdychová Radka, Šulcerová Hana, Bogovič-Matijašić Bojana, Obermajer Tanja, Rogelj Irena 260 Usage of Gram-staining for autolysis detection of Lactobacillus helveticus Ondráčková Iva, Solichová Kateřina, Fiala Jaromír a Milada Plocková High autolytic Lactobacillus helveticus strain selection using detection of peptidoglycan hydrolases genes Ondráčková Iva, Valence-Bertel Florence, Plocková Milada a Sylvie Lortal Effect of lactococci on persistent listerial strains Složilová Ivana, Šviráková Eva, Tichovský Petr, Plocková Milada Effect of lactococci biochemical potential on the reduction of listerias growth Šviráková Eva, Složilová Ivana, Tichovský Petr, Solichová Kateřina, Plocková Milada

10 Undesirabrable micro organisms in Dutch-type semi-hard chesses with probiotic culture during ripening Poľáková Lucia, Dudriková Eva, Lovayová Viera Antibacterial and antioxidant activity of phenolic acids esters Merkl Roman, Hrádková Iveta, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír Author index

11 Celostátní přehlídky sýrů

12

13 VÝSLEDKY 13. ROČNÍKU CELOSTÁTNÍCH PŘEHLÍDEK SÝRŮ Čurda Ladislav, Štětina Jiří Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Results of 13 th National Cheese Competition Summary: The 13th National Cheese Competition was organized traditionally by Department of Dairy and Fat Technology (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 14 and 20 of January 2010 in Prague. 75 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 20 producers competed in this year s show. Competitive samples of cheeses were divided into 11 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three or four members assessed each cheese. More than 160 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (12 samples) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the show. The National Cheese Show was accompanied by a conference called Milk and Cheeses with a scientific programme involving 19 lectures in two sections and 35 poster presentations. Po dvouleté přestávce se ve dnech 14. a 20. ledna 2010 se v Praze uskutečnil 13. ročník Celostátních přehlídek sýrů, organizovaný Ústavem technologie mléka a tuků VŠCHT v Praze ve spolupráci s Českomoravským svazem mlékárenským a Odbornou skupinou pro potravinářskou a agrikulturní chemii České společnosti chemické. Přejímka vzorků a odborné hodnocení se konalo 14. ledna. Kladně lze hodnotit poměrně vysoký počet přihlášených vzorků - do hodnocení bylo zařazeno 75 sýrů od 20 tuzemských výrobců a 12 vzorků zahraničních, které poskytli 3 dovozci sýrů. Sýry byly rozděleny do 11 kategorií. Označení kategorií a počty sýrů v jednotlivých kategoriích jsou uvedeny v tab. I. Díky vysokému počtu vzorků mohly být zachovány některé kategorie, které v předchozích ročnících byly slučovány. Poměrně silně tak byla obsazena kategorie sýrů s tvorbou ok a typu moravský bochník, také plísňové sýry a sýry s mazem na povrchu byly samostatnými kategoriemi. Opět se však projevil trend poklesu počtu druhů sýrů, které jsou charakteristické pro základní sortiment mlékáren, naopak narůstá kategorie specialit. Společně se skutečností, že se několik výrobců do přehlídek sýrů nezapojilo (Lacrum Velké Meziříčí, NET Kralovice, Agricol Polička, Mlékárna NET Plasy Bystřice pod Hostýnem) to má za následek, že Celostátní přehlídky sýrů mohou svůj původní účel, poskytnout ucelený přehled sýrů vyráběných v České republice, splnit jen částečně. Všechny zúčastněné sýrárny a přihlašovatelé sýrů uvádí tab. II. Způsob hodnocení zůstal zachován z předchozích ročníků. Při odborném hodnocení posuzují každý sýr 2 paralelní 3 až 4 členné komise, každá má nezávislého předsedu a je doplněna dalším nezávislým hodnotitelem nebo zástupci výrobců. Sýry se posuzují ve dvou znacích: vzhled a konzistence (ve výsledném hodnocení tvoří 40 %) a chuť a vůně (60 %). Tuzemským sýrům bylo na základě tohoto hodnocení uděleno celkem 24 diplomů. Počet diplomů v jednotlivých kategoriích závisí na počtu přihlášených vzorků na jeden diplom musí být v kategorii alespoň 3 sýry, diplomy získávají první tři sýry v pořadí. Ve dvou případech byla udělena 2 druhá místa kvůli rovnosti bodů. V kategorii specialit není určováno pořadí, ale diplomy byly uděleny vzorkům s hodnocením alespoň velmi dobrý s přihlédnutím k typům sýrů v této kategorii. K nejúspěšnějším sýrárnám na letošních přehlídkách patří Madeta a Miltra B se 3 diplomy. Po dvou diplomech obdržely také BEL Sýry Česko, Kromilk, Mlékárna Klatovy, Moravia Lacto a Pribina. Na rozdíl od minulého ročníku, kdy byly 4 sýry hodnoceny jako výborné (t. j. v rozmezí 90 až 100 bodů), letos odborné komise nezařadily do této kvalitativní kategorie žádný sýr. Nejvyšší bodové ohodnocení (86,67 bodu) tak patří Eidamu uzenému 45 % t. v s. (Jaroměřická mlékárna a.s., středisko Želetava). Tři sýry (4 %) byly hodnoceny jako podprůměrné. Přehled rozdělení sýrů do kvalitativních kategorií v odborném i veřejném hodnocení je uveden v tab. III. 13

14 Tabulka I Rozdělení sýrů do kategorií. Kategorie Počet vzorků 1 Eidamské sýry % t.v s. 6 2 Eidamské sýry % t.v s. 7 3 Sýry s tvorbou ok a typu Moravský blok 9 4 Uzené sýry 6 5 Plísňové sýry 6 7 Sýry s mazem na povrchu 4 8 Čerstvé a termizované sýry neochucené 6 9 Čerstvé a termizované sýry ochucené 4 10 Tavené sýry neochucené 8 11 Tavené sýry ochucené (uzené maso, šunka) 6 12 Speciality 13 Celkem 75 Tabulka II Přehled přihlašovatelů sýrů a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích. Přihlašovatel Počet Kategorie sýrů Česká republika A.W. s.r.o., Pravé olomoucké tvarůžky, Loštice 1 1 BEL Sýry Česko a.s., Želetava J+R s.r.o., Moravské Budějovice Jaroměřická mlékárna a.s Kromilk s.r.o., Kroměříž Madeta a.s., České Budějovice Miltra B s.r.o., Městečko Trnávka Mlékárna Klatovy a.s Mlékárna Olešnice, RMD Mlékárna Otínoves s.r.o. 1 1 Mlékárna Polná s.r.o Mlékárna Příšovice Mlékárna Varnsdorf s.r.o Moravia Lacto a.s., Jihlava Niva s.r.o. 1 1 Orrero a.s Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany Pribina, s.r.o., Přibyslav TANY, s.r.o., Nýrsko TPK, s.r.o., Hodonín Vzorky z ČR celkem Dovozce zahraničních sýrů NIKA s.r.o. 5 Bongrain Czech Management Services 1 Lactalis CZ, s.r.o. 6 Sýry z dovozu celkem 12 14

15 Ve skupině zahraničních sýrů bylo hodnoceno sedm francouzských sýrů, které byly získány díky úsilí pana Ladislava Liklera. Další vzorky ze Slovenska poskytla společnost NIKA. Tyto sýry jsou posuzovány odděleně, hodnotí je všichni členové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr zařazuje do kvalitativních kategorií a navíc má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Nejvíce návrhů na diplom získal sýr Snacking feinwürzig (Lactalis CZ, s.r.o.), který získal 28 návrhů na diplom z 38 možných). Diplomem byla dále oceněna další varianta tohoto sýra Snacking mild-cremig a ovčí sýr Brebiou (Bongrain Czech Management Services). Ze sýrů slovenské společnosti NIKA nejvíce zaujal sýr NIKA blue. Tabulka III Rozdělení sýrů do kvalitativních kategorií Kvalitativní kategorie Bodové hodnocení Odborné hodnocení [% vzorků] Veřejné hodnocení [% vzorků] Výborný (ideální typ) Velmi dobrý Průměrný (standardní kvalita) Podprůměrný (min. 30 bodů od každé komise) Nevyhovující < Relativní četnost [%] Hodnocení expertů Veřejné hodnocení Bodové hodnocení Obr. 1. Porovnání relativních četností hodnocení expertů a při veřejném hodnocení. 15

16 Tabulka IV Výsledky Celostátních přehlídek sýrů Kategorie Pořadí odborného hodnocení Pořadí veřejného hodnocení Sýr Výrobce (přihlašovatel) tvs suš [%] [%] Odb. hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Veřejné hodnocení Neparametrické hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o Eidam J+R s.r.o., M. Budějovice Eidamský sýr Moravia Lacto a.s Eidam Mlékárna Příšovice Bio Eidam Mlékárna Příšovice Eidam Mlékárna Příšovice Krásná Haná Kromilk s.r.o Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o Jasan - polotvrdý sýr Mlékárna Klatovy a.s Bio Gouda Mlékárna Příšovice Eidam J+R s.r.o., Moravské Budějovice Eidamský sýr Mlékárna Polná s.r.o Bio Eidam Mlékárna Příšovice Montana Moravia Lacto a.s Moravský blok Mlékárna Klatovy a.s Primátor MADETA a.s Madeland MADETA a.s Verena Orrero a.s Archivní sýr z Miltry MILTRA B s.r.o Moravský blok J+R s.r.o Sychrov Mlékárna Příšovice Tolštejn, přír. sýr polotvrdý s tvorbou ok Mlékárna Varnsdorf s.r.o Eidam uzený Jarom. mlékárna., stř. Želetava Pařený sýr uzený MILTRA B s.r.o Eidamský sýr uzený Mlékárna Polná s.r.o Eidamský salám. polotvrdý sýr uzený MILTRA B s.r.o Eidam uzený Mlékárna Příšovice Eidamský sýr uzený Moravia Lacto a.s Kamadet Královský sýr MADETA a.s Král sýrů Hermelín Pribina s.r.o Niva extra Mlékárna Otinoves s.r.o Král sýrů Sametový Pribina s.r.o Caesar Bleu MADETA a.s Niva Niva s.r.o Romadur měkký zrající sýr MADETA a.s Pivní sýr Mlékárna Olešnice, RMD Sedlčanský Romadůžek Povltavské mlékárny a.s Pravé olomoucké tvarůžky A.W. s.r.o., Pravé ol. tvarůžky Gervais Jarom. mlékárna, stř. Jaroměřice Žervé KLASIK Kromilk s.r.o Cottage čerstvý sýr ve smetaně MADETA a.s Krajanka Kromilk s.r.o Čerstvý salátový sýr Mlékárna Olešnice, RMD Lučina Kostičky Povltavské mlékárny a.s Lučina Žervé s paprikou a bylinkami Povltavské mlékárny a.s Cottage, č. sýr ve smetaně Letní zelenina MADETA a.s Lučina Linie s brokolicí Povltavské mlékárny a.s Cottage, č. sýr ve smetaně Maďar. zelenina MADETA a.s

17 Tabulka IV Výsledky Celostátních přehlídek sýrů - pokračování Kategorie Pořadí odborného hodnocení Pořadí veřejného hodnocení Sýr Výrobce (přihlašovatel) tvs suš [%] [%] Odb. hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Veřejné hodnocení Neparametrické hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Želetava jemný BEL Sýry Česko a.s Smetanito BEL Sýry Česko a.s Tavený uzený sýr bez příchutě Moravia Lacto a.s Šumavský uzený salámový tavený sýr Mlékárna Klatovy a.s DELICATO EXTRA smetanové TANY s.r.o., Nýrsko Jizeráček Mlékárna Příšovice Maratonec TPK s.r.o., Mlékárna Hodonín Apetito SuperCremo TPK s.r.o., Mlékárna Hodonín Šumavský uz. salám. tav. sýr se šunkou Mlékárna Klatovy a.s Smetanito se šunkou BEL Sýry Česko a.s Delicato se šunkou TANY s.r.o., Nýrsko Tavený uzený sýr se šunkou Moravia Lacto a.s Matador s klobásou BEL Sýry Česko a.s Apetito SuperCremo se šunkou TPK s.r.o., Mlékárna Hodonín Král sýrů Marinované kostičky Pribina s.r.o Gran Moravia Orrero a.s Balkánský sýr 50, 1 kg plechovka Mlékárna Polná s.r.o Příšovický uzený sýr se šunkou Mlékárna Příšovice Sýrový kokos - uzený sýr s chilli MILTRA B s.r.o Král sýrů Hermadur Pribina s.r.o Zlatá Praha Mlékárna Polná s.r.o Balkánský sýr MADETA a.s Adygejský copánek Mlékárna Varnsdorf s.r.o Příšovický sýr s vlašskými ořechy Mlékárna Příšovice Balkánský sýr pikant MADETA a.s Adygejský copánek uzený Mlékárna Varnsdorf s.r.o Balkánský sýr tzatziki MADETA a.s Veřejné hodnocení se konalo 20. ledna v kongresovém sále Masarykovy koleje. Přehlídky osobně zahájil rektor VŠCHT Doc. Ing. Josef Koubek, CSc., pod jehož záštitou se přehlídky konají. Shoda mezi odborným a veřejným hodnocením je poměrně dobrá, především u sýrů s udělenými diplomy. Některé sýry odbornými komisemi hodnocené jako podprůměrně byly veřejnými komisemi hodnoceny podstatně lépe. Porovnání četností hodnocení je uvedeno na obr. 1, v obou komisích se nejčastěji objevilo hodnocení mezi 75 a 80 body. Průměrné hodnocení se lišilo o 3,1 bodu (71,0 a 74,1 bodu). Medián je pro odborné hodnocení je 72 bodů, pro veřejné 74 bodů. Celkové výsledky přehlídek jsou shrnuty v tab. IV, hodnocení vzorků z dovozu je uvedeno v tab. V. Tučně jsou vyznačené vzorky, které obdržely diplom. 17

18 Tabulka V Výsledky Celostátních přehlídek sýrů zahraniční vzorky Sýr Dovozce tvs suš. Kvalitativní kategorie Modus Medián Návrhy na diplomy Brebiou Bongrain Czech Management Services 50% Snacking mild-cremig Lactalis CZ, s.r.o. 55% 50% Snacking fein-würzig Lactalis CZ, s.r.o. 55% 50% Roquefort Société Lactalis CZ, s.r.o. 52% 55% Salakis, bloček 200g Lactalis CZ, s.r.o. 48% 44% Salakis s bylinkami, bloček 180g Lactalis CZ, s.r.o. 48% 44% Salakis light, bloček 180 g Lactalis CZ, s.r.o. 25% 34% NIKA Blue NIKA s.r.o. 50% 53% Považský dierovec NIKA NIKA s.r.o. 45% 57% Bryndziarka NIKA NIKA s.r.o. 45% 28% Bryndzauer NIKA NIKA s.r.o. 45% 36% Valachova bryndziarka NIKA s.r.o. 38% 38% Kvalitativní kategorie: 1. Vynikající 2. Výborný 3. Velmi dobrý 4. Průměrný 5. Podprůměrný Hlavním bodem odborného programu přehlídek byla přednáška Ing. J. Kopáčka, CSc. (Českomoravský svaz mlékárenský), který účastníky seznámil se situací v mlékárenství a výrobě sýrů v roce Další přednáška se zabývala využitím senzorické analýzy při hodnocení mléčných výrobků. (Dr. Z. Panovská, VŠCHT Praha). Přednáška ing. Heriana byla věnována výrobě sýrařských specialit na Slovensku. Na navazující konferenci Mléko a sýry 21. ledna bylo prezentováno 19 přednášek, v letošním ročníku bylo nutné pro velký zájem zavést jednání v sekcích. Kromě přednášek bylo prezentováno 35 posterů. Obou akcí se dále účastnilo 7 firem, jejichž činnost se dotýká především laboratorního vybavení pro analýzu mléka a mléčných výrobků. Tradiční součástí programu přehlídek a konference je doprovodné výstava, kde byla prezentována celá řada dalších výrobků. Jejich seznam uvádí tab. VI. 18

19 Tabulka VI Seznam sýrů vystavených v průběhu Celostátních přehlídek sýrů a konference Mléko a sýry Společnost, mlékárna, sýrárna Sýr Sušina tvs A.W. spol. s r.o., Loštice Pravé olomoucké tvarůžky 33% 1% BEL Sýry Česko, Želetava Smetanito 36% 50% Smetanito se šunkou 36% 45% Matador s klobásou 33% 40% Želetava jemný 34% 40% (prod. Lactalis) Šumavský uzený tavený sýr 40% 30% Šumavský uzený tavený sýr se šunkou 50% 45% Jaroměřická mlékárna Eidam uzený 55% 45% Kromilk s.r.o., Kroměříž Čerstvý sýr přírodní / Mexiko / křen / 36% 60% česnek / provensálské koření Čerstvý sýr s brusinkymi 36% 60% Čerstvý sýr s chilli papričkami 36% 60% Kromík minigouda 56% 45% Krásná Haná 56% 45% Lučanka se šunkou 38% 24% Zálesák se zeleninou 38% 24% Zálesák s příchutí Niva 38% 24% Zálesák lahůdkový 38% 24% Žervé klasik 37% 26% Krajanka, terminovaný smetanový sýr 37% 70% Madeta a.s., České Budějovice Kamadet 51% 48% Caesar 52% 50% Romadur 40% 44% Miltra B s.r.o., Městečko Trnávka Archivní sýr z Miltry 58% 45% Eidamský salámový polotvrdý sýr 50% 30% Eidamský salámový polotvrdý sýr 53% 40% Eidamský salámový polotvrdý sýr 53% 40% uzený Polooštěpek - pařený sýr uzený 50% 45% Sýrový kokos chilli 50% 40% Mlékárna Klatovy + Lactalis CZ Eidam 30% 50% 30% Eidam 45% 56% 45% Jasan - polotvrdý sýr 60% 50% Moravský blok 61% 45% Uzený salámový tavený sýr 50% 45% Uzený salámový tavený sýr se šunkou 50% 45% Uzený sýr Eidam 40% 54% 40% Kolekce porcovaných sýrů Šumavský eidam, Moravský blok, President, Goldenburg Mlékárna Otinoves s.r.o. NIVA extra 53% 52% Mlékárna Polná s. r.o. Balkánský sýr 42% 50% Eidamský sýr 55% 45% Eidamský sýr uzený 57% 45% Zlatá Praha 58% 50% Mlékárna Příšovice Příšovický sýr uzený se šunkou 56% 45% Příšovický sýr s vlašskými ořechy 56% 45% Příšovický sýr s dýňovými semínky 56% 45% Sychrov 60% 45% 19

20 Tabulka VI pokračování Seznam sýrů vystavených v průběhu Celostátních přehlídek sýrů a konference Mléko a sýry Společnost, mlékárna, sýrárna Sýr Sušina Tvs NIKA s.r.o., Povážská Bystrica, NIKA Blue 53% 50% Slovensko Považský dierovec NIKA 57% 45% Bryndziarka NIKA 28% 45% Bryndzauer NIKA 36% 45% Valachova bryndziarka 38% 38% NIVA s.r.o., Dolní Přím Niva Olga Apoleníková, SHR, Pružina - Ovčí syr údený nakladaný v oleji 40% 50% okr. Povážská Bystrica, Slovensko Ovčí syr vyzretý nakladaný v oleji 48% 48% Ovčí syr vyzretý nakladaný v slanom 48% 48% náleve Oštiepok ovčí nakladaný v oleji 60% 50% Orrero a.s., Litovel Gran Moravia krájený sýr, 67% 43% výseč 4000 g Gran Moravia porcovaný sýr, 67% 43% 100 a 250 g Gran Moravia Tochetti-kostičky, 250g 67% 43% Verena, 370 a 4000 g 58% 51% Povltavské mlékárny a.s., Sedlčany Lučina kostičky 36% 26% Lučina linie s brokolicí 28% 9% Lučina žervé s paprikou a bylinkami 32% 17% Sedlčanský modřenín 52% 58% Sedlčanský troubelín 45% 53% TANY s. r.o., Nýrsko Delicato extra 40% 60% Delicato nízkotučné 30% 26% Delicato plísňové 38% 50% Delicato s klobásou 140 g 33% 50% Delicato s klobásou 150 g 33% 50% Delicato se šunkou 140 g 38% 50% Delicato se šunkou 150 g 38% 50% TPK s. r.o., Hodonín Apetito SuperCremo 34% 49% Apetito SuperCremo se šunkou 34% 45% Hotová sýrová omáčka s bylinkami 23% 45% Hotová sýrová omáčka s ementálem 23% 45% Hotová sýrová omáčka s houbami 23% 45% Jogurtová zálivka

21 VÝROBA SYRÁRSKYCH ŠPECIALÍT NA SLOVENSKU Keresteš Ján, Herian Karol Cech bryndziarov, Považská Bystrica, Slovensko The Production of Cheese Specialities in Slovakia Summary: In addition to their economic function, the cattle, sheep and goat breeding fulfil some social and ecological goals. It mainly concerns the production of sheep and goat milk, which is suitable for making an assortment of cheese products. It is first of all used for making soft cheese; only a smaller part of the milk is used to make other fermented products. The goat milk is used for making excellent cheese with white mould and also the so called white cheese The sheep and goat cheese products have a very high nutritional value. They have a suitable rate of protein and caloric fractions, an appropriate amount of most of the minerals and a relatively high content of vitamins. The most of cheese specialities in Slovakia have their origin in sheep dairy production. The products mainly include sheep lump cheese, bryndza, oštiepok, all kinds of steamed cheese, cheese in salt brine as well as long-ripening hard cheese. In addition, new kinds of cheese specialties are currently being produced at farms. Today, this production reflects the rural traditions and promotes rural development. In addition, it makes a positive contribution in human health and nutrition, for it offers healthy food without preservatives. Some of Slovak cheese products have already received the Territorial Protection mark. For these reasons, the Bryndza-making Guild has a great interest in extending the production of both traditional and new cheese specialties. Význam výroby syrárskych špecialít Výroba syrárskych špecialít na Slovensku, tvorí už takmer 30 % - ný podiel zo všetkých vyrobených syrov a získava stále viac na význame. Ich význam nie je len imidžotvorný pre turistov a zahraničný obchod, ale má veľký prínos i na rozvoji vidieka, na sociálny program, na udržanie tradícií a taktiež na zabezpečení zdravej výživy. Syrárske špeciality sa v zahraničí, ale aj u nás nevyrábajú len vo veľkých mliekarniach, ale aj v malých prevodzovniach a na farmách. Malé tradičné mliečne hospodárstva si i vo vyspelých krajinách Európy presadzujú svoje typické národné a zvlášť syrárske špeciality a napomáhajú výrazne pri rozvoji regionálneho rozvoja i agroturistiky. Tak to robí najmä Francúzsko, Taliansko, Španielsko, Grécko a iné krajiny. Zakladajú si tiež svoje spolky, napr. Spolok svätého Uguzona, ktorý je patrónom malých výrobcov syrárskych špecialít. Takéto spolky majú v krajinách EÚ veľkú spoločenskú podporu a sú silným partnerom aj vláde pri presadzovaní svojich požiadaviek pri rozvoji vidieka a pri rozvoji národných tradícii. Z uvedených dôvodov aj u nás na Slovensku máme záujem stále viac a viac rozširovať takú výrobu syrov, ktorá nie je bežná v zahraničí a ktorá by pomohla oživiť naše tradície, zvýšiť odbyt našich syrov a prispela by aj zdraviu ľudí. Sme presvedčení, že je potrebné sa tejto problematike stále viac venovať, rozvíjať ju a viac presadzovať. Z týchto dôvodov vniklo na Slovensku aj občianske združenie Cech bryndziarov, ktoré zastupuje výrobcov syrárskych špecialít, bryndziarov i farmárov vyrábajúcich mliečne výrobky a syrárske špeciality (1, 4). V tomto príspevku spomenieme len súčasný stav vo výrobe syrárskych špecialít z ovčieho, kozieho i kravského mlieka a aktuálne problémy s ich presadzovaním. Výroba a spotreba mlieka a syrov Veľká časť slovenských syrárskych špecialít je vyrobená z ovčieho mlieka, ktoré má dlhé tradície a má svoj pôvod už v stredoveku pri postupujúcom rozvoji syrárstva v Európe. Podstatná časť našich syrárskych špecialít, ako čerstvé a mäkké syry, parené syry, údené syry tvarované a lisované syry vznikali na salašoch a dokonca ešte aj pred príchodom valašskej kolonizácie v 14. storočí. Výroba syrov z kravského mlieka sa rozšírila hlavne až po II. svetovej vojne, kedy začali vznikať väčšie mliekarne a syrárne. Výroba syrov na Slovensku sa prevažne orientovala na výrobu polotvrdých syrov a iba malá časť mlieka sa spracovávala na výrobu tvrdých, alebo plesňových syrov. Neskôr, najmä vývojom pariaceho stroja sa začali na Slovensku priemyslovo vyrábať parené syry, ktoré boli vlastne napodobneninami tradičných ovčích syrov. Súčasná svetová produkcia mlieka všetkých druhov je 644 mil. ton. Z toho podiel ovčieho mlieka je 1,3 % a kozieho mlieka 1,9 %. (U nás tvorí podiel ovčieho mlieka iba 1,1 % a kozieho 21

22 mlieka ešte menej 0,13 %.) Vo svete je produkcia ovčieho a kozieho mlieka je pomerne stabilizovaná a iba nepatrne sa zvyšuje. Pritom najväčšia produkcia ovčieho a kozieho mlieka je v krajinách Ázie (3.475 / tis. ton) a Európy ( / tis. ton). Od r u nás počet dojníc poklesol najviac zo všetkých európskych krajín a to až o 70 % a stále klesá a produkcia mlieka, zvlášť kravského, veľmi výrazne klesla a to takmer o 50 % a aj naďalej klesá. Najhoršie je, že zároveň aj vplyvom hospodárskej krízy klesá i spotreba mlieka a mliečnych výrobkov. Relatívne dobré je, že najmä stavy oviec sa v podstate udržali, neklesla ani cena ovčieho mlieka a ani syrov tak, ako tomu bolo pri kravskom mlieku. Prehľad produkcie a spotreby kravského, ovčieho a kozieho mlieka za posledné roky je uvedený v tabuľke I. Tabuľka I. Produkcia a spotreba mlieka kravského, ovčieho a kozieho na Slovensku v r a 2008 Produkcia mlieka Rok Kravské mlieko Ovčie mlieko Kozie mlieko Spolu mlieko mil. kg tis. kg tis. kg mil. kg , , , , ,2 963,9 Index 08/05 86,83 95,0 78,6 86,9 Spotreba mlieka a mliečnych výrobkov Rok Kravské mlieko Ovčie mlieko Kozie mlieko kg/osobu/rok kg/osobu/rok kg/osobu/rok ,3 1,6 0,6 154, ,3 1,5 0,6 151,7 Index 08/05 99,3 93, ,1 22 Spotreba spolu kg/osobu/rok Napriek klesajúcej produkcii mlieka, spotreba mliečnych výrobkov a zvlášť syrov neklesala a mala a má mierne stúpajúcu tendenciu. O tento mierny nárast sa zaslúžili i syrárske špeciality, ktoré sústavne zvyšujú spotrebu mliečnych výrobkov. Celkovo možno konštatovať, že výroba syrov prakticky sa na Slovensku ustálila a zvyšuje sa najmä výroba prírodných polotvrdých syrov a tavených syrov. Výroba tvarohov a zvlášť ovčích syrov akoby klesala. V spotrebe syrov na Slovensku prevažujú tiež najmä polotvrdé a parené syry. Celková spotreba syrov, hoci sa mierne zvyšuje, je stále pomerne nízka a naším cieľom je perspektívne ju zvýšiť aspoň na 16 kg/osobu a rok. V krajinách EÚ 20 je spotreba syrov vyše 20 kg na osobu a rok a u ovčích a kozích syrov (Francúzsko, Grécko a iné krajiny) až vyše 6 kg na osobu a rok. Tu máme teda ešte bohatú rezervu vo výrobe i v spotrebe syrov a budeme sa musieť zamerať na podstatne lepšiu propagáciu syrov a syrárskych špecialít ako doposiaľ. Prehľad výroby všetkých syrov na Slovensku za posledné roky a tiež ich spotreba podľa hlavných druhov syrov je uvedená v tabuľke II. Tabuľka II. Výroba a spotreba syrov na Slovensku v r a 2009 Výroba syrov v tonách Rok Tvarohy Prírodné syry Tavené syry Ovčie syry Syry spolu Index 08/05 96,4 113,9 110,0 61,8 107,2 Spotreba syrov v kg/osobu/rok Rok Tvarohy Tvrdé a polotvrdé Mäkké a polomäkké Tavené syry Syry spolu ,9 2,2 2,1 1,9 9, ,3 3,9 1,6 1,6 9,4 Index 08/05 79,3 177,3 76,2 84,2 103,3

23 Uvedený prehľad výroby a spotreby syrov (2) je však vyhotovený zo štatistických údajov Výskumného ústavu ekonomiky poľnohospodárstva a potravinárstva a nezachycuje skutočnú výrobu malých farmárov a súkromníkov, ktorí predávajú zvlášť ovčie syrárske špeciality (ovčí hrudkový syr, bryndzu, oštiepky, parenice a rôzne tvary parených syrov údených a neúdených) po celom Slovensku v osobitných stánkoch a tiež v reštauráciách. Skutočná spotreba syrárskych a ovčích syrov je teda podstatne vyššia (teraz začíname podchycovať do štatistiky i malovýrobcov). Situácia v posledných rokoch na Slovensku je už dokonca taká, že ak sami nezvýšime chov oviec a produkciu ovčieho mlieka, budú nútení naši bryndziari a syrári dovážať aj ovčie mlieko zo zahraničia, aby uspokojili dopyt po ovčích syroch. Najväčšie využitie ovčieho mlieka u nás je na výrobu ovčieho hrudkového syra a z neho vyrobenej bryndze. Táto postupne nadobudla už priemyselný charakter a predstavuje ročne v priemere približne 3500 ton pre domáci a zahraničný trh. Jej výroba sa za viac ako dve storočia uchovala a rozšírila najmä preto, že nadväzuje na veľmi racionálny systém spracovania ovčieho mlieka ihneď po pôdoji na hrudkový syr, ktorý v salašníckych podmienkach prekysáva a zrie a následne sa obyčajne 1 krát týždenne zváža do bryndziarní, kde sa odborne spracuje na komerčný výrobok - bryndzu. Výroba tzv. bačovských výrobkov oštiepkov a pareníc- bola u nás dlho nelegálna a výrobky sa nesmeli distribuovať cez verejný obchodný systém. V súčasnosti už prevláda farmársky i tzv. priemyslový charakter spracovania ovčieho mlieka, pričom sa aj ovčie mlieko zváža do mliekarne, alebo ovčej syrárne, pasterizuje sa, obohatí sa mliečnymi kultúrami a spracováva na hrudkový syr a bryndzu, alebo aj na iné zrejúce ovčie syry. V poslednom čase sa veľmi rozšírila farmárska a tiež domácka výroba syrov a tiež predaj z dvora na stôl. Kozieho mlieka sa v súčasnosti vyprodukuje len asi 10 ton ročne, z toho však väčšia časť mlieka ide na vlastnú spotrebu vo forme mlieka a syrov a len menšia časť sa spracováva priemyselne. Z kozieho mlieka sa už v posledných rokoch začalo priemyselne vyrábať celý rad tekutých a sušených výrobkov so špeciálnymi výživovými účinkami, ale aj celá rada mäkkých, plesňových i tvrdých syrov, ale zatiaľ iba v malom merítku. Na zlepšenie propagácie našich syrárskych špecialít sa v poslednom období uskutočnili mnohé tradičné i folklórne podujatia. Medzi tradičné oslavy ovčieho mliekarstva patrí napr. Ovčiarska nedeľa v Pribyline, Ovenálie vo Východnej, Bačovské pastorálie v Detve, regionálne oslavy bačovských tradícii v Novoti, Zázrivej, v Krompachoch a mnohých ďalších miest. Tu sa robia prehliadky syrov, súťaže v kvalite, vo varení bryndzových halušiek a tiež v hre na fujare a v tradičných spevoch a hrách. Hoci máme dlhú tradíciu ovčiarstva, mnohé spracovateľské problémy stále nemáme dotiahnuté a to napr. oceňovanie ovčieho a kozieho mlieka podľa kvality a zloženia, zabezpečenie odborných kádrov na takéto malé mliekarne a salaše a hlavne máme problémy chovateľského charakteru ako nízka užitkovosť, vysoká sezónnosť, nevyužité spracovateľské priestory v zimnom období a pod. Podstatným problémom je ale nevyužitie 60 tis. ha lúk a pasienkov vhodných pre živočíšnu výrobu a chov oviec a kôz, hoci tu nie sme limitovaní pridelenými kvótami. Zloženie ovčieho, kravského a kozieho mlieka Väčší ekonomický význam a bohatšiu tradíciu využívania u nás má ovčie mlieko. Toto mlieko v porovnaní s mliekom kravským obsahuje vo viac koncentrovanej forme veľmi hodnotné bielkoviny (5,2 %), tuky (6,2%), uhľohydráty i minerálne látky, pričom aj obsah tzv. špecificky účinných látok je obyčajne vyšší ako u kravského mlieka. Napríklad sa zistilo, že ovčie mlieko obsahuje o 9 % viac vitamínu B12, o 19 % viac biotínu a až o 37 % viac kyseliny pantoténovej, obsahuje aj viac mliečnych enzýmov, najmä amylázy, ako je tomu u kravského mlieka. Ovčie mlieko má však relatívne nižší obsah vápenatých solí, ako je tomu u kravského a kozieho mlieka. Kozie mlieko je v základnom zložení podobné mlieku kravskému, keď v priemere obsahuje okolo 12,7 % sušiny, 3,5 % bielkovín, 3,9 % tuku, 4,4 % laktózy a 0,8 % minerálnych látok. V zložení kozieho mlieka sú značné rozdiely medzi plemenami, individuálnymi zvieratami a k značným zmenám dochádza aj v priebehu laktácie. Preukazné rozdiely medzi kozím a kravským 23

24 mliekom sú v zložení a štruktúre tuku. Priemerná veľkosť tukových guľôčok kozieho mlieka je okolo 2 mikrometre, zatiaľ čo v kravskom tuku je priemerná veľkosť 2,5 až 3,5 mikrometrov. Bielkovinové zloženie kozieho a kravského mlieka je podobnejšie ako je tomu u ovčieho mlieka. Hoci typický α s 1 kazeín kravského mlieka je v kozom mlieku neprítomný a tvorba kazeínovej syreniny je preto rozdielna. Kozie mlieko formuje jemnejšie vločky a rýchlejšie ako kravské mlieko. To možno dať do súvisu aj s ľahšou a rýchlejšou stráviteľnosťou bielkovín kozieho mlieka ako je tomu u kravského mlieka. Tradičné slovenské syrárske špeciality Podstata výroby všetkých syrov spočíva na využívaní princípu kyslého, alebo enzymatického zrážania mlieka a na ovplyvňovaní spôsobu väzby vápenatých solí s kazeinovými micelami v mlieku i v syre. Od tohto vzťahu závisí konzistencia a štruktúra syrov všetkých druhov a tá je ovplyvnená kyslosťou (resp. využitím kyslomliečnych baktérií pri prekysávaní), tepelnými podmienkami, prítomnosťou proteolytických enzýmov a mineráliami. Ďalšie technologické faktory sú čas trvania jednotlivých operácií, mechanické podmienky spracovania, aditívne látky a pod. Práve využitím týchto faktorov môžeme dosiahnuť nové druhy syrov. Veľmi dôležitý faktor na konzistenciu všetkých syrov je pomer kazeínu, tuku, vody, minerálnych solí a organických kyselín. Rôznorodosť syrov a tým aj ich vlastnosti v podstate závisia od : bielkoviny v syre, a to najmä kazeínu, ktorý svojou vápnikovou väzbou dáva syru pevnosť, formu a stabilitu, t.j. čím je vyšší obsah kazeínu v syre tým je pevnejší syr, vápnika, ktorý svojou väzbou viaže kazeín, čím je teda väčší podiel viazaného vápnika na kazeín, tým je dlhšie syrové cesto a elastickejší syr a naopak, čím je menej viazaného vápnika v syre, tým je kratšie syrové cesto a drobivejší syr, tuku v syre, ktorý je umiestnený medzi kazeinovo vápnikovou štruktúrou a nie je na bielkovinu viazaný, napriek tomu platí všeobecné pravidlo, že čím je obsah tuku vyšší, tým je syrové cesto mäkšie, vody v syre, ktorá môže byť ako voľná, alebo viazaná na kazeín, a to najmä v závislosti od priebehu kysnutia syrov počas výroby, čím je vyšší obsah vody v syre, tým je mäkšie syrové cesto a naopak, kyslosti syra, ktorá má podstatný vplyv na konzistenciu syra a na sušinu syra, čím je kyslosť syra v priebehu výroby vyššia, t.j. čím je vyššia koncentrácia kyseliny mliečnej, tým viac vápnika z kazeinátového komplexu odchádza do srvátky a tým je u syrov kratšia konzistencia a naopak. U nás základný výrobok z ovčieho, kozieho mlieka a napokon aj z kravského, ktorý sa robí buď tradične zo surového mlieka, alebo zo zberaného a pasterizovaného mlieka je výroba hrudkového syra. Z tohto syra, zvlášť z ovčieho hrudkového syra, po vykysnutí a vyzretí možno vyrobiť parené ovčie syry, oštiepky, bryndzu a iné tradičné syrárske špeciality. Okrem už uvedených tradičných výrobkov z ovčieho mlieka existuje u nás celá rada ďalších tradičných výrobkov, ktoré sa doposiaľ nerobia. Sú to napr. : rôzne syry z ovčieho, kozieho, alebo zmesného mlieka, ako sú regionálne oštiepkovité syry, parenice, korbáčiky, bryndzové nátierky a tiež syr Urda srvátkový syr z ovčieho mlieka, Karpatský tvrdý syr, Toporecký polotvrdý syr, Klenovecký syr, zmesné syry a pod. Tiež mnohé syrárske špeciality vyvinul VUM v Žiline, ktoré sa však neuchytili vo výrobe a sú veľmi zaujímavé. Sú to napr. parený salámový syr, mozaikové lisované syry, plesňové syry (typ Kalinka dvoj plesňový kozí syr, zmesný syr s bielou plesňou Choč a pod.). Podobných syrov z ovčieho, alebo kozieho mliek a prípadnej zmesi s kravským mliekom by sa z histórie i súčasnosti našlo podstatne viac. Bude preto potrebné sa touto problematikou viac zapodievať a dotiahnuť to do konca. Na Slovensku máme zatiaľ chránené 3 druhy syrov so značkou Chránené zemepisné 24

25 označenie. Z toho práve Cech bryndziarov sa presadil o ochranu označenia Slovenská bryndza a Slovenská parenica. Náš partnerský Cech výrobcov ovčieho hrudkového syra dosiahol už svoj salašnícky i údený hrudkový syr do zoznamu EÚ ako tradičné výrobky. Pripravujú sa však na ochranu aj ďalšie naše syrárske špeciality. Prínos bryndze vo výžive Bryndza, ako naša tradičná syrárska špecialita je mikrobiálny fenomén, ktorý zachováva všetky pôvodné zložky ovčieho mlieka. Proces kysnutia a zrenia na salaši, alebo aj v syrárni spôsobí, že sa v nej doslova premnožia baktérie mliečneho kysnutia, tzv. probiotiká, ktorých blahodarné účinky na ľudský organizmus čoraz častejšie ospevujú vedci i lekári (3). Podľa prof. RNDr. Libor Ebringera, Dr.Sc. z Prírodovedeckej fakulty UAK v Bratislave, pravidelná konzumácia bryndze dokázateľne znižuje hladinu škodlivého cholesterolu, a to aj napriek tomu, že má vysoký podiel tuku v sušine. Má pozitívne účinky pri prevencii rakoviny hrubého čreva, zažívacích problémoch, alergických ochoreniach, rednutí kostí, cukrovke, zvyšuje imunitu a znižuje dokonca krvný tlak. Nespochybniteľné dôkazy jej pozitívneho vplyvu na ľudský organizmus priniesol aj medializovaný klinický test, v ktorom skupina 24 dobrovoľníkov osem týždňov jedla sto gramov bryndze denne. Okrem poklesu celkového a zlého cholesterolu sa zaznamenal vzostup toho,,dobrého. Vedcov prekvapil aj pokles hladín krvného cukru, zápalového parametra C-reaktívneho proteínu (CRP) či hodnôt krvného tlaku. Bryndza ako fermentovaný živý ovčí syr okrem toho, že je výdatným zdrojom kvalitných bielkovín, vitamínov a minerálov obsahuje veľké množstvo probiotických mliečnych baktérií a kvasiniek, ktorých počty v grame bryndze dosahujú hodnoty od 1 do 10 miliárd. Kým v jogurtoch a acidofilnom mlieku sa nachádzajú iba dva alebo tri druhy mliečnych baktérií v tradičnej bryndzi je ich až desaťnásobok. Sú to najmä viaceré druhy mliečnych baktérií rodov Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc a Streptococcus a mikroskopické huby Galactomyces geotrichum, Kluyveromyces lactis a Mucor circinelloides. Prednosťou tradičnej bryndze je, že sa vyrába bez akéhokoľvek tepelného spracovania. Mnohé bioaktívne látky si zachovávajú pôvodnú aktivitu len v surovom mlieku. Vyššie teploty ich znehodnocujú. Stupeň inaktivácie závisí od výšky teploty a dĺžky jej pôsobenia. Na vyššie teploty sú citlivejšie látky bielkovinového charakteru najmä enzýmy, imunoglobulíny a rastové faktory. Aj aktivita biopeptidov, ktoré znižujú krvný tlak je vyššia v surovom mlieku ako v mlieku pasterizovanom. Vyššie teploty znižujú aj antioxidačné vlastnosti mlieka, ktoré sa pripisujú viacerým zložkám mlieka o.i. aj β-laktoglobulínu. Pasterizácia negatívne ovplyvní vstrebávanie niektorých minerálov vrátane vápnika, železa a zinku ako aj kyseliny listovej a ďalších vitamínov. Pasterizácia iba čiastočne poškodí väčšinu vitamínov B skupiny (1 10 %), vitamínu C sa zachová po pasterizácii iba 50 %. Neporušené zostávajú iba vitamín B 2 a vitamíny rozpustné v tukoch (vitamín A, D, E a K). Komplex zmien vyvolaných pasterizáciou a vyššími teplotami spôsobí, že využiteľnosť vápnika z mlieka klesne až na %. Pre porovnanie z materského mlieka sa vstrebá a využije až 80 % vápnika. Tieto konštatovania platia aj pre iné živé mliečne výrobky a preto máme záujem ta, kde je to možné zbytočne nesterilizovať a nekonzervovať mliečne výrobky a ani syry.. Záver Výroba syrárskych špecialít má pre rozvoj poľnohospodárstva a mliekarstva podstatný vplyv. Svedčia o tom bohaté tradície, keď práve domáce mliečne a syrárske špeciality tvorili základ každodennej stravy. Tieto tradície majú aj v súčasnosti svoje opodstatnenie a je potrebné naďalej rozvíjať miestne a regionálne syrárske špeciality na zachovanie tradícii, zamestnanosti ľudí na vidieku a pre zlepšenie výživy obyvateľstva.. Slovensko má bohaté tradície s kravským, ovčím i kozím mliekarstvom a má aj veľké predpoklady na ich ďalší rozvoj. Poďakovanie: Autori príspevku ďakujú za dobrú spoluprácu a pomoc členom Cechu bryndziarov na Slovensku. 25

26 Použitá literatúra: 1. Herian, K.: Mliekarstvo, 33, 2003, č. 3. s. Možnosti a predpoklady efektívneho spracovania ovčieho mlieka 2. Šajbidorová, V.: Komoditná situačná správa Mlieko, dec. 2006, VUEPP, Bratislava 3. Keresteš, J.: Bryndza a jej zdravotné účinky, júl Herian, K. : Súčasnosť a perspektíva ovčieho a kozieho mliekarstva na Slovensku, máj, 2009 Kontaktní adresa: Ing. Ján Keresteš,, predseda Cechu bryndziarov, NIKA, s.r.o., Považská Bystrica, ul. Nová 135, tel.: , mail : dir@nika.sk Ing. Karol Herian, CSc., Žilina, ul. A. Rudnaya 47, tel.: , mail: kherian@stonline.sk 26

27 VYUŽITÍ SENZORICKÉ ANALÝZY PŘI HODNOCENÍ MLÉČNÝCH VÝROBKŮ Panovská Zdeňka Ústav chemie a analýzy potravin, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Using sensory analysis for evaluation of dairy products Summary: Sensory panel is the most important part for the evaluation of products by sensory analysis. Technical Committee that works under The Czech Accreditation Institute has described the procedures that are used for testing assessors and confirmed laboratories which can these tests organise. New 8 ISO Standards important for the work in sensory laboratories were translated into Czech language in Recently have been published different scientific papers on sensory vocabulary for the Quantitative Descriptive Analysis (QDA) of different milk products. New taste kokumi found in cheeses and other food products is also described. Úvod Senzorická analýza je relativně mladý obor, který se významně uplatňuje v potravinářském průmyslu. Většina publikací uvádí, že senzorické metody byly vyvinuty a použity na konci čtyřicátých let pro hodnocení kvality nápojů a v potravinářském průmyslu. Mlékárenský průmysl však datuje vývoj technik pro hodnocení svých výrobků již od prvních let dvacátého století. V roce 1913 byla v USA navržena pravidla pro řazení másla do kvalitativních skupin. V roce 1916 bylo provedeno první hodnocení mléčných výrobků a jedna z prvních knih, zabývajících se hodnocením mléčných produktů byla publikována již v roce 1934 a dočkala se čtyř vydání 1. V dalších letech se rozšířilo používání senzorické analýzy a postupně se měnila metodologie, rozšířila se oblast průmyslové a vědecké aplikace, včetně kontroly kvality, vývoje nových výrobků pro uspokojení potřeb konzumentů apod. V posledních letech senzorická analýza prošla dalším vývojem, který by se měl odrazit i v práci senzorických laboratoří v ČR. V tomto článku bych chtěla upozornit na některé oblasti týkající se senzorické analýzy tj.: - systematický a sjednocený výcvik hodnotitelů a vlastní práce panelu - senzorické ISO normy a jejich změny - práce týkající se tvorby slovníku pro jednotlivé komodity mléčného průmyslu - zajímavé publikované práce a nejnovější poznatky Práce senzorického panelu Již pět let je v platnosti dokument EA Evropská spolupráce pro akreditaci (EA-4/09) s názvem Akreditace laboratoří působících v oblasti senzorického zkoušení. Tento dokument doplňuje EN ISO/ IEC a poskytuje pokyny pro akreditaci laboratoří působících v oblasti senzorického zkoušení. Velký důraz je kladen na práci panelu, výcvik posuzovatelů a na úlohu vedoucího panelu. U senzorického panelu, který představuje hlavní nástroj senzorické analýzy je důraz kladen na proškolení členů panelu a zácvik. Při Českém institutu pro akreditaci pracuje Technická komise v oblasti senzorického zkoušení. Jedním z cílů této komise bylo sjednotit senzorické zkoušky pořádané různými laboratořemi, sjednotit pracovní postupy a dohled nad akreditací laboratoří. Potravinářské podniky, ale i další pracoviště nechávají svoje zaměstnance otestovat na citlivost smyslů a tím se snaží vybrat lidi vhodné pro práci v panelu. Technická komise sjednotila úlohy, které se při testování hodnotitelů používají, tak aby všechna pracoviště, která tyto zkoušky pořádají, používala stejné postupy (interní materiál ČIA). Testování posuzovatelů probíhá na SZPI, VŠCHT Praha, Státním zdravotním ústavu Ostrava a Mendelově Univerzitě v Brně. Účastníkům je vydáváno Osvědčení vybraného posuzovatele pro senzorickou analýzu. Nově je na osvědčení i věta Toto osvědčení potvrzuje splnění požadavků na odbornou způsobilost posuzovatele senzorických vlastností dle ČSN EN ISO/IEC a vydává se na dobu 5 let. 27

28 Senzorické normy V roce 2009 byla přepracovávaná norma, která zatím vyšla jen v angličtině ISO/DIS : 2007 Mléko a mléčné výrobky senzorická analýza. Část 3: Posouzení shody se specifikací výrobku z hlediska senzorických vlastností. V roce byly přeloženy do českého jazyka a vydány následující senzorické normy, u některých norem došlo k významným změnám, které jsou zmíněny dále. Senzorická analýza Senzorická analýza - Obecné pokyny pro uspořádání senzorického pracoviště ISO 8589: ČSN ISO 8589 překlad Náhrada normy z r. 1993, změny nepatrné. Datum účinnosti Senzorická analýza Metodologie Pořadová zkouška ISO 8587: ČSN ISO překlad Tato norma je doplněna o konkrétní příklady a konkrétní výpočty. Nově je zahrnuta i možnost rozdělit soubor při více vzorcích na dvě sady. Datum účinnosti Senzorická analýza Metodologie Zasvěcení do problematiky a výcvik posuzovatelů při zjišťování a rozlišování pachů ISO 5496: ČSN ISO 5496 překlad Náhrada normy z r. 1999, změny nepatrné. Datum účinnosti Senzorická analýza Obecné pokyny pro použití kvantitativních odpovědních stupnic ISO 4121:2003- ČSN ISO 4121 překlad Norma zahrnuje dosti obecný přehled. Datum účinnosti Senzorická analýza Metodologie Párová porovnávací zkouška ISO 5495:2005, EN ISO: 2007 ČSN EN ISO 5495 překlad Norma prodělala podstatné změny, má propracovanější statistiku, přepočítané tabulky, práce s α a β chybou. Datum účinnosti Senzorická analýza Metodologie Trojúhelníková zkouška ISO 4120:2004, EN ISO 4120:2007, EN ČSN ISO 4120 překlad Norma prodělala podstatné změny, má propracovanější statistiku, přepočítané tabulky, práce s α β chybou. Datum účinnosti Senzorická analýza Metodologie Slovník ISO 5492:2008, ČSN ISO 5492 překlad V normě byl rozšířen hlavně slovník týkající se textury. Datum účinnosti Senzorická analýza Metodologie Všeobecné pokyny ISO 6658:2005, ČSN ISO 6658 překlad Norma je dosti obecná, jde o souhrn obecných pravidel pro všechny zkoušky. Datum účinnosti Kvantitativní deskriptivní analýza Senzorické metody se vyvíjely postupně od čtyřicátých let dvacátého století. Nejprve se používaly rozdílové testy, (1946, 1949) pak byly popsány stupnicové metody (1948, 1955), profilové metody (1950,1957) a TI (1957). Používání metod a jejich další rozvoj byl ve vztahu na jedné straně k vývoji ve fysiologii a psychologii senzorického vnímání a na druhé straně k aplikaci pokročilých sofistikovaných a statistických modelů a metod pro zpracování dat. Ty první přispívaly k lepšímu pochopení senzorického procesu za senzorickým posuzováním, ty pozdější pomohly lepšímu pohledu do struktury a vztahů multi-dimensionálních senzorických dat. Největší vypovídající schopnost mají profilové metody. Metoda senzorického profilu (Flavor Profile Method - FPM) byla vyvinuta firmou Arthur D. Little Inc. v padesátých letech. Později v sedmdesátých letech se rozšířilo využití kvantitativní deskriptivní analýzy (Quantitative Descriptive Anaylysis - QDA) a Spectrum TM metod deskriptivní 28

29 analýzy. Metoda QDA používá pro hodnocení grafickou stupnici kódovanou na obou koncích, zatímco Spectrum TM používá kromě 15cm grafické stupnici raději 15bodovou stupnici s dělením po deseti tj. celkem na 150 bodů. Mnohem důležitější pro použití obou metod je však vývoj správného slovníku a tomu je věnováno také velké množství senzorických prací. V devadesátých letech byly publikovány slovníky pro různé mléčné výrobky např. pasterizované mléko, zmrzlinu a sýr. V roce 2002 M. A. Drake a G. V. Civille shrnuli poznatky o historii a vývoji senzorického slovníku a aplikací profilových metod 2. Podle těchto autorů vývoj representativního slovníku zahrnuje několik standardních kroků, ale záleží i na účelu, pro který je používán. Např. u sýru Čedar byl vyvinut slovník pro sledování vlivu startovací kultury na chuť a vůni čedaru, na sledování senzorických vlastnosti nízkotučného čedaru nebo na sledování vývoje chuti a aroma během zrání čedaru. Vývoj slovníku není rychlá a jednoduchá záležitost, např. Drake a kol. posoudili 220 vzorků Čedaru, lišících se stářím, tepelným ošetřením zpracovaného mléka a geograficky. Coggins a kol. v roce 2008 publikovali slovník pro hodnocení jogurtů a určili 61 parametrů, které popisují chuť, vůni, texturu a vzhled 3. Tento slovník pak použili pro posouzení dvanácti komerčně vyráběných jogurtů, aby ověřili vybrané parametry a zjistili, že z původních 61 charakteristik jich 37 vysvětluje rozdíly mezi jednotlivými výrobky. Autoři z Kansaské university se zaměřili na vývoj zjednodušeného slovníku, který by byl vhodný pro posuzování Evropských sýrů 4. Pro rozlišení chuti a vůní navrhli 25 hlavních charakteristik a dalších 19 lze použít při posuzování konkrétního druhu sýru. U všech těchto prací je důležité, že kromě vlastního slovníku je uvedena i podrobnější definice termínu a také navržena referenční látka, na které lze posuzovatele učit rozpoznávat danou charakteristiku. V těchto základních pracích je také obvykle pomocí PCA analýzy zjišťován význam jednotlivých charakteristik pro daný výrobek. K zajímavým závěrům došel Avsar a kol 5. Ve své práci se pokusili definovat senzorický termín ořechový. Z hlediska senzorika jde o složitou otázku, protože kvalita aroma není u ořechů stejná. Spojením senzorické analýzy a instrumentální plynové chromatografie nejenže určili chemické látky zodpovědné za toto aroma, ale také popsali, jaké technologické kroky doporučují pro výrobu čedaru s oříškovým aroma. Stále více senzorických prací se zaměřuje na porovnání mléčných výrobků z různých zemí. Tyto práce jsou důležité i z metodického hlediska, protože navrhují a pomáhají sjednotit metodiku používanou na různých pracovištích. Např. v červnu 2009 byla v časopise Sensory Studies publikována práce amerických autorů, kteří porovnávali senzorickou kvalitu plnotučných a nízkotučných mlék ošetřených UHT technologií ze sedmi zemí (Francie, Itálie, Japonsko, Korea, Peru, Thajsko, a USA) 6. Jejich práce ukázala, že používaný UHT proces v jednotlivých společnostech má větší vliv na senzorické rozdíly v mléce než země původu nebo obsah tuku. Ve své práci použili senzorický slovník vyvinutý pro hodnocení UHT mléka, ale slovník rozšířili o další deskriptory, které lépe vystihovali texturu, chuť a vůni mléka. Pro každý deskriptor navrhli také referenční standardy. Důležitost výcviku posuzovatelů pro daný úkol je vidět i u této práce. Autoři uvádí, že všichni posuzovatelé měli 120 hodinový trénink senzorického posuzování potravinářských výrobků, dále více než 2000 hodin zkušeností s hodnocením mléčných výrobků a dále tři 1,5 hodinové orientační sezení zaměřené již na UHT mléko a vývoj slovníku. Posuzováno bylo 36 deskriptorů, z toho 7 bylo přidáno navíc proti slovníku vyvinutým Chapmanem 7 pro hodnocení UHT mléka a další dva vyplynuly během studie. V dalších studiích byly porovnávány sýry z Irska, Nového Zélandu a USA 8. Nové poznatky Sladidlo Neotam bylo oficiálně v Evropské unii schváleno sladidlo neotam pod kódem E 961. Chemicky je derivátem aspartamu, tj.- N-(3,3-dimethylbutyl) derivát dipeptidu složeného z aminokyselin L- fenylalaninu a L-asparagové kyseliny. Byl objeven v roce 1992 při výzkumech sladících účinků různých peptidů iniciovaných firmou Monsanto. Toto sladidlo by mělo najít uplatnění v mlékárenském průmyslu, protože nepodléhá rozkladu během pasterizace a také není metabolizován obvyklými jogurtovými kulturami. 29

30 Pojem kokumi chuť Zcela novým pojmem, který začali někteří autoři používat je anglický pojem sensometabolomic. Cílem sensometabolických studií je vytvořit seznam, kvantifikovat a hodnotit senzorickou aktivitu metabolitů, které jsou přítomny v surovém materiálu nebo vznikly během zpracování např. tepelným, tlakovým nebo fermentačním procesem. S těmito studiemi souvisí i používání nového termínu kokumi pro popis chuti. Tento termín pochází z japonštiny a popisuje vnímání chuti na základě různých charakteristik chuti nebo pocitů v ústech, např. účinek, plnost, jemnost, spojitost. Látky, které se podílí na této chuti, jsou většinou ve vodě bez chuti, ale zvýrazňují chuť dalších látek. Z mléčných výrobků je chuť kokumi nejvíce studována u sýrů. Např. srovnávací studie autorů Toelstede a kol. ukázala, že 44 týdnů zralý sýr Gouda vykazuje lepší tzv. plnost (mouthfullness) než 4 týdny zralý sýr 9. Je snaha identifikovat sloučeniny, které jsou za to odpovědné. Jako nejpravděpodobnější látky byly zkoumány molekuly osmi α-l-glutamyl a deseti γ- l-glutamyl dipeptidů s tím, že největší význam pro plnost chuti má z nich γ-l-glutamyl dipeptid. Pozornost je věnována i volným mastným kyselinám zvláště dokosahexaenové kyselině (DHA), která může vznikat při hydrolýze fosfolipidů a jejíž výzkumy ukazují, že se může podílet na kokumi chuti. U ne mléčných výrobků byly identifikovány peptidy γ-glutamyl-leucine, γ-glutamyl-valine and γ-glutamyl-cysteinyl-β-alanine, odpovědné za kokumi chuť ve fazolích 10. Látky, které vyvolávají chuť kokumi jsou i předmětem patentu 11. Poděkování: Tato práce vznikla za podpory grantu MSM Použitá literatura: 1. Nelson, J. A., and G. M. Trout Judging dairy products. The Olsen Publ. Co., Milwaukee, 2. M.A. Drake, G.V. Civille: 2003, Flavor Lexicons - Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Volume 2, Issue 1, p , 3. Coggins P.C., Schilling M.W., Kumari S, Gerrard P.D.: 2008, Development of a sensory lexicon for conventional milk youghurt in the United states, Journal of Sensory Studies, Volume 23, Issue 5, p , 4. Talavera-Bianchi M., Chambers D.H: 2008, Simplified lexicon to describe flavour charactersistics of western European cheeses Journal of Sensory Studies Volume 23, Issue 4, Pages: Avsar Z.K., Karagul-Zuceer Y., Drake M.A, Singh T.K, Zoon Z., and Calwallader K.R.: 2004, Characterisation of nutty flavor in Cheddar cheese, J. Dairy Sci. 87: Oupadissakoon G., Chambers D.H. and Chambers IV E.: 2009, Comparison of the sensory properties of ultra high-temperature (UHT) milk from different countries Journal of Sensory Studies 24, Chapman K.W., Lawless H.T. and BoorK.J Quantitative descriptive analysis and principal component analysis for sensory characterization of ultra pasteurized milk. J. Dairy Sci. 84, Drake, M.A., Keziah, M.D., Gerard, P.D., Delahunty, C.M. Sheehan, C., Turnbull, R.P. and Dodds, T.M., Comparison of cross-cultural differences between lexicons for descriptive analysis of Cheddar cheese flavor in Ireland, New Zealand, and the United States. International Dairy Journal 15: Toelstede S., Dunkel A., Hofmann T.: 2009 A Series of Kokumi Peptides Impart the Long-Lasting Mouthfulness of Matured Gouda Cheese, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Volume 57, Issue 4, Pages A. Dunkel, J. Köster and T. Hofmann: 2007, Molecular and sensory characterization of gamma-glutamyl peptides as key contributors to the kokumi taste of edible beans (Phaseolus vulgaris L.), Journal of Agricultural and Food Chemistry 55 pp Hofmann, T. F., & Dunkel, A., Kokumi flavour compounds and use. International application no.: PCT/EP2006/009817, Publication No.: WO/2007/

31 MLÉKO a SÝRY Přednášky

32

33 CO NOVÉHO V MIKROBIOLOGII SÝRŮ Plocková Milada, Horáčková Šárka Ústav technologie mléka a tuků, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, VŠCHT Praha What s new in cheese microbiology Summary: Microorganisms are present in all cheese varieties and play very important role during both cheese production and cheese ripening. The main functions of lactic acid bacteria and other microorganisms used during cheese manufacture are to produce acid and secondly to contribute to flavour development by proteolysis and conversion of amino acids. The aim of presented thesis is to summarize current approach both to the improvment of microorganisms properties and to the ensuring of cheese safety and quality. The role of non-starter lactic acid bacteria during cheese ripening and their possible application as adjunct cultures are discussed. In details there are mentioned protective characters of lactic acid bacteria, especially the bacteriocin production.the studies which have demonstrated that cheeses have a great potential as a carrier to deliver probiotic bacteria to the consumers are also summerized. Vzhledem k stoupajícímu trendu spotřeby sýrů se hledají neustále metody, jak urychlit a zkvalitnit jejich výrobní proces. Využití různých druhů mikroorganismů s požadovanými vlastnostmi při zrání sýrů dává celou řadu možností, jak tento proces ovlivnit. Významnou roli v procesu poznání jevů souvisejících s výrobou a zráním sýrů hraje pokrok ve výzkumu vlastností bakterií mléčného kvašení (BMK). Řada aktivit je poznána na úrovni genů kódujících produkci enzymů spojených s těmito aktivitami. Vědci mají nástroje k modifikaci jednotlivých kmenů BMK tak, aby bylo dosaženo jejich optimálních funkčních vlastností. Nové molekulárně biologické metody posunuly výrazně poznání mikrobiální ekologie sýrů a umožnily porozumět dějům v sýrech, které byly klasickými mikrobiologickými metodami nepoznatelné. S postupujícími poznatky vědy se tak postupně daří původní empirické znalosti spojené s tradiční výrobou sýrů vysvětlovat až na molekulární úrovni 1. Na zrání sýrů se podílí celá řada enzymů enzymy použitého syřidla, nativní enzymy mléka, enzymy zákysových a doplňkových kultur (zástupci rodů Lactococcus a Lactobacillus) a v neposlední řadě enzymy tzv. nezákysových mikroorganismů (NSLAB non-starter lactic acid bacteria). Mezi uvedenými mikroorganismy dochází k celé řadě interakcí jako je soutěžení o živiny, různé druhy kooperace, ale i antagonismu, které mají významný vliv na jejich růst a přežívání v matrici sýra. Důležitou vlastností použitých mikroorganismů je schopnost lýze, která má za následek uvolnění intracelulárních enzymů, které pak ovlivňují proteolýzu, katabolismus aminokyselin, lipolýzu a katabolismus volných mastných kyselin během zracího procesu sýrů. Další sledovanou vlastností BMK je jejich protektivní funkce spojená s tvorbou antimikrobiálních látek potlačujících rozvoj nežádoucí mikroflory. Kromě nejvíce probádaného a prakticky používaného bakteriocinu nisinu, jehož aplikace je však kvůli aktivitě jen při nízkých hodnotách ph a inhibici žádoucích BMK potřebných pro zrání sýrů omezená 2, se pozornost zaměřuje i na další bakteriocin produkční kmeny BMK. Příkladem úspěchu v této oblasti je příprava komerčního preparátu na bázi bakteriocinu lacticinu 3147 a více než 30 lakticin 3147 produkujících transkonjugovaných kmenů Lactococcus lactis vhodných pro aplikace v sýrařství. Výhodou těchto kmenů i oproti nisinu je aktivita i při vyšších hodnotách ph a širokospektrální antimikrobiální účinek včetně inhibice klíčových potravinářských patogenů Listeria monocytogenes a Staphylococcus aureus 3. Na Ústavu technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha bylo testováno několik kmenů bakterií mléčného kvašení, a byla u nich objevena antifungální a antiklostridiální aktivita 4,5. Kmeny heterofermentativních laktobacilů izolovaných ze sýra eidamského typu byly testovány na aktivitu proti plísním Fusarium proliferatum M 5689, Penicillium sp. DMF 0006 a Aspergillus niger DMF Inhibiční efekt všech vybraných kmenů byl způsobem pouze živými buňkami a byl nejintenzivnější v proti plísni F. proliferatum M Výsledkem dalšího vědeckého projektu 33

34 Ústavu byla charakterizace kmene Lbc. paracasei ST 68, který vykazoval inhibiční aktivitu proti různým kmenům rodu Clostridium patřící k druhům Cl. butyricum, Cl. tyrobutyricum, Cl. beijerinckii a Cl. sporogenes 4. Během výroby sýra se rychle zvyšuje počet zákysových laktokoků, dosahuje až 10 9 KTJ/g sýřeniny, po solení se opět značně snižuje v závislosti na druhu použitého mikroorganismu v důsledku přítomnosti chloridu sodného, nízkého ph sýřeniny a nepřítomnosti dostatečného zdroje energie (laktosy). Zároveň se snižováním počtu zákysových mikroorganismů dochází k prudkému nárůstu nezákysových bakterií 7. NSLAB obsažené v polotvrdých sýrech pocházejí buď z mléka nebo z prostředí výrobny jako post-pasterizační kontaminanty. Jsou to obvykle kmeny mezofilních homofermentativních laktobacilů, fakultativně heterofermentativních laktobacilů nebo pediokoků. Zastoupení jednotlivých kmenů se liší během zrací doby i mezi jednotlivými výrobnami. Jejich počet se během zrání sýra zvyšuje z hodnot 10 2 JTK/g až k 10 8 JTK/g ve zralém sýru, kdy tvoří převážnou většinu přítomných mikroorganismů 8. Role NSLAB při proteolýze a rozvoji chuti a vůně u polotvrdých sýrů je předmětem mnoha vědeckých studií. Jako široce akceptována je teorie, že pasterizace a rovněž zlepšení sanitárních podmínek v prostředí výroben sýrů, vedlo k redukci počtu nezákysových BMK a tím k méně výrazné chuti zralých sýrů. Sýry vyrobené ze syrového mléka obvykle zrají rychleji a vyvíjí se u nich intenzivnější senzorické vlastnosti než u sýrů vyrobených z pasterizovaného mléka. Důležitost NSLAB pro rozvoj senzorických vlastností vedla k výzkumům přídavku vybraných laktobacilů do mléka s cílem urychlení zrání a zlepšení kvality sýrů buď jako důsledek jejich vlastní metabolické aktivity nebo inhibicí růstu nežádoucích bakterií 9. Na Ústavu technologie mléka a tuků byla provedena rozsáhlá studie, která se zabývala možností přídavku doplňkových kultur, izolátů NSLAB při výrobě sýra eidamského typu. Na obr. 1 je uveden příklad vlivu přídavku nezákysových bakterií Lactobacillus helveticus 121 na celkový počet NSLAB. 4 Obr. 1. Stanovení celkového počtu NSLAB po výrobě a během zrání v sýrech typu Eidam 30 % tvs vyrobených s přídavkem ( ) a bez přídavku ( ) Lb. helveticus Významnou roli v růstu NSLAB mají dostupné zdroje energie v sýru 10. V počáteční fázi kolonizace sýrového zrna je pro NSLAB důležitým zdrojem energie laktosa 11, z laktátu a citrátu nejsou NSLAB schopny získávat energii 12. Předpokládanými zdroji energie v dalších fázích zrání sýra jsou některé aminokyseliny, organické kyseliny nebo sacharidy uvolňované z glykomakropeptidů, kaseinu, glykoproteinů membrán kuliček mléčného tuku nebo látky uvolňované z lyzovaných buněk zákysových bakterií (galaktosa, N-acetylgalaktosamin, N- acetylneuraminovaá kyselina, manosa, fukosa, ribosa, deoxyribosa apod.) 12,13. Použití zástupců NSLAB může vést i k určitým rizikům při výrobě sýrů. Nežádoucí produkce plynů některými zástupci rodu Lactobacillus, vede k tzv. sekundární fermentaci sýrů. Schopnost transformovat L(+) laktát na méně rozpustný (D-) laktát může být příčinou vzniku bílých krystalů, někdy zaměňovaných nesprávně za plísně, na povrchu sýrů. Některé kmeny rodů Lactobacillus a Enterococcus ze skupiny NSLAB mohou produkovat biogenní aminy. Jak bylo zkoumáno na 34

35 pracovišti Ústavu technologie mléka a tuků, zástupci nezákysových bakterií rodu Enterococcus mohou vytvářet biogenní aminy. Biogenní aminy se řadí mezi základní dusíkaté sloučeniny, které vznikají enzymatickou dekarboxylací volných aminokyselin nebo dekarboxylasovou aktivitou bakterií v potravinách a jejich hlavními zástupci jsou histamin, tyramin, putrescin, kadaverin, spermin, spermidin. Potraviny s vysokým obsahem biogenních aminů mohou mít vysoký toxikologický efekt na lidský organismus. Mohou způsobovat bolesti hlavy, migrény, průjmy, zvýšení krevního tlaku, infekci respiračního traktu, podporují zvýšení koncentrace krevního cukru atd. Na Ústavu technologie mléka a tuků bylo testováno celkem 33 izolátů enterokoků ze syrového mléka a z polotvrdých sýrů, u 20 z nich byla prokázána tyrosindekarboxylasová aktivita a u 3 kmenů navíc histidindekarboxylasová aktivita (obr. 2) 14. Byly zde rovněž úspěšně zavedeny metody na stanovení biogenních aminů pomocí tenkovrstvé chromatografie a stanovení genů zodpovědných za dekarboxylaci aminokyselin pomocí PCR (obr. 3 a 4) 15. Obr. 2. Dekarboxylasová aktivita vůči tyrosinu a histidinu vybraných izolátů enterokoků potvrzená plotnovou metodou s přídavkem bromkresolového purpuru 14 Obr. 3. Detekce tyraminu a histaminu pomocí tenkovrstvé chromatografie: T tyramin, H - histamin, 1 L. lactis subsp. lactis NIZO B33, 2 Lbc. paracasei 171R2, 3 - Br4, 4 3/3C, 5 4/1A, 6 6/4D 15 Obr. 4. Detekce tdc genu u vybraných kmenů pomocí metody PCR: M - DNA marker 100 bp, 1- Z1, 2 - Z3, 3- Z4, 4 - Ž4, 5 - Br4, 6-3/3C, 7-4/1A, 8-6/4D, 9 - L. lactis subsp. lactis NIZO B643, 10 - L. lactis subsp. lactis NIZO B33, 11 - Lbc. paracasei 171R

36 Velká pozornost se v posledních 20 letech věnuje studiu probiotických bakterií, které se nejčastěji řadí k rodu Lactobacillus či Bifidobacterium. Jako probiotické mikroorganismy se označují živé mikroorganismy, které po požití v dostatečném množství ovlivní mikroflóru hostitele a u kterých jsou prokázány zdravotně prospěšné účinky. Aby byly probiotické mikroorganismy schopny uplatnit svoji pozitivní funkci, je nutné dodat organismu buněk/den, což odpovídá obsahu v potravinách buněk v 1 g či 1 ml. Toto množství zohledňuje také nutnost překonat změnu prostředí při přechodu z potraviny do gastrointestinálního traktu člověka a nutnost odolat stresovým podmínkám při průchodu traktem 16. Bakterie mléčného kvašení, u kterých byly prokázány probiotické vlastnosti, se nejčastěji přidávají do zakysaných mléčných výrobků (fermentované mléčné nápoje a jogurty). V posledních letech se objevují pokusy využít tyto mikroorganismy i v technologii sýrů. Oproti fermentovaným výrobkům jsou hlavním rozdílem doba výroby, podmínky při výrobě a také složení média. Pro úspěšné využití probiotických mikroorganismů při výrobě sýra je nutné, aby tyto mikroorganismy přežily v dostatečném počtu výrobní proces, dobu zrání a skladování sýrů a zároveň také neovlivňovaly nežádoucím způsobem složení, chuť, vůni, texturu senzorické vlastnosti charakteristické pro daný sýr. Rovněž je žádoucí, aby použití probiotických bakterií při výrobě sýrů nevyžadovalo žádný významný zásah do používané technologie 17. Největší pozornost je z hlediska použití probiotických mikroorganismů věnována polotvrdým sýrům typu Čedar. Matrice sýra spolu s vyšším obsahem tuku může zajistit vyšší ochranu probiotických mikroorganismů při průchodu gastrointestinálním traktem 18. Také další parametry polotvrdých a tvrdých sýrů jako jsou vyšší hodnoty ph, nišší hodnoty redox-potenciálu, vyšší pufrační kapacita, mají pozitivní vliv na životaschopnost probiotických bakterií 19. Vliv probiotických mikroorganismů na senzorické vlastnosti je posuzován převážně z pohledu jejich metabolického působení ovlivňování proteolýzy a z pohledu jejich dlouhodobého přežívání v sýrech 20,21. Probiotické mikroorganismy jsou citlivé na parametry prostředí potravinářského výrobku i trávicího traktu člověka. Aby se zvýšila možnost dopravit vitální probiotické BMK až do trávicího traktu člověka, chrání se tyto před nepříznivými vlivy pomocí různých technik mikroenkapsulace. Na našem ústavu byla úspěšně provedena mikrooenkapsulace probiotického kmene Lactobacillus casei L-26 LAFTI emulzním způsobem metodou dle Heidebacha 22, která poskytuje kapsule vhodné velikosti i rozpustnosti ve vodném prostředí pro aplikace do fermentovaných mléčných nápojů nebo čerstvých sýrů (nepublikovaná data). Závěrem možno konstatovat, že hlavním cílem vědeckého bádání, včetně zvládnutí pokroků v mikrobiologii, je lépe poznat mikrobiologické a biochemické procesy v sýrech a lépe je kontrolovat tak, aby společným úsilím vědců i technologů byl vyroben mikrobiálně bezpečný, kvalitní sýr, který bude plně uspokojovat požadavky zákazníků. Poděkování: Tato práce vznikla za podpory grantů Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR MSM a MSM 2B Použitá literatura: 1. Peláez C., Requena T.: Exploiting the potential of bacteria in the cheese ecosystem. Int. Dairy J. 15, (2005). 2. Maisnier-Patin S., Deschamps N., Tatini S., Richard J.: Inhibition of Listeria monocytogenes in camembert cheese made with a nisin-producing starter. Le Lait 72, (1992). 3. Sobrino-López A., Martín-Belloso O.: Use of nisin and other bacteriocins for preservation of dairy products. Int. Dairy J. 18, (2008). 4. Tůma Š., Kučerová K., Plocková M.: Isolation of anticlostridially active lactobacilli from semi-hard cheese. Czech J. Food Sci. 26, (2008). 5. Tůma Š., Vogensan F., Plocková M., Chumchalová J.: Isolation of antifungally active lactobacilli from 36

37 Edam cheese. Acta Alimentaria 36, (2007). 6. Plocková M., Chumchalová J., Giesová M., Boučková O.: Antifungal effectiveness of Lactobacillus rhamnosus VT1 at different temperatures. Adv. Food Sci. 26, (2004) 7. Martley F.G, Crow V.L.: Interactions between non-starter microorganisms during cheese manufacture and ripening. Int. Dairy J. 3, (1993). 8. Hussain M. A., Rouch D. A., Britz M. L.: Biochemistry of non-starter lactic acid bacteria isolate Lactobacillus casei GCRL163: Production of metabolites by stationary-phase cultures. Int. Dairy J. 19, 12 21(2009). 9. McSweeney, P.L.H., Fox, P.F., Lucey, J.A., Jordan, K.N., Cogan T.M.: Contribution of the indigenous microflora to the maturation of Cheddar cheese. Int. Dairy J. 3, (1993). 10. Adamberg, K., Adamberg, S., Laht, T., Ardo, Y., Paalme, T.: Study on cheese associated lactic acid bacteria under carbohydrate-limited conditions using D-stat cultivation. Food Biotech. 20, (2006). 11. McSweeney P.L.H., Fox P.F.: Metabolism of residual lactose and of lactate and citrate Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Volume 1, 2004, Laht T. M., Kask S., Adamberg K., Elias P., Paalme T.: The role of arginine in the development of the secondary microflora in Swiss-type cheese. Int. Dairy J. 12, (2002). 13. Adamberg, K., Adamberg, S., Laht, T., Ardo, Y., Paalme, T.: Study on cheese associated lactic acid bacteria under carbohydrate-limited conditions using D-stat cultivation. Food Biotech. 20, (2006). 14. Kučerová K., Svobodová H., Tůma Š., Ondráčková I., Plocková M.:Production of Biogenic Amines by Enterococci. Czech J. Food Sci. 27, S2-50-S2-55(2009). 15. Kučerová K., Svobodová H., Tůma Š., Ondráčková I., Plocková M.: Produkce biogenních aminů enterokoky. Výroční konference Komise potravinářské mikrobiologie Česko-slovenské společnosti mikrobiologické, , Třešť. 16. Morelli L.: In vitro assessment of probiotic bakteria from survival to functionality. Int. Dairy J. 17, (2007). 17. Corbo M.R., Albenzio M., De Angelis M., Sevi A., Gobbetti M.: Microbiological and biochemical properties of Canestrato Pugliese hard cheese suplemented with bifidobacteria. J. Dairy Sci. 84, (2001). 18. Stanton C., Gardiner G., Lynch P.B., Collins J.K., Fitzgerald G., Ross R.P.: Probiotic cheese. Int. Dairy J. 8, (1998). 19. Shah N.P.:Functional cultures and health benefits, Int. Dairy J. 17, (2007). 20. Ong L., Henriksson A., Shah N.P.: Chemical analysis and sensory evaluation of Cheddar cheese produced with Lactobacillus acidophilus, Lb. casei, Lb. paracasei or Bifidobacterium sp. Int. Dairy J. 17, (2007). 21. Ong L., Henriksson A., Shah N.P.: Proteolytic pattern and organic acid profiles of probiotic Cheddar cheese as influenced by probiotic strains of Lactobacillus acidophilus, Lb. paracasei, Lb. casei or Bifidobacterium sp.. Int. Dairy J. 17, (2007). 22. Heidebach T., Forst P., Kulozik U.: Microencapsulation of probiotic cells by means of rennet-gelation of milk proteins. Food Hydrocolloids 23, (2009). Kontaktní adresa: Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT, Technická 3, Praha 6 milada.plockova@vscht.cz 37

38 URYCHLENÍ ZRÁNÍ SÝRA CHEDDAR POMOCÍ PŘÍDAVKU ENZYMATICKÉHO PREPARÁTU Magdaléna Abrlová*, Alice Bavard**, Eva Šviráková*, Milada Plocková*, Kieran Kilcawley** *Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, **Moorepark Food Research Centre, TEAGASC Acceleration of Cheddar cheese ripening using enzymatic preparation addition Summary: Cheddar is a semi-hard cheese. It is the most popular cheese in Great Britain, Ireland, Australia, Canada, USA, South Africa, New Zealand and Island. Ripening period of Cheddar cheese is 6-18 months and it represents an important part of the cost of Cheddar cheese production. Acceleration of Cheddar cheese ripening means significant savings of the cost of Cheddar cheese production. We made Cheddar cheeses using Lactococcus lactis subsp. lactis 303 as a starter. To accelerate cheese ripening, we added enzymatic preparation made of Lactococcus lactis subsp. lactis 303 to curd chips and mixed with NaCl. We sampled Cheddar cheese blocks and measured important parameters during the period of 6 months. We measured characteristics connected with cheese ripening (water soluble nitrogen, free amino acids content), intracellular enzyme activities of enzymes released into cheese (LDH, PepX, PepN). We confirmed increase in these enzyme activities in cheese blocks with enzyme preparation addition at the beginning of ripening period (day of cheese production and day one). Added enzymes were shown to be unstable in the cheese environment and there was no evidence of increased enzyme activities after 30 days of ripening in cheeses made with the enzyme preparation. There was no difference observed in other measured characteristics (water soluble nitrogen, free amino acids content, textural analysis), but sensory analysis show the difference in flavour of produced cheeses. Kmen Lactococcus lactis subsp. lactis 303 Kmen Lc. lactis subsp. lactis 303 patří mezi nelytické kmeny. Jeho buněčná stěna je velmi odolná mechanickému působení např. sonikaci. Ve vhodném médiu rychle roste a je odolný vůči bakteriofágům. Z tohoto důvodu je často používán k výrobě sýra Cheddar. Nevýhodou použití kmene Lc. lactis subsp. lactis 303 v sýrařství jeho odolnost buněčné lyzi a z toho vyplývající nižší senzorická hodnota sýrů [1, 2]. Kmen Lc. lactis 303 lyzí nemůže uvolňovat intracelulární enzymy, které se podílejí na vzniku aroma a odstranění hořkosti sýrů - peptidasy. Sýry vyrobené s Lc. Lactis subsp. lactis 303 proto mohou mít nedostatečně rozvinuté aroma a být nahořklé. Přes nižší senzorickou kvalitu vyrobených sýrů je tento kmen jako zákysová kultura hojně využíván právě díky jeho odolnosti a snadné kultivaci. Bylo prokázáno, že kmen Lc. lactis subsp. lactis 303 obsahuje významné množství intracelulárních enzymů peptidas [3], které zůstávají uvnitř buňky a protože nejsou uvolňovány buněčnou lyzí, nemají vliv na zrání sýrů. V této práci jsme se pokusili tyto enzymy uvolnit z buněk laktokoků, vhodnou formou je aplikovat do sýra a sledovat, jaký mají vliv na zrání experimentálního sýra. Enzymový preparát V literatuře bylo popsáno mnoho způsobů rozbití bakteriálních buněk. Tyto způsoby se dělí na chemické a mechanické. Chemické způsoby narušení buněčné stěny jsou účinné, ale legislativa nedovoluje získaný preparát použít v potravinářské výrobě, resp. při výrobě sýrů. Mechanické způsoby narušení buněk jsou s ohledem na využití v potravinářství vhodnější, ale zároveň jsou méně účinné [3, 4]. Pro výrobu enzymového preparátu z kmene Lc. lactis subsp. lactis 303 byl kmen nejprve kultivován (inokulum 0,1-1%, teplota C, doba 4-12 h, podle časového harmonogramu) ve sterilním (režim sterilace: tři tepelné záhřevy ve fermentoru ve třech po sobě jdoucích dnech) obnoveném sušeném odtučněném mléce. Kultivace byla byla ukončena po dosažení ph 5,2 ochlazením fermentoru. Po skončení kultivace bylo zvýšeno ph na ph 7 postupným přidáváním roztoku hydroxidu sodného, aby byla kultura méně namáhána působením kyselého prostředí a aby byla zachována viskozita kultury z důvodu zařazení následujícího kroku zahuštění kultury. 38

39 K zahuštění kultury byla provedena filtrace (Techsep PS3R, Novasep, Francie) na keramické membráně (M14 s velikostí pórů 0,14 μm). Retentát byl recyklován v systému až do dosažení dvojnásobného zahuštění; vyšší zahuštění filtrací nebylo z technologického hlediska možné. Retentát byla viskózní bílá kapalina s příjemně nakyslým aroma. Permeát představovala čirá nažloutlá průhledná kapalina se stejným aroma jako retentát. Zahuštěnou kulturu z předchozího kroku (retentát) jsme použili pro výrobu práškového enzymového preparátu. Kulturu jsme narušili a usušili. Výhodou vzniklého prášku je stabilita aktivit enzymů, možnost jeho dlouhého uchování a snadné použití v sýrařské technologii. Tabulka I uvádí důležité vlastnosti kultury Lc. lactis subsp. lactis 303 a vyrobeného enzymového preparátu. Z tabulky je možné vidět nárůst aktivit intracelulárních enzymů v enzymovém preparátu v porovnání s čerstvou a zahuštěnou kulturou (retentátem). Enzymový preparát vykazoval vyšší aktivity enzymů u všech tří sledovaných enzymů (LDH, pep X a pep N). V průběhu filtrace docházelo pouze k zanedbatelným nebo žádným ztrátám aktivních enzymů v permeátu. Přestože při přípravě enzymového preparátu byly mnohonásobně zvýšeny aktivity enzymů, došlo ke snížení počtu živých laktokoků pouze o dva řády (o 84 %). Enzymový preparát tedy stále obsahoval také živé laktokoky v denzitě 10 9 KTJ g -1. Vyrobený preparát byl stabilní v průběhu skladování při -20 C. Sledované enzymové aktivity enzymů (LDH, pep X, pep N) a celkové počty mikroorganismů zůstávaly nezměněny po dobu 6 měsíců skladování. Tabulka I Důležité vlastnosti kultury Lc. lactis subsp. lactis 303 a finálního enzymového preparátu. Kultura 303 Permeát Retentát Enzymový preparát LDH* pepx** pepn** CPM [KTJ g -1 ] 5, , , , * jedna jednotka je definována jako enzym potřebný ke katalýze oxidace 1µM NADH/min/0,1 ml vzorku ** množství µm AMC uvolněné za minutu jedním mg proteinu Výroba sýra Cheddaru Výrobu sýra Cheddaru jsme uskutečnili v poloprovozních podmínkách. Mléko (250 l/sýr) jsme naočkovali kulturou Lc. lactis subsp. lactis 303. Přidali jsme syřidlo a ponechali čas na koagulaci. Sýřeninu jsme rozkrájeli a dohřívali na teplotu 39 C. Po dohřívání sýřeniny jsme odpustili syrovátka a v další fázi, tzv. čedarování, jsme několikrát otáčeli bloky sýřeniny a překládali je přes sebe. Ke krájení jsme použili krájecí stroj a sýřenu jsme promíchali s NaCl (2 % hm.) a případně enzymovým práškem. Sýřeninu jsme přes noc lisovali a druhý den jsme sýry vložili do ochranné fólie, vakuově zabalili a přemístili do zracího sklepa. Sýry jsme ponechali ve zracím sklepě při teplotě 8 C po dobu 6 měsíců. Po tuto dobu jsme ze sýrů pravidelně odebírali vzorky. Průměrné složení vyrobených sýrů uvádí tabulka II. Tabulka II Průměrné složení vyrobených sýrů. Voda [%] Tuk [%] Bílkoviny [%] NaCl [%] ph ,0 Sýr s přídavkem enzymů Z vyrobených sýrů experimentálního sýra s přídavkem enzymového preparátu (2 % hm. sýřeniny) a kontrolního sýra jsme pravidelně odebírali vzorky. Pro posouzení vlivu přídavku enzymu do sýrů jsme použili měření aktivit peptidas, laktátdehydrogenasy, obsahu volných mastných kyselin, analýzu těkavých sloučenin a sensorickou analýzu na konci zrání sýrů. 39

40 Přídavek enzymového preparátu do sýra zvýšil enzymovou aktivitu pep X (obr. 1), pep N (obr. 2), ale měl jen malý vliv na aktivitu LDH (obr. 3). Nízký rozdíl v aktivitě LDH experimentálního a kontrolního sýra může být způsoben nižší celkovou aktivitou LDH v enzymovém preparátu (ve srovnání s aktivitami peptidas) a jeho následným naředěním v sýru. Z grafů (obr. 1 a 2) je patrný výrazný pokles aktivit obou enzymů v experimentálním sýru; od 30. dne zrání se již aktivity v kontrolním a experimentálním sýru neliší. To může být způsobeno nízkou stabilitou enzymů v prostředí sýra nebo interakcemi enzymů s některými dalšími složkami sýrů. Aktivita (jednotka aktivity) 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0, Čas (den) adj. Obr. 1. Enzymová aktivita pepx v sýru v průběhu jeho zrání při teplotě 8 C. Aktivita (jednotaka aktivity) 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0, Čas (den) adj. Obr. 2. Enzymová aktivita pepn v sýru v průběhu jeho zrání při teplotě 8 C. Hodnoty celkové koncentrace volných aminokyselin (měřeno ve vodném extraktu sýra pomocí HPLC; obr. 4) se v experimentálním a kontrolním sýru neliší. Podobné byly také výsledky stanovení ve vodě rozpustného dusíku a texturní analýzy nebyl zaznamenán žádný vliv přídavku enzymového preparátu na vlastnosti sýra. 40

41 Po šesti měsících zrání byly sýry odeslány k analýze těkavých látek pomocí plynové chromatografie a sensorické analýzy. Plynová chromatografie prokázala rozdílné koncentrace některých těkavých látek. Je zajímavé, že množství těchto látek bylo v kontrolním sýru vyšší než v experimentálním sýru. Některé chuti byly v experimentálních sýrech intenzivnější, než v sýru kontrolním. Jedná se o ovocnou, ořechovitou, kyselou a specifickou ( kočičí ) chuť. Hořká chuť byla v experimentálním sýru méně intenzivní, než v kontrolním sýru. Aktivita (jednotka aktivity) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Čas (den) adj. Obr. 3. Aktivita LDH ve vyrobených sýrech v průběhu jeho zrání při teplotě 8 C. Koncentrace (mg/kg) Čas (den) adj. Obr. 4. Koncentrace volných aminokyselin ve vyrobených sýrech v průběhu jeho zrání při teplotě 8 C. Závěr Enzymový preparát vyrobený z kultury Lc. lactis subsp. lactis 303 má vysokou enzymovou aktivitu, která je stabilní při teplotě skladování -20 C. Přídavek enzymového preparátu do sýra Cheddar ovlivnil pouze počáteční enzymovou aktivitu v sýru, ale enzymy nebyly v prostředí sýra stabilní. Po 30 dnech zrání nebyl zaznamenán žádný rozdíl v celkovém množství volných aminokyselin v sýru. Z těchto údajů by se dalo předpokládat, že v sýrech nebudou žádné další rozdíly týkající se chuti a vůně, ale senzorická analýza prokázala rozdíly v některých chutích a také v intenzitě hořké chuti. Také plynová chromatografie potvrdila rozdílné koncentrace některých těkavých látek. Z výsledků vyplývá, že přidaný enzymový preparát ovlivňuje senzorické vlastnosti vyrobeného sýra. Výsledkem je intenzivnější chuť a kratší doba zrání vyrobeného sýra. Poděkování: Tato práce vznikla díky podpoře Národního rozvojového plánu Irské Republiky, FIRM Projekt č. 04/R&D/C/238 RMIS

42 Použitá literatura: 1. Hickey D. K., Kilcawley N. K., Beresford T. P., Sheehan E. M., Wilkinson M. G. (2007): Starter strain related effects on the biochemical and sensory properties of Cheddar cheese. J. of dairy res. 74, Boutrou R., Sepulchre A., Pitel G., Durier C., Vassal L., Gripon J.-C., Monnet V. (1998). Lactococcal lysis and curd proteolysis : two predictable events important for the development of cheese flavour. Int. dairy J. 8, Doolan I. A., Wilkinson M. G. (2009): Comparison of the effect of various attenuation methods on cell permeability and accessibility of intracellular enzymes in Lactococcus lactis strains. Int. dairy J. 1, Geciova J., Bury D., Jelen P. (2001): Methods for disruption microbial cells for potential use in the dairy industry a review. Int. dairy J. 12, Kontaktní adresa: abrlovam@vscht.cz 42

43 MOŽNOSTI NÁHRADY TRADIČNÍCH TAVICÍCH SOLÍ PŘI VÝROBĚ TAVENÝCH SÝRŮ Černíková Michaela 1), Hladká Kristýna 2), Buňka František 1) 1) Ústav technologie a mikrobiologie potravin, FT UTB ve Zlíně 2) Ústav biochemie a analýzy potravin, FT UTB ve Zlíně Possibility of substition of traditional emulsifying salts during processed cheese production Summary: Different hydrocolloids (e. g. modified starch with bound sodium octenyl succinate, low methoxyl pectin (alone or combined with lecithin), locust bean gum, κ-carrageenan and ι-carrageenan; generally at concentrations in the final product of 1.0% w/w) and monoacylglycerols were worldwide examined as possible replacements for traditional phosphate- and citrate-based emulsifying salts in processed cheese production. Modified starch, locust bean gum and low methoxyl pectin could not be recommended as replacements for traditional emulsifying salts. Model processed cheeses without traditional emulsifying salts of 40% (w/w) dry matter and 55% (w/w) fat-in-dry matter containing 1.0% (w/w) κ-carrageenan or ι-carrageenan were found to be homogeneous, however the products were hard with fracturable texture. Úvod Tavené sýry a jejich analogy patří mezi potraviny, které jsou zdrojem bílkovin, tuků, minerálních látek a vitaminů. Tradičně jsou tavené sýry vyráběny mícháním surovin a přídatných látek při teplotách pohybujících se obvykle v rozmezí C za mírného podtlaku. Suroviny pro výrobu tavených sýrů zahrnují především přírodní sýry, dále pak máslo, tavicí soli a vodu (popř. další mléčné nebo nemléčné suroviny). 1,2 Tavicí soli hrají při produkci tavených sýrů významnou roli a zabezpečují výrobu homogenních výrobků s odpovídajícími konzistenčními vlastnostmi. Vlastní účinek tavicích solí spočívá ve výměně vápenatých kationů nerozpustného parakaseinanu vápenatého za ionty sodné, čímž vzniká rozpustnější parakaseinan sodný. Následkem aplikace tavicích solí dochází k peptizaci řetězců, rozptýlení a hydrataci bílkovin, emulgaci a stabilizaci tuku. 1,3 Nejčastěji se jako tavicí soli používají sodné soli fosforečnanů a polyfosforečnanů, u kterých s rostoucí délkou řetězce roste jejich afinita k vápenatým iontům. Vápenaté ionty a fosforečnany přispívají při procesu krémování k utváření finální trojrozměrné proteinové matrice. 1 Vazba vápenatých iontů s fosforečnany pravděpodobně přispívá ke zhoršení biologické využitelnosti vápníku z tavených sýrů. 4 Tato úvaha vychází z faktu, že nadměrné množství fosforu v dietě může přispívat k rozvoji některých onemocnění pohybové soustavy (např. osteoporózy), zejména je-li spojeno s nízkým příjmem vápníku. 5 Optimální poměr vápníku a fosforu ve výživě je 1:1 nebo vyšší. 6,7 V tavených sýrech je však poměr Ca:P redukován, obvykle se pohybuje na úrovni 1:1,5 3,0. 4 Tradiční tavicí soli obsahují také vysokou koncentraci sodných iontů (v některých případech až 30 % hmot.), což je dnes ve výživě také hodnoceno spíše jako negativum a rizikový faktor pro řadu civilizačních onemocnění. 8 Vhodné nahrazení tradičních tavicích solí založených na sodno-fosforečnanových sloučeninách by napomohlo: (i) ke zvýšení poměru Ca:P a tím i využitelnosti vápenatých iontů z tavených sýrů; (ii) ke snížení obsahu sodíku v tavených sýrech; (iii) vývoji a uvedení na trh nového výrobku se zdravotním benefitem. V širším kontextu by, v případě využití biodegradabilních zdrojů, tato náhrada mohla snížit zátěž pro životní prostředí (nadměrný obsah fosforu v prostředí). Na druhou stranu nebude snadné nalézt sloučeniny, které vyhoví výše uvedeným předpokládaným výhodám, a na druhé straně poskytnou homogenní výrobek s rozmanitou škálou texturních vlastností, jako u dnes známého a vyráběného taveného sýra. 43

44 Možné náhrady tavicích solí V dostupné literatuře se o náhradách tradičních tavicích solí fosforečnanového a citranového typu mnoho informací nevyskytuje. Kwak a kol. 9 použili částečně hydrolyzovaný kasein jako náhradu tradičních tavicích solí. Uspokojivé výsledky však autoři dosáhli pouze při částečné náhradě tavicích solí (do 50 %). Při úplné náhradě se výrazně zhoršila tavitelnost směsi a zvýšila se pravděpodobnost uvolňování tuku u finálního výrobku. Další zmínku je možné najít v práci Carić & Kaláb 10, kteří uvedli, že lze nahradit až 50 % tradičních tavicích solí monoacylglyceroly a vyrobit tak senzoricky akceptovatelný výrobek. Pluta a kol. 11 aplikovali některé hydrokoloidy (modifikovaný škrob, lokustovou gumu, xanthanovou gumu a nízkomethylovaný pektin) jako částečnou náhradu tradičních tavicích solí. Poměrně uspokojivých výsledků dosáhli zejména s modifikovaným škrobem a lokustovou gumou. Cestu hydrokoloidů při náhradě tavicích solí zvolili i Schäffer a kol. 4,12 Autoři však druh hydrokoloidu nespecifikovali, deklarovali pouze, že je rostlinného původu. Na výše zmíněné práce navázali Černíková a kol. 13,14, kteří sledovali možnost nahradit tradiční tavicí soli aplikací hydrokoloidů nízkometylovaného pektinu (v kombinaci s lecitinem) a karagenanů (κ- a ι-karagenany). Ze studií vyplynulo, že v případě pektinu (ani v kombinaci s lecitinem) nedojde na úrovni mikrostruktury k tvorbě homogenního výrobku. Na druhou stranu v případě karagenanů lze získat makroskopicky (organolepticky) i mikroskopicky homogenní produkt. Hydrokoloidy jako možné náhrady tavicích solí Hydrokoloidy jsou z chemického hlediska polysacharidy anebo proteiny patřící v dnešní době k široce využívaným přídatným látkám. Hydrokoloidy jsou využívány díky svým schopnostem tvořit gel, stabilizovat pěny, emulze a disperze. K nejvíce využívaným hydrokoloidům na bázi polysacharidů patří přírodní a modifikované škroby, karagenan, pektin, xantanová, arabská a lokustová guma. 15,16 Karagenany jsou vysokomolekulární lineární anionaktivní polysacharidy, které jsou extrahovány z červených mořských řas čeledi Rhodophyceae, především z rodů Euchema, Chondrus a Gigantina. Základem struktury karagenanů je disacharid karabióza složený ze stavebních jednotek β-d-galaktopyranózy a 3,6-anhydro-α-D-galaktopyranózy spojených vazbou β-(1 4). Karabiózy jsou v karagenanu spojeny především vazbou α-(1 3). Karabióza κ-karagenanu obsahuje jednu sulfátovou skupinu. 16 Kappa-karagenan se může ve vodném prostředí v závislosti na teplotě vyskytovat ve dvou stavech, a to v uspořádané helikální struktuře (šroubovici) a v neuspořádaném stavu. Teplota přechodu z helikální struktury do neuspořádaného stavu se ve vodném prostředí obvykle pohybuje v intervalu C a je závislá na řadě parametrů. 16,17 Tvorba helixů podmiňuje u karagenanů jejich schopnost vytvářet gely, které vznikají asociací helikálních struktur. 17,18 Polysacharidy jsou obecně hodnoceny jako stabilizátory emulzí spíše než pravé emulgátory. Přesto je možné v literatuře nalézt zmínky o povrchové aktivitě polysacharidů, která je pravděpodobně způsobena: (i) přítomností reziduí bílkovinného původu s hydrofobními aminokyselinami, které jsou vázány na polysacharid; (ii) schopností snižovat povrchové napětí; (iii) schopností rapidně zvýšit viskozitu kontinua matrice a tím snížit čas potřebný ke spojování tukových částic, resp. separaci hydrofobních a hydrofilních fází; (iv) částečným hydrofobním charakterem některých polysacharidů, a to díky acetylovým nebo jiným skupinám Podle Dickinson 15 a Nakauma a kol. 22 je povrchová aktivita polysacharidů dána především proteinovými nečistotami vázanými (kovalentně nebo nekovalentně) na sacharidické složky. 44

45 Aplikace karagenanů jako možných náhrad tavicích solí Černíková a kol. 13,14 publikovali práci, kde jako možnou náhradu tavicích solí označili κ-karagenan (v koncentraci 1 % hmot.). Jako modelový systém použili tavený sýr s obsahem sušiny 40 % (hmot.) a % (hmot.) tuku v sušině. Homogenitu vzorků posuzovali na makroskopické úrovni pomocí senzorické analýzy a na mikroskopické úrovni pomocí dynamické oscilační reometrie a světelné mikroskopie. 13,14 Zdůvodnění schopnosti κ-karagenanu stabilizovat tukové kuličky a vodu v trojrozměrné proteinové matrici lze pravděpodobně hledat ve vazbě κ-karagenanu na kaseinové bílkoviny (a jejich hydrolyzáty) v přítomnosti vápenatých iontů. Tyto komplexy pravděpodobně disponují hydrofilními a hydrofobními segmenty, které pak mohou působit jako povrchově aktivní látky. Svou roli zde zřejmě sehrává i schopnost κ-karagenanu rychle zvýšit viskozitu systému. 15,16,21,23 K těmto procesům pravděpodobně přispívají i slabé chelatační vlastnosti karagenanů vůči dvojmocným iontům. 24 Vzniklý výrobek má však odlišné vlastnosti ve srovnání s taveným sýrem, k jehož výrobě byly použity tradiční tavicí soli. Hlavní odlišnost spočívá ve vysoké tuhosti vzniklého výrobku, což je patrné z Obr. 1, který znázorňuje křivky tuhnutí: kontrolního výrobku, kde byly použity tradiční tavicí soli (2 % hmot.) bez přídavku κ-karagenanu, výrobku, kde byly tradiční tavicí soli zcela nahrazeny κ-karagenanem (1 % hmot.), výrobku, kde byly použity tradiční tavicí soli (2 % hmot.) i κ-karagenan (1 % hmot.). Horká tavenina byla nalita do měřící geometrie dynamické oscilační reometrie (válec ve válci) a řízeně chlazena z 80 C na 10 C (1 C min -1 ). Komplexní modul pružnosti G* (Pa) Teplota taveniny T ( C) Obr. 1. Závislost komplexního modulu pružnosti (G*) na klesající teplotě taveniny (T) s obsahem sušiny 40 % (hmot.) a obsahem tuku v sušině 55 % (hmot.): kontrolní výrobek, kde byly použity tradiční tavicí soli (2 % hmot.) bez přídavku κ-karagenanu ( ); výrobek, kde byly tradiční tavicí soli zcela nahrazeny κ-karagenanem (1 % hmot.) ( ); a výrobek, kde byly použity tradiční tavicí soli (2 % hmot.) i κ-karagenan (1 % hmot.) ( ). Převzato a upraveno podle Černíková a kol. 14 U kontrolního vzorku byl při chlazení zaznamenán postupný a pomalý nárůst hodnot komplexního modulu pružnosti. Tento nárůst se mírně zrychlil při teplotách C. Průběh chlazení u modelového taveného sýra bez použití tradičních tavicích solí byl zcela odlišný. 45

46 V oblasti teplot C byl nárůst komplexního modulu pružnosti (G*) rovněž postupný a pomalý, tavenina měla mírně nižší G* ve srovnání s kontrolním vzorkem. V oblasti teplot C však došlo ke skokovému (prakticky stonásobnému) zvýšení komplexního modulu pružnosti (G*). Při dalším chlazení z 45 C na 10 C byl již pozorován pouze postupný a pomalý nárůst G*. Charakter nárůstu komplexního modulu pružnosti (G*) se při teplotách C již neměnil na rozdíl od kontrolního vzorku. Při analýze modelového vzorku s použitím tavicích solí i 1 % hmot. κ-karagenanu bylo zjištěno, že v celém průběhu chlazení (80 10 C) vykazuje vyšší komplexní modul pružnosti než kontrolní vzorek. V oblasti teplot C byl zaznamenán pozvolný nárůst G* následovaný prudším zvýšením G* při přechodu z 55 C na 45 C. Nárůst rychlosti zvyšování komplexního modulu pružnosti (G*) v oblasti C však nebyl tak velký jako u vzorku s 1 % w/w κ-karagenanu bez aplikace tavicích solí. Při poklesu teplot z C byl nárůst G* již pozvolný. V teplotní oblasti C bylo zaznamenáno mírné zvýšení rychlosti růstu G*, obdobné jako v případě kontrolního vzorku. Celkově lze říci, že po zchlazení na 10 C vykazoval nejvyšší hodnotu komplexního modulu pružnosti (G*) vzorek bez použití tavicích solí, následoval produkt s tavicími solemi i κ-karagenanem a produkt s nejnižší hodnotou G* byl kontrolní vzorek. 13,14 Rapidní navýšení komplexního modulu pružnosti při teplotách C pravděpodobně souvisí s přechodem κ-karagenanu z neuspořádané formy do helikální struktury, následnou asociací vzniklých šroubovic a tvorbou gelu. 18 Provedená studie křivek tuhnutí poukazuje na fakt, že výrobek, kde byly tradiční tavicí soli nahrazeny κ-karagenanem, má ve srovnání s tradičními produkty jiné konzistenční vlastnosti. Závěr Problematika náhrady tradičních tavicích soli fosforečnanového a citranového typu není zdaleka ještě vyřešena. Přístup aplikací κ-karagenanu je pouze jednou z prvních variant, kterou je však nutné podrobit dalším testům. Je třeba tuto možnost otestovat v širším rozmezí obsahů sušiny a tuku v sušině, v přítomnosti dalších surovin mléčného, popř. nemléčného původu apod. Rovněž je nutné detailněji zmapovat vlastnosti nově vzniklého produktu např. jeho tavitelnost, stabilitu vazby tuku, změnu konzistence v průběhu skladování aj. Problémem prozatím zůstává jeho vysoká tuhost, která jej staví do roviny neroztíratelného výrobku, který by většinoví spotřebitelé nemuseli kladně přijmout. Těmto otázkám bude třeba se v další práci věnovat. Poděkování: Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM Použitá literatura: 1. Guinee, T. P., Carić, M., Kaláb, M., (2004). Pasteurized processed cheese and substitute/imitation cheese products. In. P. F. Fox, P. L. H. McSweeney, T. P. Cogan, T. P. Guinee (Eds.), Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Vol. 2: Major Cheese groups (3rd ed) (pp ). London, UK: Elsevier Applied Science. 2. Lu, Y., Shirashoji, N., Lucey, J. A., (2007). Rheological, textural and melting properties of commercial samples of some of the different types of pasteurized processed cheese. International Journal of Dairy Technology, 60, Lucey, J. A., Johnson, M. E., Horne, D. S., (2003). Perspectives on the basis of the rheology and texture properties of cheese. Journal of Dairy Science, 86, Schäffer, B., Lörinzy, D., Belágyi, J., (1999). DSC and electronmicroscopic investigation of dispersiontype processed cheeses made without peptization. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 56, Cashman, K. D., (2006). Milk minerals (including trace elements) and bone health. International Dairy Journal, 16,

47 6. Buchman, A. L., Moukarzel, A., (2000). Metabolic bone disease associated with total parenteral nutrition. Clinical Nutrition, 19, Palacios, C., (2006). The role of nutrients in bone health, from A to Z. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46, Palar, K., Sturm, R., (2009). Potential societal savings from reduced sodium consumption in the US adult population. American Journal of Health Promotion, 24, Kwak, H. S., Choi, S. S., Ahn, J., Lee, S. W., (2002). Casein hydrolysate fraction act as emulsifiers in processed cheese. Journal of Food Science, 67, Carić, M., Kaláb, M., (1997). Processed cheese products. In P. F. Fox, P. L. H. McSweeney, T. P.Cogan (Eds.), Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Vol. 2: Major Cheese groups (2nd ed) (pp ). London, UK: Elsevier Applied Science. 11. Pluta, A., Ziarno, M., Smolińska, A., (2000). Możliwości zastosowania hydrokoloidów w produkcji serów topionych. Przemysl Spożywczy, 5, (in Polish, with English abstract). 12. Schäffer, B., Szakály, S., Lörinczy, D., Schäffer, B., (2001). Processed cheeses made with and without peptization. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 64, Černíková, M., 2009: Studium možností snížení obsahu tavicích solí v tavených sýrech [dizertační práce]. Zlín: UTB. 14. Černíková, M., Buňka, F., Pospiech, M., Tremlová, B., Hladká, K., Pavlínek, V., Březina, P. (2010). Replacement of traditional emulsifying salts by selected hydrocolloids in processed cheese production. International Dairy Journal, doi: /j.idairyj (v tisku) 15. Dickinson, E., (2003). Hydrocolloids at interfaces and the influence on the properties of dispersed systems. Food Hydrocolloids, 17, Phillips, G. O., Williams, P. A., (2000). Handbook of hydrocolloids. Boston, MA, USA: CRC Press. 450 p. 17. Nickerson, M. T., Paulson, A. T., Hallett, F. R., (2004). Dilute solution properties of κ-carrageenan polysaccharides: effect of potassium and calcium ions on chain conformation. Carbohydrate Polymers, 58, Langendorff, V., Cuvelier, G., Launay, B., Michon, C., Parker, A., de Kruif, C. G., (1999). Casein micelle/iota carrageenan interactions in milk: influence of temperature. Food Hydrocolloids, 13, Garti, N., Leser, M. E., (2001). Emulsification properties of hydrocolloids. Polymers for Advanced Technologies, 12, Benichou, A., Aserin, A., Garti, N., (2002). Protein-polysaccharide interactions for stabilization of food emulsions. Journal of Dispersion Science and Technology, 23, Rinaudo, M., (2008). Main properties and current applications of some polysaccharides as biomaterials. Polymer International, 57, Nakauma, M., Funami, T., Noda, S., Ishihara, S., Al-Assaf, S., Nishinari, K., Phillips, G. O., (2008). Comparison of sugar beet pectin, soybean soluble polysaccharide, and gum arabic as food emulsifiers. 1. Effect of concentration, ph, and salts on the emulsifying properties. Food Hydrocolloids, 22, Hemar, Y., Hall, C. E., Munro, P. A., Singh, H., (2002). Small and large deformation rheology and microstructure of κ-carrageenan gels containing commercial milk products. International Dairy Journal, 12, Kim, S. G., Lee, K. S., Lee, K. H., (2006). Polyelectrolyte complex membranes based on two anionic polysacchardides composed of sodium alginate and carrageenan: the effect of annealing on the separation of methanol/water mixures. Journal of Applied Polymer Science, 102, Kontaktní adresa: Doc. Ing. František Buňka, Ph.D., Ústav technologie a mikrobiologie potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T. G. Masaryka 275, Zlín, tel.: , bunka@ft.utb.cz. 47

48 TECHNOLOGIE VÝROBY SYROVÁTKOVÝCH NÁPOJŮ Tůma Štěpán, Běláková Markéta, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická, Praha, Česká Republika Technology of whey drink production Summary: The whey drinks are widespread in Europe in many variations. The whey contains many components with different healthy benefits. The most nutritionally important are essential amino acids and non-essential amino acid cystein. The whey drink is supposed to be nutritionally interesting milk products for the customers. However, the technology of whey drinks production is not still very well described. The basic properties and parameters of raw whey, during cheese production are necessary for the successful using in the whey fermented beverage production. In this study, the different whey, from the semi-hard and hard cheese, was tested. The influence of the each whey from the different kind of cheese on the whey drink production was observed. Syrovátkové nápoje V současné době se na trhu s mléčnými výrobky vyskytuje celá škála výrobků na bázi syrovátky od různých výrobců. Nejbohatší a nejpestřejší výběr výrobků nabízí zřejmě trh rakouský. V České republice tyto výrobky teprve začínají zaujímat svá místa v obchodech. Polovinu zde dostupných výrobků činí výrobky zahraniční výroby, a to jak rakouské, tak německé. Syrovátkové nápoje mají příznivý vliv, obsahují vitamíny a další zdraví prospěšné látky, mají nízký obsah tuku (0,1%). Nejčastějšími příchutěmi syrovátkových nápojů jsou exotická ovoce jako je mango a marakuja, dále pomeranč, ananas či různá spojení s mrkví. Společnými složkami všech nápojů je syrovátka (většinou sladká), cukr nebo sladidla (aspartam a acesulfam), ovocná šťáva z koncentrátu, stabilizátor (většinou pektin). Pro design obalů jsou voleny pestré barvy, vždy s obrázkem ovocné příchutě, ve většině případů je zdůrazněn nízký obsah tuku. Typ použité syrovátky a její parametry, technologické postupy získávání, použití syrovátky a výroba syrovátkových nápojů nejsou příliš známy. Vznik a složení syrovátky Syrovátka vzniká jako vedlejší produkt při výrobě sýrů nebo tvarohu. Sladká syrovátka vzniká při výrobě sýrů, kdy dochází ke srážení bílkovin pomocí enzymového syřidla. Průměrně se z 10 litrů mléka získá 9 litrů syrovátky, ale vše záleží na typu sýra a obsahu tuku v mléce. V syrovátce je obsaženo průměrně 50 % sušiny mléka, ta se pohybuje v rozmezí 5,5-6,6 %, z čehož největší podíl tvoří laktóza asi % sušiny (4) a dále bílkoviny asi 10 % sušiny (6). Výživové vlastnosti syrovátky Mezi nejdůležitější složky syrovátky patří sérové bílkoviny a jejich součásti, dále laktosa, vitaminy a minerální látky. Syrovátka má příznivý výživový profil (vzhledem k obsahu esenciálních aminokyselin), rozmanité funkční vlastnosti a nízké náklady na výrobu (3). Sérové bílkoviny vyskytující se v syrovátce se dělí na α-laktalbumin, β-laktoglobulin, sérový albumin a imunoglobuliny. Součástí sérových bílkovin je také proteázo-peptonová frakce, laktoferin a transferin (7,9). α-laktalbumin pomáhá zvyšovat imunitu a snižovat riziko některých druhů rakoviny. Často je také využíván jako zdroj aminokyselin s rozvětveným řetězcem (isoleucin, leucin a valin) (11). β-laktoglobulin je dobrým zdrojem cysteinu, který je důležitý pro syntézu glutathionu. Ten chrání buňky především proti oxidačnímu stresu, snižuje riziko vzniku rakoviny a po dobu chemoterapeutické léčby rakoviny chrání zdravé buňky (11). Bovinní sérový albumin je také důležitým zdrojem cysteinu a tím i důležitý pro produkci glutathionu v játrech. Váže na sebe mastné kyseliny a další malé molekuly (6). 48

49 laktoferin má mnoho biologických funkcí - antimikrobiální, imunoprotektivní a antioxidační, dále váže a transportuje železo. Jeho nejbohatším zdrojem je mlezivo (kolostrum), jeho obsah v mléce postupně s časem klesá. Využívá se k léčení chronické hepatitidy C a kožních infekcí. Má příznivý vliv na růst bifidobakterií v zažívacím traktu (5). Enzym laktoperoxidáza v organismu katalyzuje peroxidaci thiokyanátu a některých halogenidů, zejména bromu a jódu, za vzniku látek se silnými antibakteriálními a antioxidačními účinky (8). Toho se využívá hlavně ve výrobcích pro zubní hygienu k omezení vzniku zubního kazu a v poslední době i k léčbě kožních onemocnění. Laktóza je nejvíce zastoupeným sacharidem v mléce (4,4-4,9 %) a představuje hlavní zdroj uhlíku a energie. Laktóza je výhodná jako prebiotikum, tj. jako látka schopná podporovat růst probiotických bakterií střevní mikroflóry (10). Technologie výroby syrovátkových nápojů Technologie syrovátkových nápojů se skládá ze základních operací, které jsou důležité pro dosažení kvalitního a zdravotně nezávadného produktu. Základní surovinou může být sladká syrovátka nebo sušený koncentrát syrovátky. Základní principy technologie výroby jsou uvedeny v jednotlivých bodech. Jedním z nejproblémovějších bodů je výběr vhodné suroviny a její úchova, ošetření a příprava pro použití. 1. Příprava suroviny- sladká syrovátka z výroby sýrů (úchova, chlazení, filtrace, odstřeďování), nebo sušený koncentrát (rozpouštění). 2 Rozpuštění- při C, v případě použití sušeného koncentrátu. 3. Ohřev při 60 C úprava teploty pro rozpouštění dle použité přísady (přídavek stabilizátorů, vlákniny, dalších aditiv dle dané receptury) 4. Homogenizace. 5. Pasterace- při 95 C, 10 min. 6. Chlazení na fermentační teplotu. 7. Přídavek kultury- při výrobě fermentovaného nápoje použití jogurtové kultury. 8. Fermentace při 37 C, doba fermentace, dle použité kultury, optimální ph na konci fermentace ph 4,6. 9. Chlazení Cvhodné pro optimální trvanlivost výrobku. 10. Přídavek ovocné složky. 11. Plnění a balení. Technologie výroby a práce se syrovátkou je závislá na technologickém vybavení a možnostech dané mlékárny. Volba použití čerstvé sladké syrovátky nebo sušeného koncentrátu významně ovlivní možnosti a technologii zpracování syrovátky a výroby syrovátkových nápojů. Experimentální část Experimentální část byla naměřena v provozním měřítku. Cílem práce bylo sledovat proces výroby sýrů, vlastnosti a chování syrovátky, sledování a porovnání fyzikálně-chemických parametrů syrovátky (ph, titrační kyselost, sušina) u 3 typů sýra. Současně byly prováděny laboratorní pokusy výroby syrovátkových fermentovaných nápojů. Odběr vzorků První vzorek syrovátky se odebíral v průběhu krájení sýřeniny, druhý před vypouštěním do lisovací vany a třetí po vypuštění z vany, a to u sýrů Eidam 30 % a 45 % t.v s. a tvrdého archivního sýru Sychrov. Odebralo se vždy cca 200 ml syrovátky. Stanovení kyselosti - ph, SH, sušiny Hodnota ph vzorků se stanovovala pomocí digitálního ph metru MPH61 (Monokrystaly, ČR). Titrační kyselost byla stanovena ihned po odběru vzorků. 50 ml vzorku se titrovalo 0,25 mol/l roztokem NaOH za přídavku 1 ml 2 % ethanolického roztoku fenolftaleinu do slabě růžového zbarvení, které je stálé alespoň po dobu 30 sekund dle Soxhlet Henkela. Obsah sušiny se stanovoval na přístroji Sartorius (LABO-MS, spol. s r.o., Německo) s navážkou přibližně 2 g písku a 1 g vzorku (1). Stanovení obsahu tuku, sušiny, ph v syrovátkovém nápoji Obsah tuku se stanovoval acidobutyrometrickou metodou. Bylo pipetováno 10 ml H 2 SO 4 dle Gerbera, 11 ml nápoje a 1 ml amylalkoholu. Po odstředění se odečetlo množství tuku (2). Obsah sušiny se stanovoval na přístroji Sartorius (LABO-MS, spol. s r.o., Německo) 49

50 s navážkou přibližně 2 g písku a 1 g nápoje (ČSN ). Hodnota ph nápoje se stanovovala pomocí digitálního ph metru MPH61 (Monokrystaly, ČR). Skladovací zkoušky- trvanlivost syrovátky Při výrobě tvrdého sýru se před vypouštěním do lisovací vany odebraly asi 3 litry syrovátky. Byly provedeny zkoušky trvanlivosti syrovátky při 30 C a 6 C. V intervalu 0, 2, 4, 6 a 22 hodin se sledoval průběh změn ph a SH. Technologie výroby syrovátkového nápoje V laboratorním měřítku byl vyroben fermentovaný syrovátkový nápoj s příchutí. Pro výrobu byla použita sladká syrovátka z výroby sýrů Eidam a tvrdého archivního sýry Sychrov. Syrovátkový nápoj byl vyroben z 2,5 litru syrovátky, ve které se rozpustí 1,6 % inulinu (Beneo, Belgie), směs se zahřeje na teplotu kolem 60 ºC, aby se dobře rozpustil přidávaný pektin 0,5 % ( Döhler, Německo). Po rozmíchání pektinu se směs pasteruje 10 minut při teplotě 95 ºC a po vychlazení na teplotu 37 C, se zaočkuje 0,1 g kultury YO-MIX 207 (Danisco, Dánsko). Fermentace probíhá po dobu 4 h, dokud se nedosáhne ph < 4,7. Po vychlazení se přidává 12 % ovocné příchutě z koncentrátu (výrobce Agrana, AT). Výsledky a diskuse Z fyzikálně-chemických vlastností se sledovalo ph a titrační kyselosti syrovátky. Tyto hodnoty jsou ukazatelem čerstvosti a jakosti syrovátky. Hodnota titrační kyselosti syrovátky se při vypuštění pohybuje dle typu sýrů přibližně v rozmezí 4,7 5 SH. Hodnoty se mohou lišit v závislosti na použitých kulturách, míře prokysání, typu sýra a výrobním postupu. Bylo tedy nutné otestovat a pokusit se určit rozmezí SH a ph při jakém je možnou ještě syrovátku použít pro výrobu nápojů. Pro sledování parametrů syrovátky z Eidamu 30 % byly provedeny odběry z 2 výrobníků z 1.,2.,3. a 4. výroby v jeden výrobní den (krájení, vypouštění do vany a vypouštění z vany). Hodnota ph syrovátky se pohybovala v rozmezí 6,4 6,6 a titrační kyselost 4,5 5,3 SH. Vyšší hodnoty ph se objevily až ke konci výrobního dne, kdy sýr lépe prokysával. Technologickým rozdílem při výrobě Eidamu 45 % je vyšší teplota dohřívaní, která více podporuje prokysání v závislosti na použité kultuře. To vedlo i při měření k zvýšeným hodnotám SH syrovátky. U tvrdého sýra je technologie výroby odlišná než od výroby Eidamu (neodpouští se syrovátka) a vzorky se tedy odebíraly jen během vypouštění do lisovací vany. V Tab. I jsou uvedeny naměřené průměrné hodnoty ph, titrační kyselosti a sušiny syrovátky získané při výrobě sýrů. Tabulka I Průměrné hodnoty ph, SH a sušiny syrovátky při výrobě sýrů. ph SH sušina (g) 30% EIDAM: Krájení 6,5 5,1 6,03 Vypouštění 6,4 4,7 4,98 Vana 6,5 4,7 4,98 45% EIDAM: Krájení 6,6 5,1 5,40 Vypouštění 6,2 4,8 4,75 Vana 6,0 4,8 4,60 Sychrov: Vypouštění 6,5 5,1 5,55 50

51 Z průměrných hodnot lze vyčíst, že ph syrovátky při krájení se pohybuje kolem hodnoty 6,5 a poté klesá v důsledku prokysávání. Titrační kyselost se pohybovala v rozmezí 4,7 5,1 SH. Hodnoty obsahu sušiny jsou taktéž nejvyšší při krájení. Při vypouštění je sušina nižší, důvodů odpouštění určité množství syrovátky a dopouštění vody. Obsah sušiny při vypouštění a ve vaně by měl být ovšem stejný. Z naměřených dat bylo lze usuzovat, že odběr syrovátky pro výrobu lze provádět v průběhu krájení i vypouštění. Skladovací test na trvanlivost syrovátky je důležitý při výrobě nápojů pro případ, kdy by došlo k přerušení výrobního procesu a materiál by zůstal v potrubí, vyrovnávací nádrži určitou dobu při teplotě cca 30 C. Také je nutné počítat s časovým zdržením při odpouštění a dopravě syrovátky potrubím z výrobníku do vyrovnávací nádrže a do tanků. V tabulkách II a III jsou uvedeny naměřené hodnoty. Pomocí skladovacích testů při daných teplotách lze přesněji určit za jakých možností lze použít syrovátku pro výrobu fermentovaného syrovátkového nápoje. Tabulka II Hodnoty ph a SH při teplotě 30 C. 0 h 2 h 4 h 6 h 22 h ph 5,5 6,3 5,3 4,1 4,0 ºSH (průměr) 5,3 5,8 6,4 8,6 15,6 *hodnoty jsou průměrem ze 3 měření Tabulka III Hodnoty ph a SH při teplotě 6 C. 0 h 2 h 4 h 6 h 22 h ph 5,5 6,4 6,0 6,2 6,2 ºSH (průměr) 5,3 5,6 5,2 5,0 5,0 *hodnoty jsou průměrem ze 3 měření Z výsledků lze říci, že syrovátka jako základní surovina pro výrobu syrovátkového nápoje by byla použitelná pro další zpracování maximálně do 4 hodin od začátku vypouštění, pokud by se nechladila a pouze se přečerpala do zásobní nádrže, tedy maximálně do hodnoty 6,4 SH a ph kolem 5,3. Při delší časové prodlevě během přepravy či odběru by došlo již k přílišnému prokysání. Při skladování po dobu 6 hodin a déle se ph snížilo až na hranici hodnoty 4, kdy už by v připravovaném nápoji nemusela růst přidaná kultura. Syrovátka se musí tedy pasterovat co nejrychleji. Při uskladnění v chladu je potřeba pamatovat, že materiál stále pracuje, ph se prvně mírně zvýší a poté klesá, aby se ustálilo přibližně na hodnotě kolem 6,2. Kyselost syrovátky se pohybovala v přijatelném rozmezí 5,2-5,0. Z naměřených dat lze usoudit, že při dodržení chladírenských podmínek není nutné syrovátku ihned spotřebovat a je zde možný časový odstup před dalším zpracování. Pro výrobu syrovátkových nápojů se použila syrovátky během vypouštění z vany, ze všech tří typů sýrů. Syrovátka se neodstřeďovala ani nefiltrovala. Použitý druh syrovátky neměl vliv na výsledný syrovátkový nápoj. Rozdílný obsah sušiny neovlivnil konečný vzhled SN. Přídavek ovocného koncentrátu ovlivnil barvu, konzistenci, výsledné ph syrovátkového nápoje, a to snížením až pod hranici hodnoty 4. Přídavkem koncentrátu se zvýšil obsah sušiny z průměrné hodnoty kolem 5 g na 11,6 g. Obsah tuku u všech SN byl < 0,1 %. Při laboratorní výrobě nebylo využito filtrace, odstřeďování ani homogenizace. Předpokládá se, že tyto operace by mohly kvalitu syrovátkového nápoje ještě zlepšit. 51

52 Závěr Výroba syrovátkových nápojů se stává rozšířenější. Technologické postupy výroby, zejména technologické operace, parametry a informace o získávání syrovátky, ošetření a přípravě pro výrobu nejsou zcela známy a zdokumentovány. Samotná výroba syrovátkového nápoje je již více známa a řídí se pravidly při výrobě slazených mléčných nápojů nebo fermentovaných výrobků. Tato práce se snažila popsat a identifikovat problémy při získávání a přímé zpracování syrovátky před přípravou a výrobou fermentovaného nápoje. Testována byla pouze sladká syrovátka z výroby sýrů. Syrovátku lze získat a použít jak při krájení tak při vypouštění. Limitujícím faktorem je především objem odpuštěné syrovátky. Dalším limitujícím faktorem jsou dopravní cesty a skladovací možnosti syrovátky pro další zpracování. Toto je technologicky nejproblematičtější operace. Syrovátka, která není zchlazená se musí rychle do 4 hodin zpracovat (zchladit, pasterovat), aby bylo zabráněno nežádoucím změnám a překysání. Toto časové omezení je z pohledu technologického vybavení mlékáren jedním z největších úskalí pro výrobu syrovátkových nápojů. Z hlediska výživy jde o zdraví prospěšné výrobky s nutričními benefity. Syrovátka obsahuje celou řadu důležitých živin pro organismus. Jedná se na víc o přirozený nízkotučný výrobek. Výhodou je taktéž levná vstupní surovina. Poděkování: Tato práce vznikla za podpory grantu MŠMT: MSM Použitá literatura: 1. ČSN : Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Stanovení sušiny. 2. ČSN ISO 2446 (570543): Mléko - Stanovení obsahu tuku (Rutinní metoda) (2001). 3. KILARA A., v knize: Proteins in Food Processing (YADA R.,ed.) [online], str Woodhead Publishing, KJAERDAARD-JENSEN, v knize: Wiley encyklopedia of food science and technology (2nd ed) (Frencis F.J., ed.) [online], str John Wiley&Sons, LÖNNERDAL B., IYERS S.,., v knize: : Proteins in Food Processing (YADA R.,ed.) [online], str Woodhead Publishing, MARSHALL K.R., HARPER W.J., v knize: Wiley encyklopedia of food science and technology (2nd ed) (Frencis F.J., ed.) [online], str John Wiley&Sons, MCCLEMENTS D.J., v knize: Functional dairy products (SAARELA M., ed.) [online], str Woodhead Publishing, REICHERT S.H., MORR C.V., COONEY C.M., v knize: : Proteins in Food Processing (YADA R.,ed.) [online]. Woodhead Publishing, REITER B.,HÄRNULV G., v knize: Food presservation techniques (ZEUTHEN P., BÖGH- SÖRENSEN L., eds.) [online]. Woodhead Publishing, RELKIN, v knize: Whey processing, functionality and health benefits (ONWULATA C.I., HUTH P.J., eds.) [online]. Iowa State University Press (USA), SUKOVÁ, I. Syrovátka v potravinářství. Praha : ÚZPI, ISBN SWAIGSGOOD, v knize: Whey processing, functionality and health benefits (ONWULATA C.I., HUTH P.J., eds.) [online]. Iowa State University Press (USA), Kontaktní adresa: Štěpán Tůma, VŠCHT Praha, Ústav Technologie mléka a tuků, Technická 3, Praha 6, , stepan.tuma@vscht.cz, tel:

53 EMULGAČNÍ VLASTNOSTI SYROVÁTKOVÝCH BÍLKOVIN Kováčová Renáta, Diblíková Lenka a Štětina Jiří Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha Emulsifying properties of whey proteins Summary: Whey proteins are important additive agents for the food industry for their nutritional and functional properties. The aim of this work was to evaluate influence of acidity, heat treatment and salt addition on colloidal properties of whey proteins in relation to their emulsifying properties, where both standards of pure whey proteins and commercial whey protein substrates (whey powder and whey protein concentrate) were used. Size of proteins in solution and their aggregation were determined by dynamic laser scattering method and colloidal stability of whey proteins was characterised by measuring zeta-potential. The model oil-in-water emulsions with various oil content (10-60 % w/w) and equal protein content (0.56 % in water phase) were prepared using a rotor-stator mixer from commercial whey protein substrates. The oil droplets sizes increased both by increasing oil content and by decreasing content of proteins. The content of free oil was significantly higher for reconstituted whey powder in comparison with whey protein concentrate. Whey protein concentrate showed better emulsifying properties than whey powder, significantly for low protein and high oil concentrations. The addition of salts, acidity at ph 4 and high temperatures lead to production of aggregates of whey proteins which had negative influence on emulsifying properties of whey proteins. Mnoho potravinářských surovin má formu emulze nebo se z nich emulse stává v průběhu výrobního procesu. V potravinách se nejčastěji setkáváme se systémem emulze olej ve vodě, kde disperzní prostředí tvoří voda, resp. vodné roztoky a disperzní podíl tvoří nepolární látka, např. olej nebo mléčný tuk. Příkladem mohou být mléko, smetana, omáčky, polévky, majonézy, mléčné dezerty, pudinky, dresinky, ovocné náplně a krémy, směs pro výrobu mražených krémů, snídaňových cereálií, cukrovinek, emulze v masném průmyslu, kořeninové přípravky i alkoholické nápoje jako jsou krémové likéry [1, 2]. Zajímavým typem, s využitím např. do nízkotučných výrobků, mohou být i mnohočetné emulze, kde disperzní podíl tvoří jiná emulze, případně kombinace emulze s bublinkami vzduchu, resp. inertního plynu. Výroba emulze, emulgace, je vysoce energeticky náročný dynamický proces, při kterém se zvětšuje plocha mezifázového rozhraní [3]. Emulze se nejčastěji připravují za přítomnosti emulgátoru intenzivním mechanickým dispegováním (třepáním, mícháním, prosáváním, ultrazvukem apod.), které vede k vzájemnému pronikání obou nemísitelných kapalin. Někdy se získané polydisperzní emulze ještě dodatečně homogenizují ve speciálních homogenizátorech různé konstrukce [4]. Homogenizací značně stoupne stálost emulze. Pro oba typy zařízení platí, že velikost tukových kuliček klesá úměrně s rostoucí velikostí vložené energie. Prodloužení doby emulgace na emulgačním míchadle či opakovaný průchod emulze homogenizátorem vede k menší a jednotnější velikosti tukových kuliček [3]. Emulgátory vedle stabilizačního účinku snižují mezifázovou energii a tím celkově usnadňují vznik emulze [4]. Pro dosažení požadované stability potravinářských výrobků ve formě emulze se nabízí uplatnění syrovátky, jako přírodního aditiva se zajímavými fyzikálně-chemickými vlastnostmi a vysokou nutriční hodnotou. Pozitivním výsledkem mediální anti-kampaně proti aditivům v potravinách byla skutečnost, že výrobci potravin se zaměřili na minimalizaci dávek aditivních látek do potravin, případně jejich úplnou eliminaci, bez negativního vlivu na jakost. Z pohledu legislativy má syrovátka výhodu, že může být použita jako přírodní komponenta, která nemá označení E kódem. Musí se však na výrobku uvést informace o obsahu alergenu - skupina Mléko a výrobky z něj podle Směrnice evropského parlamentu a rady 2000/13/ES, týkající se označování potravin a její novelizace: Směrnice evropského parlamentu a rady 2003/89/ES, jejíž příloha IIIa je změněna Směrnicí komise 2007/68/ES [5]. Jako emulgátor se ze syrovátky uplatňují její bílkoviny. Syrovátkové bílkoviny jsou hlavní dusíkaté látky, které zůstanou v mléku po vysrážení kaseinu. Tvoří je asi z 50 % globulární protein β-laktoglobulin s relativní molekulovou hmotností 18 kda, α-laktalbumin (25 30 %) s relativní molekulovou hmotností 14 kda a sérový albumin s molekulovou hmotností 66 kda. Další frakce tvoří peptidy, nízkomolekulární proteiny, 53

54 imunoglobuliny a v sladké syrovátce navíc kaseinomakropeptid [6]. Hlavní podíl na chování syrovátky jako funkčního aditiva má β-laktoglobulin jako její majoritní bílkovina. Z funkčního hlediska jsou však zajímavé i ostatní frakce, například i tak minoritní skupina jako jsou proteasopeptonové frakce, protože obsahují povrchově aktivní peptidy. Syrovátkové bílkoviny vykazují, kromě již zmiňovaných emulgačních vlastností, i pěnotvorné a želírující vlastnosti a k stabilizaci výrobku může být užitečná i jejich schopnost vázat vodu [2, 3, 7]. V praxi se obvykle čisté syrovátkové bílkoviny nevyužívají, protože jejich separace je velmi náročná a jsou tudíž relativně drahé. Proto se snažíme využít přímo syrovátku a to sušenou i čerstvou, sladkou i kyselou. Moderní jsou koncentráty nebo izoláty syrovátkových bílkovin získané ultrafiltrací, případně demineralizací, dále pak produkty modifikované hydrolýzou příp. obohacené o některou frakci bílkovin. Tyto produkty se navzájem liší, zejména podílem syrovátkových bílkovin a doprovodných látek (laktosa, minerální látky), což má za následek velkou variabilitu jejich funkčních vlastností, které jsou současně ovlivněny i technologickými procesy použitými při jejich přípravě (např. tepelné ošetření a sušení) [8]. Funkční vlastnosti syrovátkových bílkovin jsou dány strukturou molekuly a dále ve výrobku i různými mezimolekulárními interakcemi mezi proteiny navzájem a interakcemi s jinými složkami potraviny. Důležitými faktory ovlivňující tyto interakce a celkové chování bílkovin jsou kyselost, obsah a typ solí, teplota a vliv ostatních složek potraviny [3, 7]. Při hodnotách ph nižších než je isoelektrický bod proteinu, je celkový náboj molekuly kladný a daná bílkovina se chová jako polykationt. Nad isoelektrickým bodem se molekuly bílkovin chovají jako polyanionty [9]. Při nízkém přídavku solí mohou být některé bílkoviny lépe rozpustné, při větší koncentraci, nebo jiném typu soli, může naopak docházet k jejich vysolování, tedy poklesu rozpustnosti, až jejich vysrážení [1]. Vlivem záhřevu dochází u bílkovin k trvalé nebo vratné změně struktury, zejména z důvodů oslabení či destrukce intramolekulárních stabilizujících interakcí. Změnou struktury molekuly záhřevem často dochází k odkrytí interaktivních míst, což vede k následné agregaci s jinými molekulami bílkovin nebo jiných makromolekul [1]. Různé mezimolekulární interakce můžou vést k často negativní asociaci, agregaci, polymeraci, příp. separaci fází [10]. Znalostí chování syrovátkových bílkovin v těchto podmínkách můžeme cíleně ovlivňovat jakost výrobků či předurčovat receptury a chování nových výrobků. Pro srovnání vlastností jednotlivých produktů syrovátkových bílkovin dosud chybí standardní metody pro hodnocení emulgačních vlastností, protože tyto vlastnosti jsou ovlivňovány mnoha faktory, nejvíc závisí na podmínkách emulgace, a to např. i na použitém emulgačním zařízení [11]. Užitečná může být aspoň charakterizace dle vybraných parametrů vztahujících se ke konkrétním aplikačním potřebám. Cílem této práce bylo charakterizovat emulgační vlastnosti různých syrovátkových substrátů z více hledisek, jako emulgační kapacita (vztahující se k obsahu oleje, který můžeme zaemulgovat při určité koncentraci bílkovin); dále velikost tukových kuliček, která nám může poskytnout informaci např. o stabilitě a vzhledu emulze nebo i o jejím vnímaní v ústech; obsah volného tuku, který se negativně projevuje na vzhledu výrobku, či obsah bílkovin na fázovém rozhraní. Změna kyselosti prostředí, teploty a obsahu solí byly vybrány jako modelové podmínky charakterizující variabilitu ve vlastnostech syrovátky jako suroviny a dějů při výrobním procesu. Materiál a metody Jako zdroj syrovátkových bílkovin byly v této práci použity tyto substráty: β-laktoglobulin o čistotě 90 % (Sigma Aldrich, L3908) α-laktalbumin o čistotě 85 % (Sigma Aldrich, L6010) hovězí sérový albumin o čistotě 92 % (Roanal Budapešť) Obnovená syrovátka, což je 7% roztok sušené syrovátky (Promil a.s. Nový Bydžov, ČR), obsah bílkovin po obnovení 0,56 %, popeloviny 0,6 %, ph 6,5 Koncentrát syrovátkových bílkovin WPC 70 (Promil a.s. Nový Bydžov, ČR) obnoven na 1% roztok s obsahem bílkovin 0,56 %, popeloviny 0,6 % a ph 6,5 54

55 Práškové preparáty byly naváženy a rozpuštěny v Millipore vodě (vodivost 0,05 μs/cm). Úprava ph byla prováděna roztokem kyseliny chlorovodíkové nebo hydroxidu sodného (přídavek menší než 2 %). Úprava iontové síly byla prováděná přídavkem naváženého množství soli (NaCl, CaCl 2 ) přímo do tekutého substrátu. Záhřev vzorků byl prováděn v temperační jednotce přístroje Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) ve skleněné kyvetě PCS Emulze typu o/v s obsahem tuku % byly připravovány z obnovených substrátů zaemulgováním směsného rostlinného oleje CERESOL (řepkový a slunečnicový, Setuza a.s., Ústí nad Labem, ČR) pomocí emulgačního míchadla Silent Crusher M (Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, D) při otáčkách po dobu 10 minut a teplotě 40 C. Velikost částic v roztocích bílkovin byla stanovena metodou dynamického rozptylu světla (DLS) na přístroji Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK). Vzorky byly měřeny po odfiltrování prachu a velkých agregátů (stříkačkové filtry typu PVDF o porozitě 5 a 0,45 μm, dodavatel Chromservis s.r.o. Praha, ČR) v plastových čtvercových kyvetách o tloušťce 1 cm při teplotě 25 C, resp. při teplotním trendu C ve skleněné kyvetě. Výsledky jsou vyjádřeny jako parametry distribuce velikosti částic podle intenzity rozptýleného světla (medián a 10 a 90% kvantil) nebo z ní vyjádřený hydrodynamický průměr (Z-Average). Zeta-potenciál byl stanoven metodou Dopplerovy laserové elektroforézy na stejném přístroji. Měření bylo prováděno v mikroelektroforetických kyvetách DTS 1060 při teplotě 25 C. Hodnota Henryho funkce (faktor vztažený ke geometrii částice a její elektronové dvojvrstvě) byla 1,5 (doporučená hodnota pro měření v polárním médiu). Viskozita média byla při 25 C 1,0984 mpa.s a refrakční index 1,345 pro syrovátkové substráty, respektive 0,8872 mpa.s a 1,330 pro vodné roztoky. Refrakční index bílkovin byl zvolen 1,450 a absorbance 0,001, relativní dielektrická konstanta vody 78,5. Při hodnocení distribuce velikosti tukových kapének v emulzích byla použita metoda laserové difrakce (Mastersizer 2000, Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) verifikována pozorováním emulzí pomocí mikroskopu Leica 55 s digitální kamerou Leica DFC 320 (Leica Microsystems Ltd., Wetzlar GmbH, D). Pro rozptýlení případných shluků tukových kapének byl použit 0,1% roztok laurylsíranu sodného. Index emulgační aktivity (m 2 /g) udávající plochu fázového rozhraní stabilizovanou jednotkou hmotnosti proteinu při standardních podmínkách emulgace, byl přepočten z velikosti tukových kapének D[3,2] (střední hodnota průměru kapének vztažená plochou povrchu) a obsahu bílkovin na fázovém rozhraní w br (rozdíl obsahu dusíku (dle Kjeldahla; Kjeltec Auto 1030 Analyzer, Foss Tecator AB, Höganäs, SE) mezi celým objemem emulze a její vodní fázi po odstředění, vynásoben koeficientem 6,38)) dle odvozeného vztahu, kde m t je obsah tuku (oleje) a ρ t jeho hustota: EAI = 2,4m D[3,2] ρ w t t br Obsah volného tuku v emulzi byl stanoven gravimetricky po extrakci volného oleje z emulze do organických rozpouštědel (diethylether a petrolether) a jejich následném odpaření. Název tukové kuličky používaný v mlékárenské technologii byl nahrazen výrazem tukové kapénky, protože se jedná o uměle vytvořené emulze. Výsledky a diskuze Pro velikost tukových kapének, která byla v připravovaných emulzích stanovena metodou laserové difrakce a pozorovaná souběžně i pomocí mikroskopu, můžeme říct, že roste úměrně se zvyšujícím se obsahem tuku (10 60 %) (obr. 1) a se snižujícím se obsahem bílkovin (naředění vodné fáze 1 a 2krát) (obr. 2), a to jak u vzorků sušené syrovátky tak i u vzorků koncentrátu syrovátkových bílkovin (v obrázcích jsou zobrazeny výsledky pouze pro WPC). Pro emulze budou dále proto pro zjednodušení diskutovány pouze výsledky získané pro emulze s obsahem tuku 10 % (příp. pro vliv denaturace, emulze s obsahem 10 a 60 %). 55

56 d (μm) d (0.1) d (0.5) d (0.9) Obsah oleje (%) Obr. 1 Závislost velikosti tukových kapének na obsahu oleje pro emulze koncentrátu syrovátkových bílkovin ( 10% kvantil, medián (50% kvantil) a 90% kvantil). 10 % 60 % 10 % 60 % 10 % 60 % 1 % WPC 10 μm 0.5 % WPC 10 μm 0.25 % WPC Obr. 2 Mikroskopický obraz emulzí koncentrátu syrovátkových bílkovin (WPC) o koncentraci 1, 0,5 a 0,25 % a s obsahem tuku 10 a 60 % (měřítko 10 μm). Změna kyselosti prostředí se nejvýrazněji projevila na změně povrchového náboje bílkovin, vyjádřeného jako zeta-potenciál (ζ). Tento náboj přechází při snižování ph (obr. 3A) z negativních do pozitivních hodnot a v oblasti isoelektrického bodu (ζ=0) způsobí ztráta vnějšího náboje silné interakce mezi molekulami bílkovin vedoucí v roztoku k jejich agregaci. Velikost těchto agregátů, která byla měřená metodou dynamického rozptylu světla, dosahuje např. pro β-laktoglobulin až 2,5 µm (obr. 3B). Tato agregace se negativně odrazí na emulgačních vlastnostech syrovátkových bílkovin, kdy se z důvodu horší mobility těchto agregátů na fázové rozhraní, za stejných podmínek emulgace vytvoří větší tukové kapénky (obr. 4A) (nárůst velikosti tukových kuliček 10% emulze o 24 %). Dokonce při ph 4 jednotlivé tukové kapénky agregují k sobě a vytváří větší shluky o velikosti až 20 µm (obr. 4B) ve tvaru hroznů tukových kapének (obr. 4C), které mohou mít ještě větší tendenci vyvstávat, než samostatné větší tukové kapénky. Tohoto jevu se případně může využít i ve prospěch stability emulze, kdy u některých případů koncentrovanějších emulzí může dojít k situaci, že tření mezi shluky zpomaluje vyvstávání, případně se jednotlivé shluky propojí až do určité stabilizující trojrozměrné sítě. A) B) 20 Zeta Potential (mv) ph ph Obr. 3. Vliv ph na zeta-potenciál (A) a velikost částic (Z-Average) (B) β-laktoglobulinu ve vodném roztoku. Když se průměr tukových kapének a obsah bílkovin na fázovém rozhraní přepočte na hodnoty indexu emulgační aktivity (obr. 5A), je patrné, že nejlepší emulgační vlastnosti vykazují vzorky obnovené syrovátky, ale obecně i jiných substrátů, při svém přirozeném ph (ph 6,5). Z-Average (μm) μm 56

57 Dalším sledovaným faktorem byl vliv obsahu a typu solí na syrovátkové bílkoviny a jejich emulgační vlastnosti za těchto podmínek. Zvýšením iontové síly vodného roztoku bílkovin (přídavek chloridu od 0 do 100 mm) dochází k redukci elektrostatických odpudivých sil mezi molekulami bílkovin [7], jak je patrné z klesajících hodnot zeta-potenciálu uvedených v tabulce I na příkladu sérového albuminu a obnovené syrovátky. Toto pak vede u bílkovin k jejich vzájemné interakci a následné agregaci do větších částic. Pro chlorid sodný byly pozorovány částice o velikosti kolem 100 nm a pro chlorid vápenatý dosahovaly tyto agregáty velikost až 1 µm. A) B) C) D[4,3] [μm] Velikost samostatných tukových kuliček ph D[4,3] [μm] Velikost tukových kuliček vč. agregátů ph Obr. 4. Velikost tukových kuliček v 10% emulzi obnovené syrovátky (D[4,3] střední hodnota průměru částic vážená objemem). C) Mikrofotografie emulze - shluky tukových kuliček při ph 4 (měřítko 10 μm). A) B) EAI [m 2 /g] EAI [m 2 /g] NaCl CaCl2 0 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 ph ,048 0,040 % 0,5 x 1 x 1,5 x 2 x 1 % 2 % 3 % 4 % 5 % Obsah soli Obr. 5. Index emulgační aktivity pro 10% emulze obnovené syrovátky v závislosti na ph (A) a v závislosti na přídavku solí a typu přidaných iontů (B); 0,5 2x jsou násobky přirozeného obsahu těchto iontů v mléce. Tabulka I Charakterizace zeta-potenciálu částic pro sérový albumin (BSA) a obnovenou syrovátku v závislosti na přídavku chloridu sodného. Zeta-potenciál (mv) c NaCl (mmol.l -1 ) BSA Syrovátka 0-23,4 ± 2,5-12,0 ± 0, ,1 ± 2,1-10,5 ± 0, ,7 ± 0,7-10,0 ± 0, ,4 ± 0,5-8,3 ± 0,7 Velikost agregátů utvořených přídavkem solí se negativně projevila na emulgačních vlastnostech syrovátkových bílkovin. Na emulgační vlastnosti měl horší vliv přídavek vápenatých iontů než iontů sodných, což se projevilo nárůstem velikosti tukových kapének o 7 resp. 3 %. Na obr. 5B jsou zobrazeny výsledky stanovení indexu emulgační aktivity, kdy byly zkoušeny přídaveky obou iontů v 0,5 až 2 násobcích jejich přirozeného obsahu v mléce (0,048 pro sodné a 0,040 % pro vápenaté ionty) a pro chlorid sodný byl zkoušen i vyšší přídavek (1 5 %), který se používá např. do emulzí v masném průmyslu. Zhoršení emulgačních vlastností,

58 které je výraznější pro vápenaté ionty, lze vysvětlit snížením rychlosti pohybu agregátů syrovátkových bílkovin na fázové rozhraní úměrně s jejich velikostí. Je však zajímavé, že když byl okyselován roztok bílkovin v přítomnosti solí, výsledná velikost vzniklých agregátů syrovátkových bílkovin byla asi třikrát menší (1500 nm a 500 nm, resp. pro vzorky obnovené syrovátky), než při titraci těchto bílkovin pouze ve vodném prostředí. Tuto skutečnost lze vysvětlit předpokladem, že přítomné ionty zřejmě pokryjí část elektrostaticky interagujících míst v molekulách bílkovin, čímž omezí jejich vzájemnou interakci a tvorbu velkých agregátů. Dalším sledovaným faktorem byl vliv záhřevu syrovátkových bílkovin na jejich chování v roztoku a následně vliv denaturace na jejich emulgační vlastnosti. Na následujících obrázcích lze vidět typické chování vzorků β-laktoglobulinu (obr. 6A) a obnovené syrovátky (obr. 6B) při zahřívání ze 40 na 90 C. Dochází zde vlivem destrukce vodíkových můstků a jiných stabilizujících interakcí k rozbalovaní molekul bílkovin a jejich následné agregaci [3], což se projeví nárůstem velikosti částic (sledováno metodou dynamického rozptylu světla). Snížení ph pod isoelektrický bod (měřeno při ph 3) způsobí ještě rozsáhlejší agregaci syrovátkových bílkovin. Zaznamenaný pokles velikosti částic (obr. 6A, B), lze vysvětlit sedimentací největších agregátů v průběhu měření. I takto významné agregaci, nežádoucí např. při výrobě syrovátkových nápojů, můžeme zabránit přídavkem vhodného stabilizačního činidla, např. pektinu (obr. 6C). Je však nutné použít vhodný typ pektinu, protože některé pektiny tuto stabilizaci neposkytují, jiné ji poskytují jen v určité oblasti ph a některé interagují s bílkovinami syrovátky za vzniku makroskopických agregátů, což se negativně projeví na jejich funkčních vlastnostech [12]. A) B) C) Z-Average (nm) ph3_blg ph7_blg Teplota ( C) Z-Average (nm) ph3_syrovátka ph7_syrovátka Teplota ( C) Z-Average (nm) ph3_blg+pektín ph7_blg+pektín Teplota ( C) Obr. 6. Vliv teploty na velikost částic (Z-Average) roztoku β-laktoglobulinu (blg) (A), obnovené syrovátky (B) a směsného roztoku β-laktoglobulinu s pektinem (C), ph 3 (přerušovaně) a ph 7 (plná čára). A) B) C) D [3,2] (μm) Volný tuk (%) olej 10 % olej 60 % Protein (mg.m -2 ) RW 7 % 3.5 % 1.75 % 0 RW 7 % 3.5 % 1.75 % 0 RW 7 % 3.5 % 1.75 % D [3,2] (μm) Volný tuk (%) olej 10 % olej 60 % Protein (mg.m -2 ) WPC 1 % 0.5 % 0.25 % 0 WPC 1 % 0.5 % 0.25 % 0 WPC 1 % 0.5 % 0.25 % Obr. 7. Porovnání emulgačních vlastností (střední hodnota průměru tukových kapének vztažená plochou povrchu D[3,2], obsah volného tuku a obsah bílkovin na fázovém rozhraní) pro 10 a 60% emulze připravených v roztoku sušené syrovátky (RW) nebo koncentrátu syrovátkových bílkovin (WPC) o vzájemně stejném obsahu bílkovin po obnovení (zředění 0, 1, 2x). 58

59 Vliv denaturace substrátu syrovátkových bílkovin při jeho výrobním procesu ve vztahu k jeho emulgačním vlastnostem byl porovnán na vzorcích emulzí připravených z dvou nejběžněji dostupných komerčních syrovátkových substrátů: obnovené syrovátky a koncentrátu syrovátkových bílkovin (WPC), který při výrobě prochází mnohem šetrnějším ošetřením. Intenzivnější záhřev bílkovin způsobí nejen nárůst velikosti tukových kapének, ale zejména výrazně zvýší obsah volného tuku v emulzi (obr. 7). Při porovnání emulgačních vlastností těchto dvou substrátů, prokázal WPC, zejména při vyšší koncentraci oleje (60 %) a nízké koncentraci bílkovin (původní vodní fáze 2x naředěná), lepší emulgační schopnosti než sušená syrovátka (velikost tukových kuliček 23 a 38 µm (obr. 7A), obsah volného oleje 9 a 13 % (obr. 7B), resp.). WPC má při stejné koncentraci bílkovin lepší emulgační vlastnosti právě proto, že lépe stabilizuje mezifázové rozhraní, což lze pozorovat jako nižší množství bílkovin potřebné k pokrytí jednotky plochy fázového rozhraní (obr. 7C). Závěr: V této práci bylo na modelových vzorcích standardů i komerčních preparátů popsáno a demonstrováno chování bílkovin syrovátky ve vztahu k jejich emulgačním vlastnostem, přičemž byl sledován vliv nejběžnějších faktorů, se kterými se v mlékárenské praxi můžeme setkat: vliv kyselosti, teploty a přídavku solí. Výsledky lze využít jako podkladové materiály při aplikaci syrovátky do potravinářských výrobků a to nejen v mlékárenském odvětví. Poděkování: Tato práce byla finančně podpořena z projektu MŠMT ČR (MSM ). Použitá literatura: 1. Damodaran S. : Food proteins: An Overview. V knize: Food proteins and their applications (ed. Damodaran A. & Paraf A.), kap. 1, 1-24, Marcel Dekker Suková I.: Syrovátka v potravinářství. Informační přehledy ÚZPI. Praha Wit J.N.: Nutritional and Functional Characteristics of Whey Proteins in Food Products. Journal of Dairy Science 81, (1998). 4. Bartovská L., Šišková M.: Fyzikální chemie povrchů a koloidních soustav. 5th ed., kap. 9.4 Heterogenní disperze Emulze. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha Portál EUR Lex (Přístup k právu Evropské unie), dostupné Velíšek J. (ed): Chemie potravin, díl 1, kap. 4, OSSIS, Tábor 2002a. 7. Cayot P., Lorient D.: Structure-function relationship of whey proteins. V knize: Food proteins and their applications (ed. Damodaran S., Paraf A.), kap. 8, , Marcel Dekker Scott K.: Handbook of industrial membrans, 2nd ed., kap. 17, Elsevier B.V., Unterhaslberger G., Schmitt C., Sanchez C., Appolonia-Nouzille C., Raemy A.: Heat denaturation and aggregation of β-lactoglobulin enriched WPI in the presence of arginine HCl, NaCl and guanidinium HCl at ph 4.0 and 7.0. Food Hydrocolloids 20, (2006). 10. Euston S.R, Hirst L.R.: Comparison of the concentration-dependent emulsifying properties of protein products containing aggregated and non-aggregated milk protein. International Dairy Journal 9, (1999). 11. Pearce K.N., Kinsella J.E.: Emulsifying properties of proteins: Evaluation of a turbidimetric technique. Journal of Agricultural and Food Chemistry 26, (1978). 12. Kováčová R., Synytsya An., Štětina J.: The characterization of whey proteins-pectin interaction in relation to emulsification properties of whey proteins. Czech Journal of Food Sciences 27, S4-8 (2009). Kontaktní adresa: Ing. Renáta Kováčová, Ústav Technologie mléka a tuků, VŠCHT, Technická 5, , Praha 6 - Dejvice renata.kovacova@vscht.cz 59

60 IZOLACE β-laktoglobulinu POMOCÍ CHITOSANU Diblíková Lenka, Čurda Ladislav Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha β-lactoglobulin isolation by chitosan Summary: A method for selective separation of undenatured β-lactoglobulin (β-lg) from cheese whey, based on electrostatic interactions between whey proteins (WP) and chitosan was performed. We observed the effect of chitosan concentration ( mg.ml -1 ), ph (2-7) and temperature (30-50 C) on β-lactoglobulin yield. In all experiments, we used fresh cow's whey ultrafiltration retentate (membrane with cut-off 50 kda, pressure MPa, temperature 35 C). When chitosan added, the reaction took 120 minutes at defined ph and temperature. After coagulation, mixture was centrifuged at 5000x g, 10 min, 4 C. For final extraction sodium acetate solution of ph 10 was added to pellet. After centrifugation, supernatant with β-lg was analyzed by RP-HPLC. Optimum chitosan concentration for selective separation of β-lg was about 4.5 mg.ml -1. We observed no sifnificant influence of temperature on protein yield. At ph values 2-4 biopolymers did not interact with each other or formed soluble complexes. At ph values 6-7 strong interactions were observed. The highest content of β-lg was obtained at ph 6. A recovery of 16% of β-lg with a protein purity of 86% was achieved. β-lg isolation by chitosan is a selective method that provides protein fraction with a good purity and recovery. The production of cheese whey without β-lactoglobulin could help to extend the application of dairy by-products in food processing, and to isolate hypoallergenic whey protein concentrates. Úvod Syrovátka je významným vedlejším produktem mlékárenského průmyslu, který vzniká při výrobě sýrů a tvarohu 1. Je zdrojem cenných složek jako jsou syrovátkové bílkoviny, laktosa, minerální látky nebo vitaminy 2,3,4. Syrovátkové bílkoviny (WP) představují heterogenní skupinu proteinů vysoké nutriční hodnoty a technologicky zajímavých funkčních vlastností. Hlavní bílkovinou syrovátky je β-laktoglobulin (β-lg). Představuje asi 10 % všech bílkovin mléka a více než 50 % WP 5. Nativní β-lg je globulární protein o molekulové hmotnosti 18,3 kda. Primární strukturu tvoří 162 aminokyselinových zbytků se dvěma disulfidovými můstky a jednu volnou -SH skupinou, která vykazuje zvýšenou reaktivitu při ph > 7. Sekundární a terciární struktura je vysoce uspořádaná, tvoří ji ze % β-list a z % α-helix. V závislosti na ph a teplotě se může β-laktoglobulin vyskytovat v různých formách. Při ph 5,2 (pi) -7,5 se vyskytuje jako dimer. V rozmezí ph 3,5-5,2 se vyskytuje jako oktamer a při ph < 3,5 jako monomer. Molekula β-laktoglobulinu denaturuje při teplotě 78 C 6,7,8,9. β-laktoglobulin se využívá zejména při přípravě emulzí, gelů nebo pěn v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu 10,11,12. Omezeně je též používán při přípravě kojenecké dětské výživy, neboť je hlavním bílkovinným alergenem mléka a alergickou reakci může vyvolat již při velmi nízkých koncentracích 13. Velká pozornost je proto věnována jeho izolaci a purifikaci 5,14. Mezi nejběžnější metody frakcionace WP patří: membránové filtrace, iontově-výměnná chromatografie, selektivní srážení, enzymové metody, atd Většina těchto metod je však použitelná pouze v laboratorním měřítku. Průmyslovému využití brání jejich složitost, časová náročnost, cena, nízká výtěžnost, úroveň degradace produktu nebo nízká selektivita 15. Chitosan je lineární polysacharid obsahující 5-25 % N-acetylglukosaminových jednotek a % glukosaminových jednotek. Jedná se o účinný derivát chitinu, který je stavebním prvkem vnější kostry korýšů nebo buněčných stěn některých hub. Průmyslově se chitosan vyrábí deacetylací chitinu, stupeň deacetylace se v komerčních přípravcích pohybuje v rozmezí % 21. V kyselém prostředí nese polysacharid kladný náboj, což mu umožňuje reagovat s negativně nabitými polyelektrolyty jako jsou proteiny. Jednotlivé proteiny syrovátky se navíc liší strukturou, fyzikálními a chemickými vlastnostmi, což zaručuje selektivitu srážení 15. Kationaktivní charakter propůjčuje chitosanu řadu technologicky využitelných vlastností. Běžně se používá v potravinářském, kosmetickém nebo farmaceutickém průmyslu jako emulgátor, stabilizátor pěn a gelů. Prokázána byla i antibakteriální aktivita, schopnost chitosanu vázat tuk, odstraňovat nečistoty z vody, snižovat cholesterol, aj. 15,16,22,23. 60

61 Cílem této práce bylo nalézt optimální podmínky srážení syrovátkových bílkovin s chitosanem. Materiály a metody Materiál Byla použita čerstvá kravská syrovátka s termofilní kulturou z výroby nezrajícího poloměkkého sýru Parenica (Agrofarma, s.r.o., Červený Kameň, Slovensko). Výchozí surovina byla filtrována na filtrační jednotce ARNO 700 (Mikropur, s.r.o., Hradec Králové, ČR) s keramickými tříkanálovými membránami společnosti TAMI-Industries (Hermsdorf, Německo) typu Clover. Délka membrány je 550 mm, průměr 10 mm, průměr kanálu 3,5 mm, filtrační plocha 0,02 m 2. Mikrofiltace byla provedena na membráně o velikosti pórů 1,4 µm, při 35 C a tlaku 0,125 MPa, ultrafiltrace na membráně s cut-off 50 kda při tlaku 0,250 MPa. U všech získaných produktů byla poté provedena následující stanovení: stanovení celkového obsahu bílkovin dle Kjeldahla, vážkové stanovení sušiny, stanovení tučnosti acidobutyrometricky, stanovení obsahu popelovin, stanovení bodu mrznutí pomocí kryoskopu (Marcel, Polsko) 24. Vodivost a ph bylo měřeno na přístrojích Eurotech Instruments a WTW 340i. Retentát po ultrafiltraci (RUF, koncentrační faktor tři) byl následně použit pro srážecí reakci s chitosanem. Nízko-molekulární chitosan (M r = 120 kda) deacetylovaný z 91 % dodala společnost Porta, s.r.o. (Praha, ČR). Srážení s chitosanem Při srážecí reakci byla využita modifikovaná metoda dle Casala 11. Pevný chitosan byl rozpuštěn v 0,1 mol.l -1 kyselině octové na koncentraci 2 mg.ml -1, resp. 0,5-5,0 mg.ml -1. Roztok chitosanu (50 ml) byl přidán k výchozí surovině (RUF) v poměru surovina:chitosan = 1:1 a ph bylo upraveno na hodnoty 2, 3, 4, 5, 6 a 7 pomocí 10% HCl nebo NaOH. Srážení probíhalo při 50 C, resp C po dobu 120 minut. Vzniklá sraženina byla odstředěna při 5000x g, 4 C po dobu 10 minut. K peletě, obsahující komplex β-lg-chitosan, bylo poté přidáno 25 ml 0,1 mol.l -1 octanu sodného (ph 10) a po rozpuštění byla směs odstředěna za výše uvedených podmínek. Supernatant s frakcí β-lg byl analyzován metodou RP- HPLC. Stanovení β-laktoglobulinu Pro analýzu frakcí syrovátkových bílkovin byla využita metoda HPLC v reversní fázi s gradientovou elucí 25. Použita byla polymerní kolona PLRP-S (30 nm, 8 µm, 150 4,6 mm) s nástřikem 20 µl a UV detekcí při 220 nm, teplota kolony byla 40 C a průtok 1 ml.min -1. Jako eluent A byl použit roztok 0,1% k. trifluoroctové (TFA) v ultračisté vodě a jako eluent B 0,1% roztok TFA ve směsi acetonitril:ultračistá voda (80:20). Celková délka analýzy byla 30 minut. Data byla vyhodnocena dle kalibrační křivky standardů bílkovin (Sigma Aldrich, s.r.o., Praha, ČR). Výsledky a diskuse Vliv koncentrace chitosanu Byl zkoumán vliv množství přidaného chitosanu o koncentracích 0,5-5 mg.ml -1 na obsah β-lg v izolované frakci. Srážení probíhalo při ph 6 a teplotě 50 C po dobu 120 minut dle postupu uvedeného v oddíle Materiály a metody. Bylo zjištěno, že optimální množství chitosanu pro vysrážení β-lg se pohybuje okolo 4,5 mg.ml -1. Dosaženo bylo více než 80% čistoty dané frakce. K podobným závěrům dochází i autoři v publikaci 23. Obsah β-lg, výtěžnost a čistotu získané frakce udává tabulka I. Koncentrace β-lg v surovině byla 6,847 ± 0,117 mg.ml -1. Chromatogramy srážení znázorňuje Obr.1. 61

62 Tabulka I Výtěžnost a čistota frakce β-laktoglobulinu vliv koncentrace chitosanu Koncentrace chitosanu [mg.ml -1 ] Výsledná koncentrace [mg.ml -1 ] Koncentrace β-lg [mg.ml -1 ] * Výtěžnost [%] Čistota [%] 0,5 0,25 0,227 ± 0,023 1,7 ± 0,2 37,3 ± 3,2 1,0 0,50 0,688 ± 0,004 5,0 ± 0,1 64,9 ± 1,2 1,5 0,75 1,788 ± 0,084 13,0 ± 0,4 78,5 ± 1,3 2,0 1,00 2,399 ± 0,352 17,5 ± 3,1 79,1 ± 3,0 2,5 1,25 2,994 ± 0,282 21,8 ± 2,2 82,4 ± 2,3 3,0 1,50 3,539 ± 0,409 25,8 ± 3,4 82,8 ± 2,0 3,5 1,75 3,966 ± 0,273 28,9 ± 1,9 83,5 ± 1,9 4,0 2,00 4,417 ± 0,232 32,2 ± 1,4 83,0 ± 1,0 4,5 2,25 5,091 ± 0,029 37,2 ± 0,9 82,2 ± 2,0 5,0 2,50 5,053 ± 0,194 36,9 ± 0,8 81,6 ± 3,0 * data bez přepočtu ředění Obr. 1. Chromatogramy srážení s chitosanem při různé koncentraci chitosanu Vliv ph srážení Při selektivní separaci bílkovin syrovátky pomocí chitosanu dochází ke vzniku komplexu β-lg-chitosan, uplatňují se přitom elektrostatické interakce mezi záporně nabitým proteinem a kladně nabitým polysacharidem. Hlavním faktorem, který ovlivňuje sílu těchto interakcí, je ph a iontová síla. Byl proto rovněž sledován vliv ph srážecí reakce v rozmezí 2-7 na výtěžnost a čistotu získaných frakcí bílkovin. Izolace β-laktoglobulinu probíhala při teplotě 50 C a koncentraci chitosanu 2 mg.ml -1 po dobu 120 minut. Závislost koncentrace bílkovin na ph srážení je znázorněna na Obr

63 c 3,0 [mg.ml -1 ] 2,5 β-laktoglobulin ostatní bílkoviny 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ph 2 ph 3 ph 4 ph 5 ph 6 ph 7 Obr. 2. Závislost koncentrace bílkovin na ph srážení Z Obr. 2 je patrné, že při ph 2-4 se β-lg téměř nesráží. Oba biopolymery mají stejný náboj a vzájemné elektrostatické interakce jsou velmi slabé. Při ph 5, tj. v blízkosti isoelektrického bodu proteinu, jsou za vznik komplexu s chitosanem odpovědné některé negativně nabité skupiny na povrchu bílkoviny. Nad isoelektrickým bodem proteinu (ph 6-7) dochází k silné interakci mezi negativně nabitým β-lg a pozitivně nabitým chitosanem (pk a 6,5). Při ph > 6,5 však chitosan částečně ztrácí kladný náboj, čímž se elektrostatické interakce oslabují. Optimální ph srážecí reakce je ph 6. Tyto výsledky jsou ve shodě s studiemi 15,23. Za uvedených podmínek byla získána frakce β-laktoglobulinu o čistotě 86 % a výtěžnosti 16 %. Malá výtěžnost je dána ztrátami v průběhu srážecí reakce a srážením při nižší než optimální koncentraci chitosanu. Vliv teploty srážení Vliv teploty srážení na množství separovaného β-lg byl zkoumán při teplotách 30, 40 a 50 C. Srážení probíhalo při ph 6 a koncentraci chitosanu 2 mg.ml -1 po dobu 120 minut postupem uvedeným v odstavci Materiály a metody. Při všech třech teplotách byla získána bílkovinná frakce o srovnatelné čistotě, tj. 79 %. Nejvyšší výtěžnosti β-lg bylo dosaženo při teplotě 50 C. Rozdíly ve výtěžnosti při jednotlivých teplotách však nejsou statisticky významné. Chromatogramy srážení znázorňuje Obr. 3. Obr. 3. Chromatogramy srážení s chitosanem při různých teplotách 63

64 Závěr Na základě získaných výsledků byly stanoveny optimální podmínky srážení syrovátkových bílkovin s chitosanem. Nejvyšších výtěžnosti β-laktoglobulinu bylo dosaženo při koncentraci chitosanu 4-5 mg.ml -1. Vyšší koncentrace již nevede k vyšší výtěžnosti bílkovinné frakce. Teplota množství vysráženého β-lg významně neovlivňovala. Výrazný vliv však měla hodnota ph. Při ph 2-4 spolu biopolymery neinteragovaly, příp. tvořily rozpustné komplexy. K silné interakci naopak docházelo při ph 6-7. Optimální ph reakce bylo ph 6. Při všech provedených experimentech byla získána frakce β-lg o čistotě minimálně 80 %. Srážení s chitosanem proto představuje selektivní metodu frakcionace syrovátkových bílkovin, která umožňuje získat nativní β-lg o vysoké čistotě a odstranit tak hlavní alergen kravského mléka. Poděkování: Tato práce vznikla za podpory MŠMT ČR(MSM ) a společnosti Membrain s.r.o.., Stráž pod Ralskem, Česká republika. Použitá literatura: 1. DOULTANI, S.; TURHAN, K.N.; ETZEL, M.R. Fractionation of proteins from whey using cation exchange chromatography. Process Biochemistry, 2004, vol. 39, s SIENKIEWICZ, T.; RIEDEL, L.C. Whey and whey utilization; Verlag Th. Mann: Gelsenkirchen-Buer, Germany, GREITER, M.; NOVALIN, S.; WENDLAND, M.; KULBE K.D.; FISCHER, J. Desalination of whey by electrodialysis and ion exchange resins: analysis of both processes with regard to sustainability by calculating their cumulative energy demand. Journal of Membrane Science, 2002, vol. 210, s BRAMAUD, C.; AIMAR, P.; DAUFIN, G. Thermal isoelectric precipitation of α-lactalbumin from a whey protein concentrate: influence of protein-calcium complexation. Biotechnology and Bioengineering, 1995, vol. 47, s LOZANO, J.M.; GIRALDO, G.I.; ROMERO, C.M. An improved method for isolation of β-lactoglobulin. International Dairy Journal, 2008, vol. 18, s KINSELLA, J.E.; whitehead, D.M. Proteins in whey: chemical, physical and functional properties. Advances in Food and Nutrition Research, 1989, vol. 33, s CAESSENS, P.W.J.R.; VISSER, S.; GRUPPEN, H. Method for the isolation of bovine β-lactoglobulin from a cheese whey protein fraction and physicochemical characterization of the purified product. International Dairy Journal, 1997, vol. 7, s BRYANT, C.M.; McCLEMENTS, D.J. Molecular basis of protein functionality with special consideration of cold-set gels derived from heat-denatured whey. Food of Science and Technology, 1998, vol. 9, s FOX, P.F. Developments in Dairy Chemistry. Elsevier Applied Publishers: London, LUCENA, M.E.; AVAREZ, S.; MENÉNDEZ, C.; RIERA, F.A.; ALVAREZ, R. Beta-lactoglobulin removal from whey protein concentrates. Production of milk derivates as a base for infant formulas. Separation and Purification Technology, 2006, vol. 52, s NEALL, B. The wonderful ways of whey. Food Review, 2002, vol. 29, s MATÉ, J.; KROCHTA, J.M. β-lactoglobulin separation from whey protein isolate on a large-scale. Journal of Food Science, 1994, vol. 59, s UCHIDA, Y.; SHIMATANI, M.M.; MITSUHASHI, T.; KOUTAKE, M. - Process for preparing a fraction having a high content of α-lactalbumin from whey and nutritional compositions containing such fractions. US patent 5,503,864; ZYDNEY, A.L. Protein separations using membrane filtration: new opportunities of whey fractionation. International Dairy Journal, 1998, vol. 8, s GUZEY, D.; McCLEMENTS, D.J. Characterization of β-lactoglobulin-chitosan interactions in aqueous solutions: A kalorimetry, light scattering, electrophoretic mobility and solubility study. Food Hydrocolloids, 2006, vol. 20, s

65 16. MIRALLES, B.; MARTÍNEZ-RODRIQUEZ, A.; SANTIAGO, A.; van de LAGEMAAT, J.; HERAS, A. The occurrence of Maillard-type protein-polysaccharide interaction between β-lactoglobulin and chitosan. Food Chemistry, 2007, vol. 100, s NEYESTANI, R.T.; DJALALI, M.; PEZESHKI, M. Isolation of α-lactalbumin, β-lactoglobulin and bovine serum albumin from cow's milk using gel filtration and anion-exchange chromatopraphy including evaluation of their antigenicity. Protein expression and Purification, 2003, vol. 29, s KINEKAWA, Y.I.; KITABATAKE, N. Purification of β-lactoglobulin from whey protein concentrate by pepsin treatment. Journal of Dairy Science, 1996, vol. 79, s SCHLATTERER, B.; BAEKER, R.; SCHLATTERER, K. Improved purification of β-lactoglobulin from acid whey by means of ceramic hydroxiapatite chromatography with sodium fluoride as a displacer. Journal of Chromatography B, 2004, vol. 807, s YE, X.; YOSHIDA, S.; NG, T.B. Isolation of lactoperoxidase, lactoferrin, α-lactalbumin, β-lactoglobulin B and β-lactoglobulin A from bovine rennet whey using ion-exchange chromatography. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2000, vol. 32, s LIU, D.; WEI, Y.; YAO, P.; JIANG, L.Determination of the degree of acetylation of chitosan by UV spectrophotometry using dual standards. Carbohydrate Research, 2006, vo. 341, s MONTILLA, A.; CASAL, E.; MORENO, F.J.; BELLOQUE, J.; OLANO, A.; CORZO, N. Isolation of bovine β-lactoglobulin from complexes with chitosan. International Dairy Journal, 2007, vol. 17, s CASAL, E.; MONTILLA, A.; MORENO, F.J.; OLANO, A.; CORZO, N. Use of chitosan for selective removal of β-lactoglobulin from whey. Journal of Dairy Science, 2006, vol. 89, s CVAK, Z.; PETEROVÁ, L.; ČERNÁ, E. Chemické a fyzikálně-chemické metody v kontrole jakosti mléka a mlékárenských výrobků. VÚPP Středisko potravinářských informací, Praha THOMÄ, C.; KRAUSE, I.; KULOZIK, U. Precipitation of caseinomacropeptides and their simultaneous determination with whey proteins by RP-HPLC. International Dairy Journal, 2006, vol. 16, s Kontaktní adresa: Lenka Diblíková, Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, , Praha 6 diblikoe@vscht.cz 65

66 VLIV HYDROLYZÁTU SYROVÁTKOVÝCH BÍLKOVIN NA TEXTURNÍ VLASTNOSTI SYROVÁTKOVÝCH DEZERTŮ Mihulová Miroslava, Šilhavá Jaroslava, Štětina Jiří Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha Influence of Whey Protein Hydrolysates on the Texture Properties of Whey Desserts Summary: This research is focused on the influence of whey protein hydrolysates (WPH) on the texture properties of whey desserts. Whey protein hydrolysates were prepared using enzyme Promod 439L. Hydrolysis of reconstituted dry whey (solution 7 % w/w, ph 8.0) was carried out in a bath reactor (3 h, 40 C), enzymesubstrate ratio was 1 : Bitterness of produced hydrolysates was removed by activated carbon Norit CG1 (dosage 0.3 g of activated carbon into 100 g whey protein hydrolysates). Whey desserts consisted of starch, κ carrageenan, sugar and protein component (reconstituted dry whey 7 % w/w, whey protein hydrolysate, whey protein hydrolysate treated by activated carbon). It was observed that protein component influenced the texture of whey desserts. Desserts, which contained whey protein hydrolysates, were less stiff, firm and deformable than desserts produced from nonhydrolysed whey. It was also observed that whey desserts from whey protein hydrolysate treated by activated carbon were significantly (P (α) = 0.05) firmer than desserts containing nontreated whey protein hydrolysate. Activated carbon Norit CG1 adsorbed hydrophobic compounds (bitter peptides and other hydrophobic compounds) which probably interact with starch or other hydrocolloids and thereby affect the texture properties of whey desserts. 1. Úvod Syrovátka je vedlejší produkt výroby sýrů. Mlékárenský průmysl ročně vyprodukuje průměrně více než 145 milionů tun syrovátky, z čehož 60 % je různými způsoby využito a zbylých 40 % se stává průmyslovým odpadem. Tento trend není vhodný nejen z hlediska lidské výživy, neboť syrovátka obsahuje nutričně kvalitní bílkoviny (z hlediska skladby a množství esenciálních aminokyselin jsou syrovátkové bílkoviny řazeny na roveň plnohodnotným bílkovinám vaječným), ale ani z hlediska ekonomického a ekologického. Je tedy žádoucí veškerou vyprodukovanou syrovátku efektivně využít. 1 Jednou z možností dalšího zpracování syrovátky je její enzymová hydrolýza. Tímto způsobem může být produkován materiál s nižší alergenicitou (hlavní syrovátková bílkovina, β-laktoglobulin, je zároveň jedním z hlavních alergenů mléka), lepšími funkčními vlastnostmi (lepší rozpustností, vyšší emulgační aktivitou a tepelnou stabilitou) a případně i dalšími výživovými 2, 3, 4 benefity (ACE inhibiční aktivitou, antihypertensním účinkem či funkcí prebiotickou). Hydrolyzáty syrovátkových bílkovin jsou v současnosti využívány k výrobě kojenecké a dětské výživy, speciálních diet pro osoby se specifickými výživovými požadavky (fenylketonurie, cystická fibróza, Crohnova choroba), hypoalergenních potravin a fitness doplňků. Snahou je nalézt pro ně uplatnění i při produkci běžných potravin, jako je maso a masné výrobky či výrobky mléčné. 5, 6 Cílem této práce bylo využít hydrolyzát syrovátky při výrobě syrovátkových dezertů a prozkoumat vliv této suroviny na jejich texturní vlastnosti. 2. Materiály a metody 2.1. Příprava hydrolyzátu syrovátkových bílkovin (WPH) Výchozí surovinou pro výrobu bílkovinného hydrolyzátu byl 7% (w/w) roztok sušené syrovátky (Moravia Lacto, a. s., Česká Republika) v demineralizované vodě, což odpovídá obsahu bílkovin 0,93 %hm. (stanoveno Kjeldahlovo metodou dle ČSN EN ISO ). Aktivní kyselost byla upravena 10% (w/w) roztokem NaOH na hodnotu ph 8,0. Hydrolýza probíhala ve vsádkovém skleněném dvouplášťovém reaktoru za stálého míchání při 40 C po dobu 3 h účinkem enzymového preparátu Promod 439L (Biocatalysts Ltd., Velká Británie), poměr enzymu ku substrátu byl 1 : 100,6. Enzym byl poté tepelně inaktivován při teplotě 85 C s výdrží 15 min. Stupeň hydrolýzy produktu byl stanoven OPA metodou 8 a dosáhl hodnoty 13,8 %. 66

67 2.2. Odhořčení hydrolyzátu syrovátkových bílkovin (WPH NCG1) Hořkost hydrolyzátu syrovátky, způsobená vznikem hydrofobních peptidů, byla odstraněna jejich adsorpcí na aktivní uhlí Norit CG1 (Norit Activated Carbon, AC Amersfoort, Nizozemí), které bylo dávkováno v množství 0,3 g na 100 g suroviny. Ošetření aktivním uhlím probíhalo 1,5 h při laboratorní teplotě za konstantního míchání o rychlosti 800 rpm (magnetické míchadlo MR Hi Tech, Heidolph Instruments GmbH&Co., Schwabach, Německo). Uhlí bylo následně odstraněno odstředěním (30 min, 160 RCF, 4 C; odstředivka Universal 320R, Andreas Hettich GmbH&Co. KG, Tuttlingen, Německo). Odhořčením poklesl obsah bílkovin v hydrolyzátu o 0,05 %hm. (stanoveno Kjeldahlovo metodou dle ČSN EN ISO ) Šaržová příprava syrovátkových dezertů Syrovátkové dezerty byly vyráběny z bramborového škrobu (nativní bramborový škrob; Trumf International, s. r. o., ČR), κ karagenanu (Trumf International, s. r. o., ČR), sacharosy (cukr polobílý krystal; Investice Strategie Management, a. s., ČR) a tekutého syrovátkového substrátu (7 %hm. roztok sušené syrovátky, resp. WPH, nebo WPH NCG1). Směs sypkých surovin (5 %hm. škrobu, 0,05 %hm. κ karagenanu, 2,25 %hm. cukru) byla navážena, promíchána a rozpuštěna v tekuté složce (92,7 %hm.). Vzniklá suspenze byla poté za stálého míchání zahřívána na vodní lázni při teplotě 85 C s výdrží 5 min. Syrovátkové dezerty byly v množství 100 g nality do plastových kelímků (objem 140 ml, průměr 50 mm) a po vychladnutí při laboratorní teplotě skladovány do dalšího dne při 5 C Hodnocení texturních vlastností syrovátkových dezertů Texturní vlastnosti syrovátkových dezertů byly hodnoceny přístrojem Texture Analyser TA.XT.plus (Stable Micro Systems, Godalming, Velká Británie). Válcová sonda o průměru 20 mm byla vtlačována při pokojové teplotě do vzorku vytemperovaného na 5 C do hloubky 25 mm. Rychlost pohybu sondy před vzorkem byla 1 mm/s, při překonání síly 0,05 N, signalizující začátek vzorku, bylo zahájeno měření a rychlost pohybu sondy se změnila na 0,5 mm/s. Odečítáno bylo 200 bodů za sekundu. Měření bylo provedeno pro každý vzorek třikrát a byly při něm hodnoceny vybrané texturní parametry tuhost (vyjádřena počáteční elasticitou, tedy směrnicí křivky v hloubce 2 mm), pevnost (síla na mezi pevnosti) a deformovatelnost (tedy hloubka na mezi pevnosti) Statistické metody Statistické vyhodnocení výsledků bylo provedeno v programu MS Excel 2007 za použití metod Vylučování odlehlých výsledků a testu Rozdílu mezi dvěma výběrovými průměry Výsledky a diskuze Cílem této práce bylo uplatnit hydrolyzát syrovátkových bílkovin při produkci syrovátkových dezertů a zkoumat jeho vliv na texturní vlastnosti těchto dezertů. Jelikož se hydrolýzou syrovátkových bílkovin snižuje alergenicita syrovátky a mění se její funkční vlastnosti, je náhrada syrovátky jejím hydrolyzátem zajímavou možností. Hydrolyzát syrovátkových bílkovin byl připraven enzymovou hydrolýzou 7% roztoku sušené sladké syrovátky enzymovým přípravkem Promod 439L ve vsádkovém míchaném reaktoru. Část produktu byla vždy v dalším kroku odhořčena aktivním uhlím Norit CG1. Pro výrobu syrovátkových dezertů byla zvolena receptura, jejíž základ tvořilo 5 %hm. bramborového škrobu, 0,05 %hm. κ karagenanu a 2,25 %hm. cukru. Složky byly v suchém stavu promíchány a následně rozpuštěny ve zvoleném médiu (7% roztok sušené syrovátky (W), nebo její hydrolyzát (WPH) a nebo odhořčený hydrolyzát (WPH-NCG1)). Po záhřevu ve vodní lázni na teplotu 85 C s výdrží 5 min byly dezerty vychlazeny a další den hodnoceny na texturometru metodou vtlačování sondy. Každý vzorek byl proměřen třikrát a celkem bylo provedeno 5 výrob. Výsledky texturních měření jsou uvedeny v tabulce I, grafické zobrazení trendu texturních parametrů syrovátkových dezertů na Obr

68 Tabulka I Vliv náhrady syrovátky (W) jejím neodhořčeným (WPH) a odhořčeným bílkovinným hydrolyzátem (WPH-NCG1) na texturní vlastnosti syrovátkového dezertu Výroba Vzorek Tuhost [g/mm] Pevnost [N] Deformovatelnost [mm] W 1 14,5 ± 1,2 0,891 ± 0,117 5,43 ± 0,10 1 WPH 2 0,60 ± 0,41 0,071 ± 0,016 5,08 ± 1,36 WPH - NCG1 3 5,71 ± 0,38 0,396 ± 0,009 4,37 ± 0,46 W 7,63 ± 0,01 0,507 ± 0,021 5,22 ± 0,42 2 WPH 0,67 ± 0,62 0,061 ± 0,003 3,97 ± 0,09 WPH NCG1 5,33 ± 0,72 0,294 ± 0,021 3,66 ± 0,58 W 11,7 ± 0,41 0,491 ± 0,033 3,97 ± 0,28 3 WPH 9,12 ± 2,72 0,263 ± 0,009 2,32 ± 0,66 WPH NCG1 9,63 ± 2,20 0,397 ± 0,021 3,32 ± 0,47 W 4,89 ± 0,62 0,191 ± 0,042 2,99 ± 1,07 4 WPH 0,39 ± 0,14 0,033 ± 0,001 3,14 ± 0,01 WPH NCG1 0,74 ± 0,07 0,036 ± 0,001 2,49 ± 0,76 W 14,1 ± 1,3 0,666 ± 0,015 4,28 ± 0,30 5 WPH 1,74 ± 1,00 0,119 ± 0,006 1,85 ± 0,23 WPH NCG1 5,54 ± 0,45 0,228 ± 0,007 2,91 ± 0,22 Výsledky jsou vyjádřeny ve formě intervalu spolehlivosti pro aritmetický průměr ze 3 paralelních měření; (1) 7 %hm. roztok sušené obnovené syrovátky; (2) bílkovinný neodhořčený enzymový (Promod 439L) hydrolyzát 7 %hm. roztoku sušené obnovené syrovátky; (3) bílkovinný odhořčený (aktivní uhlí Norit CG1) enzymový (Promod 439L) hydrolyzát 7 %hm. roztoku sušené obnovené syrovátky 100 WPH WPH - NCG1 % parametru desertu ze syrovátky ( vztaženo na vzorek W) Výroba č Tuhost Pevnost Deformovatelnost Obr. 1. Relativní vliv náhrady syrovátky (W) jejím neodhořčeným (WPH) a odhořčeným bílkovinným hydrolyzátem (WPH-NCG1) na texturní vlastnosti syrovátkového dezertu 68

69 Z hodnot výsledků texturního měření zobrazených v Tabulce I i z grafu na Obr.1 vyplývá, že náhradou syrovátky jejím enzymovým hydrolyzátem dochází k modifikaci texturních parametrů syrovátkového dezertu. Dezerty vyrobené ze syrovátky, jejíž proteiny byly hydrolyzovány účinkem enzymového preparátu Promod 439L, vykazovaly oproti dezertům ze sušené obnovené syrovátky menší tuhost, pevnost a ve většině případů i deformovatelnost. Odhořčení hydrolyzátu adsorpcí hořkých peptidů účinkem aktivního uhlí Norit CG1 však vedlo k produkci dezertů tužších, pevnějších a v některých případech i méně deformovatelných, než byly výrobky z neodhořčeného syrovátkového hydrolyzátu. Z uvedených dat je ovšem patrná i značná variabilita texturních parametrů desertů z různých výrob. Statistická průkaznost nalezených rozdílů jednotlivých texturních parametrů byla hodnocena metodou ANOVA. 10 Byl testován vliv dvou faktorů (pokusná výroba a použitý substrát) s opakováním (paralelní stanovení). Hodnocení bylo provedeno vždy pro srovnání dvou substrátů. Výsledky uvádí Tabulka II. Potvrzují statisticky významný vliv pokusné výroby na všechny sledované parametry textury. V případě tuhosti a pevnosti výrobku byly statisticky významné i rozdíly mezi všemi substráty, ale současně byl významný i vliv interakce mezi faktory, tzn. rozdíl mezi substráty se u jednotlivých výrob liší. V případě deformovatelnosti byl statisticky významný rozdíl zjištěn mezi deserty připravenými ze syrovátky (W) a deserty z hydrolyzátu (WPH) a odhořčeného hydrolyzátu (WPH-NCG1). Naopak vliv odhořčení hydrolyzátu byl statisticky neprůkazný (pro srovnání deformovatelnosti vzorků WPH a WPH-NCG1 bylo P > 0,1) Tabulka II Výsledky hodnocení statistické významnosti rozdílu textury mezi vzorky dezertů metodou ANOVA (pravděpodobnost nulové hypotézy). Tuhost Pevnost 69 pravděpodobnost pro vliv porovnání vzorků výroby vzorku interakce W WPH < 0,001** < 0,001** < 0,001** W WPH-NCG1 < 0,001** < 0,001** < 0,001** WPH WPH-NCG1 < 0,001** < 0,001** 0,011* pravděpodobnost pro vliv porovnání vzorků výroby vzorku interakce W WPH < 0,001** < 0,001** < 0,001** W WPH-NCG1 < 0,001** < 0,001** < 0,001** WPH WPH-NCG1 < 0,001** < 0,001** < 0,001** Deformovatelnost pravděpodobnost pro vliv porovnání vzorků výroby vzorku interakce W WPH < 0,001** < 0,001** 0,015* W WPH-NCG1 < 0,001** < 0,001** 0,311 WPH WPH-NCG1 < 0,001** 0,700 0,035* ** rozdíl statisticky vysoce významný (P < 0,01); * rozdíl statisticky významný (P < 0,05) Statistické hodnocení tedy potvrdilo, že při použití aktivního uhlí Norit CG1 k odstranění hořké chuti bílkovinného hydrolyzátu syrovátky enzymu Promod 439L, se snižuje pevnost a tuhost vyrobených syrovátkových dezertů. Pravděpodobně hydrofóbních peptidy přítomné v neodhořčeném hydrolyzátu interagují s ostatními hydrokoloidy přítomnými v matrici dezertu

70 (škrob, κ karagenan) a zamezují vytvoření pevné prostorové sítě a tímto způsobem snižují celkovou pevnost syrovátkového dezertu. 11 Odstranění těchto složek adsorpcí na aktivní uhlí pak vede ke zvýšení tuhosti a pevnosti, které ovšem nedosahují původních hodnot dezertů z nehydrolyzované syrovátky. 4. Závěr Bylo připraveno 5 výrob syrovátkových dezertů složených ze škrobu, κ karagenanu a cukru. Jako bílkovinné složky bylo použito sušené obnovené syrovátky, jejího neodhořčeného a odhořčeného hydrolyzátu bílkovin. Vliv přidané bílkovinné složky na vybrané texturní vlastnosti (tuhost, pevnost, deformovatelnost) dezertů byl hodnocen metodou vtlačování válcové sondy. Bylo zjištěno, že použitím obou typů hydrolyzátu syrovátky vznikly dezerty s nižší tuhostí, pevností a deformovatelností, než jakou vykazovaly výrobky obsahující syrovátku nehydrolyzovanou. Produkty s odhořčeným hydrolyzátem syrovátkových bílkovin však byly statisticky významně pevnější (na hladině pravděpodobnosti P (α = 0,05)), než dezerty z hydrolyzátu neodhořčeného. Ošetřením bílkovinného syrovátkového hydrolyzátu enzymu Promod 439L aktivním uhlím Norit CG1 tedy pravděpodobně dochází k odstranění hydrofobních látek (hořkých peptidů a případně dalších hydrofobních složek), které interakcemi s hydrokoloidy přítomnými v matrici dezertu snižovaly jeho pevnost. 5. Poděkování Tato práce byla podpořena Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (výzkumný záměr MSMT ). 6. Použitá literatura 1. PEREA, A., et al.: Preparation and characterization of whey protein hydrolysates: Applications in industrial whey bioconversion processes. Enzyme Microbial Technology 15, (1993). 2. ABUBAKAR, A., et al.: Structural analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by proteinase K digestion. Journal of Dairy Science 81, (1998). 3. BARROS, R. M., et al.: Quantitative studies on the enzymatic hydrolysis of milk proteins brought about by cardosin precipitated by ammonium sulfate. Enzyme and Microbial Technology 29, (2001). 4. EUSTON, S. R. - FINNIGAN, S. R. - HIRST, R. L.: Heat-induced destabilization of oil-in-water emulsions formed from hydrolyzed whey protein. Journal of Agriculture Food Chemistry 49, (2001). 5. CLEMENTE, A.: Enzymatic protein hydrolysate in human nutrition. Trends Food Science Technology 11, (2000). 6. EXL, B.: A review of recent developments in the use of moderately hydrolyzed whey formulae in infant nutrition. Nutrition Research 21, s (2001). 7. ČSN EN ISO : Mléko Stanovení obsahu dusíku Část 3: Metoda s blokovou mineralizací (Semi-mikro rychlá rutinní metoda), Český normalizační institut, Praha ADLER-NISSEN, J.: Enzymatic hydrolysis of food proteins. p , Elsevier Applied Science Publishers, PISKA, I.: Rheologické vlastnosti tavených sýrů. Disertační práce, VSCHT Praha., Praha: VORLÍČEK, M.; HOLICKÝ, M.; ŠPAČKOVÁ, M.: Pravděpodobnost a matematická statistika pro inženýry, 345 s., České vysoké učení technické v Praze, Praha DE KRUIF, C. G.;TUINIER, R.: Polysaccharide protein interactions. Food Hydrocolloids 15, (2001). 7. Kontaktní adresa Ing. Miroslava Mihulová Ústav technologie mléka a tuků; VŠCHT Praha; Technická 5; Praha 6 Dejvice miroslava.mihulova@vscht.cz 70

71 VPLYV VNÚTORNÝCH FAKTOROV PROSTREDIA NA VYBRANÚ HYGIENICKY NEŽIADUCU MIKROFLÓRU Medveďová Alžbeta, Valík Ľubomír, Studeničová Adriana, Hybenová Eva Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, STU Bratislava, Slovenská republika The effect of intrinsic factors on selected undesirable hygienic microflora Summary: The growth responses of Staphylococcus aureus as affected by water activity, ph value and lactic acid bacteria addition were studied in synthetic laboratory media (PCA broth) and in milk at 15 C. The water activity values of PCA broth were adjusted by sodium chloride in the range from a w = 1.0 to 0.86 and the ph values were adjusted by addition of lactic and hydrochloric acid to ph 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 and 6.0. NaCl addition higher than 13 % (a w = 0.902), and presence of lactic acid at ph = 4.5 as well as hydrochloric acid at ph = 4.0 led to the S. aureus inhibition at 15 C. The competitive growth of Lb. rhamnosus GG or Fresco culture and S. aureus 2064 was studied in milk and various inoculums sizes of lactic acid bacteria. Addition of Lb. rhamnosus GG had only inconsiderable inhibitive effect, most likely because of the low environment acidification. On the other hand, due to effective lactic acid production by the Fresco culture, the S. aureus growth was slow down. The Fresco addition higher than 1.9 counts allowed S. aureus to increase its number only about 2 log counts in stationary phase. Rast, rozmnožovanie a metabolizmus mikroorganizmov je ovplyvňovaný viacerými faktormi vnútorného a vonkajšieho prostredia, v ktorom sa mikroorganizmy nachádzajú. Štúdium vplyvu týchto environmentálnych podmienok na rast organizmov, predovšetkým patogénnych, je dôležitým aspektom ich kontrolovania a obmedzenia ich rastu v potravinovej matrici a zabezpečenia mikrobiologickej bezpečnosti a kvality potravín 1,2. Staphylococcus aureus, predovšetkým jeho rast a potenciálna produkcia enterotoxínov, môže predstavovať v potravinách vzhľadom na podmienky ich vnútorného a vonkajšieho prostredia reálne riziko ohrozenia zdravia, ktoré spočíva vo vzniku enterotoxikóz. Podľa Akinedena a kol. 3 a Kérouantona a kol. 4, je S. aureus po r. Salmonella druhým najčastejším pôvodcom ochorení z potravín vo svete. Charakteristickým znakom, ktorý odlišuje S. aureus od ostatných patogénnych baktérií je jeho vysoká tolerancia voči nízkym hodnotám aktivity vody a koncentrácii NaCl až do 20 % 5. Vo všeobecnosti toleruje minimálne hodnoty aktivity vody v rozsahu a v 0,83 až 0,86 a minimálne hodnoty ph okolo 4,2, pričom ale tieto minimálne hodnoty závisia aj od naplnenia optimálnych hodnôt ostatných faktorov prostredia 6-9. S. aureus, ako slabý kompetitítor je v potravinách s vysokým obsahom aktívnych mliečnych baktérií zvyčajne inhibovaný, predovšetkým kvôli produkcii slabých organických kyselín, utilizácii kyslíka, znížení nutričného potenciálu a produkcii špecifických antimikrobiálnych faktorov 8,9. Cieľom tejto práce bolo sledovať dynamiku rastu S. aureus pri meniacich sa podmienkach vnútorného prostredia, aktivity vody, aktívnej kyslosti a prítomnosti kompetitívnej mikroflóry za účelom definovania podmienok, ktoré zabezpečia minimálny želateľný maximálny nárast patogénneho mikroorganizmu. Analýza rastu Staphylococcus aureus 2064 v závislosti od hodnoty aktivity vody. Výsledky pokusov z paralelne vykonaných kultivačných stanovení vplyvu aktivity vody na rast S. aureus 2064 pri 15 C v GTK bujóne sú znázornené na obr. 1 a rastové parametre (špecifická rastová rýchlosť a lag-fáza) získané z jednotlivých rastových čiar a konkrétnych hodnotách aktivity vody sú zhrnuté v tabuľke 1. Tak ako je z prezentovaných výsledkov zrejmé, so zvyšujúcou sa koncentráciou soli v médiu sa postupne predlžovala dĺžka lag-fázy z 11 h pri a v = 0,992 až na takmer 12d (286 h) pri a v = 0,902. Podobne sa spomaľoval aj rast v exponenciálnej fáze, kedy hodnota špecifickej rastovej rýchlosti pri nižšom obsahu soli bola takmer 13-krát vyššia ako pri vyššom prídavku NaCl (a v = 0,992 a a v = 0,902, v poradí). Kompletná inhibícia S. aureus 2064 v GTK bujóne pri 15 C bola pozorovaná, ak prídavok soli bol vyšší ako 13 % ( a v = 0,902). 71

72 Obr. 1. Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 v GTK bujóne v závislosti od aktivity vody pri teplote 15 C Tabuľka 1: Rastové parametre S. aureus 2064 v GTK bujóne pri teplote 15 C GTK bujón µ STA λ a v % NaCl [h -1 ] [h] 0, , ,162 11,1 0,992 1,72 0,114 31,5 0,966 5,0 0,073 65,2 0,945 7,95 0, ,8 0,923 10,6 0, ,8 0,902 13,05-0, ,0 0,888 15,25-0, ,0 0,865 18,17 Analýza rastu Staphylococcus aureus 2064 v závislosti od hodnoty aktívnej kyslosti a prítomnosti baktérií mliečneho kysnutia Ako najúčinnejší spôsob inhibície S. aureus sa uvádza rýchle okyslenie prostredia na hodnoty ph, ktoré sú už neakceptovateľné pre jeho rast 9,10. Inhibičný účinok kyselín na rast mikroorganizmov ovplyvňuje predovšetkým samotný druh použitej kyseliny. Preto sme v našej práci overovali potenciálny inhibičný účinok kyseliny mliečnej a kyseliny chlorovodíkovej voči študovanému izolátu. S. aureus 2064 bol inokulovaný do GTK bujónu, ktorého hodnota ph bola upravená 10 %-nou kyselinou mliečnou alebo 1 M kyselinou chlorovodíkovou na hodnoty ph = 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 a 6,0. Dve paralelné vzorky boli následne inkubované pri teplote 15 C. Z výsledkov na obr. 2 a zhrnutých v tab. 2 vyplýva, že pri hodnotách ph 6,0 a 5,5 nebol rast S. aureus ovplyvnený ani zníženým ph, ani druhom kyseliny. Túto skutočnosť je možné vysvetliť adaptačným mechanizmom S. aureus, ktorý je pri mierne znížených hodnotách ph (do 5,5) určovaný pufrovacou kapacitou cytoplazmy, schopnosťou izolovať alebo vylúčiť protóny a expresiou génov (ureázový operón, gény kódujúce intracelulárny chaperón a množstvo ďalších, zapojených do metabolizmu a transportu aminokyselín, sacharidov a k. fosforečnej) zodpovedných za vyrovnávanie intracelulárneho ph 11. Diametrálne odlišná situácia nastala, ak bola hodnota ph média ph = 5,0. V prostredí nastavenom anorganickou kyselinou bola predĺžená len lag-fáza S. aureus 2064, jeho rýchlosť v exponenciálnej fáze a maximálne počty v stacionárnej fáze neboli prakticky ovplyvnené. Na druhej strane, okyslenie rastového média na rovnakú hodnotu ph kyselinou mliečnou, vyústilo do redukcie maximálnych počtov S. aureus o 3 log poriadky a do 3,5-násobného spomalenia rastu. 72

73 Kompletnú redukciu rastu izolátu 2064 spôsobila acidifikácia prostredia kyselinou mliečnou na hodnotu ph = 4,5 alebo kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu ph = 4.0. Tabuľka 2: Rastové parametre S. aureus 2064 v GTK bujóne pri 15 C v závislosti od počiatočnej hodnoty ph nastavenej kyselinou mliečnou a kyselinou chlorovodíkovou kyselina mliečna kyselina chlorovodíková Gr STA [log KTJ.ml -1.h -1 ] λ [h] nedisoc. forma [%] ph 0 λ [h] Gr STA [log KTJ.ml -1.h -1 ] 0,064 17,7 0,72 6,0 15,7 0,068 0,057 20,9 0,23 5,5 17,5 0,057 0,017 66,9 6,8 5,0 36,5 0,041-0,006-18,6 4,5-0, ,0 23,4-0,013 Obr. 2: Dynamika rastu S. aureus 2064 v GTK bujóne pri 15 C v závislosti od počiatočnej hodnoty ph nastavenej k. mliečnou a k. chlorovodíkovou Ďalším cieľom bolo sledovať dynamiku rastu Staphylococcus aureus 2064 v prítomnosti rôznych kultúr baktérií mliečneho kysnutia, z ktorých sme použili probiotický kmeň Lactobacillus rhamnosus GG a komerčnú kultúru Fresco. Opäť bola ako inkubačná teplota použitá teplota 15 C, pri ktorej prebieha proces zrenia ovčích hrudkových syrov a ako kultivačné médium bolo použité UHT mlieko. Do jednotlivých paralelných vzoriek predtemperovaného mlieka bolo naočkované potrebné množstvo konkrétnej štandardnej suspenzie, tak ako sme popísali v predchádzajúcich prácach V pravidelných časových intervaloch boli odoberané vzorky mlieka na stanovenie počtu KTJ.ml -1 S. aureus 2064 podľa STN ISO , Lb. rhamnosus GG podľa STN a kultúry Fresco podľa STN ISO a rovnako aj na stanovenie aktívnej kyslosti vzoriek mlieka. Zo zistených počtov mikroorganizmov boli zostrojené rastové čiary, ktoré boli následne vyhodnotené pomocou Baranyiho D-modelu 18, za účelom získania rastových parametrov sledovaných mikrobiálnych skupín. Na obr. 3 sú znázornené rastové čiary S. aureus 2064 a Lb. rhamnosus GG počas spoločnej kultivácie pri dvoch rôznych prídavkoch kultúry GG (1 a 10 %). V pozadí všetkých rastových čiar sú znázornené aj hodnoty ph, ktoré sa počas trvania jednotlivých pokusov výrazne nemenili a po 96 h inkubácie poklesli len na hodnotu ph = 6,5. V stacionárnej fáze boli síce počty Lb. rhamnosus GG vždy vyššie ako 10 8 KTJ.ml -1, ale ani takéto vysoké počty nepostačovali na inhibíciu rastu S. aureus S postupným zvyšovaním počiatočnej koncentrácie probiotického kmeňa v spoločnej kultúre, síce dochádzalo k miernemu poklesu v náraste buniek stafylokoka v stacionárnej fáze oproti počiatočným počtom, ale po 96 h predsa len dosiahol počty vyššie alebo blízke ako 10 6 KTJ.ml -1, čo už by v prípade enterotoxinogénnych kmeňov mohlo znamenať potenciálne riziko produkcie enterotoxínov v danom prostredí. Pozitívne však bolo, že oproti rastu S. aureus

74 v samostatnej kultúre, kde začal rásť po 3,1 h lag-fáze, sa v prítomnosti mliečnej baktérie začala jeho lag-fáza predlžovať, pri 10 %-nom prídavku Lb. rhamnosus GG až na 19 h. Obr. 3: Dynamika rastu S. aureus 2064 ako monokultúry ( ) a v spoločnej kultúre ( ) s Lb. rhamnosus GG ( ) v UHT mlieku a príslušné hodnoty ph ( ) pri 15 C Rastová rýchlosť S. aureus bola Gr STA = 0,055 log KTJ.ml -1.h -1 resp. Gr STA = 0,070 log KTJ.ml -1.h -1, pri 1 a 10 %-nom prídavku probiotickej kultúry, v poradí. Lenže ak rástol S. aureus 2064 v UHT mlieku pri 15 C samostatne, jeho rastová rýchlosť bola Gr STA = 0,057 log KTJ.ml -1.h - 1, čo znázorňuje aj sklon rastových čiar stafylokoka v samostatnej a v zmiešanej kultúre. Prítomnosť mliečnej baktérie teda nepriniesla očakávanú inhibíciu rastu populácie potenciálne patogénneho mikroorganizmu, čo bolo s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobené skutočnosťou, že Lb. rhamnosus GG neprodukoval kyselinu mliečnu v množstvách, ktoré by významne znížili hodnoty ph prostredia. Ako sa v našich predchádzajúcich prácach 13,19 ukázalo, kultúra Fresco bola veľmi aktívny producent kyseliny mliečnej a preto sme sledovali osud S. aureus 2064 aj v koexistencii s kultúrou rýchlo okysľujúcou prostredie pri teplote 15 C a meniacich sa prídavkov kyslomliečnych baktérií (3 a 6 log poriadkov). Časový priebeh spolužitia nežiaduceho mikroorganizmu a inhibičnej mikroflóry je zobrazený na obr. 4. Obr. 4: Dynamika rastu S. aureus 2064 ako monokultúry ( ) a v spoločnej kultúre ( ) s kultúrou Fresco ( ) v UHT mlieku a príslušné hodnoty ph ( ) pri 15 C 74

75 V dôsledku zvyšujúceho sa počiatočného prídavku mezofilnej kultúry, sa prostredie stávalo nepriaznivejšie pre rast S. aureus Jeho rastová rýchlosť sa postupne znižovala. Zvýšením mliečnych baktérií z 3 log poriadkov na 5, sa predĺžil čas zdvojenia S. aureus o 2,5 hodiny. Pri vyššom prídavku kultúry Fresco bola rastová rýchlosť S. aureus 3,5-násobne nižšia ako pri nižšej koncentrácii a až 4-násobne nižšia ako v samostatnej kultúre. Za takýchto podmienok došlo k navýšeniu počtov buniek stafylokoka počas 2 dní len o 0,6 log poriadku. Za rovnaký časový úsek sa pri rovnakých počiatočných počtoch stafylokoka a mliečnych baktérií v spoločnej kultúre, zvýšili počty S. aureus 2064 v stacionárnej fáze oproti počiatočným počtom o 1,6 log poriadku, kým v samostatnej kultúre sa dokázal nežiaduci mikroorganizmus pomnožiť až o 4,2 log poriadky. Záver: Na základe prezentovaných výsledkov možno konštatovať, že ku kompletnej inhibícii rastu izolátu S. aureus 2064 v GTK bujóne pri teplote 15 C je potrebný prídavok soli vyšší ako 13 % (hm.), alebo počiatočná hodnota ph prostredia 4,5 nastavená kyselinou mliečnou, resp. ph = 4,0 upravené prídavkom kyseliny chlorovodíkovej. V dôsledku nedostatočnej produkcii kyseliny mliečnej a stabilnej hodnote ph počas trvania kultivačných pokusov, nepreukázal kmeň Lactobacillus rhamnosus GG inhibičné účinky na rast izolátu Staphylococcus aureus 2064 počas spoločnej kultivácie v mlieku pri 15 C. Naopak, kultúra Fresco sa ukázala ako veľmi účinná pri potlačení rastu nežiaduceho mikroorganizmu, predovšetkým vďaka rýchlym acidifikačným vlastnostiam pri teplote 15 C. Z experimentov vyplynulo, že v praxi za predpokladu dobrej mikrobiologickej kvality nadojeného mlieka, pri ktorej sa očakávajú počty rádovo 2 log poriadky, by na udržanie jeho nárastu na úroveň tolerovateľnú legislatívnymi nariadeniami postačovali minimálne počiatočné množstvá kultúry Fresco na úrovni 1,9 log poriadku pri teplote 15 C. Získané výsledky môžu poskytovať účinné nástroje na potlačenie rastu S. aureus a zabezpečenie mikrobiologickej bezpečnosti a zdravotnej neškodnosti produktov v potravinárskej praxi. Poděkování: Táto práca bola podporená z grantu MŠ SR VEGA č. 1/0845/08. Použitá literatura: 1. McCann T.L. - Eifert J.D. - Gennings C. et al. A predictive model with repeated measures analysis of Staphylococcus aureus growth data. In Food Microbiology, vol. 20, 2003, p McMeeki T.A. - Olley J.N. - Ratkowsky D.A. - Ross, T. Predctive microbiology: towards the interface and beyond. In International Journal of Food Microbiology, vol. 73, 2002, p Akineden Ö. - Hassan A.A. - Schnieder E. - Usleber E. Enterotoxinogenic properties of Staphylococcus aureus isolated from goats milk cheese. In International Journal of Food Microbiology, vol. 124, 2008, p Kérouanton A. - Hennekinne J.A. - Letertre C. et al. Characterisation of Staphylococcus aureus strains associated with food poisoning outbreaks in France. In International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, p Sutherland J.P. - Bayliss A.J. - Roberts T.A. Predctive modelling of growth of Staphylococcus aureus: the effects of temperature, ph and sodium chloride. In International Journal of Food Microbiology, vol. 21, 19994, p Troller J.A. - Stinson J.V. Influence of water activity on growth and enterotoxin formation by Staphylococcus aureus in foods. In Journal of Food Science, vol. 40, 1975, p Baird-Parker T.C. Staphylococcus aureus. In Microbiological Safety and Quality of Food. Gaithersburg: Aspen Publishers, 2000, p Jay, J.M. Staphylococcal Gastroenteritis. In Modern Food Microbiology. Gaithersburg: Aspen Publishers, 2000, p Charlier C. - Cretenet M. - Even S. - LeLoir Y. Interactions between Staphylococcus aureus and lactic acid bacteria: an old story with new perspectives. In International Journal of Food Microbiology, vol. 18, 2008, p

76 10. Elkins CH.A. - Munoz M.E. - Mullis L.B. et al. Lactobacillus mediated inhibition of clinical toxic shock syndrome Staphylococcus aureus strains and its realtion to acid and peroxide production. In Anaerobe, vol. 14, 2008, p Baker-Austin C. - Dopson M. Life in acid: ph homeostasis in acidophiles. In Trends in Microbiology, vol. 15, 2007, p Medveďová A. - Valík Ľ. - Sirotná Z. - Liptáková D. Characterisation of Staphylococcus aureus growth in milk: a quantitative approach. In Czech Journal of Food Sciences, vol. 27, 2009, p LeMarc Y. - Valík Ľ. - Medveďová A. Modelling the effect of the starter culture on the growth of Staphylococcus aureus in milk. In International Journal of Food Microbiology, vol. 129, 2009, p Valík Ľ. - Medveďová A. - Čižniar M. - Liptáková D. Growth modelling of Lactobacillus rhamnosus GG: a comparison of some temperature models. In The 21st International ICFMH Symposium, Abstract Book, Aberdeen: Food Micro, 2008, p STN ISO : Mikrobiológia potravín a krmív: Horizontálna metóda stanovenia počtu koagulázopozitívnych stafylokokov (Staphylococcus aureus a ďalšie druhy). Časť 1: Metóda s použitím Baird-Parkerovho agarového média. Bratislava: Slovenský ústav technickej normalizácie, 2001, 6s. 16. STN ISO Mikrobiológia potravín a krmív: Horizontálna metóda stanovenia mezofilných baktérií mliečneho kysnutia. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 30 C. Bratislava: Slovenský ústav technickej normalizácie, 2002, 12s. 17. STN ISO Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na stanovenie celkového počtu mikroorganizmov. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 30 C. Bratislava: Slovenský ústav technickej normalizácie, 1997, 9s. 18. Baranyi J. - Roberts T.A. - McClure P. A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. In Food Microbiology, vol. 10, 1993, p Medveďová A. - Liptáková D. - Hudecová A. - Valík Ľ. Quantification of the growth competition of lactic acid bacteria: a case co-culture with Geotrichum candidum and Staphylococcus aureus. In Acta Chimica Slovaca, vol. 1, 2008, p Kontaktní adresa: Ing. Alžbeta Medveďová, PhD., Odd. výživy a hodnotenia potravín, FCHPT STU v Bratislave, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská republika 76

77 CHARAKTERIZÁCIA MIKROFLÓRY SLOVENSKEJ BRYNDZE KULTIVAČNÝMI A NEKULTIVAČNÝMI METÓDAMI Chebeňová Viera 1, Kuchta Tomáš 1, Brežná Barbara 1, Pangallo Domenico 2 1 Výskumný ústav potravinársky, Bratislava 2 Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava Characterization of microflora of traditional Slovakian bryndza cheese by culture and non-culture methods Summary: Specific dominant microflora of typical Slovakian bryndza cheese was characterized by culture and nonculture methods. Samples of Slovakian bryndza cheese were obtained from 10 factories in Slovakia and they were analysed by culture methods. Lactic acid bacteria were isolated on de Man-Rogosa-Sharpe agar and identified biochemically, microbiologically, by genotyping by randomly-amplified microsatellite polymorphism and by 16S rdna sequencing. Samples of Slovakian bryndza cheese from 5 factories were analysed also regarding the presence of bacterial and fungal species by PCR, cloning and sequencing. Individual Slovakian bryndza cheese samples were found to contain 3-7 strains of Lactobacillus brevis, Lb. parabuchneri, Lb. fermentum, Lb. helveticus, Lb. paracasei, Lb. pentosus, Lb. plantarum and Pediococcus pentosaceus. Preliminary non-culture characterization of the dominant bacterial and fungal microflora revealed the presence of the following bacterial species: Lb. delbrueckii, Lb. helveticus, Lb. brevis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus macedonicus, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus raffinolactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Escherichia coli and Leuconostoc pseudomesenteroides. Some fungal species were also detected in certain samples, namely, Yarrowia lipolytica, Galactomyces geotrichum, Debaryomyces hansenii and Mucor fragilis. Non-culture methods facilitated the detection of additional bacterial species and, detecting uncultured lactococci, provided information on the history of the cheese. ÚVOD Bryndza je tradičný slovenský syr vyrábaný z ovčieho alebo zmesi ovčieho a kravského syra, pričom podiel ovčieho komponentu musí byť minimálne 50%. Základnou surovinou je ovčí hrudkový syr, alebo jeho skladovaná forma, a kravský hrudkový syr. Zrením alebo kysnutím syra dochádza k produkcii hlavného metabolitu mliečneho kvasenia, k tvorbe kyseliny mliečnej, a vedľajších metabolitov, ktoré majú podiel na typickej aróme a chuti výrobku. Za zrenie a ďalšie fermentačné procesy sú zodpovedné najmä baktérie mliečneho kysnutia (lactic acid bacteria, LAB). Podľa doterajších poznatkov sa na začiatku procesu zrenia vyskytujú väčšinou kokovité baktérie rodu Lactococcus, pričom so zvyšujúcou sa kyslosťou hrudky sa rast laktokokov spomaľuje a rozmnožujú sa viac kyslomliečne paličky rodu Lactobacillus (Valík a Görner, 2004). Dominantnými druhmi sú Lactobacillus plantarum, Lb. casei a Lb. brevis. Tieto druhy sú známe tým, že zohrávajú úlohu v rozvoji tradičnej chuti syrov počas výroby (Lopéz a Mayo, 1997). Rozmnožujú sa aj koliformné baktérie a Staphylococcus aureus, avšak s narastajúcou kyslosťou hrudky ich počty klesajú. Na povrchu sa rozmnožuje pleseň Geotrichum candidum, ktorá sa vo výrobnom procese odstraňuje mechanicky zrezávaním vrchnej časti hrudky. Počas sekundárneho zrenia sa na aeróbnom kvasení podieľajú aj oxidačné kvasinky rodov Torulopsis a Candida, proteolytické grampozitívne paličky rodu Brevibacterium a iné mikrokoky (Valík a Görner, 2004). Doterajšie poznatky o mikroflóre bryndze, ktoré boli založené na použití klasických mikrobiologických a biochemických metód, sme sa rozhodli doplniť s využitím moderných molekulárno-biologických metód. V prvej časti práce sme izolovali kmene baktérií mliečneho kysnutia zo vzoriek bryndze z rôznych regiónov Slovenska a ich identifikáciu mikrobiologickými a biochemickými metódami sme doplnili metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s náhodnou amplifikáciou mikrosatelitov (randomly-amplified microsatellite polymorphism, RAMP) a sekvenovaním 16S rdna. V druhej časti práce bolo naším cieľom určiť zastúpenie dominantných druhov baktérií, kvasiniek a mikroskopických húb vo vybraných vzorkách bryndze nekultivačnými metódami s použitím, klonovania a sekvenovania. 77

78 MATERIÁL A METÓDY Vzorky bryndze Vzorky bryndze boli získané priamo z výrobní z rôznych regiónov Slovenska (obr.1), s výnimkou bryndze z Agrofarmy Červený Kameň, ktorá bola zakúpená v maloobchode z dôvodu nedostupnosti od výrobcu. Mikrobiologická analýza vzoriek Mikroorganizmy sme izolovali na de Man - Rogosa - Sharpe (MRS; Merck, Darmstadt, Nemecko) anaeróbnou kultiváciou pri 37 C počas 3 dní. Morfologická, fyziologická a biochemická analýza Z vyrastených kolónií na MRS agare sme na základe morfológie kolónií náhodne vybrali kolónií pre vzorku, ktoré sme ďalej analyzovali podrobným opisom morfológie kolónií, farbením podľa Grama, KOH testom, katalázovým testom, zistením tvorby plynu ako vedľajšieho produktu v procese rozkladu glukózy a biochemickými testami použitím súpravy API CHL (Bio Mérieux, Marcy l Etoile, Francúzsko). Molekulárno - biologická analýza izolovaných kmeňov Použili sme metódu založenú na náhodnej amplifikácii mikrosatelitov s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (RAMP). DNA sme izolovali z kolónií s použitím súpravy InstaGene (Bio-Rad, Hercules, California, USA). PCR bola orientovaná na náhodné sekvencie a na sekvencie mikrosatelitov (Wu et al., 1994). Reakčná zmes v objeme 25 µl obsahovala 700 mmol.l -1 priméru K7 (CAA CTC TCT CTC TCT), 700 mmol.l -1 priméru 1254 (CCG CAG CCA A; (oba oligonukleotidy syntetizované Qiagen Operon, Köln, Nemecko), 1 koncentrovaný tlmivý roztok priložený k polymeráze, 3,5 mmol.l -1 MgCl 2, 1,25 U HotStarTaq Plus polymerázy (Qiagen, Hilden, Nemecko) a 240 μmol.l -1 každého dntp (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Amplifikácia prebiehala v cykléri Biometra Personal (Whatman Biometra, Göttingen, Nemecko) s teplotným programom pozostávajúcim z úvodnej denaturácie pri 95 ºC počas 15 min, z 30 cyklov amplifikácie (denaturácia pri 94 ºC počas 60 s, annealing pri 40 ºC počas 90 s, polymerizácia pri 68 ºC počas 180 s) a záverečnej polymerizácie pri 68 ºC počas 10 min (Pangallo et al., 2002). PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 1,5 % agarózovom géli SeaKem LE (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA). Sekvenovanie 16S rdna Nejednoznačne identifikované kmene sme analyzovali sekvenovaním 16S rdna. DNA sme izolovali chaotropickou extrakciou na tuhej fáze s použitím súpravy DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) podľa pokynov výrobcu pre grampozitívne baktérie. PCR sa realizovala v objeme 60 µl s primérmi 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC G) a 1492R (CGG CTA CCT TGT TAC GAC TT; oba Qiagen Operon, oba v koncentrácii 700 nmol l -1 ) orientovanými na sekvenciu 16S rdna. Reakčná zmes obsahovala 2 µl templátovej DNA, 1,25 U DNA HotStarTaq Plus polymerázy (Qiagen), 1 reakčný tlmivý roztok pre DNA polymerázu, 3,5 mmol l -1 MgCl 2 a 340 μmol l -1 dntp zmesi (Applied Biosystems). PCR sa uskutočnila v termocykléri GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) s teplotným programom pozostávajúcim z úvodnej denaturácie pri 95 C počas 5 min, 35 cyklov denaturácie pri 94 C počas 30 s, annealingu pri 58 C počas 30 s a polymerizácie pri 70 C počas 30 s, a záverečnej polymerizácie pri 70 C počas 7 min. PCR produkty o veľkosti 1500 bp sa separovali elektroforézou v agarózovom géli, purifikovali s použitím súpravy QIAquick PCR 78

79 Purification Kit (Qiagen) a sekvenovali na prístroji ABI 3100-Avant Genetic Analyser s použitím súpravy Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) na Prírodovedeckej fakulte Univerzity Komenského v Bratislave. Získané výsledky sme porovnali s databázou DNA sekvencií (NCBI; a príslušné kmene sme druhovo zaradili. Izolácia DNA zo vzoriek bryndze Asepticky sa odobrali 2 g vzorky a inkubovali sa v 20 ml citranu sodného so sklenenými guľôčkami (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) pri 45 C počas 30 min. Po inkubácii sa vzorky premiešali a, centrifugovali pri g počas 10 min. Odsala sa tuková vrstva a zvyšný supernatant, a bunky sa suspendovali v 1 ml tlmivého roztoku TE (Randazzo et al., 2002). Po ďalšej centrifugácii pri g počas 10 min a odstránení supernatantu sa DNA izolovala použitím súpravy DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Amplifikácia DNA v ITS PCR PCR bola orientovaná na medzerníkové sekvencie medzi génmi pre rrna. S použitím primérov G17 (GTG AAG TCG TAA CAA G) a zmesi primérov G+R (CGT CCT TCA TCG GCT) a G-R (CGT CCT TCA TCG CCT) sa amplifikovali bakteriálne sekvencie. S použitím primérov ITS3 (GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC) a ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) sa amplifikovali sekvencie kvasiniek a mikroskopických húb. Reakčná zmes v objeme 50 µl obsahovala 1 μl roztoku templátu DNA, 1,5 U polymerázy HotStarTaqPlus DNA, 1x reakčný tlmivý roztok pre DNA polymerázu, 4 mmol l -1 MgCl 2, 0,8 mmol l -1 každého dntp, a po 500 nmol l -1 z každého priméru. PCR prebiehala v termocykléri GeneAmp 9700 s teplotným programom pozostávajúcim z úvodnej denaturácie pri 95 C počas 5 min, 30 cyklov denaturácie pri 94 C počas 1 min, annealingu pri teplote 55 C počas 2 min a polymerizácie pri 72 C počas 3 min, a záverečnej polymerizácie pri 72 C počas 3 min. PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 2,5% agarózovom géli. Všetky separované fragmenty pre jednotlivé vzorky sa z agarózového gélu vyrezali a následne prečistili použitím súpravy QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Klonovanie a identifikácia klonov Jednotlivé amplikóny z ITS PCR sa naklonovali do vektora pdrive použitím súpravy PCR Cloning Kit (Qiagen) a následne zmiešali s kompetentnými bunkami E. coli DH5α. Transformanty sa selektovali kultivováciou v LB médiu obsahujúcom 100 µg.ml -1 ampicilínu sodného. Selektované transformanty sa identifikovali pomocou PCR s primérmi orientovanými na sekvencie plazmidu pdrive M13F-40 (GTT TTC CCA GTC ACG AC) a M13R (AAC AGC TAT GAC CAT G). Z pozitívne identifikovaných transformantov sa použitím súpravy QIAquick PCR Purification Kit purifikovali PCR amplikóny a tieto sa sekvenovali. Získané výsledky sme porovnali s databázou DNA sekvencií (NCBI; a príslušné kmene sa druhovo zaradili. VÝSLEDKY A DISKUSIA Typické organoleptické vlastnosti Slovenskej bryndze sa pripisujú mikroflóre prítomnej v tomto tradičnom výrobku. Avšak typická mikroflóra úzko spojená s výrobou tohto syra doposiaľ nebola presne charakterizovaná v súvislosti s výskytom rodov Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus a Leuconostoc. Tieto baktérie významne prispievajú k organoleptickým vlastnostiam rôznych druhov syrov ( Olson, 1990). V našej práci sme z 12 vzoriek bryndze izolovali 201 bakteriálnych kmeňov. Na základe ich morfologických, fyziologických, biochemických vlastností a RAMP profilov bolo možné rozlíšiť jednotlivé druhy LAB. Zistili sme, že Slovenská bryndza obsahovala nasledujúce druhy LAB: Lactobacillus plantarum, Lb. paracasei, Lb. brevis, Lb. 79

80 fermentum, Pediococcus spp., Lb. curvatus, Lactococcus lactis, Lb. collinoides, Lb. acidophilus, Leuconostoc lactis, Lb. buchneri a Lb. pentosus (Tabuľka I). Najčastejšie vyskytujúce sa druhy vo všetkých vzorkách bryndze boli Lb. brevis, Lb. paracasei a Lb. plantarum. Zriedkavo sa vyskytovali Lb. collinoides, Lb. pentosus, Leuconostoc spp. a Pediococcus spp. Rôznorodosť genotypov v rámci jedného druhu sa zistila najmä vo vzorkách obsahujúcich nepasterizované ovčie mlieko. Keďže kultivačnými metódami bolo možné zachytiť len živú mikroflóru finálneho produktu, v druhej časti práce sme analyzovali 5 vybraných vzoriek Slovenskej bryndze nekultivačnými metódami s využitím PCR, klonovacích techník a následného sekvenovania, pričom sme sa snažili zachytiť dominantnú mikroflóru tejto tradičnej potraviny. Zistili sme prítomnosť DNA 10 bakteriálnych druhov: Lb. delbrueckii, Lb. helveticus, Lb. brevis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus macedonicus, Lc. lactis ssp. lactis, Lc. raffinolactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Escherichia coli a Leuconostoc pseudomesenteroides, pričom rody Lactococcus a Streptococcus boli spoločne identifikované vo všetkých vzorkách z hľadiska bakteriálnej mikroflóry. Získali sme aj sekvencie troch druhov kvasiniek, menovite Yarrowia lipolytica, Galactomyces geotrichum a Debaryomyces hansenii, a tiež jedného druhu mikroskopickej huby, Mucor fragilis. Tabuľka I Baktérie mliečneho kysnutia identifikované v bryndzi kultivačnými metódami s uvedením počtu genotypov na základe RAMP profilov Počet genotypov Bryndza A B C D E F G H Výrobca 1: letná bryndza, 80% ovčej hrudky z nepasterizovaného mlieka Výrobca 2: zimná bryndza, zmes kravskej hrudky a ovčej hrudky z pasterizovaného mlieka Výrobca 3: letná bryndza, 100% ovčej hrudky z nepasterizovaného mlieka Výrobca 3: letná bryndza, 50% ovčej hrudky z nepasterizovaného mlieka Výrobca 4: letná bryndza, ovčia hrudka z nepasterizovaného mlieka Výrobca 4: zmes kravskej hrudky a ovčej hrudky z pasterizovaného mlieka Výrobca 5: letná bryndza, zmes kravskej hrudky a ovčej hrudky z pasterizovaného mlieka Výrobca 6: letná bryndza, zmes kravskej hrudky a ovčej hrudky z pasterizovaného mlieka Výrobca 7: letná bryndza, 100% ovčej hrudky z nepasterizovaného mlieka Výrobca 8: zimná bryndza, zmes kravskej hrudky a ovčej hrudky z pasterizovaného mlieka Výrobca 9: ovčia hrudka z nepasterizovaného mlieka Výrobca 10: zmes kravskej hrudky a ovčej hrudky z pasterizovaného mlieka A - Lactobacillus brevis, B - Lactobacillus fermentum, C - Lactobacillus helveticus, D - Lactobacillus parabuchneri, E - Lactobacillus paracasei, F - Lactobacillus pentosus, G - Lactobacillus plantarum, H - Pediococcus pentosaceus 80

81 Tabuľka II Zoznam osekvenovaných amplikónov DNA mikroskopických húb a kvasiniek zo vzoriek bryndze Vzorka bryndze (podľa sídla výrobcu) Veľkosť amplikónu(bp) Najpríbuznejší druh podľa databázy GenBank Tisovec 240 Yarrowia lipolytica Tisovec 244 Galactomyces geotrichum Červený Kameň 381 Debaryomyces hansenii Zvolenská Slatina 369 Mucor fragilis Tabuľka III Zoznam osekvenovaných amlikónov bakteriálnej DNA zo vzoriek bryndze Vzorka bryndze (podľa sídla výrobcu) Veľkosť amplikónu (bp) Najpríbuznejší druh podľa databázy GenBank Ružomberok 327 Lactobacillus brevis Ružomberok 386 Streptococcus macedonicus Ružomberok 386 Streptococcus macedonicus Ružomberok 416 Lactococcus lactis Ružomberok 416 Lactococcus lactis ssp. lactis Ružomberok 416 Lactococcus lactis ssp. cremoris Červený Kameň 315 Lactobacillus delbrueckii Červený Kameň 315 Lactobacillus delbrueckii Červený Kameň 315 Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus Červený Kameň 329 Lactobacillus delbrueckii Červený Kameň 385 Streptococcus thermophilus Červený Kameň 386 Streptococcus thermophilus Červený Kameň 386 Streptococcus thermophilus Červený Kameň 416 Lactococcus lactis ssp. lactis Červený Kameň 472 Lactococcus raffinolactis Červený Kameň 549 Escherichia coli Turčianske Teplice 386 Streptococcus thermophilus Turčianske Teplice 386 Streptococcus thermophilus Turčianske Teplice 416 Lactococcus lactis ssp. cremoris Turčianske Teplice 472 Lactococcus raffinolactis Turčianske Teplice 488 Leuconostoc pseudomesenteroides V porovnaní s kultivačnými metódami, kde sme sa sústredili na kyslomliečne paličky, nekultivačnými metódami sa nám podarilo zachytiť širšie spektrum bakteriálnych rodov a v rámci LAB viac kokov, ktoré sú zrejme v tejto potravine dominantné v počiatočných štádiách výrobného procesu. So stúpaním kyslosti hrudky však počty laktokokov zrejme prudko kleasjú a dominovať začnú kyslomliečne paličky (Prekopp et al., 1972). Nekultivačnými metódami sa nám podarilo zistiť iba prítomnosť 2 druhov kyslomliečnych paličiek. Tieto výsledky naznačujú, že DNA z laktokokov pretrváva v syre, avšak kultivačnými metódami laktokoky nie je možné zistiť. Použitie nekultivačných metód tak umožňuje zistiť aj históriu mikroflóry bryndze. 81

82 Obrázok č.1 Zoznam výrobcov bryndze 1. Agrosúča a.s., Horná Súča 2. Agrofarma s. r. o., Červený Kameň 3. Bryndziareň s. r. o., Turčianske Teplice 4. Peter Makovický- Bryndziareň, vnuk Peter Lajda, Ružomberok 5. Liptovská mliekáreň a. s., Liptovský Mikuláš 6. Bryndziareň a syráreň s. r. o., Zvolenská Slatina 7. Ľuboš Manica BRYSYRT, Tisovec 8. PD Goral, Veľká Franková 9. IGET s. r. o., Lipany 10. PD Kluknava, Kluknavská mliekáreň, Jaklovce LITERATÚRA 1. Lopez, S. Mayo, B.: Identification and characterization of homofermentative mesophilic Lactobacillus strains isolated from artisan starter- free cheeses. Letters in Applied Microbiology, 25, 1997, s Pangallo, D. Karpíšková, R. Turňa, J. Kuchta, T.: Typing of food-borne Listeria monocytogenes by the optimized repetitive extragenic palindrome-based polymerase chain reaction. New Microbiologica, 25, 2002, s Valík, Ľ. Görner, F.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín, 1. vydanie. Bratislava : Typoset, s. ISBN Wu, K. S. Jones, R. Danneberger, L. Scolnik, P. A.: Detection of microsatellite polymorphism without cloning. Nucleic Acids Research, 22, 1994, s Olson, N. F.: The impact of lactic acid bacteria on cheese flavor. FEMS Microbiology Letters, 87, 1990, s Prekopp, I. - Porubjaková, K. - Nádašský, S.: Ovčie mliekárstvo. Banská Bystrica : SVTS, 1970, 264 s. 7. Randazzo, C. L. - Torriani, S. - Akkermans, A. D. L. - De Vos, W. M. - Vaughan, E. E.:. Diversity, dynamics, and activity of bacterial communities during production of an artisanal sicilian cheese as evaluated by 16S rrna analysis. Applied and Environmental Microbiology, 68, 2002, s Kontaktná adresa: Viera Chebeňová Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, Bratislava chebenova@vup.sk 82

83 ANTIKLOSTRIDIÁLNÍ AKTIVITA BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ V SCREENINGOVÉM A MODELOVÉM POKUSU Němečková Irena 1, Rohacká Hana 2, Tůma Štěpán 2, Blahušová Jana 3, Solichová Kateřina 4, Cicvárek Jiří 3, Roubal Petr 1, Plocková Milada 4 1 Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o., 2 Mlékárna Příšovice, 3 MILCOM a.s., 4 Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha Anticlostridial activity of lactic acid bacteria in screening and model experiment Summary: Antimicrobial activity of the lactic acid bacteria in final products depends on inhibiting and inhibited strain characteristics, physico-chemical properties of food and storage conditions. Thus, protective culture selection should involve suitable strains pre-selection by the plate methods, antimicrobial compounds characterization (including detection of genes for their production), testing of desired technological properties, negation of health risk metabolites production, verification of the antimicrobial effect in a model experiment and practical application under pilot plant and plant conditions. The main scope of this work is anticlostridial activity of the lactic acid bacteria as prevention of late blowing in cheese. Two potentially suitable strains Lactobacillus paracasei ST68 and 171R2 (non-starter lactic acid bacteria isolates) were compared with anticlostridial compounds (potassium nitrate, nisin, muramidase), the nisin producing strain Lactococcus lactis ssp. lactis CCDM 731 and the common mesophilic starter culture CCDM 1 in the model cheese-slurry system. Although the both of tested stains exhibited anticlostridial activity in the model system, they were not efficient enough to prevent late blowing. The best effect was achieved with the nisin producing and the mesophilic culture. However, plate methods were unable to detect anticlostridial activity of the mesophilic culture. Thus, there is a risk that the most powerful strains would be excluded during the strains screening. Úvod Schopnost bakterií mléčného kvašení (BMK) produkovat antimikrobiální látky byla využívána už odpradávna. Homofermentativní BMK při fermentaci hexos tvoří ekvimolární množství kyseliny mléčné, heterofermentativní BMK tvoří směs kyseliny mléčné, kyseliny octové nebo ethanolu a oxidu uhličitého 1. Nedisociované molekuly kyselin jsou lipofilní mohou pasivně procházet skrz membránu, měnit její propustnost (narušovat transport látek) a okyselovat cytoplazmu 2. Antimikrobiální účinek oxidu uhličitého spočívá v modifikaci atmosféry a ve schopnosti akumulovat se v lipidové dvojvrstvě, která tím ztrácí svou permeabilitu 1. V přítomnosti kyslíku jsou BMK schopné tvořit pomocí NADH-oxidas a flavoproteinoxidas peroxid vodíku, který může oxidovat sulfhydrylové skupiny bílkovin a membránové lipidy 1. Řada kmenů BMK je schopná tvořit také bakteriociny, což jsou látky bílkovinné povahy, které jsou účinné proti příbuzným druhům bakterií. Komerčně se využívá bakteriocin nisin, a to jako prevence pozdního duření sýrů 3. Při screeningu kmenů na požadovanou antimikrobiální aktivitu se využívá řada plotnových metod agar-well diffusion assay, agar spot test, overlay assay, cross-streak assay, přičemž účinná látka bývá nejčastěji charakterizována pomocí přídavku katalasy nebo proteinasy K a rezistence vůči záhřevu a různým hodnotám ph 3,4,5. Při podezření, že je antimikrobiální aktivita způsobena některým z významných bakteriocinů (např. nisin), je možné tuto hypotézu potvrdit prostřednictvím detekce genů pro jejich tvorbu 6. Aby mohl být vybraný kmen s antimikrobiální aktivitou průmyslově využíván jako protektivní doplňková kultura, musí mít nejen prokazatelnou účinnost, ale také splňovat další požadavky. Nesmí mít negativní vliv na lidské zdraví, tzn. nesmí vytvářet toxiny, biogenní aminy ani jiné zdravotně rizikové metabolity a nesmí být patogenní. Neměl by také negativně ovlivňovat senzorickou kvalitu výrobků, např. tvorbou plynu nebo exopolysacharidů 7. Tato práce navazuje na předcházející výsledky 8, na základě kterých byl ze 322 izolátů nezákysových bakterií mléčného kvašení s využitím plotnových metod vybrán kmen Lb. paracasei ST68 jako potenciálně vhodná protektivní kultura pro výrobu polotvrdých sýrů. Cílem je ověřit 83

84 účinnost tohoto kmene v modelovém pokuse a porovnat závěry plynoucí z obou experimentálních přístupů. Materiál a postup práce Modelový pokus Cheese-slurry (50 g sýra eidamského typu bylo zhomogenizováno s 1 g citrátu disodného a 1 g citrátu trisodného v 48 g destilované vody a tepelně ošetřeno v proudící páře 100 C/20 min) 9 bylo naočkováno 1 % obj. kultury Clostridium tyrobutyricum 184 (Swedish Dairy Association, Švédsko) v RCM bujónu a přidány byly testované látky nebo kultury: dusičnan draselný (50 mg/kg) lysozym (350 mg/kg, U/mg) nisin (4 mg/kg) Lcc. lactis ssp. lactis CCDM 731 (Laktoflora, MILCOM a.s.) (1 % obj.) tvoří nisin v koncentraci 3,6 mg/l mesofilní kultura CCDM 1(Laktoflora, MILCOM a.s.) (1 % obj.) Lb. paracasei ST68 (VŠCHT, Praha) (1 % obj.) Lb. paracasei 171R2 (The Royal Veterinary and Agricultural University, Dánsko) (1 % obj.) kontrolní vzorek bez přídavku dalších látek nebo kultur Vzorky byly vloženy do anaerostatu a ponechány nejprve 24 h vedle sýrařské vany (25 30 C), a pak 2 měsíce ve zracím sklepě (7 9 C). Po 14, 30 a 60 dnech byly odebírány vzorky na rozbory. Spory klostridií byly stanoveny metodou nejpravděpodobnějšího počtu (MPN) na mléčné půdě s glukosou a kyselinou mléčnou po inaktivaci vzorků 80 C/5 min 10. Kyselina máselná byla stanovena izotachoforeticky 11. Screeningový pokus Na základě výsledků modelového pokusu byly hledány příčiny antiklostridiální aktivity mesofilní kultury CCDM 1, která je směsnou kulturou Lcc. lactis ssp. lactis, Lcc. lactis ssp. cremoris, Lcc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis a Leuconostoc mesenteroides). Mesofilní kultura byla naočkována roztěrem na M17 agar (inkubace 30 C/3 dny), odkud bylo izolováno 20 kolonií. Izolované subkultury byly kultivovány v M17 bujónu (30 C/18 h), aby vytvořily odpovídající metabolity. Aby přítomné mikroorganismy nerušily analýzu, byly buď odstraněny (odstředění 10 min při 6000 g a filtrace supernatantu přes mikrofiltry s póry 0,2 µm) nebo usmrceny (záhřev na vodní lázni 98 C/10 min). Testovány byly i varianty se zařazenou úpravou ph (na hodnotu 6,0 ± 0,2 pomocí 0,25 mol/l NaOH) před odstředěním. V takto upravených bujónech byla plotnovými metodami ( agar-well diffusion assay, agar spot test ) 12 testována přítomnost metabolitů s antimikrobiální aktivitou vůči Cl. tyrobutyricum 184 (RCM agar, 37 C/3 dny, anaerobně) a dále vůči Bifidobacterium lactis CCDM 94 (Laktoflora, MILCOM a.s.) (MRS agar ph 6,2 s cysteinem, 37 C/3 dny anaerobně), Bacillus cereus SPA 12 (MILCOM a.s.) a Micrococcus luteus CCM 732 (Česká sbírka mikroorganismů, Brno) (GTK, 30 C/3 dny aerobně). Výsledky a diskuse Účinnost antiklostridiálních látek a kultur se v průběhu skladování cheese-slurry ve zracím sklepě měnila (Tabulka I). Během prvních 14 dnů byly nejúčinnější dusičnan, nisin, lysozym a smetanová kultura. Ostatní kultury růst klostridií dokonce podporovaly pravděpodobně díky tvorbě kyseliny mléčné a octové (zdroj uhlíku pro Cl. tyrobutyricum) během 24 h vedle sýrařské vany. Po měsíci skladování byl již antiklostridiální účinek pozorován u všech testovaných látek a kultur, a s výjimkou lysozymu zůstal patrný i po dvou měsících. Účinnost antiklostridiálních látek 84

85 však během této doby klesla. Naopak nejúčinnější byly mesofilní kultura CCDM 1 a nisinprodukující kultura CCDM 731 a jak je patrné z obr. 1, pouze tyto dvě kultury byly schopné zabránit pozdnímu duření. O kultuře CCDM 731 je známo, že působí antimikrobiálně, a to zejména díky tvorbě nisinu, avšak u kultury CCDM 1 nebyla zatím antimikrobiální aktivita pozorována. S cílem zjistit, který mikroorganismus a proč inhibici klostridií způsobil, byla mesofilní kultura vyočkována na agar a izolováno bylo 20 kolonií. Ty byly různými způsoby testovány na antimikrobiální aktivitu vůči vybraným mikroorganismům (Cl. tyrobutyricum 184, B. lactis CCDM 94, B. cereus SPA 12, M. luteus CCM732). Avšak ani u jedné subkultury nebyla inhibice některého z mikroorganismů průkazná. Hypotézy, že hledaný kmen s antimikrobiální aktivitou nebyl mezi 20 testovanými subkulturami zastoupen nebo že mesofilní kultura vykazuje antiklostridiální aktivitu pouze při společné kultivaci jejích složek, byly vyvráceny, když byla plotnovými metodami otestována výchozí směsná kultura. Možným vysvětlením je, že hledaná látka, která inhibovala klostridia v modelovém pokuse, je asociována s povrchem buněk produkčních bakterií a zároveň má termolabilní povahu, popř. že je tvořena pouze v médiu na bázi mléka ( cheese-slurry ), avšak ne v bujónu. Jako nejvíce pravděpodobné vysvětlení rozdílů mezi výsledky obou pokusů se jeví odlišné možnosti, které oba přístupy nabízejí. Při použití plotnových metod jsou BMK kultivovány samostatně, a vytvoří tomu odpovídající složení a množství metabolitů. Ty pak působí na mikroorganismy, které mají být inhibovány. Naproti tomu po celou dobu modelového pokusu zůstaly jak BMK tak klostridia aktivní a mohly se vzájemně ovlivňovat. Mesofilní mléčné koky (CCDM 1, CCDM 731) i laktobacily (ST68, 171R2) tvořily nejen látky inhibující klostridia, ale i kyselinu mléčnou (popř. i octovou), které růst klostridií naopak podporují. Klostridia štěpila mléčné bílkoviny, čímž podpořila metabolickou aktivitu laktobacilů, zejména pak tvorbu klostridii využívaných organických kyselin. Růst mesofilních mléčných koků byl probíhající proteolýzou stimulován významně méně, a proto u těchto kultur převážila antiklostridiální aktivita. Tabulka I Průměrné počty spor klostridií (MPN/g) v cheese-slurry během skladování ve zracím sklepě (po naočkování do cheese-slurry bylo přítomno 3,2 x 10 1 MPN/g spor klostridií) 14 dní 30 dní 60 dní kontrola 1,6 x ,0 x ,2 x 10 3 Lb. paracasei 171R2 1,8 x ,0 x ,5 x 10 2 Lb. paracasei ST68 1,2 x ,0 x ,5 x 10 2 Lcc. lactis CCDM 731 1,5 x ,6 x ,7 x 10 1 mesofilní kultura CCDM 1 6,5 x ,0 x ,9 x 10 1 KNO 3 < 3,5 x ,0 x ,0 x 10 2 lysozym < 6,0 x ,0 x ,5 x 10 3 nisin < 3,5 x ,5 x ,6 x

86 Obr. 1. Nárůst koncentrace kyseliny máselné v cheese-slurry po 60 dnech skladování (Zduřelé sýry obsahují 0,21 0,97 g/kg kyseliny máselné 13 ) Závěr Kmeny Lb. paracasei ST68 a 171R2, u kterých byla v předcházejících pracích 8,9 plotnovými metodami prokázána antiklostridiální aktivita, vykazovaly i v modelovém pokuse schopnost potlačovat růst Cl. tyrobutyricum 184. Účinnost těchto kmenů však byla příliš nízká na to, aby nedošlo k pozdnímu duření. Pravděpodobně tomu tak bylo proto, že oba laktobacily růst klostridií zároveň podporovaly tvorbou kyseliny mléčné a octové. V modelovém pokuse byly nejúčinnější nisin produkující kultura Lcc. lactis ssp. lactis CCDM 731 a mesofilní kultura CCDM 1, u které se však plotnovými metodami nepodařilo látku s antimikrobiálním účinkem detekovat. Přestože mají plotnové metody řadu výhod (jednoduchost, rychlost, cenová dostupnost), existuje riziko, že jimi nebude vybrán ten nejvhodnější kmen. Modelové pokusy naproti tomu poskytují výsledky bližší reálnému stavu, neboť umožňují vzájemnou interakci testovaných mikroorganismů. Poděkování: Tato práce vznikla s finanční podporou MŠMT při řešení projektu 2B06048 a výzkumného záměru MSM Kmen Lactobacillus paracasei 171R2 s antiklostridiální aktivitou byl laskavě poskytnut od The Royal Veterinary and Agricultural University (Dánsko). Použitá literatura: 1. Ouwehand, A.C., Vesterlund, S. (2004): Antimicrobila components from lactic acid bacteria. V knize: Lactic acid bacteria. Microbiological and functional aspects, pp Marcel Dekker, New York, USA. 2. Ammor, S., Tauveron, G., Dufour, E., Chevallier, I. (2006): Antibacterial activity of lactic acid bacteria against spoilage and pathogenic bacteria from the same meat small-scale facility Screening and characterization of the antibacterial compounds. Food Control 17: Rodríguez, E., González, B., Gaya, P., Nunez, M., Medina, M. (2000): Diversity of bacteriocines produced by lactic acid bacteria isolated from raw milk. Int. Dairy J. 10: Hernández, D., Cardell, E., Zárate, V. (2005): Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711. J. Appl. Microbiol. 99: Cogan, T.M., Barbosa, M., Beuvier, E., Bianchi-Salvadori, B., Cocconcelli, P.S., Fernandes, I., Gomez, J., Gomez, R., Kalantzopoulos, G., Ledda, A., Madina, M., Rea, M.C., Rodriguez, E. (1997): Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy products. J. Dairy Res. 64: Dušková, M., Španová, A., Dráb, V., Rittich, B. (2009): Searching for genes of Lactococcus lactis subsp. 86

87 lactis encoding the bacteriocin nisin using DNA/DNA hybridisation. Czech J. Food Sci., Vol. 27, Special Issue, S366 S Holzapfel, W.H., Geisen, R., Schillinger, U. (1995): Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. Int. J. Food Microbiol. 24: Tůma, Š., Plocková, M. (2007): Protektivní kultury pro výrobu polotvrdých sýrů. Sborník semináře Mléko a sýry 2007, pp Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. ISBN Tůma, Š (2007): Laktobacily v sýrech s nízkodohřívanou sýřeninou eidamského typu. Disertační práce. ÚTMT, VŠCHT, Praha. 10. Havlová, J., Jičínská, E., Hrabová, H. (1993): Mikrobiologické metody v kontrole jakosti mléka a mléčných výrobků, pp ÚZPI, Praha. 11. RECMAN (2008): Stanovení vybraných kyselin v sýrech. Aplikační list č Dráb V., Dymáčková, L., Lavická, E., Růžičková, N., Samcová, L., Vilímková, M.: Stanovení antimikrobiálních vlastností bakterií mléčného kvašení lidského původu. Mlékařské listy 115 (2009): Bogovič, M.B., Koman, R.M., Perko, B., Rogejl, I. (2007): Inhibition of Clostridium tyrobutyricum in cheese by Lactobacillus gasseri. Int. Dairy J. 17: Kontaktní adresa: Ing. Irena Němečková, Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o., Ke Dvoru 12a, Praha 6, tel.: , fax: , nemeckova@milcom-as.cz 87

88 AKTIVITA LACTOBACILLUS RHAMNOSUS ŠTUDOVANÁ V MODLEOVÝCH POLOTVRDÝCH SYROCH Kontová Marcela 1, Drončovský Maroš 1, Slottová Anna 1, Greifová Mária 2, Greif Gabriel 2, Kološta Miroslav 1, Tomáška Martin 1 1 Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; Žilina 2 Ústav biotechnológie a potravinárstva, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita; Bratislava Activity of Lactobacillus rhamnosus studied in model semi-hard cheeses Summary: In previous works antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from raw milk and from cheeses was studied. 10 strains of Lactobacillus rhamnosus were selected. These strains exhibited inhibitory effect against several pathogens. The aim of this work was a technological characterization of the strains as a supplementary culture during production of cheeses. The strains were firstly tested in cow and sheep milk. Acidification of milk, sensorial properties and deliberation of L-glutamic acid (as a marker of proteolytic activity) were monitored. They were no significant differences between strains there. However two strains 65 and 123 were chosen for further experiments. The strains were combined (1:1 and 1:2) with two individual starter cultures - previously isolated and characterized ZS25 (two strains of L. lactis subsp. lactis) and commercially available Delvotec MT-53 (L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremonis and S. thermophillus). Cheeses were made from pasteurised cow full-fat milk (10 different semi-pilot productions). They were analysed immediately after processing and after 14 and 28 days of ripening for total solids, fat, ph, titratable acidity, proteolysis and sensorial properties. Addition of Lbc. rhamnosus strains to the starter culture had no effect on analytical properties of cheeses, but improved sensorial properties and very slightly enhanced proteolysis. These strains can be used in future cheese starter culture. In the next experiments their antimicrobial acitivity in real technological conditions has to be proved. Úvod Syry vyrobené z pasterizovaného mlieka môžu obsahovať sekundárnu neštartujúcu kyslomliečnu mikroflóru (NSLAB), pochádzajúcu zo surového mlieka (prevažne laktobacily) alebo priamo zo syrárne (pediokoky, enterokoky a iné), ktoré sa do mlieka dostávajú kontamináciou. Sú prevažne nekontrolovateľným faktorom pri výrobe syrov a môžu byť príčinou neštandardnej kvality a rôznych vád syrov. Monitorovaním ich rastu sa zistilo, že hoci NSLAB preukazujú slabý rast v mlieku, ale v syroch sa stávajú dominantnou mikroflórou, hlavne po poklese rastu štartujúcich laktokokov (1,2). Alternatívnym riešením nepriamej kontroly sekundárnej mikroflóry v syroch, môže byť, ako doporučuje viacero autorov (3,4), použitie doplnkovej kultúry, získanej izoláciou kmeňov laktobacilov z mlieka alebo zo syrov, ku štartujúcej kultúre. Laktobacily môžu prispievať k usmerneniu proteolýzy počas zrenia syrov cez peptidolytický potenciál (5). Kieronczyk a kol. (6) porovnávali katabolizmus vybraných aminokyselín mezofilnými laktobacilmi a kmeňom Lactococcus lactis subs. cremonis. Ich spoločné pôsobenie malo pozitívny vplyv na tvorbu arómy. Laktobacily iniciovali konverziu aminokyselín hlavne na keto- a hydroxy- kyseliny, ktoré boli následne transformované laktokokovým kmeňom na karboxylové kyseliny, ktoré sú dôležitou zložkou arómy syrov. Cieľom našej práce bolo študovať úlohu Lactobacillus rhamnosus, ako doplnkovej laktobacilovej kultúry ku štartovacej laktokokovej kultúre, pri acidifikácii, proteolytických zmenách a jej vplyv na senzorické vlastnosti polotvrdých syrov v priebehu ich zrenia. Materiál a metódy Štartovacie kultúry a) kultúry izolované z ovčieho syra VÚM Žilina a uložené v zbierke CCM (Brno, ČR) zmesná laktokoková kultúra ZS25 (zložená z dvoch kmeňov Lactobacillus lactis subsp. lactis a LM25 (zložená z viacerých variet druhu Lactococcus lactis) a jedna termofilná kultúra M37 zložená zo Streptococcus thermophilus 88

89 b) komerčná zmesná kultúra Delvotec MT-53 (DSM, Holandsko) zložená z druhov: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris a Streptococcus thermophilus Doplnkové kultúry Lactobacillus rhamnosus 10 kmeňov (65, 81, 85, 91, 123, 161, 163, 173, 183, 202) vyizolovaných zo surového kravského a ovčieho mlieka (zo zbierky Ústavu biotechnológie a potravinárstva FCHPT STU v Bratislave) s preukázanou antimikrobiálnou aktivitou (7). Aplikácia kyslomliečnych kultúr a) 10 kmeňov Lactobacillus rhamnosus a 3 druhy zmesných štarovacích kultúr sa podrobilo sledovaniu dôležitých technologických znakov: - kinetika acidifikačnej aktivity - determinovaná inokuláciou (0,5 % vol/vol) kmeňov a kultúr v pasterizovanom plnotučnom kravskom a ovčom mlieku (72 C, 10 minút) po 2, 4, 6, 10, 16 a 24 hodinovej kultivácie pri teplote 37 C (laktobacily) a 30 C (laktokoky); vstupná koncentrácia kmeňov bola 10 8 KTJ.ml -1 - kmene sa aplikovali po druhom preočkovaní z MRS tekutého média, resp. M17 tekutého média. - meranie množstva kyseliny L-glutámovej spektrofotometrickou metódou s o- ftaldialdehydom (OPA-metóda), s modifikáciou pri postupe, kde bol etanthiol nahradený sodnou soľou 2-mercaptoetansulfonovou kyselinou (8). Množstvo kyseliny L-glutámovej bolo vypočítané pomocou rovnice kalibračnej čiary, berúc do úvahy riedenie vzorky. - skupinové bodové hodnotenie chuti, vône a konzistencie vyhodnotené profilovou analýzou najdôležitejších znakov b) Na základe predchádzajúcich výsledkov boli do modelových pokusných výrob vybraté 2 kmene Lactobacillus rhamnosus 65 a Lactobacillus rhamnosus 123, ktoré sa aplikovali samostatne ako doplnková kultúra paralelne k 2 druhom štartovacích kultúr, ktoré boli použité buď samostatne - ako kontrolné syry (bez doplnkovej kultúry) a ako zmesné štartovacie kultúry s doplnkovou kultúrou kmeňa Lactobacillus rhamnosus - nahradené 1/2 a 1/3 podielom ku štartovacej kultúre. Pri všetkých výrobách bolo dodržané rovnaké dávkovanie kultúr (1% vol/vol na objem spracovaného mlieka). Na výrobu polotvrdého syra sa použilo plnotučné pasterizované kravské mlieko (72 C po dobu 10 minút). Syry sa monitorovali analyticky (sušina - gravimetricky, tuk v sušine butyrometricky podľa Van Gulika a následne výpočtom, aktívna kyslosť po rozotrení v destilovanej vode, titračná kyslosť titračne) a senzoricky a to v troch štádiách zrenia: po výrobe, po 14 a 28 dňoch zrenia pri teplota zrenia syrov: 12 C - 14 C; proteolytické zmeny sa u jednotlivých syrov porovnávali OPA-metódou. Výsledky a diskusia Technologické znaky štartovacích kultúr a kmeňov Jednotlivé kmene laktobacilov a štartovacie kultúry boli charakterizované podľa kinetiky zrážania s dosiahnutou zrážacou a finálnou ph hodnotou počas 24 hodinovej kultivácie v ovčom a kravskom plnotučnom pasterizovanom mlieku. Kinetika zrážania a acidifikácia sú znázornené na obrázku 1. Rýchly začiatok zrážania bol úplne zhodný u všetkých kmeňov laktobacilov kultivovaných v ovčom mlieku i v kravskom mlieku, pričom v ovčom mlieku bol predĺžený o 6-7 hodín kultivácie, čo pravdepodobne môže mať súvislosť s odlišným zložením mliek. Rýchle zrážanie u kmeňov Lactobacillus plantarum a Lactobacillus rhamnosus zaznamenal aj Briggiler- Marcó a kol. (9) a to už po 8 hodinách kultivácie v kravskom surovom mlieku. Najdlhšia doba zrážania u oboch mliek bola u kultúry LM25. Tá vykazuje aj odlišné technologické vlastnosti, v porovnaní s kultúrou ZS25. Rozdiely u jednotlivých kmeňov laktobacilov sa prejavili pri opakovanom preočkovaní, pri ktorom sa u viacerých kmeňov prejavila nestabilná doba zrážania. Medzi najstabilnejšie kmene pri viacnásobnom preočkovávaní sa prejavili kmene 65, 85, 123 a 163. Naopak, pri senzorickom hodnotení sa zistilo, že v aróme a chuti neboli žiadne rozdiely u všetkých sledovaných 10-ich kmeňov laktobacilov mali rovnakú mliečno-kyslú arómu a chuť. 89

90 35 7 čas zrazenia (h) ph-hodnota čas zr.(h)-krav. čas zr.(h)-ovč. ph krav.-zr. ph ovč.-zr. ph krav.-final ph ovč.-final ZS25 LM25 M37kmene Obr. 1. Porovnanie acidifikácie a zrážania u kmeňov Lactobacillus rhamnosus a kultúr v kravskom a ovčom mlieku Výsledky proteolytickej aktivity laktobacilových kmeňov a kultúr po 24-hodinovej kultivácii v mlieku boli podľa očakávania nevýrazné. Množstvo kyseliny L-glutámovej vzrástlo oproti kontrolnému mlieku z <0,01 g.kg -1 na maximálne 0,66 g.kg -1 v závislosti od prítomného mikroorganizmu, či kultúry (tabuľka I). Najvyšší nárast bol pozorovaný u kmeňov 65 a 123 a a komerčnej kultúry Delvotec MT-53. Tabuľka I Množstvo kyseliny L-glutámovej vo vzorkách mlieka s alebo bez prídavku kultúry Kultúra Kyselina L-glutámová (g.kg -1 mlieka) Kontrolné mlieko bez kultúry <0,01 ZS25 0,27 LM25 0,13 M37 <0,01 Delvotec MT-53 0,51 Lactobacillus rhamnosus 65 0,46 Lactobacillus rhamnosus 85 0,22 Lactobacillus rhamnosus 123 0,66 Lactobacillus rhamnosus 163 0,22 Charakteristika modelových polotvrdých syrov Na základe dosiahnutých výsledkov in vitro, pre modelové pokusné výroby boli vybraté dva druhy laktobacilov: kmene č.65 a č.123, ktoré ako doplnkové kultúry boli kombinované s 2 druhmi laktokokových štartovacích kultúr ZS25 a Delvotec MT-53. Táto komerčne dostupná kultúra bola použitá pre účely porovnania ako aj kvôli komplexnosti zloženia. Celkovo bolo uskutočnených 10 poloprevádzkových výrob. Charakteristika použitých kultúr je uvedená v tabuľke II. 90

91 Tabuľka II Charakteristika kultúr použitých pri poloprevádzkovej výrobe syrov Výroba Charakteristika použitej kultúry 1 ZS 25 2 ZS 25 : Lacobacillus rhamnosus 65 (1:1) 3 ZS 25 : Lacobacillus rhamnosus 65 (2:1) 4 ZS 25 : Lacobacillus rhamnosus 123 (1:1) 5 ZS 25 : Lacobacillus rhamnosus 123 (2:1) 6 Delvotec MT-53 7 Delvotec MT-53 : Lacobacillus rhamnosus 65 (1:1) 8 Delvotec MT-53 : Lacobacillus rhamnosus 65 (2:1) 9 Delvotec MT-53 : Lacobacillus rhamnosus 123 (1:1) 10 Delvotec MT-53 : Lacobacillus rhamnosus 123 (2:1) Podľa analytických vlastností možno považovať jednotlivé výroby za štandardné tabuľka III. Sušina sa pohybovala v intervale od 50,59 g.100g -1 do 56,27 g.100g -1 (52,87 ± 1,35) g.100g -1. Tuk v sušine bol od 55,73% do 60,42 % (58,15 ± 1,49) % - syry boli vyrobené s kravského mlieka bez odstránenia tuku. Aktívna kyslosť sa menila od 5,02 do 5,28 (5,14 ± 0,07) a titračná kyslosť od 86 SH do 106 SH (98,40 ± 4,11) SH. Z tabuľky III je zrejmé, že vplyv použitej kultúry bol minimálny na dané merané vlastnosti syrov. Tabuľka III Analytické charakteristiky poloprevádzkových výrob syrov charakterizovaných v tabuľke II - S je sušina v g.100g -1, TVS je beztuková sušina v %, ph je aktívna kyslosť a SH je titračná kyslosť v SH Výr. Po výrobe 14 dní zrenia 28 dní zrenia S TVS ph SH S TVS ph SH S TVS ph SH 1 50,59 59,30 5,22 96,0 54,37 57,94 5,18 99,0 56,27 60,42 5,27 98,0 2 52,51 57,13 5,14 97,0 54,44 58,78 5,08 102,0 55,51 58,55 5,09 100,0 3 52,65 56,98 5,09 97,0 52,69 59,78 5,02 106,0 54,30 58,93 5,07 105,0 4 51,43 56,39 5,28 86,0 51,63 58,11 5,08 103,0 51,11 56,74 5,21 96,0 5 51,84 56,91 5,28 93,0 52,15 59,44 5,12 99,0 53,53 57,91 5,25 96,0 6 51,66 56,14 5,11 99,0 52,78 55,89 5,06 104,0 52,93 55,73 5,09 102,0 7 52,19 56,52 5,24 92,0 51,96 59,66 5,13 99,0 52,41 59,15 5,18 96,0 8 51,10 57,73 5,15 94,0 52,03 56,70 5,05 101,0 52,75 55,92 5,16 96,0 9 53,04 59,39 5,15 98,0 53,92 59,35 5,12 97,0 54,31 58,92 5,14 99, ,14 60,41 5,08 99,0 53,12 60,24 5,07 102,0 54,59 59,53 5,05 101,0 Napriek krátkej dobe zrenia syrov (28 dní) boli pri senzorickom hodnotení zaznamenané určité rozdiely v chuti a v konzistencii, samozrejme najvýraznejšie na jeho konci. Po výrobe, čiastočne aj po 14-ich dňoch, prevládala nakyslá a mliečno-smotanová chuť, ktorá sa postupne menila na lahodnú syrovo-maslovú chuť (čo zodpovedá vyššiemu podielu tuku v sušine). Ako výsledky komisionálneho hodnotenia ukázali, chuť a konzistencia syrov vyrobených s prídavkom doplnkovej laktobacilovej kultúry súvisela so zložením použitej štartovacej kultúry; pri použití jednoduchšej štartovacej kultúry zloženej len z dvoch kmeňov druhu Lactococcus lactis subs. lactis, senzorické hodnotenie bolo priaznivejšie u syrov s doplnkovou laktobacilovou kultúrou; pri bodovom hodnotení dosiahol najvyšší počet bodov syr vyrobený s kultúrami ZS25 a Lactobacillus rhamnosus 123 v pomere 1:1 (výroba 4). Syry vyrobené so zmesnou viacdruhovou štartovacou kultúrou (Delvotec MT-53) mali výraznú nakyslú až kyslú chuť (výroba 6), ktorá sa prídavkom doplnkovej laktobacilovej kultúry zjemnila, čo sa prejavilo na zvýšenom počte bodov pri senzorickom hodnotení (výroba 10 Delvotec MT-53 a Lactobacillus rhamnosus 123, avšak 91

92 v pomere 2:1). Kultúra Delvotec MT-53 bola zložená nielen z mezofilných laktokokov, ale aj s určitým podielom druhu Streptococcus thermophilus, ktorý má schopnosť výrazne sa podieľať na acidifikácii syrov hlavne v prvých štádiách výroby. Proteolýza syrov determinovaná OPA-metódou sa zvyšovala s dĺžkou doby zrenia, ako je to znázornené na obrázku 2, čo bol predpokladaný priebeh. Po 28 dňoch sa najväčšie množstvo kyseliny L-glutamovej nameralo u syrov z výroby 8 a 7, následne 9 a 10 - to znamená u kultúr s najbohatším druhovým zastúpením mikroorganizmov. Vo všeobecnosti mal prídavok Lactobacillus rhamnosus na priebeh proteolýzy veľmi mierne stimulujúci efekt - množstvo kyseliny L-glutámovej bolo s výnimkou dvoch takýchto výrob (výroba 3 - takmer rovnaké množstvo v porovnaní s výrobou 1 a výroba 2 - nižšie množstvo v porovnaní s výrobou 1) vždy na konci zrenia o niečo vyššie. Ak by sme hľadali vzťah medzi senzorickými vlastnosťami a proteolýzou, potom syry s prídavkom Lactobacillus rhamnosus boli senzoricky hodnotené lepšie a zároveň mali aj vyšší podiel kyseliny L-glutámovej, ako vyrobené len pomocou štartovacej kultúry. Samozrejme je otázne, či vylepšenie senzorických vlastností bolo spôsobené (iba) proteolýzou, alebo aj produkciou iných látok (6). Na druhej strane, namerané množstvá kyseliny L-glutámovej boli nižšie (doba zrenia bola iba 28 dní), ako kritické hodnoty, ktoré boli zistené u syrov so senzorickými vadami (10) Kyselina L-glutámová (g.kg -1 sušiny syra) po výrobe po 14 dňoch po 28 dňoch Obr. 2. Porovnanie priebehu proteolýzy počas poloprevádzkovej výroby syrov (označenie výrob 1-10 je vysvetlené v tabuľke II) Záver Cieľom práce bolo overiť vplyv doplnkovej kultúry laktobacilov druhu Lactobacillus rhamnosus ku štartovacej kultúre na prekysávanie, proteolýzu a celkové senzorické vlastnosti polotvrdých syrov počas zrenia. Zistilo sa, že prídavok doplnkovej kultúry ku štartovacej kultúre nemal vplyv na analytické vlastnosti syrov (množstvo sušiny, tuku v sušine, ph a titračnej kyslosti) v priebehu zrenia. Prejavil sa však na zlepšení senzorických vlastností, predovšetkým na zjemnenie nakyslej až kyslej chuti, ak štartovacia kultúra svojím zložením mala zvýšenú kysaciu schopnosť a veľmi mierne aj na zvýšení proteolýzy. 92

93 Vzhľadom na študovaný sľubný technologický potenciál doplnkových kultúr Lactobacillus rhamnosus a ich už skôr preukázanú antimikrobiálnu aktivitu (7) sa bude v ďalšom sledovať ich účinnosť voči nežiaducim mikroorganizmom, potenciálne sa vyskytujúcich pri výrobe a zrení syrov, ako aj ďalšia optimalizácia zloženia technologicky a nutrične prijateľnej štartovacej syrárskej kultúry. Poďakovanie: Práca bola riešená vďaka podpore projektu APVV Použitá literatúra: 1. Peterson, S. D. a Marshall. R. T.: Nonstarter lactobacilli in Cheddar cheese: A review. J. Dairy Sci., 73, (1990) 2. Fox, P. F., McSweeney, P. L. H. a Lynch, C. M.: Significance of non-starter lactic acid bacteria in Cheddar cheese. Aust. J. Dairy Technol., 53, (1998) 3. Crow, V. L., Curry, B. a Hayes, M.: The ecology of non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) and their use as adjuncts in New Zealand Cheddar. Int. Dairy J., 11, (2001) 4. Di Cagno, R., De Angelis, M., Upadhyay, V., McSweeney, P. L. H., Minervini, F., Gallo, G. a Gobbetti, M.: Effect of proteinases of starter bacteria on the growth and proteolytic activity of Lactobacillus plantarum DPC2741. Int. Dairy J., 13, (2003) 5. Lynch, C. M., Muir, D. D., Banks, J. M., McSweeney, P. L. H. a Fox, P. F.: Influence of adjunct cultures of Lactobacillus paracasei ssp. paracasei or Lactobacillus plantarum on Cheddar cheese ripening. J. Dairy Sci., 82, (1999) 6. Kieronczyk, A., Skeie, S., Langsrud, T. a Yvon, M.: Cooperation between Lactococcus lactis and nonstarter lactobacilli in the formation of cheese aroma from amino acids. Appl. Environ. Microbiol., 69, (2003) 7. Greifová, M., Krajčová, E., Greif, G., Karovičová, J., Kontová, M. a Tomáška, M.: Antimikrobiálna aktivita laktobacilov izolovaných zo surového ovčieho mlieka a kravského mlieka. Potravinárstvo, 3, (2009) 8. Tschager, E.: Eine einfache Methode zur Kontrolle des Eiweißabbaus im Käse. Milchwirtschaftliche Berichte, 105, (1990) 9. Briggiler-Marcó, M., Capra, M.L., Quiberoni, A., Vinderola, G., Reinheimer, J.A. a Hynes, E.: Nonstarter Lactobacillus strains as adjunct cultures for cheese making: In Vitro characterization and performance in two model cheeses. J. of Dairy Sci., 90, (2007) 10. Osl, F. a Ginzinger, W.: Kvalitatívne faktory u syrov s propiónovým kvasením. V: Zborník referátov Syrotech 95 - Nové poznatky v syrárskej technológii a technike máj 1995, Žilina., Výskumný ústav mliekárenský, š.p., Žilina, ISBN , (1995) Kontaktná adresa: Ing. Martin Tomáška, PhD., Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; Dlhá 95, Žilina; tomaska@vumza.sk 93

94 ŠTÚDIUM ANTIMIKROBIÁLNYCH VLASTNOSTI LAKTOBACILOV IZOLOVANÝCH ZO SUROVÉHO MLIEKA Greifová Mária 1, Greif Gabriel 1, Krajčová Eva 1, Smetanková Jana 1, Kontová Marcela 2 1 Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU Bratislava, SR 2 Výskumný ústav mliekarensky, Žilina, SR Study of antimicrobial properties of lactobacilly isolated from raw milk Summary: The dynamics of growth of S. aureus was monitored in UHT milk with coexistence of butter cultures (MT53, ZS25 and Laktoflóra) as well as additional cultures of Lactobacillus rhamnosus 123 or Lactobacillus rhamnosus LC 705. The initial concentrations of S. aureus in all experiments were 10 3 CFU/ml. Applying butter cultures that have very good acidifying properties, there was a 2,5 log reduction in maximum cell number of S. aureus in the stationary phase. The addition of additional culture reduced the maximum cell number of S. aureus about another one log - reduction. The inhibitory effect was confirmed in vitro by using three different butter cultures against S. aureus. The inhibition of S. aureus increased by the addition L. rhamnosus 123 to creamy cultures. The importance of additional protection cultures was confirmed. Predmetom intenzívneho svetového výskumu je sledovanie antimikrobiálnej aktivity baktérií mliečneho kysnutia (BMK) ako ochranných kultúr pre biologické prostredie. Antimikrobiálne pôsobenie BMK, využívané ku bioprezervácií potravín zahrňuje produkciu organických kyselín, H 2 O 2, CO 2, diacetylu alebo bakteriocínov ( Konings a kol., 2000; Ross a kol., 2002; Charlier a kol., 2009). Každá z týchto zlúčenín a predovšetkým vo vzájomnej kombinácii môže zvýšiť zdravotnú bezpečnosť a trvanlivosť potravín. Najviac bol skúmaný antimikrobiálny vplyv organických kyselín, hlavne kyseliny mliečnej v súvislosti s redukciou ph-hodnoty. Baktérie s technologickým významom, ktoré je snaha izolovať z tepelne neošetreného mlieka a identifikovať ich, sú označované ako divoké kmene. Výskum týchto kmeňov sa sústreďuje na opísanie ich vlastností, ktorými sa odlišujú od kmeňov priemyselne využívaných zákysových kultúr, pre možnosti ich využitia vo forme prídavných kultúr k tradične používaným priemyselným zákysovým kultúram. V budúcnosti sa o divokých kmeňoch uvažuje ako súčasť viacdruhových zmesných zákysových kultúr pre rôznu mliekarenskú výrobu (Kozáková a kol., 2004). Cieľom našej práce bolo determinovať schopnosť a spoľahlivosť vybraných kyslomliečnych štartovacích kultúr (ZS 25, Laktoflóra, MT-53), s/alebo bez prídavku doplnkovej laktobacilovej kultúry (kmeň Lactobacillus rhamnosus 123) izolovanej zo surového ovčieho mlieka na efekt inhibície rastu Staphylococcus aureus v modelových pokusoch i) v mlieku a ii) in vitro difúznou metódou. Materiál a metódy: Smotanové kultúry: ZS25 bola izolovaná na VÚM Žilina, z ovčieho hrudkového syra vyrobeného v salašníckych podmienkach Slovenska. Je to zmes rôznych variet druhu Lactococcus lactis, je uložená v zbierke mikroorganizmov CCM Masarykovej univerzity (Brno, ČR). Ide o originálnu kultúru, ktorá má perspektívne využitie pri revitalizácii mikroflóry po tepelnom ošetrení ovčieho mlieka a vývoji nových funkčných mliečnych výrobkov. Laktoflóra bola získana z Milcom, a.s., Praha. Je to zmesná kultúra: Lactococcus lactis subsp. lactis a Lactococcus lactis subsp. cremoris. Delvotec MT-53 (DSM, Holandsko) je zmes: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris a Streptococcus thermophilus. 94

95 Doplnkové kultúry : Lactobacillus rhamnosus 123 bola izolovaná na Ústave biotechnológie a potravinárstva FCHPT STU v Bratislave zo surového ovčieho mlieka a bola u neho preukázaná antimikrobiálna aktivita. Lactobacillus rhamnosus LC 705 (Danisco, Nemecko) komerčná kultúra Indikátorový kmeň: S. aureus CCM 4516, CCM Czech Collection of Microorganisms, Brno. Kompetícia Staphylococcus aureus a BMK v modelových pokusoch v mlieku Sterilné UHT mlieko (1,5 % tuku) bolo inokulované S. aureus tak, aby jeho vstupná koncentrácia bola 10 3 KTJ.ml -1. V ďalšej sade sterilného UHT mlieka boli k S. aureus pridané jednotlivé smotanové kultúry a tiež doplnková kultúra L. rhamnosus 123, resp. LC705 pre sledovanie ovplyvnenia rastu S. aureus pridanými BMK. Vstupná koncentrácia BMK bola 10 7 KTJ/ml, vstupná koncentrácia doplnkovej kultúry tiež 10 7 KTJ/ml. Pripravili sa kombinácie kultúr v mlieku: S. aureus v mlieku, S. aureus + Laktoflóra v mlieku, S. aureus + Laktoflóra + Lactobacillus rhamnosus 123 (1:1) v mlieku, S. aureus + Laktoflóra + Lactobacillus rhamnosus LC705 (1:1) v mlieku. S. aureus + ZS 25 v mlieku, S. aureus + ZS 25 + Lactobacillus rhamnosus 123 (1:1) v mlieku, S. aureus + ZS 25 + Lactobacillus rhamnosus LC705 (1:1) v mlieku. S. aureus + MT-53 v mlieku, S. aureus + MT-53 + Lactobacillus rhamnosus 123 (1:1) v mlieku, S. aureus + MT-53 + Lactobacillus rhamnosus LC705 (1:1) v mlieku. Následne boli vzorky kultivované pri 30 ºC a postupne mikrobiologicky analyzované na obsah S. aureus v časových intervaloch 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 h. Súčasne sa vo zvolených časových intervaloch sledovala zmena ph. Sledovanie antimikrobiálneho účinku laktokokov resp. laktobacilov na vybraný indikátorový mikroorganizmus in vitro metódou Pri dvojvrstvovej difúznej metóde bol testovaný kmeň laktokokov resp. (laktobacilov) nanesený pomocou pipety v množstve 30 µl na tuhý MRS agar a kultivovaný pri optimálnych podmienkach jeho rastu 48 hod. Po vyrastení kolónií boli PM preliate mäkkým BHI (0,8 % agaru) s koncentráciou indikátorového kmeňa cca 10 7 KTJ/ml. Po 24 h aeróbnej kultivácii pri 37 C bola porovnávaná plocha inhibície (vyjasnená zóna). Výsledky: Sledovanie kompetície S. aureus a BMK v mlieku Na význam doplnkovej ochrannej kultúry sme sa snažili poukázať posúdením rastu S. aureus s vybranými druhmi BMK v mlieku, pomocou smotanových kultúr aj doplnkovej kultúry. Získané výsledky sú grafický znázornené na obr. 1 až 3. Rast S. aureus v sterilnom mlieku bez KMB nie je ničím inhibovaný a za 24 h pri 30 C sa jeho počty zvýšili o takmer 4,5 log poriadku (z pôvodných 10 3 na takmer 10 7,5 KTJ/ml). Prídavok samotných smotanových kultúr do mlieka nárast S.aureus za 24 h znížil o 2 log poriadky oproti ideálnemu rastu S. aureus. Prídavok testovannej ochrannej kultúry L. rhamnosus 123 nárast S. aureus znížil o ďalší log poriadok. Podobný účinok mal prídavok komerčnej ochrannej kultúry (LC 705). Z obrázkov je tiež vidieť, že prídavok KMB do mlieka neovplyvnil lag fázu S. aureus ani výrazne jeho rýchlosť rastu, iba jeho max. počty v stacionárnej fáze. 95

96 8 6,5 7 6,0 log(ktj/ml) ph 5,5 5,0 3 2 STA v mlieku STA + MT53 STA + MT (1:1) STA + MT53 + LC ,5 STA v mlieku STA + MT53 STA + MT (1:1) STA + MT 53 + LC Čas [h] Čas [h] Obr. 1 Rast S. aureus v mlieku pri 30 C v prítomnosti vybraných kultúr BMK 8 6,4 7 6,2 6,0 6 5,8 5,6 log(ktj/ml) 5 ph 5,4 5,2 4 5,0 3 2 STA v mlieku STA + Laktoflora STA + Laktoflora (1:1) STA + Laktoflora (1:2) STA + Laktoflora + LC Čas [h] 4,8 4,6 4,4 STA v mlieku STA + Laktoflora STA + Laktoflora (1:1) STA + Laktoflora (1:2) STA + Laktoflora + LC Čas [h] Obr. 2 Rast S. aureus v mlieku pri 30 C v prítomnosti vybraných kultúr BMK 96

97 Vďaka fermentačnému metabolizmu BMK sa v prostredí tvorí kyselina mliečna, ktorá spôsobuje pokles hodnôt ph, ale aj ďalšie antimikrobialne pôsobiace zložky. Čím bola nižšia hodnota ph, tým bol menší nárast S. aureus v danom prostredí. Medveďová a kol. (2007) svojimi pokusmi podobne kvantitatívne dokázali a popísali skutočnosť, že použitím vhodnej kompetitívnej kultúry baktérií mliečneho kysnutia a zvyšovaním jej inokulácie sa dá spomaliť rastová rýchlosť S. aureus v exponenciálnej fáze a znížiť jeho maximálne počty dosiahnuté v stacionárnej fáze. Inhibícia nárastu S. aureus je tiež tým účinnejšia, čím bol prídavok kompetitívnej mikroflóry vyšší a inkubačná teplota nižšia. Haines a Harmon (1973) testovali inhibičné schopnosti 8 druhov baktérií patriacich do rodov Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Streptococcus. Dokázali, že zmesné kultúry spomínaných baktérií v laboratórnych podmienkach s médiom obsahujúcim S. aureus potlačovali jeho rast viac ako samotné kultúry. log(ktj/ml) STA v mlieku STA + ZS 25 STA + ZS STA + ZS 25 + LC ph 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 Čas kultivácie [h] STA v mlieku STA + ZS 25 STA + ZS STA + ZS 25 + LC Obr. 3 Rast S. aureus v mlieku pri 30 C v prítomnosti vybraných kultúr BMK Charlier a kol. (2008) monitorovali 75 druhov Lc. lactis a ich potenciál inhibovať rast S. aureus v mlieku a dokázali, že inhibičné vlastnosti týchto vybraných druhov boli rôzne. Väčšina kmeňov Lactococcus lactis (93 %) rast S. aureus inhibovala a pár kmeňov (7 %) nemala voči S. aureus žiadny inhibičný účinok. Sledovanie antimikrobiálneho účinku laktokokov resp. laktobacilov na S. aureus metódou in vitro Na sledovanie antimikrobiálneho účinku laktokokov resp. laktobacilov voči S. aureus sa použila dvojvrstvová difúzna metóda. 97

98 Obr. 4 Inhibičné zóny smotanovej kultúry MT53 bez a s doplnkovou kultúrou (L.rhamnosus 123 alebo LC 705) voči S. aureus V prvom stĺpci (obr. 4) je znázornená inhíbicia smotanovej kultúry (MT-53). V druhom stĺpci je znázornená inhíbicia smotanovej kultúry spolu s doplnkovou kultúrou L. rhamnosus 123 (1:1). Už voľným okom vidieť väčšiu vyjasnenú plochu oproti samotnej smotanovej kultúre. V treťom stĺpci je pre porovnanie pokus zopakovaný s komerčnou ochrannou kultúrou LC 705 (1:1 k smotanovej kultúre). Podobným postupom sme pracovali s ďalšími smotanovými kultúrami (Laktoflóra a ZS25), kde sa dosiahli obdobné výsledky. Aj takým jednoduchým a názorným spôsobom sme poukázali na význam doplnkovej ochrannej kultúry. Poďakovanie: Práca bola podporená projektom APVV , VEGA 1/0746/08 Použitá literatúra: 1. Haines, W.C., Harmon, L.G.: Effect of selected lactic acid bacteria on growth of Staphylococcus aureus and production of enterotoxin. Appl Microbiol., 25(3), (1973) 2. Charlier, C., Cretenet, M., Even, S., Le Loir, Y. : Interactions between Staphylococcus aureus and lactic acid bacteria: An old story with new perspectives. International Journal of Food Microbiology, 131, (2009) 3. Konings, W. N., Kok, J., Kuipers, O.P., Poolman, B.: Lactic acid bacteria: the bugs of the new millennium. Current Opinion Microbiology, 3, (2000) 4. Kozáková, E., Plocková, M., Šviráková, E.: Variabilita vlastností u kmenů rodu Lactococcus sp. izolovaných z různych zdrojů In: Sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2004, Praha, 2004, s ISBN Medveďová, A., Valík, Ľ., Bajúsová, B.: Kompetitívny účinok baktérií mliečneho kysnutia na rast Staphylococcus aureus. Slovak J. Anim. Sci., 40, (2007) ISSN Ross, R.P., Morgan, S., Hill, C.: Preservation and fermentation: past, present and future. International Journal of Food Microbiology, 7, 3-16 (2002) Kontaktná adresa: doc. Ing. M. Greifová, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU Bratislava, Radlinského 9, Bratislava; maria.greifova@stuba.sk 98

99 PRODUKCIA ORGANICKÝCH KYSELÍN A BIOGÉNNYCH AMÍNOV BAKTÉRIAMI NSLAB IZOLOVANÝMI Z BRYNDZE Greif Gabriel, 1 Greifová Mária, 1 Sopčaková Zuzana, 1 Karovičová Jolana, 1 Tomaška Martin 2 1 Ústav biotechnológie a potravinárstva, STU Bratislava, 2 Výskumný ústav mliekárenský, a.s., Žilina Production of organic acids and biogenic amines by bacteria (NSLAB) isolated from sheep cheese (bryndza) Summary: Phenyllactic acid (PLA) is an organic acid produced from phenylalanine by some strains of lactic acid bacteria (LAB). This acid can inhibit growth of bacteria, moulds and yeasts. Chromatographic separations were performed on a Polymer IEX H + column (8 mm 250 mm, 5 μm, Watrex, Slovak Republic). 1 mm H 2 SO 4 was used as the mobile phase at the flow rate 1.0 ml/min at 50 C. The ultraviolet detection was carried out at 210 nm for phenyllactic acid, where as dl-lactic acid, acetic acid and ethanol were detected by refractive index detector. The developed methods were utilized for monitoring of the production of phenyllactic acid, dl-lactic acid, acetic acid and ethanol in MRS broth by bacteria (NSLAB) isolated from sheep cheese (bryndza). The content of biogenic amines produced by NSLAB as well was monitored. From the results concluded that applied NSLAB produced only histamine. Baktérie mliečneho kvasenia (BMK) sú často nachádzané a známe svojím rozmnožovaním pri fermentačných procesoch alebo ako kolonizátori mukozomálneho povrchu vyšších živočíchov. Aby mohli rásť, vyžadujú prostredie bohaté na živiny. Okrem sacharidov potrebujú aminokyseliny, peptidy, soli a vitamíny a mnoho ďalších suplementov 1, 2. BMK majú dve rozdielne metabolické dráhy pre fermentáciu hexóz, homofermentatívnu a heterofermentatívnu dráhu. Homofermentatívnou dráhou sa rozumie glykolýza (Embden-Meyerhof- Parnas dráha) a nastáva u rodoch Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus a homofermentatívny je aj Lactobacillus species. Je to charakterizované štiepením frutóza-1,6-difosfátu (FDP) na dve fosfátové triózy, glyceraldehyd-3-fosfát (GAP), a dihydroxyacetónfosfát (DHAP) v rovnováhe pomocou FDP aldolázy. GAP je ďalej konvertovaný na pyruvát, ktorý je potom redukovaný na kyselinu mliečnu 3, 4. Heterofermentatívne alebo 6-fosfoglukonátova/fosfoketolázová dráha je charakterizovaná oxidáciou glukóza-6-fosfátu na glukonát-6-fosfát následnou dekarboxyláciou. Zvyšujúca sa pentóza je štiepená na C-3 podiel (glyceraldehyd-3-fosfát) a C-2 podiel ( acetyl-fosfát) pomocou fosfoketolázy. Výsledkom je ekvimolárne množstvo CO 2, kyselina mliečna a etanol, ktoré sú formované z hexózy. Kyseliny majú veľmi široké spektrum účinku a potláčajú rast grampozitívnych i gramnegatívnych baktérií, kvasiniek i plesní. Vo všeobecnosti tieto látky vytvárajú nevhodné prostredie pre rast patogénnych a kontaminujúcich mikroorganizmov. Množstvo a typ produkovanej kyseliny závisí od kmeňa, ktorý ju produkuje, od zloženia použitej zmesnej kultúry ako aj od podmienok kultivácie 5, 6. Hlavným metabolitom BMK je kyselina mliečna, ktorá je zodpovedná za významnú zmenu ph v ich rastovom prostredí, dostatočnú pre antagonizmus viacerých baktérií. Nedisociovaná forma slabých organických kyselín difunduje cez bunkovú membránu a je v závislosti na intracelulárnom ph viac alebo menej disociovaná vo vnútri bunky, uvoľňuje H + ióny, ktoré okysľujú cytoplazmu 7. Navyše nedisociovaná forma molekuly sprostredkováva antimikrobiálny efekt kolapsom elektrochemického protónového gradientu, čím vzniká bakteriostatický vplyv alebo smrť citlivej baktérii. Efekt je viac výrazný pri ph hodnote pod pka hodnotu kyseliny, t.j. keď kyselina je v nedisociovanom stave 7. Heterofermentatívne BMK produkujú kyselinu octovú v relatívne veľkom množstve v prítomnosti vonkajších elektrónových akceptórov, kým kyselina propionová je produkovaná len v stopových množstvách. Obe kyseliny majú vyššiu hodnotu pk a než kyselina mliečna a preto majú 99

100 väčšiu časť nedisociovanej kyseliny pri určitom ph. Podobne ako kyselina mliečna, octová aj propionová kyselina interagujú s bunkovou membránou a neutralizujú elektrochemický protónový gradient, ale vplyv kyseliny octovej a propionovej je často závislý na znížení ph vplyvom kyseliny mliečnej. Kyselina propionová negatívne ovplyvňuje rast húb, špeciálne pri nižšom ph a pôsobí na membránu plesní pri ph hodnote pod 4,5 8. Kyselina propionová a octová tiež inhibuje príjem aminokyselín. Niektoré soli kyseliny propionovej, napr. propionát sódny a amónny podobne vplývajú na kvasinky a vláknité huby pri nízkom ph 9. Moon (1983) 10 zistil, že zmes o vyššej koncentrácií kyseliny mliečnej, octovej a propionovej inhibuje kvasinky, ktoré normálne dobre rastu pri relatívne vysokej koncentrácii (100 mm) jednotlivých kyselín, okrem kyseliny propionovej. Kombinácia kyseliny mliečnej, produkovanej počas rastu BMK a octanu sodného z MRS média (štandardné rastové médium pre BMK) malo synergicky antifungálny efekt 11. Cieľ práce Využitie HPLC-UV/RID metódy pre stanovenie kyseliny fenylmliečnej, utilizácie sacharidov a produkciu organických kyselín kmeňmi baktérii (NSLAB) izolovaných z bryndze v mlieku a MRS bujóne pre posúdenie ich možností pri výrobe syrov. Stacionárna kultivácia mikroorganizmov bola realizovaná v aeróbnych a anaeróbnych podmienkach pri teplote 37 C. Materiál a metódy Chemikálie: kyselina DL-3-fenylmliečna, DL-mliečnan lítny, putrescín dihydrochlorid, kadaverín dihydrochlorid, histamín dihydrochlorid, tyramín hydrochlorid (Sigma-Oldrich, Nemecko), kyselina jantárová, ľadová kyselina octová (99,8%), D-glukóza monohydrát, metanol (Lichrosolv gradient grade LC), acetonitril (Lichrosolv gradient grade LC) (MERCK, Nemecko) Kultivačné médium: MRS bujón, mlieko Mikroorganizmy: Laktobacily: Lactobacillus paracasei (G1), Lactobacillus brevis (G3), Lactobacillus helveticus (G4), Lactobacillus brevis (G6), Lactobacillus fermentum (G8), Lactobacillus plantarum (G9), Lactobacillus buchneri (G10), Lactobacillus paracasei (G11), koky Pediococcus sp. (G5) izolované z bryndze Predanalytická úprava vzorky: MRS bujón s testovanými mikroorganizmami sa odstredil pri 9000 ot.min -1. Supernatant sa prefiltroval cez mikrofilter (0,2 μm) a následne aplikoval na kolónu. Analýza biogénnych amínov: Biogénne amíny (putrescín, kadaverín, histamín) sa stanovili vo forme Danzyl- derivátov metódou HPLC-UV (Greif, Greifová, Karovičová 2006) Podmienky analýzy pre organické kyseliny a sacharidy: Pumpa: DeltaChrom SDS 030, manuálny dávkovač Rheodyne 7725i, dávkovacia slučka 20 μl, kolóna: Polymer IEX H + (250 x 8 mm), vyhrievač kolóny DeltaChrom Temperature Control Unit (50±0,1 C), mobilná fáza: 1 mm H 2 SO 4, prietok mobilnej fázy: 1 cm 3.min -1, detekcia: UV detektor Applied Biosystems 759A (210 nm) a refraktometrický detektor RI K-2301, zberač dát a vyhodnotenie v programe Clarity PC. Podmienky analýzy pre biogénne amíny: Pumpa: DeltaChrom SDS 030, manuálny dávkovač Rheodyne 7725i, dávkovacia slučka 20 μl, kolóna NUCLEOSIL C18 (150 x 3,9 mm), 5 μm fy Macherey Nagel (Nemecko), vyhrievač kolóny DeltaChrom Temperature Control Unit (40±0,1 C), mobilná fáza metanol, acetonitril a voda v pomere (2 : 1 : 1), prietok mobilnej fázy 1 cm 3.min -1, detekcia: UV detektor Applied Biosystems 759A (254 nm), zberač dát a vyhodnotenie v programe Clarity PC. Výsledky a diskusia Hlavným kritériom pri výbere BMK ako štartovacích kultúr je schopnosť rastu v komplexnom médiu a rýchlosť prekvášania substrátu s čím je spojená produkcia kyselín (predovšetkým kyseliny mliečnej) a pokles ph (titračnej kyslosti). Antimikrobiálna aktivita laktobacilov je daná predovšetkým produkciou organických 100

101 kyselín (mliečnej, octovej, propiónovej, valérovej) a iných inhibičných látok H 2 O 2, CO 2, biacetylu, bakteriocínov nízkomolekulárnych látok na báze aminokyselín. V práci sme sa zamerali na využitie HPLC-UV/RID metódy pre simultánne stanovenie kyseliny fenylmliečnej, sacharidov a organických kyselín vybranými kmeňmi baktérií mliečneho kysnutia v MRS bujóne pri teplote 37 C. Kyselina fenylmliečna (KFM) bola produkovaná NSLAB izolovanými z bryndze len v anaeróbnych podmienkach kultivácie. Pri použití kolóny Polymer IEX H + bola eluovaná za použitých podmienok v 22,7 minúte a detekovaná UV-VIS detektorom pri 210 nm (obr. 1) štandard KFM L. plantarum G9 Napätie (mv) KFM Čas (min) Obr. 1. Chromatogramy štandardu kyseliny fenylmliečnej (1,2041mM) a L. plantarum. (G9) v MRS bujóne 72. h. Kyselina fenylmliečna sa zúčastňuje sa na chuti a vôni syrov. Tvorí sa pri degradácii fenylalanínu a tyrozínu. Aby bunka zabránila akumulácii fenylalanínu, hydroxyluje túto molekulu na tyrozín alebo ju transamináciou mení na fenylpyrohroznovú kyselinu, ktorá sa následne metabolizuje na fenylmliečnu alebo 4-hydroxy-fenylmliečnu kyselinu 12, 13. Za anaeróbnych podmienok bola sledovaná produkcia KFM NSLAB (obr. 2) c KFM [mg.dm -3 ] G1 G3 G4 G6 G8 G9 G10G11 Mikroorganizmus G5 Obr. 2. Obsah kyseliny fenylmliečnej produkovaný NSLAB izolovanými z bryndze (MRS bujón + 0,1% FA, teplota 37 C, 72 h, anaeróbna kultivácia). 101

102 Produkcia kyseliny mliečnej, octovej a etanolu NSLAB izolovanými z bryndze v MRS bujóne bola sledovaná v aeróbnych a anaeróbnych podmienkach kultivácie (obr. 3, 4). Najviac k. mliečnej v aeróbnych podmienkach kultivácie produkovali Lactobacillus paracasei (G1), Lactobacillus brevis (G3) a Pediococcus sp. (G5) aeróbna anaeróbna c KM [g.dm -3 ] G1 G3 G4 G6 G8 G9 G10 G11 G5 Mikroorganizmus Obr. 3. Vplyv podmienok kultivácie na obsah kyseliny mliečnej produkovaný NSLAB izolovanými z bryndze v MRS bujóne, teplota 37 C, 72 h. Koncentrácie kyseliny octovej produkovanej NSLAB izolovanými z bryndze v MRS bujóne za podmienok kultivácie nepravý hodnotu 2,5 g.dm -3 (obr. 4). 2,5 2,0 aeróbna anaeróbna aeróbne anaeróbne c KO [g.dm -3 ] 1,5 1,0 0,5 c EtOH [g.dm -3 ] ,0 G1 G3 G4 G6 G8 G9 G10 G11 G5 Mikroorganizmus 0 G1 G3 G4 G6 G8 G9 G10 G11 G5 Mikroorganizmus Obr. 4. Vplyv podmienok kultivácie na obsah kyseliny octovej a etanolu produkovaný NSLAB izolovanými z bryndze v MRS bujóne, teplota 37 C, 72 h. Je preto možné tieto mikroorganizmy považovať za homofermentatívne. Heterofermentatívne BMK produkujú kyselinu octovú v relatívne veľkom množstve v prítomnosti vonkajších elektrónových akceptórov. Kyselina octová má vyššiu hodnotu pk a než kyselina mliečna a preto má väčšiu časť nedisociovanej kyseliny pri určitom ph. Podobne ako kyselina mliečna aj octová kyselina interagujú s bunkovou membránou a neutralizujú elektrochemický protónový gradient, ale vplyv kyseliny octovej je často závislý na znížení ph vplyvom kyseliny mliečnej. NSLAB izolované z bryndze v MRS bujóne pri teplote 37 C produkovali len histamín. 102

103 c HIS [mg.dm -3 ] G1 G3 G4 G6 G8 G9 G10G11 Mikroorganizmus Obr. 5. Obsah histamínu produkovaný NSLAB izolovanými z bryndze (MRS bujón, 37 C, 72 h). Poďakovanie: Práca bola podporená grantom APVV Použitá literatura: 1. Hammes, W.P. Weiss, N. Holzapfel, W.: The genera Lactobacillus and Carnobacterium. In The Prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria volume II. Edited by A. Balowa, H.G. Trüper, M. Dworkin, W. Harder & K.-H. Schleifer. pp Springer Verlag, New York. 2. Carr, F.J. - Chill, D. - Maida, N.: The lactic acid bacteria: a literature survey. Critical Reviews in Microbiology, 28, 2002, s Kandler, O.: Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek, 49, 1983, s Axelsson, L.: Lactic acid bacteria: Classification and physiology. In Lactic Acid Bacteria: Microbiology and functional aspects, 2nd Edition, Revised and Expanded. Edited by S. Salminen & A. von Wright. pp Marcel Dekker, Inc. New York. 5. Kazatelová M.: Produkty metabolismu bakterií mléčného kvašení s antimikrobiální aktivitou. Bulletin of Food Research, 42(1-2), 2003, s Schnürer, J.- Magnusson, J.: Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends in Food Science & Technology, 16, 2005, s Piard, J.C. - Desmazeaud, M.: Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria. 1. Oxygen metabolites and catabolism end-products. Lait, 71, 1991, s Hunter, D.R. - Segel, I.H.: Effect of weak acids on amino acid transport by Penicillium chrysogenum: Evidence for a proton or charge gradient as the driving force. Journal of Bacteriology, 113, 1973, s Woolford, M.K.: The antimicrobial spectra of some salts of organic acids and glutaraldehyde in respect to their potential as silage additives. Grass and Forage Science, 39, 1984, s Moon, N.J.: Inhibition of the growth of acid tolerant yeasts by acetate, lactate and propionate, and their synergistic mixtures. Journal of Applied Bacteriology, 55, 1983, s Stiles, J. - Penkar, S. - Plocková, N. - Chumchalová, J. - Bullerman, L.B.: Antifungal activity of sodium acetate and Lactobacillus rhamnosus. Journal of Food Protection, 65, 2002, s Lavermicocca, P. - Valerio, F. - Evidente, A. - Lazzaroni, S. - Corsetti, A. - Gobetti, M.: Purification and characterization of Novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2000, s Ström K.: Fungal Inhibitory Lactic Acid Bacteria-Characterization and Application of Lactobacillus plantarum MiLAB 393. Doctor s dissertation. Faculty of Natural Resources and Agricultural Sciences, Department of Microbiology, Uppsala Kontaktní adresa: Ing. Gabriel Greif, PhD., FCHPT STU, Bratislava, SR. gabriel.greif@stuba.sk 103 G5

104 DISTRIBUCE BIOGENNÍCH AMINŮ BĚHEM ZRÁNÍ PŘÍRODNÍCH SÝRŮ EIDAMSKÉHO TYPU A IDENTIFIKACE JEJICH PŮVODCŮ Buňková Leona 1), Buňka František 2), Mantlová Gabriela 2), Čablová Andrea 2), Sedláček Ivo 3), Švec Pavel 3), Pachlová Vendula 4), Kráčmar Stanislav 4) 1) Ústav technologie tuků, tenzidů a kosmetiky, FT UTB ve Zlíně 2) Ústav technologie a mikrobiologie potravin, FT UTB ve Zlíně 3) Česká sbírka mikroorganizmů, PřF MU Brno 4) Ústav biochemie a analýzy potravin, FT UTB ve Zlíně Distribution of biogenic amines during the ripening of Edam-cheese and identification of their sources Summary: The aim of this study was to describe the development of selected biogenic amines (histamine, tyramine, putrescine and cadaverine) in 4 layers of Edam-cheese depending on two ripening/storage regimes during a 98-day period. A further goal was to identify microbial sources of biogenic amines in the material analysed. The higher content of tyramine, putrescine and cadaverine was determined in cheeses stored in a ripening cellar at a temperature of 10 C during the whole observation period. Lower biogenic amines content was determined in samples which were moved into a cold storage device (5 C) after 38 days of storage in a ripening cellar (10 C). During the 98-day period, histamine was not detected. Within the cheeses analysed, non-starter lactic acid bacteria Lactobacillus curvatus, Lactobacillus casei/paracasei and Lactobacillus plantarum were detected as the main producers of the biogenic amines tested. In starter bacteria Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris the decarboxylase activity tested was not detected. Úvod Biogenní aminy jsou nízkomolekulární dusíkaté látky, které v potravinách vznikají především mikrobiální dekarboxylací příslušných aminokyselin. Význam sledování obsahu biogenních aminů v potravinách spočívá především v jejich potenciální toxicitě pro člověka, zvláště je-li koncentrace >100 mg/kg (nebo >100 mg/l). Výskyt biogenních aminů tak podstatně ovlivňuje jakost potravin a jejich bezpečnost. 1,2 Fermentované mléčné potraviny a zejména přírodní sýry patří k nejčastějším zdrojům biogenních aminů, především histaminu a tyraminu. Původci enzymů dekarboxylujících příslušné aminokyseliny za vzniku biogenních aminů (dekarboxyláz) mohou být starterové bakterie mléčného kvašení, non-starterové bakterie mléčného kvašení a/nebo ostatní spontánní mikroflóra. 1,3,4 Mikroorganizmy se v jednotlivých vrstvách zrajícího sýra mohou z kvalitativního i kvantitativního hlediska lišit, což může způsobit různou koncentraci biogenních aminů v různých částech přírodního sýra. 5,6 Studium distribuce biogenních aminů v jednotlivých vrstvách přírodních sýrů a skríning jejich původců mohou přispět k prevenci obsahu biogenních aminů a ke zvýšení bezpečnosti potravin. Na trhu je možné zakoupit celou řadu přírodních sýrů vyrobených různou technologií. Podle Fox et al. 7 jsou jednou z nejrozšířenějších skupin přírodních sýrů eidamské sýry (sýry holandského typu). Optimální doba zrání těchto výrobků je 6 10 týdnů, obvykle při teplotách C. V poslední době však řada výrobců z ekonomických důvodů vyskladňuje do obchodní sítě přírodní sýry nevyzrálé (zrající pouze 2 4 týdny). Prodejci pak tyto přírodní sýry skladují a distribuují za chladírenských teplot (4 8 C). Tento proces může trvat i několik týdnů. Další chladírenské skladování lze předpokládat u spotřebitele, a to do okamžiku konzumace. 8 Otázkou však zůstává, zda a jak se obsah biogenních aminů v přírodních sýrech v průběhu distribuce za chladírenských teplot mění. Vývojem obsahu biogenních aminů ve dvou vrstvách sýrů holandského typu během jejich zrání se již zabývali i další autoři. 5,9,10 Jejich studie se však týkala přírodních sýrů vyráběných ve velkých kg blocích (zrajících za optimálních teplot ~ 10 C), které slouží především pro další průmyslové zpracování (strouhání, plátkování, bloky, výrobu tavených sýrů) a teprve následně 104

105 pro prodej. Na druhou stranu, v obchodní síti se skladují a prodávají také menší cihly o hmotnosti 1 3 kg, které se prodávají vcelku nebo se na místě porcují dle přání zákazníků. O obsahu a distribuci biogenních aminů v malých blocích při chladírenském skladování v obchodní síti však nebylo v dostupné literatuře nalezeno dostatek informací. Zároveň není k dispozici mnoho prací, které by se zabývaly současně stanovováním obsahu biogenních aminů v potravinách a zároveň izolací a identifikací jejich původců. Primárním cílem této práce bylo popsat vývoj obsahu biogenních aminů (histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu) během zrání a skladování ve 4 vrstvách malých bloků eidamských sýrů. Distribuce obsahu biogenních aminů byla sledována v závislosti na 2 různých režimech zrání a skladování za účelem simulace současných podmínek u výrobců a v obchodní síti. Dalším cílem této studie byla identifikace izolovaných bakterií mléčného kvašení (BMK) jako předpokládaných původců biogenních aminů a stanovení jejich dekarboxylázové aktivity. Materiál a metody Vzorky eidamských sýrů (50 % w/w sušiny a 30 % w/w tuku v sušině) byly získány ze 3 šarží jako část standardní výroby od producenta v oblasti České republiky vyrábějícího produkty z pasterovaného mléka. Všechny 3 šarže byly vyrobeny podle stejného technologického postupu ve stejný den a z každé bylo odebráno 54 cihel. Eidamské cihly (1,2 1,4 kg; cca cm) byly po uzavření do kryovakového obalu uloženy do zracího sklepa s teplotou 10 ± 2 C. Po 38 dnech (od počátku výroby) bylo 14 cihel z každé šarže přemístěno ze sklepa do lednice (5 ± 1 C), kde probíhalo další skladování (dále označeno jako 5W). Zbylá část cihel z každé šarže (označeno jako C) zůstala po celou dobu pokusu ve zracím sklepě (celkem 98 dnů). Odběry vzorků ze sklepa (a později i z lednice) byly realizovány v 1., 2., 3., 4., 7., 10., 13., 16., 20., 23., 27., 34., 38., 43., 49., 56., 63., 70., 84. a 98. dnu od počátku výroby (v den 1 byly sýry vyrobeny, vylisovány a uloženy do solné lázně, den 2 byly sýry vyjmuty ze solné lázně, zabaleny a uloženy do zracího sklepa). V každém dnu, kdy probíhaly analýzy, byly odebírány vždy 2 paralelní cihly z každé šarže a každého režimu zrání/skladování. Z každé odebrané cihly byl asepticky příčně vykrojen středový pás (cca cm). Tento středový pás byl asepticky rozdělen na 4 vrstvy: 7 mm od okraje (vrstva I), dalších 14 mm (vrstva II), dalších 14 mm (vrstva III) a zbylý střed (vrstva IV). Z konkrétní cihly byly nejprve odebrány vzorky pro mikrobiologickou analýzu (pokud byla dělána), teprve následně pro analýzu obsahu biogenních aminů. Vzorky sýrů byly podrobeny rutinní mikrobiologické analýze, kdy byly sledovány koliformní bakterie (půda s violetí, žlučovými solemi a laktózou, HiMedia, Bombai, Indie), bakterie mléčného kvašení (De Man-Rogosa-Sharpe médium MRS; Oxoid, Basingstoke, UK). Petriho misky byly v případě bakterií mléčného kvašení inkubovány 72 hodin při 30 ± 1 C, koliformní bakterie byly kultivovány při 37 ± 1 C po dobu 48 hodin. Kromě vzorků sýrů byl v den výroby sýrů analyzován rovněž starterová kultura v podobě provozního zákysu. Pro všechny 3 šarže byl použit stejný provozní zákys. Vyizolované a přečištěné bakterie byly podrobeny skríningové kultivační metodě detekující produkci biogenních aminů, ke které bylo využito dekarboxylační médium podle Bover- Cid & Holzapfel. 11 Bakterie byly kultivovány paralelně při 37 ± 1 C a 30 ± 1 C a výsledky byly odečteny po 24, 48 a 72 hodinách inkubace. Bakterie, které kultivační test označil jako pozitivní a dále bakterie izolované z provozního zákysu (bez ohledu na výsledek kultivačního testu), byly identifikovány pomocí biochemických testů (API 50 CH) a metodou PCR. 12 K identifikaci bakterií byla použita i metoda rep-pcr podle Švec et al. 13 s využitím (GTG) 5 primeru (5 -GTG GTG GTG GTG GTG-3 ). Získané PCR-fingerprinty byly vyhodnoceny pomocí BioNumerics v software (Applied-Maths) a srovnány s databází České sbírky mikroorganizmů. Dendrogramy byly sestrojeny shlukovou analýzou (metodou UPGMA). Pro detekci biogenních aminů v jednotlivých vrstvách sýrů byl navážen 1 g rozstrouhaného vzorku sýra a zalit 4 ml sodno citrátového pufru (ph 2,2). Směs byla homogenizována 15 minut, 105

106 míchána 1 hodinu při okolní teplotě a následně centrifugována (4 000 g po dobu 30 min). Supernatant byl zfiltrován a pevný podíl byl podruhé extrahován výše zmíněným způsobem. Kombinované extrakty byly doplněny do 10 ml odměrné baňky sodno citrátovým pufrem (ph 2,2). Směs byla dále zfiltrována přes 0,45 μm filtr a dávkována do analyzátoru aminokyselin. Každý vzorek byl analyzován nejméně dvakrát. Na produkci biogenních aminů byly testovány rovněž bakterie mléčného kvašení, které byly kultivační metodou označeny jako pozitivní. Obsah biogenních aminů byl analyzován v dekarboxylačním médiu (bujónu) obsahujícím prekurzory příslušných biogenních aminů (3,0 g/l) po inokulaci a inkubaci příslušnou bakterií. Bakterie byly kultivovány při 30 ± 1 C po dobu 72 hodin. Po inkubaci byly bakterie z dekarboxylačního média odstraněny centrifugací ( g po dobu 30 min) a následně byla směs filtrována (0,45 μm filtr). Biogenní aminy (histamin, tyramin, putrescin, kadaverin) byly detekovány pomocí iontově-výměnné chromatografie (analyzátor aminokyselin AAA400, Ingos, Praha) podle Buňková et al. 14 Každý vzorek byl analyzován 12. Výsledky IEC byly statisticky vyhodnoceny pomocí t- testu s použitím statistického software Unistat 5.5 (Unistat Ltd., Londýn, UK). Výsledky a diskuze Během 98-denního zrání/skladování testovaných přírodních sýrů Eidamského typu byla zjištěna přítomnost tyraminu, putrescinu a kadaverinu. Histamin nebyl detekován v průběhu celého experimentu u žádného vzorku z testovaných režimů zrání/skladování. Nejvyšší obsahy tyraminu, putrescinu a kadaverinu byly zjištěny v okrajové vrstvě (vrstva I) u obou testovaných režimů zrání/skladování. Naopak, nejmenší obsahy byly detekovány uvnitř sýrů (vrstva IV). Tento signifikantní rozdíl (P < 0,01) obsahů tyraminu, putrescinu a kadaverinu v okraji a středu je patrný zejména od 30. dne, a to bez ohledu na režim zrání/skladování. Ke stejnému závěru, tedy že v povrchové vrstvě jsou zjišťovány vyšší koncentrace biogenních aminů než ve středu, došli i Komprda et al. 5,10 Z komparace těchto prací a naší studie tak vyplývá, že distribuce biogenních aminů je u přírodních sýrů eidamského typu ekvivalentní jak u velkých bloků sýrů (> 10 kg) tak i u menších spotřebitelských balení (< 1,5 kg). Od počátku zrání/skladování byly obsahy tyraminu, putrescinu a kadaverinu ve II. a III. vrstvě velmi obdobné (P 0,05), a proto byly od 56. dne tyto vrstvy spojeny a analyzovány jako jedna vrstva. Hodnoty obsahu tyraminu, putrescinu a kadaverinu ve II. a III. vrstvě ležely vždy mezi hodnotami těchto biogenních aminů na okraji a ve středu. Ve většině případů byl rozdíl II. a III. vrstvou od okraje a středu signifikantní (P < 0,01). Z výsledků rovněž vyplývá závislost obsahu biogenních aminů v testovaných eidamských sýrech na režimu zrání/skladování. Sýry uchovávané po celou dobu zrání ve zracím sklepě při teplotě 10 C (C) měly u všech testovaných vrstev vyšší obsahy tyraminu, putrescinu i kadaverinu. Nižší hodnoty biogenních aminů byly zjišťovány ve všech vrstvách u produktů uchovávaných prvních 38 dnů ve zracím sklepě a následně skladovaných za chladírenských teplot (5W). Při obou režimech zrání/skladování však docházelo k postupnému nárůstu obsahu tyraminu, putrescinu i kadaverinu. Výše popsaná zjištění korespondují i s dalšími pracemi, podle kterých se nárůst koncentrace biogenních aminů zpomaluje při poklesu teploty kultivace modelových bakterií mléčného kvašení. 15,16 Zmíněné studie rovně uvádějí, že podstatný vliv na produkci biogenních aminů mají také hodnoty ph a koncentrace NaCl. Zdůvodnění různého obsahu biogenních aminů v jednotlivých vrstvách je tak nutné hledat zejména v rozdílných podmínkách prostředí ovlivňujících růst a metabolizmus mikroorganizmů. K těmto podmínkám patří zejména různá vodní aktivita, obsah O 2 a proteolytická aktivita. 6,10 Mikrobiologická analýza sestávala především ze zjišťování počtů BMK v jednotlivých vrstvách přírodních sýrů po 49 a 98 dnech zrání/skladování. Výsledky počtů BMK ve vrstvách I., II. a IV. jsou zobrazeny v Tabulce I. Po 49 dnech byly počty BMK u obou režimů zrání/skladování nejvyšší v I. vrstvě a nejnižší ve IV. vrstvě. Nicméně tyto rozdíly nebyly signifikantní (P 0,05). Po 98 dnech byly počty BMK v I. vrstvě signifikantně vyšší ve srovnání s IV. vrstvou (P < 0,05). 106

107 (bp) Tabulka I Počet bakterií mléčného kvašení (log CFU/g) v jednotlivých vrstvách eidamských sýrů během skladování (n = 12; medián ± SD). Den odběru vzorku Režim zrání/skladování Vrstva Bakterie mléčného kvašení (log CFU/g) 49 C I 7.93 ± 0.47 II 7.61 ± 0.38 IV 7.48 ± W I 7.65 ± 0.24 II 7.42 ± 0.36 IV 7.31 ± C I 6.91 ± 0.39 II 6.65 ± 0.27 IV 6.05 ± W I 6.22 ± 0.42 II 5.84 ± 0.33 IV 5.57 ± 0.31 Po 49 dnech byly počty BMK v jednotlivých vrstvách vzorků 5W nižší ve srovnání s odpovídajícími si vrstvami produktů uchovávaných po celou dobu experimentu ve zracím sklepě. Po 98 dnech byly počty BMK v odpovídajících si vrstvách opět vyšší u přírodních sýrů C. Tyto rozdíly byly na základě statistické analýzy u většiny vrstev klasifikovány jako signifikantní (P < 0,05). Počty BMK zjištěné po 49 dnech zrání/skladování byly signifikantně vyšší (P < 0,05) ve srovnání s počty stanovenými po 98 dnech zrání/skladování. Koliformní bakterie nebyly v průběhu celé mikrobiologické analýzy zjištěny v testovaných sýrech ani v provozním zákysu. Similarity (%) LIV-1 LI-5 LIV-3 LIV-11 LIV-18 CCM 1753 T CCM 7089 LIV-13 BS-3 BS-6 LIV-9 BS-2 CCM 1877 T CCM 7039 T LI-7 LI-3 LIV-15 LI-2 CCM 7558 T Molecular Size Marker Lb. casei / paracasei Lb. casei / paracasei Lb. casei / paracasei Lb. casei / paracasei Lb. casei / paracasei Lb. paracasei subsp. paracasei Lb. casei subsp. casei Lb. casei / paracasei Lc. lactis subsp. lactis Lc. lactis subsp. lactis Lc. lactis subsp. lactis Lc. lactis subsp. lactis Lc. lactis subsp. lactis Lb. plantarum Lb. plantarum Lb. curvatus Lb. curvatus Lb. curvatus Lb. curvatus 4000 Obrázek 1 Dendrogram BMK izolovaných z eidamských sýrů sestrojený na základě (GTG) 5 -PCR fingerprintů (Lactobacillus Lb., Lactococcus Lc.). 107

108 Izolace mikroorganizmů z přírodních sýrů za účelem zjištění produkce vybraných biogenních aminů byla prováděna pouze po 98 zrání/skladování. Celkem bylo pomocí De Man- Rogosa-Sharpe (MRS) média vyizolováno 58 fenotypově odlišných kolonií bakterií, jejichž dekarboxylační aktivita byla skríningově testována dle Bover-Cid & Holzapfel. 11 Kultivační metoda označila 11 izolátů potenciálně produkujících tyramin, putrescin anebo kadaverin, přičemž z I. vrstvy pocházely 4 izoláty a ze IV. vrstvy 7 izolátů. Fenotypová identifikace a rep-pcr analýza určily testované izoláty jako Lactobacillus curvatus subsp. curvatus (3 kmeny), Lactobacillus plantarum (1 kmen), Lactobacillus casei/paracasei (6 kmenů) a Lactococcus lactis subsp. lactis (1 kmen) (Tabulka II). Analýza rep-pcr fingerprintů separovala testované kmeny do několika skupin odpovídajících Lb. curvatus (LI-2, LI-3, LIV-15), Lb. plantarum (LI-7), a Lb. casei/paracasei (LI- 5, LIV-1, LIV-3, LIV-11, LIV-13, LIV-18) (Obr. 1). Podle Wouters et al. 17 patří všechny výše jmenované druhy k pravidelným, které bývají izolovány z přírodních sýrů, kam pravděpodobně přecházejí z mléka anebo z prostředí. Kromě vyšetření přírodních sýrů byl stejné analýze podroben i provozní zákys, který byl použit k inokulaci mléka při výrobě testovaných přírodních sýrů. Ze zákysu bylo celkem vyizolováno 15 mikroorganizmů, z nichž kultivační metoda dle Bover-Cid & Holzapfel 11 označila 3 kmeny jako potenciálně produkující biogenní aminy. Všechny tři izoláty (BS-2, BS-3, BS-6) byly identifikovány jako Lactococcus lactis subsp. lactis (Tabulka II a obr. 1), přičemž kmen BS-2 izolovaný z provozního zákysu byl fenotypově identický s kmenem LIV-9 izolovaným ze sýra. Tvorba biogenních aminů vyizolovanými a identifikovanými bakteriemi, které skríningová metoda označila jako potenciálně produkující některý z testovaných biogenních aminů, byla kvantifikována pomocí chromatografického stanovení obsahu biogenních aminů v dekarboxylačním médiu. Obsah biogenních aminů byl zhodnocen a rozdělen do 4 skupin: (i) produkce biogenního aminu nebyla zjištěna; (ii) slabá produkce (< 10 mg/l); (iii) střední produkce ( mg/l); a (iv) silná produkce (> 100 mg/l). Výsledky jsou uvedeny v tabulce II. Tabulka II Produkce biogenních aminů identifikovanými mikroorganizmy. Zdroj izolace Kmen Druh a Produkce biogenních aminů b Tyramin Putrescin Kadaverin Provozní BS-2 Lc. lactis subsp. lactis ND ND ND zákys BS-3 Lc. lactis subsp. lactis ND ND ND BS-6 Lc. lactis subsp. lactis ND ND ND Povrchová LI-2 Lb. curvatus vrstva LI-3 Lb. curvatus ND (vrstva I) LI-5 Lb. casei/paracasei ND ND ND Střední vrstva (vrstva IV) LI-7 Lb. plantarum ++ ND ND LIV-1 Lb. casei/paracasei ND ND ND LIV-3 Lb. casei/paracasei ND ND ND LIV-9 Lc. lactis subsp. lactis ND ND ND LIV-11 Lb. casei/paracasei ++ ND + LIV-13 Lb. casei/paracasei ++ ND + LIV-15 Lb. curvatus ND LIV-18 Lb. casei/paracasei ND ND ND a Lactobacillus Lb., Lactococcus Lc. b Produkce biogenních aminů v rozmezí: biogenní aminy nedetekovány (ND); < 10 mg/l (+); mg/l (++); > 100 mg/l (+++); n = 12; všechny kmeny negativní na produkci histaminu. U žádného ze tří kmenů L. lactis (BS-2, BS-3, BS-6) vyizolovaných z provozního zákysu nebyla chromatografickou metodou zjištěna produkce biogenních aminů. U jednoho izolátu z I. vrstvy identifikovaného jako Lb. casei/paracasei (LI-5) nebyla chromatografickou metodou zjištěna produkce žádného z testovaných biogenních aminů. Dva kmeny Lb. curvatus (LI-2, LI-3) získané 108

109 z I. vrstvy testovaných přírodních sýrů vykazovaly silnou až velmi silnou produkci tyraminu a putrescinu, přičemž jeden z těchto kmenů (LI-3) slabě produkoval i kadaverin. K produkci tyraminu v I. vrstvě pravděpodobně přispíval i Lb. plantarum (LI-7) středně silnou produkcí. Ve IV. vrstvě bylo 5 izolátů (LIV-1, LIV-3, LIV-11, LIV-13, LIV-18) identifikováno jako Lb. casei/paracasei, přičemž u tří z nich (LIV-1, LIV-3, LIV-18) nebyla chromatografickou metodou zjištěna produkce testovaných biogenních aminů. Zbývající 2 izoláty (LIV-11, LIV-13) produkovaly středně silně tyramin a slabě i kadaverin. Ve výše zmíněné vrstvě byl identifikován i jeden kmen Lb. curvatus (LIV-15) s velmi silnou proudukcí tyraminu a putrescinu. Poslední kmen (LIV-9) izolovaný ze IV. vrstvy, označený kultivační metodou jako potenciálně pozitivní na produkci biogenních aminů, byl identifikován jako L. lactis subsp. lactis, který pravděpodobně pocházel z provozního zákysu. U tohoto izolátu (LIV-9) však produkce biogenních aminů nebyla detekována. Burdychová & Komprda 9 v souladu s naší prací rovněž vyizolovali kmen Lb. curvatus z přírodních sýrů holandského typu a označili jej za jednoho z původců biogenních aminů. Kromě laktobacilů bývají jako producenti biogenních aminů v přírodních sýrech rovněž identifikováni zástupci rodů Lactococcus a Enterococcus. 9,18 Podle Arena et al. 19,20 patří některé kmeny Lb. plantarum k producentům tyraminu, což je v souladu s našimi výsledky, a zároveň dodávají, že určité kmeny Lb. plantarum jsou schopny produkovat i putrescin. V naší studii však produkce putrescinu u výše jmenovaného izolátu detekována nebyla. Kmeny Lb. curvatus jsou v literatuře 21,22 rovněž popisovány jako producenti tyraminu a putrescinu, což koresponduje s výsledky naší studie. Kmeny Lb. curvatus (izolované a identifikované v této studii) byly detekovány jako výhradní producenti putrescinu u sledovaných přírodních sýrů. Jeden kmen Lb. curvatus (LI-2) izolovaný v naší práci produkoval také kadaverin, což podle dostupné literatury není obvykle popisováno. U dvou z šesti vyizolovaných a identifikovaných kmenů Lb. casei/paracasei (LIV-11, LIV-13) byla detekována dekarboxylační aktivita vedoucí k produkci tyraminu a kadaverinu. Kmeny Lb. casei a Lb. paracasei jsou sice dle mnohých autorů 17,23 častými zástupci non-starterových BMK v přírodních sýrech, na druhou stranu podle Landete et al. 24 nepatří k obvyklým producentům biogenních aminů. Řada publikací 5,9,10 popisuje histamin, jako biogenní amin jehož incidence v přírodních sýrech je vysoká. Během naší studie však histamin detekován nebyl v přírodních sýrech ani u vyizolovaných bakterií. Závěr Všichni zjištění původci tyraminu, putrescinu a kadaverinu byli označeni jako nonstarterové bakterie mléčného kvašení pocházející z rodu Lactobacillus. Z provozního zákysu nebyla vyizolována jediná bakterie, která by vykazovala produkci biogenních aminů. Distribuce biogenních aminů v přírodních sýrech eidamského typu není rovnoměrná, přičemž v povrchové vrstvě se nacházejí signifikantně vyšší koncentrace než ve středu. Tato distribuce je pravděpodobně nezávislá na velikosti bloku sýra. Ani chladírenské skladování přírodních sýrů nezastaví nárůst obsahu tyraminu, putrescinu a kadaverinu. Poděkování: Práce vznikla za podpory projektů MŠMT: MSM a MSM Použitá literatura: 1. Halász, A., Baráth, Á., Simon-Sarkadi, L., Holzapfel, W., Biogenic amines and their production by microorganisms in food. Trends Food Sci. Technol. 51, Smit, G., Smit, B. A., Engels, W. J. M., Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiol. Rev. 29, Bernardeau, M., Vernoux, J. P., Henri-Dubernet, S., Guéguen, M., Safety assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. Int. J. Food Microbiol. 126, de las Rivas, B., Marcobal Á., Carrascosa A. V., Muñoz R., PCR detection of foodborne bacteria producing the biogenic amines histamine, tyramine, putrescine and cadaverine. J. Food Prot. 69,

110 5. Komprda, T., Smělá, D., Novická, K., Kalhotka, L., Šustová, K., Pechová, P., Content and distribution of biogenic amines in Dutch-type hard cheese. Food Chem. 102, Novella-Rodrígues, S., Veciana-Nogués, M. T., Izquerdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M. C., Distribution of biogenic amines and polyamines in cheese. J. Food Sci. 68, Fox, P. F., Guinee, T. P., Cogan, T. M., McSweeney, P. L. H., Fundamentals of Cheese Science. Aspen Publication. 8. McSweeney, P. L. H., Hayaloglu, A. A., O Mahony, J. A., Bansal, N., Perspectives on cheese ripening. Aust. J. Dairy Technol. 61, Burdychová, R., Komprda, T., Biogenic amine-forming microbial communities in cheese. FEMS Microbiol. Lett., 276, Komprda, T., Burdychová, R., Dohnal, V., Cwiková, O., Sládková, P., Dvořáčková, H., Tyramine production in Dutch-type semi-hard cheese from different producers. Food Microbiol. 25, Bover-Cid, S., Holzapfel, W. H., Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 53, Švec, P., Sedláček, I., Žáčková, L., Nováková, D., Kukletová, M., Lactobacillus spp. associated with early childhood caries. Folia Microbiol. 54, Švec, P., Vancanneyt, M., Seman, M., Snauwaert, C., Lefebvre, K., Sedláček, I., Swings, J., Evaluation of (GTG)5-PCR for identification of Enterococcus spp. FEMS Microbiol. Lett. 247, Buňková, L., Buňka, F., Hlobilová, M., Vaňátková, Z., Nováková, D., Dráb, V., Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus. Eur. Food Res. Technol. 229, Gardini, F., Martuscelli, M., Caruso, M. C., Galgano, F., Crudele, M. A., Favati, F., Guerzoni, M. E., Suzzi, G., Effects of ph, temperature and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of Enterococcus faecalis. Int. J. Food Microbiol. 64, Santos, W. C., Souza, M. R., Cerqueira, M. M. O. P., Glória, M. B. A., Bioactive amines formation in milk by Lactococcus in the presence of not of rennet and NaCl at 20 and 32 C. Food Chem. 81, Wouters, J. T. M., Ayad, E. H. E., Hugenholtz, J., Smit, G., Microbes from raw milk for fermented dairy products. Int. Dairy J. 12, Delgado, S., Delgado, T., Mayo, B., Technological performance of several Lactococcus and Enterococcus strains of dairy origin in milk. J. Food Prot. 65, Arena, M. E., Manca de Nadra, M. C., Biogenic amine production by Lactobacillus. J. Appl. Microbiol. 90, Arena, M. E., Fiocco, D., Manca de Nadra, M. C., Pardo, I., Spano, G., Characterization of a Lactobacillus plantarum strain able to produce tyramine and partial cloning of a putative tyrosine decarboxylase gene. Curr. Microbiol. 55, Bover-Cid, S., Miguélez-Arrizado, M. J., Becker, B., Holzapfel, W. H., Vidal-Carou, M. C., Amino acid decarboxylation by Lactobacillus curvatus CTC273 affected by the ph and glucose availability. Food Microbiol. 25, Pereira, C. I., Barreto Crespo, M. T., San Romao, M. V., Evidence for proteolytic activity and biogenic amines production in Lactobacillus curvatus and L. homohiochii. Int. J. Food Microbiol. 68, Öner, Z., Sagdic, O., Simsek, B., Lactic acid bacteria profiles and tyramine and tryptamine contents of Turkish tulum cheese. Eur. Food Res. Technol. 219, Landete, J. M., Ferrer, S., Pardo, I., Biogenic amine production by lactic acid bacteria, acetic bacteria and yeast isolated from wine. Food Control. 18, Kontaktní adresa: RNDr. Leona Buňková, Ph.D., Ústav technologie tuků, tenzidů a kosmetiky, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T. G. Masaryka 275, Zlín, tel , bunkova@ft.utb.cz 110

111 ANALÝZA MNOŽSTVA PROBIOTICKÝCH MIKROORGANIZMOV V MLIEČNYCH NÁPOJOCH. Koreňová Janka Výskumný ústav potravinársky, Bratislava, SR Enumeration of probiotics bacteria in fermented dairy drinks. Summary: A number of health benefits have been claimed for probiotic bacteria such as Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium sp.. Because of the potential health benefits, these organisms are increasingly incorporated into dairy foods. To obtain the desired therapeutic effets, the probiotics bacteria must be available in sufficient numbers. However, many studies have shown low viability of probiotics in market preparations. This study focused viability of probiotic bacteria L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus a Bifidobacterium sp. in some dairy drinks. Counts of these bacteria in fifteen dairy probiotics products were found in range 6,0 8,5 log 10 CFU.g -1. The products that are claimed to some health benefits contained probiotics organisms in range 9,7 10,6 log 10 CFU/daily intake and carried out requirements to provide health benefits. Úvod V súčasnej dobe sa v priestore slovenského aj európskeho trhu pozoruje rozšírenie a tiež obľúbenosť kyslomliečnych probiotických výrobkov pre ich potenciálny priaznivý vplyv na ľudské zdravie. Ide hlavne o pozitívne ovplyvňovanie imunitného systému, trávenia a metabolických procesov, prevencie nádorových ochorení [1, 2, 3]. Probiotiká (mikroorganizmy) môžu mať tento priaznivý účinok na zdravie konzumenta len pri príjme v živom stave a v dostatočnom množstve. Okrem prísnych zdravotných a iných kritérií musia preto spĺňať aj podmienku prežívania počas technologického spracovania a skladovania výrobku, v ktorom sú zakomponované. Slovenská legislatíva vymedzuje definície, názvy a označovanie kyslomliečnych výrobkov a ustanovuje množstvo živých mikroorganizmov špecifických pre konkrétny druh výrobku na 10 7 KTJ.g -1, a pridaných mikroorganizmov uvedených v názve či v zložení výrobku na 10 6 KTJ.g -1 [4]. Osobitnou skupinou sú výrobky, ktoré majú na obaloch tzv. zdravotné tvrdenia. Zdravotné tvrdenie je každé tvrdenie, ktoré uvádza, naznačuje, alebo z ktorého vyplýva, že spotreba určitej kategórie potraviny, alebo niektorej z jej zložiek významne znižuje riziko vzniku určitého ľudského ochorenia. Ich uvádzanie nie je povinné, ale ak ich výrobca uvedie, musí dodržať ďalšie podmienky, ktoré sú definované v Nariadení Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1924/2006 z decembra 2006 [5] a v príslušných novelizáciách. Spolu so zdravotným tvrdením musí byť na obale uvedená aj stanovená denná dávka potraviny a spôsob jej konzumácie potrebnej na dosiahnutie uvedeného priaznivého zdravotného účinku. Aby sa u človeka dosiahlo akýchkoľvek kladných zdravotných účinkov, je nevyhnutná denná konzumácia výrobkov s obsahom živých buniek v množstve KTJ.g -1 [6, 7]. Zdravotné účinky konkrétnych probiotických kmeňov a súčasne deklarácia zdravotných tvrdení pri označovaní výrobkov na obaloch a v reklame môžu byť uznané len na podklade spracovania výsledkov in vitro a in vivo testovania kmeňov v nezávislých vedeckých štúdiách [3, 8, 9, 10, 11]. Žiadosti o schválenie zdravotných tvrdení sa podávajú cez vnútroštátny úrad na Európsky úrad pre bezpečnosť potravín (EFSA) až po Komisiu zriadenú EFSA, ktorá spravuje register podaných žiadostí prístupný verejnosti, s prehľadom v akom štádiu je schvaľovanie konkrétnej podanej žiadosti [12]. Na schválenie bol podaný aj zoznam oprávnených zdravotných tvrdení pre konkrétne probiotické mikroorganizmy vypracovaný Európskou konfederáciou potravinárskeho a nápojového priemyslu (CIAA) [13]. V tomto zozname je určená denná dávka pre dosiahnutie deklarovaných zdravotných účinkov mikroorganizmov Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei a Bifidobacterium sp KTJ / deň, podľa konkrétneho kmeňa[14]. Z pohľadu spotrebiteľa má tento údaj praktické využitie, pretože u výrobkov s dostatočnou koncentráciou probiotickej kultúry postačuje konzumácia jedného balenia (porcie) výrobku denne na dosiahnutie kladného zdravotného účinku. Prvým krokom k splneniu významného kritéria, ktorým je schopnosť mikroorganizmov prežiť počas technologických procesov a skladovania výrobku, do ktorého boli pridané, je používanie 111

112 štartovacích a probiotických kultúr od renomovaných výrobcov, ktorí zaručujú prežívanie kultúr v dostatočnom množstve pri dodržaní podmienok inokulácie, a ostatných daných technologických parametrov. Potom je už viabilita kultúr počas výrobného procesu a skladovania výhradne na zodpovednosti výrobcu kyslomliečneho výrobku [22]. Štúdie výsledkov mikrobiologických analýz probiotických výrobkov z obchodných sietí však poukazujú na nízku viabilitu probiotík v týchto výrobkoch a poukazujú na potrebu zavedenia normovaných pracovných metód selektívneho merania počtu probiotických mikroorganizmov [7, 15, 16, 17, 18, 19, 20]. Medzi najbežnejšie probiotiká patria Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium sp. [15, 21, 22]. V predkladanom príspevku uvádzame výsledky stanovenia koncentrácie živých probiotických kultúr Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus a Bifidobacterium sp. vo vybraných kyslomliečnych nápojoch zo slovenskej obchodnej siete. Materiál a metódy Predmetom analýzy bolo 15 kyslomliečnych nápojov od 9 výrobcov, ktoré boli vybrané na základe obsahu pridaných probiotických kultúr Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus a Bifidobacterium sp. Každý výrobok bol analyzovaný z troch balení, bezprostredne pred uvedeným dátumom spotreby (3 0 dní).opis zloženia výrobkov je v Tab. I. Tab. I: Prehľad zloženia analyzovaných vzoriek výrobkov Vyšetrovaný č. Opis výrobku druh / rod vzorky L.casei 1 ochutený jogurtový nápoj s probiotickou kultúrou zloženie: jogurtová kultúra, probiotická kultúra L. casei, 100g 2 ochutené jogurtové mlieko s L. casei zloženie: jogurtová kultúra, L.casei,100g 3 ochutený fermentovaný mliečny nápoj s probiotickou kultúrou zloženie: jogurtová kultúra, probiotická kultúra L. casei, 100g L.acidophilus 4 plnotučné biele zakysané mlieko s probiotickou kultúrou zloženie: smotanová kultúra, probiotická kultúra L. acidophilus, 250g 5 plnotučné ochutené zakysané mlieko s probiotickou kultúrou zloženie: smotanová kultúra, probiotická kultúra L. acidophilus, 250g 6 plnotučné ochutené zakysané mlieko s probiotickou kultúrou zloženie: smotanová kultúra, probiotická kultúra L. acidophilus, 250g 7 1% tuku, biele zakysané mlieko s probiotickou kultúrou zloženie: smotanová kultúra, probiotická kultúra L. acidophilus, 250g 8 acidofilné mlieko s probiotickou kultúrou L. acidophilus zloženie: mlieko, acidofilná kultúra L. acidophilus,200g 9 acidofilné mlieko plnotučné s probiotickou kultúrou L. acidophilus zloženie: smotanová kultúra, probiotická kultúra L.acidophilus,230 ml 10 acidofilné mlieko s probiotickou kultúrou L. acidophilus zloženie: smotanová kultúra, probiotická kultúra L. acidophilus, 950g 11 acidofilné mlieko zloženie: smotanová kultúra, probiotická kultúra L. acidophilus, 250 g Bifidobacterium sp. 12 ochutený jogurtový nápoj s probiotickou kultúrou zloženie: jogurtová kultúra, probiotická kultúra B.longum, 330 g 13 ochutený jogurtový nápoj s probiotickou kultúrou zloženie: jogurtová kultúra, probiotická kultúra B.longum, 330 g 14 ochutený zakysaný mliečny výrobok s bifidogénnou kultúrou zloženie: jogurtová kultúra, bifidogénna kultúra Bifidobacterium sp., L. acidophilus, L. rhamnosus 15 ochutený probiotický zakysaný nápoj zloženie: probiotická kultúra Bifidobacterium sp., L. acidophilus, L. rhamnosus, 500g 112

113 Ako štandardné kmene selektívne stanovovaných mikroorganizmov boli použité zbierkové kultúry (CCM Brno, ÚTMT VŠCHT Praha, ČR) a originály probiotických kultúr poskytnutých dodávateľmi priamo od výrobcu kultúr (Chr. Hansen, DK; Danisco, DK). Vyšetrovanie výrobkov na obsah deklarovaných probiotických kultúr sa vykonalo metódami podľa ISO a vedeckých publikácií, ktoré boli vybrané na základe predošlého skúšania (výsledky nie sú uvedené). Stanovenie počtu L. casei vo výrobku metódou anaeróbnej kultivácie na MRS-vancomycin agare pri 37 C [23]. Stanovenie počtu L. rhamnosus vo výrobku metódou anaeróbnej kultivácie na MRS-vancomycin agare pri 43 C [23]. Stanovenie počtu L.acidophilus vo výrobku metódou anaeróbnej kultivácie na MRS-climdamycinciprofloxacin agare pri 37 C [24]. Stanovenie počtu Bifidobacterium sp. vo výrobku metódou anaeróbnej kultivácie na MRSmupirocin agare pri 37 C [25]. Po kultivácii bola overená morfológia buniek baktérií farbením podľa Gramma a mikroskopickým pozorovaním [26]. Druhová príslušnosť Lactobacillus sp.bola overená biochemickým štandardným systémom API 50CH (BioMérieux, France). Výsledky a diskusia 15 kyslomliečnych nápojov od 9 slovenských a českých výrobcov bolo analyzovaných na obsah pridaných probiotických kultúr Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus a Bifidobacterium sp. Každý výrobok bol analyzovaný z troch balení, bezprostredne pred uvedeným dátumom spotreby (3 0 dní). Vyšetrované výrobky vykazovali počty sledovaných baktérií v priemerných hodnotách 6,02 7,94 log KTJ.g -1, v jednom prípade (výrobok č. 2) 8,55 log KTJ.g -1 (Tab. II). Výsledky zahraničných štúdií uvádzajú obsah L. acidophilus v dvoch jogurtových výrobkoch od 7,33 7,21 log KTJ.g -1 a obsah bifidobaktérií 6,23 7,21 log KTJ.g -1 [15], v troch probiotických tyčinkách ten istý autor zistil L. acidophilus len v množstve 4,72 5,20 log KTJ.g -1 a Bifidobacterium sp. v množstve 2,08 3,04 log KTJ.g -1. Podobne v českých a slovenských kyslomliečnych výrobkoch stanovil autor počty bifidobaktérií priemerne v hodnotách 2,37; 5,44; 6,03; 6,22; 6,31; a 7,17 log KTJ.g -1 [20]. L. casei vo fermentovaných mliečnych nápojoch bol stanovený v hodnotách 6,98 8,22 log KTJ.g -1 a zo 6 analyzovaných jogurtov v troch bol stanovený obsah L. casei < 3,0 log KTJ.g -1, v dvoch 3,41 3,72 log KTJ.g -1 a len v jednom výrobku 7,49 log KTJ.g -1 [17]. Podľa našich meraní požiadavkám Výnosu [4] vyhovelo 12 z 15 skúšaných výrobkov, pričom vyšší počet sledovaných mikroorganizmov o 1-2 desiatkové poriadky sa stanovil u výrobkov č. 1, 2, 6, 12 a 13, o 1 desiatkový poriadok u výrobkov č. 4, 5, 7, 12 a 14. V acidofilnom mlieku č. 10 bol stanovený počet zárodkov L. acidophilus tesne pod hranicou 10 7 KTJ.g -1 a v acidofilnom mlieku č. 8, 9 bol počet o 1 desiatkový poriadok nižší, ako predpisuje Výnos [4]. Vo vzorkách výrobku č. 15 neboli baktérie Bifidobacterium sp. identifikované v množstve >1, KTJ.g -1. Čistá kultúra od výrobcu nebola k dispozícii, ostatné dva použité štandardy (B. lactis a B. longum) preukazovali dobrý rast na selektívnom substráte. Zdravotné tvrdenia mali na obaloch uvedené výrobky č. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 15. Okrem výrobku 15, kde sa nepodarilo vykultivovať bifidobaktérie, ostatné výrobky obsahovali po prepočte na jedno balenie priemerne 5, , KTJ, čím tieto výrobky v 1 balení plne pokrývajú potrebnú dennú dávku probiotického mikroorganizmu pre prejavenie sa zdravotných tvrdení. 113

114 Tabuľka II: Prehľad výsledkov mikrobiologickej analýzy - počtu živých probiotických baktérií v jednotlivých vyšetrovaných výrobkoch. č. výrobku Sledovaný mikroorganizmus Priemer ± SD* log KTJ.g -1 Limit ** KTJ.g -1 Výsledok*** KTJ/ 1 balenie 1. Lactobacillus casei 7,94 ± 0, , L. casei 8,55 ± 0, , L. casei 6,13 ± 0, , L. acidophilus 7,27 ± 0, , L. acidophilus 7,41 ± 0, , L. acidophilus 7,89 ± 0, , L. acidophilus 7,47 ± 0, , L. acidophilus 6,02 ± 0, , L. acidophilus 6,24 ± 0, , L. acidophilus 6,85 ± 0, , L. acidophilus 7,69 ± 0, , Bifidobacterium longum 7,86 ± 0, , Bifidobacterium longum 7,99 ± 0, , Bifidobacterium sp. 7,04 ± 0, , L. acidophilus 7,07 ± 0, , L. rhamnosus 7,15 ± 0, , Bifidobacterium sp. x * priemer z výsledkov analýzy 3 balení z každého výrobku v 3 riedeniach po 2 paralelkách ± smerodajná odchýlka. ** minimálny obsah živých probiotických mikroorganizmov podľa Výnosu [5] *** výpočet obsahu KTJ v 1 balení výrobku x hodnota nebola merateľná použitou metódou KTJ kolóniu tvoriaca jednotka Záver Metódami selektívnej mikrobiologickej analýzy boli v 15 výrobkoch stanovené počty mikroorganizmov L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus a Bifidobacterium sp. Každý výrobok sa analyzoval z troch balení v čase bezprostredne pred uvedeným dátumom spotreby. Výrobky vykazovali počty sledovaných baktérií v hodnotách KTJ.g -1, pričom 3 výrobky nesplnili legislatívou stanovené požiadavky na minimálny obsah živých charakteristických mikroorganizmov. Výrobky so zdravotnými tvrdeniami (8 ks) obsahovali KTJ probiotickej kultúry v objeme odporúčanej dennej dávky, čím splnili kritérium pre potenciálne prejavenie sa zdravotných tvrdení na výrobku. Probiotická kultúra jedného analyzovaného výrobku nebola vykultivovaná na selektívnom substráte. 114

115 Použitá literatúra 1. Kuchta, M., Pružinec, P. a kol.: Probiotiká, ich miesto a využitie v medicíne. Bonus CCS, Bratislava, 2006, 162 s. 2. Leahy, S.C., Higgins, D.G., Fitzgerald, G.F., Van Sinderen, D.: Getting better with bifidobacteria, Journal of Applied Microbiology, 98, 2005, s Sanders, M. E., Klaenhammer, T. R.: Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic. Journal of Dairy Science 84(2), 2001, s Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky zo 14. augusta / , ktorým sa vydáva hlava Potravinového kódexu Slovenskej republiky upravujúca mlieko a výrobky z mlieka. Vestník MP SR, 38 (18), Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1924/2006 z 20. decembra 2006 o výživových a zdravotných tvrdeniach o potravinách. Official Journal of the European Union OJ L12. : Lee, Y. K., Salminen, S.: The coming of age probiotics. Trends in Food Science &Technology, 6-7, 1995, s Robinson, R. K.: Survival of Lactobacillus acidophilus in fermented products. Suid Afrikaanse Tydskrif Vir Suiwelkunde 19, 1987, s Reid, G.: Minireview. The scientific basis for probiotics strains of Lactobacillus, Applied and Enviromental Microbiology, 65, 9, 1999, s Anonym: Physiological effects of Bifidobacterium longum BB in vitro tests and administration to humans and animals. Morinaga milk Industry,, 1999, Tokyo. 10. Anonym: Effect of Bifidobacterium longum BB 536 on prevention of influenza virus infection of elderly. Morinaga probiotics news release. Annual meeting of japan Society for bioscience, biotechnology, and agrochemistry, Anonym: Lactobacillus acidophillus NCFM - a probiotic with provwn efficacy. Technical memorandum TM 54-I e, Danisco, Register EFSA: Industry contribution to Article 13 under Health and Nutrition Claims Regulation 1924/2006/EC List of health and nutritional claims covered by Article 13 (3) of EU regulation 1924/2006/EC Dave, R. I., Shah, N. P.: Evaluation of Media for Selective Enumeration of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, and Bifidobacteria. Journal of Dairy Science 79 (9), 1996, s Dave, R. I., Shah, N. P: Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from commercial starter culture. International of Dairy Journal 7, 1997, s Ravula, R. R., Shah, N. P.: Selective enumeration of Lactobacillus casei from yogurt and fermented milk drinks. Biotechnol. Tech. 12, 1998, s Shah, N.P.: Probiotic Bacteria: Selective Enumeration and Survival in Dairy Foods. Journal of Dairy Science 83 (4), 2000, s Shah, N.P., Lankaputhra, W.E.V., Britz, M., Kyle, W.S.A.: Survival of L. acidophilus and Bifidobacterium bifidum in commercial yoghurt during refrigerated storage. International of Dairy Journal 5, 1995, s Rada, V.: Bifidobakterie v mléčných kysaných výrobcích a funkčních potravinách. Potravinářská revue 2, 2006, s Michalík, I., Urminská, D., Bauerová, M., Šilhár, S., Sokol, J., Ouwehand, A., Kirjavainen, P., Shortt, C., Salminen, S.: Probiotics: mechanism and established effects. International of Dairy Journal, 9, 1999, s Hughes, D. B., Hoover, D. G.: Bifidobacteria - Their Potential for Use in American Dairy Products. Food Technology, 45 (4), 1991, s

116 23. Tharmaraj, N.- Shah, N.P.:Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria. Journal of Dairy Science 86, 2003, International standard ISO 20128:2006, IDF 192: Milk products Enumeration of presumptive Lactobacillus acidophilus on selective medium Colony count technique at 37 C. 25. Draft ISO/WD... I IDF : Milk products Enumeration of presumptive bifidobacteria Colony count technique at 37 C. 26. Horáková, K., Baráthová, H., Vollek, W.: Mikrobiológia. Návody na cvičenia. STU Bratislava,1993 Kontaktná adresa: Ing. Janka Koreňová, Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, Bratislava, 02/ , korenova@vup.sk 116

117 SLEDOVANIE POČTOV VYBRANÝCH PROBIOTICKÝCH KULTÚR V SYROCH HOLANDSKÉHO TYPU POČAS ZRENIA Lovayová Viera 1, Burdová Oľga 1, Dudriková Eva 1, Guba Peter 2, Nemcová Radomíra 3, Rimárová Kvetoslava 4 1 Ústav hygieny a technológie mlieka, Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach 2 Klinika koní, veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach 3 Ústav mikrobiológie a gnotobiológie, veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach 4 Ústav verejného zdravotníctva, Lekárskej fakulty, UPJŠ v Košiciach Monitoring selected of probiotic cultures in the Dutch-type cheeses during ripening Summary The work monitor changes in numbers of selected probiotic cultures in the cheese during its ripening. The technology to manufacture semi-hard low-scaled Dutch - type cheeses used probiotic cultures Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Lactobacillus plantarum96. Sampling took place each month from January 2009 to June Samples of cheese were microbiologically analyzed by standard microbiological methods for the numbers ingested probiotic cultures throughout the period. Physico-chemical parameters (fat content, dry matter content of sodium chloride, titratable acidity, ph and in the last month and lactic acid and protein content) were followed selected during four months of ripening. For each sample analyzed, and the center region of the cheeses. Achieved values observed physico-chemical parameters were significantly changed during the reporting period and amounted to the value required by the applicable legislation for the cheese. The results of microbiological analysis showed that in all evaluated selected probiotic cheeses was observed during a six month minimum storage period of therapy, which sets the value of micro-organisms at the end of the storage order of 10 6 cfu / ml. Úvod Mlieko, mliečne výrobky, a teda aj syry majú významné miesto vo výžive všetkých skupín obyvateľstva. Ich každodenný príjem je odporúčaný zdravotníckymi organizáciami a mnohými odborníkmi. Syry ako také patria medzi najatraktívnejšie mliečne výrobky a celosvetovo sa na ich výrobu spotrebováva cca 46 % všetkého mlieka. Napriek stále zvyšujúcej sa spotrebe syrov u nás, máme oproti krajinám EÚ ešte veľkú rezervu a možnosť jej zvyšovania. Hoci u nás je spotreba syrov už vyše 9 kg/obyvateľa a rok, celoeurópsky priemer je cca 19 kg/osobu a rok, čo je spotreba vyše dvojnásobná a pritom niektoré syrárske krajiny majú spotrebu aj vyše 20 kg/osobu a rok (Nemecko, Grécko, Francúzsko). Syry vyrobené na Slovensku majú dobrý kvalitatívny štandard a niektoré syrárske špeciality majú už svoju tradíciu a sú známe i v zahraničí (2). Syry sa vyznačujú bohatým výskytom esenciálnych živín ako sú bielkoviny, tuky, minerálne látky, vitamíny a podobne. Spracovaním mlieka na syr sa uspôsobujú niektoré jeho základné zložky na lepšiu stráviteľnosť ako aj na to, aby sa syr stal vhodnou potravou pre diabetikov, pre ľudí trpiacich intoleranciou laktózy, aby bol vhodný na konzumáciu pre chorých a rekonvalescentov a aby ho mohli bez problémov konzumovať rovnako deti, ako aj dospelí (5). Syr môže ponúknuť určité výhody ako nosič probiotických mikroorganizmov. S vyšším ph, ako tradičné probiotické potraviny (napr. jogurty a fermentované mlieka), môže poskytovať stabilnejšie prostredie, ktoré podporuje ich dlhodobé zretie. Okrem toho jeho relatívne vysoký obsah tuku môže poskytnúť ochranu probiotických baktérií počas priechodu zažívacím traktom. Avšak, medzi najdôležitejšie kritériá pri posudzovaní syra ako probiotickej potraviny je, že mikroorganizmy sú schopné prežiť pomerne dlhé doby zrenia v dĺžke najmenej 6 mesiacov. Podľa Chapmana a Sharpea (3) v období dozrievania syrov, spravidla pri teplote 2 až 16 C, počet nepatogénnych baktérií, predovšetkým laktobacilov (Lactobacillus plantarum, L. casei, L. brevis) a pediokokov (Pediococcus pentosaceus) stúpa rýchlejšie ako u čerstvých syrov. Mnohé z týchto baktérií mliečneho kvasenia majú zložité proteolytické systémy, ktoré sú spojené s procesom zrenia. V dôsledku toho boli laktobacily s definovanými proteolytickými systémami vedome pridávané ako doplnky do mlieka na výrobu syrov s cieľom ovplyvniť zrenie syrov (4). 117

118 V súčasnej dobe sa veľké množstvo probiotických mikroorganizmov používa na zlepšenie chuti a sú komerčne dostupné aj v syroch, vrátane syrov holandského typu a syrov čedar. Existuje pomerne málo správ o syroch ako nosičoch probiotických organizmov. V roku 1994, Dinakar a Mistry (1) pridali Bifidobacterium bifidum do syrov typu čedar ako probiotický doplnok. Tento kmeň prežil aj v syroch, ktoré boli uchovávané po dobu 6 mesiacov, kde ich hodnoty dosahovali CFU / g syra, bez toho, aby sa nepriaznivo ovplyvnila chuť, konzistenciu či vzhľad syra. Tento príklad je jasnou ukážkou, že v syroch by mohlo byť vhodné prostredie pre zachovanie probiotických mikroorganizmov vo vysokých počtoch po dlhú dobu. Cieľom tejto práce bolo vyrobiť syry holandského typu s použitím probiotických kultúr Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei a Lactobacillus plantarum96 ako doplnkových kultúr a ich vplyvov, zistiť prežívanie probiotických kultúr v priebehu zrenia syrov a ich vplyv na fyzikálno-chemické a senzorické vlastnosti finálneho výrobku počas zretia. Materiál a metodika Mlieko v množstve 400l sa spracovávalo v laboratórnych priestoroch na Ústave mikrobiológie a gnotobiológie UVL v Košiciach. Proces výroby polotvrdých syrov prebiehal na prístroji Polyfood model SI (Inventa Agri, Taliansko). Boli vyrobené polotvrdé syry s nízkodohrievanou syreninou holandského typu, ktoré zreli po dobu 6 mesiacov. Po samotnej výrobe sa syry rozdelili do 4 skupín, z ktorých tri skupiny syrov obsahovali tri vybrané probiotické kultúry, štvrtá skupina syrov bola kontrolná. V každej skupine sa nachádzali tri bochníky syrov o priemernej hmotnosti 3273 g. Vzorky syrov sa následne označili ako: S1 - skupina obsahujúca Lactobacillus acidophilus S2 - skupina obsahujúca Lactobacillus casei S3 - skupina obsahujúca Lactobacillus plantarum 96 Sk - kontrolná skupina Na prípravu 3 skupín probiotických syrov s vybranými probiotickými kultúrami uvedenými vyššie sa použila kultúra mikroorganizmov distribuovaná z jedného objemu do fermentorov v jednej operácii tak, že bola zaručená rovnorodosť, ochrana pred kontamináciou a stabilita. Do pripraveného média bola pridaná príslušná probiotická kultúra o množstve 10U/100l mlieka. Po premiešaní sa na zariadení zobrazila hodnota ph inokula. Do fermentorov sa pridali magnetické miešadlá a po uzavretí sa fermentory vložili do termostatu pri teplote 39 C - 40 C. Inokulum sa sledovalo v pravidelných časových intervaloch (3-6 hodín), pričom sa odoberali vzorky o množstve 50 ml a sledovalo sa ph inokula. Prvé dva týždne po výrobe boli syry skladované pri teplote C pričom sa pravidelne otáčali. Potom sa teplota upravila na 8-10 C. Keď sa na syroch vytvorila kôra, syry sa nalakovali a navoskovali. Takto upravené syry zreli pri teplote 10 C. Odber vzoriek sa uskutočňoval jedenkrát za mesiac v období január 2009 až jún Po každom odbere sa jednotlivé vzorky syrov analyzovali mikrobiologicky, pričom sa sledovala životaschopnosť jednotlivých probiotických kultúr v syroch počas zrenia. Fyzikálno-chemické parametre (obsah tuk, sušiny, obsah chloridu sodného, titračná kyslosť a ph) sa sledovali počas vybraných štyroch mesiacov. V poslednom mesiaci (jún) sa vo vzorkách syrov zisťovalo aj množstvo kyseliny mliečnej a obsah bielkovín. U každej vzorky sa analyzoval stred a kraj syrov. Na štatistické porovnanie výsledkov jednotlivých experimentov sa použili štatistické metódy spracovania a vyhodnocovania hromadných číselných údajov, ktoré boli spracované do tabuliek a grafov (MS Excel 2007). Z parametrických testov bola použitá analýza rozptylu ANOVA a metódy induktívnej štatistiky párového t-testu pre testovanie rovnosti priemerov medzi závislými parametrami, korelačný phí koeficient pre zistenie tesnosti vzťahu medzi dvoma nominálnymi premennými (SPSS, GaphPad Prism 5). Výsledky a diskusia Najvyšší obsah tuku počas sledovaných období bol zaznamenaný u skupiny syrov obsahujúcich probiotickú kultúru Lactobacillus acidophilus (S1) v priemere 31,12 % a 30,48 % v 118

119 skupine syrov obsahujúcich probiotickú kultúru Lactobacillus casei (S2). Najnižší obsah tuku bol u syrov poslednej tretej skupiny obsahujúcej probiotické kmene Lactobacillus plantarum 96 (S3) - 28,67 %, pričom na začiatku zrecieho obdobia sa pohybovali hodnoty tuku v priemere 20,79 %. Pri hodnotení množstva tuku v syroch jednotlivých experimentálnych skupín možno konštatovať, že jedným z rozhodujúcich kvalitatívnych znakov syrov je konzistencia a teda, že ani v jednej sledovanej skupine syrov nepresiahla stanovená hodnota obsahu tuku pre výrobu nízkodohrievaných syrov 31,5 %. Priemerná hodnota sušiny pre polotvrdé syry z nízkodohrievanou syreninou je 54 %, pre beztukovú sušinu 54 % - 63 % a tuku v sušine 45 % - 60 %. Sušina ako aj ostatné namerané hodnoty (beztuková sušina a tuk v sušine) mali po celé sledované obdobie vo všetkých troch skupinách iba veľmi mierne kolísavý charakter. Kyslosť syra podstatne ovplyvňuje odtok srvátky a tým aj obsah sušiny syra. Titračná kyslosť u sledovaných skupín probiotických syrov stúpala počas obdobia zretia u skupiny S1 o 2,2 SH, u skupiny S2 až o 5,6 SH a u tretej skupiny S3 o 2,6 SH na konci zrecieho obdobia. Priemerné hodnoty aktívnej kyslosti ph sa pohybovali od 4,93 do 5,27 ph. Hodnoty ph prostredia syrov klesali v závislosti od hromadenia sa kyseliny mliečnej v syroch. Obsah soli v syroch má vplyv na chuť syrov a tiež nepriamy vplyv na štruktúru syrového cesta. Priemerné hodnoty soli by sa mali v syroch pohybovať v rozpätí od 1,5 % - 3 %. V jednotlivých skupinách syrov hodnoty soli stúpali počas celého zrecieho obdobia, ale ani jedna vzorka syrov nepresiahla hodnotu 3 %. Tým sa zabezpečila požadovaná sušina a konzistencia syrov. Fermentáciou laktózy vzniknutá kyselina mliečna výraznou mierou ovplyvňuje nielen chuť syrov, ale zabezpečuje ich trvanlivosť a hlavne nutričné a dietetické vlastnosti. Obsah kyseliny mliečnej u skupiny vzoriek syrov S1 stúpal počas zrecieho obdobia až na hodnotu 1,94 g/100g syra, v skupine S2 bola konečná hodnota mliečnej kyseliny 1,57 g/100g a najnižšia hodnota kyseliny mliečnej bola v tretej skupine 1,46 g/100g obsahujúcej probiotickú kultúru Lactobacillus plantarum 96. Kyselina mliečna vo všetkých skupinách stúpala úmerne so štiepením laktózy za súčasného enzymatického štiepenia bielkovín. Výsledky ukázali, že v polotvrdých syroch sa laktóza počas zrecieho obdobia úplne transformovala na kyselinu mliečnu. Bielkoviny v syre a to najmä kazeín, svojou vápnikovou väzbou dávajú syru pevnosť, formu a stabilitu. Priemerné hodnoty bielkovín v poslednom mesiaci skladovania v jednotlivých skupinách vzoriek syrov boli u S1-22,12 %, S2-23,54 % a S3-21,73 %. Pri štiepení bielkovín počas zrenia vzoriek syrov vznikali látky, ktoré v jednotlivých skupinách vytvárali typickú chuť a vôňu syrov. Vyhodnotenie jednotlivých výsledkov fyzikálno-chemických parametrov párovým t-testom nedokázalo preukazné rozdiely v stredných hodnotách. To znamená, že namerané hodnoty neovplyvnili kvalitu skladovaných vzoriek syrov. Z vyhodnotenia kvantitatívnych priemerných hodnôt sledovaných probiotických kultúr u jednotlivých vzoriek vyplýva, že medzi počtom jednotlivých sledovaných probiotických kultúr boli rozdiely tak na začiatku skladovania syrov ako aj na konci skladovacieho - zrecieho obdobia. Zo štatistického hodnotenia výsledkov na základe testovacích charakteristík uvedených v tabuľke I vyplýva, že v odobratých vzorkách syrov boli zistené štatisticky významné rozdiely v skupine syrov obsahujúcich Lactobacillus acidophilus na hladine významnosti p< 0,0001 pri 95 % intervale významnosti. Počty kultúr Lactobacillus acidophilus na začiatku skladovacieho obdobia sa pohybovali radovo 2, KTJ/g a klesali až do 4. mesiaca skladovania na hodnotu 0, KTJ/g. Posledný mesiac skladovania hodnoty začali stúpať na konečných 0, KTJ/g. Rozdiel medzi počiatočným rastom a konečným rastom probiotickej kultúry bol 2, KTJ/g. Pri porovnaní rastu kultúr Lactobacillus acidophilus medzi jednotlivými mesiacmi počas zrecieho obdobia bola preukázaná štatistická významnosť medzi všetkými obdobiami, ale najväčšia významnosť bola zistená medzi mesiacmi február a apríl, a to p<0,0005 na hladine významnosti 95 %. 119

120 Tabuľka I Priemerný počet jednotlivých probiotických kultúr v experimentálne vyrobených syroch počas zrecieho obdobia a ich korelačná závislosť Probiotické KTJ/g Korelačná kultúry január február marec apríl máj jún závislosť Lactobacillus 2, , , , , , ,0001 acidophilus *** Lactobacillus 4, , , , , , ,0086 casei ** Lactobacillus 3, , , , , , ,0001 plantarum 96 *** KTJ - kolónie tvoriace jednotky Pri porovnaní výsledných počtov probiotických kultúr Lactobacillus casei s ostatnými sledovanými probiotickými kultúrami možno konštatovať, že boli najvyššie. Na začiatku zrecieho obdobia sa pohybovali radovo až 4, KTJ/g, pričom polovičný počet rádovo 10 7 si udržiavali až do tretieho mesiaca. V priebehu ďalších troch mesiacov experimentu sa počty Lactobacillus casei zvýšili až na konečnú hodnotu 0, KTJ/g. Významný rozdiel bol zaznamenaný pri porovnaní mesiacov január - apríl (p<0,0079), január - máj (p<0,0116), január - jún (p<0,0195), február - apríl (p<0,0181), február - máj (p<0,0409) a apríl - jún (p<0,0296) na 95 % intervale spoľahlivosti. Pri celkovom porovnaní mesiacov, počas ktorých syry zreli bola zistená hladina významnosti p<0,0086 na 95 % intervale spoľahlivosti. Počty probiotickej kultúry Lactobacillus plantarum 96 sa pohybovali počas celého skladovacieho obdobia radovo až 10 8 KTJ/g. Pri celkovom hodnotení počtu Lactobacillus plantarum 96 počas celého obdobia skladovania sa preukázala štatistická významnosť na hladine p<0,0001 pri 95 % intervale spoľahlivosti. Najvyššie významnosti na hladine p<0,0001 boli zaznamenané medzi mesiacmi február - marec, február - apríl a február - máj. Medzi ostatnými sledovanými obdobiami sa štatistické významnosti pohybovali na hladinách p<0,001 a p<0,05. Mikrobiologickým vyšetrením sa zistilo, že kultúry Lactobacillus plantarum 96 sa na začiatku skladovacieho obdobia pohybovali radovo 3, KTJ/g pričom počty tejto kultúry sa zvyšovali až do konca zrecieho obdobia, a to až o dva rady na konečnú hodnotu 0, KTJ/g. Počty probiotických baktérií boli vyššie ako 10 6 KTJ/g, počas celého obdobia skladovania experimentálne vyrobených syrov. U všetkých skupín syrov, kde boli použité vybrané probiotické kultúry sa dosiahli hodnoty radovo až 10 8 KTJ/g. Tým bol splnený limit legislatívneho a terapeutického minima pre výrobky obsahujúce probiotické baktérie určené na ľudskú výživu. V grafe 1. je znázornená závislosť rastu jednotlivých probiotických kultúr v stredových častiach vzoriek experimentálne vyrobených syrov. Počty jednotlivých probiotických kultúr v stredovej časti vzoriek syrov v priebehu zretia do 4. mesiaca klesali, kedy došlo k miernemu ustáleniu počtu kultúr, ale od 5. mesiaca probiotické kultúry začali intenzívne rásť (p<0,01) až na priemerné hodnoty 0, KTJ/g. Výnimku tvoril len probiotický kmeň Lactobacillus casei, ktorý v začiatkoch zrenia prudko rástol až do hodnoty 4, KTJ/g. Rovnako aj u tohto kmeňa, došlo k ustáleniu jeho počtov v priebehu 5. mesiaca zretia. Na konci zrecieho obdobia počty probiotickej kultúry Lactobacillus casei sa prudko zvyšovali na konečnú hodnotu 0, KTJ/g. Pri porovnaní okrajových častí vzoriek jednotlivých experimentálne vyrobených syrov sa zistil štatisticky významný rozdiel p<0,05 medzi vybranými probiotickými kultúrami. Z grafu 2. vyplýva, že na začiatku zrenia boli počty jednotlivých probiotických baktérií odobratých z okrajových častí experimentálnych syrov vyššie v porovnaní so vzorkami odobratými zo stredových častí vzoriek syrov. Dôvodom tohto rozdielu mohlo byť pravdepodobne nepravidelné rozloženie probiotických kultúr v zrejúcich syroch. Počty jednotlivých kultúr v okrajovej časti syrov až do mesiaca klesali, ale nie pod hodnotu nižšiu ako 10 6 KTJ/g. V priebehu ďalších mesiacoch zrenia počty probiotických kultúr mierne rástli až na priemernú hodnotu 0, KTJ/g. 120

121 Výnimku tvoril kmeň Lactobacillus casei, ktorý od 4. mesiaca prudko rástol na konečnú hodnotu 0, KTJ/g. Graf 1. Rast probiotických kultúr v stredových častiach experimentálne vyrobených syrov počas zrecieho obdobia Graf 2. Rast probiotických kultúr v okrajových častiach experimentálne vyrobených syrov počas zrecieho obdobia Bola zistená štatistická významnosť v intervale 95 % (p<0,05) v raste vybraných probiotických kultúr medzi stredovou a okrajovou časťou experimentálne vyrobených syrov. Pri porovnaní stredových a okrajových vzoriek syrov bola v poslednom mesiaci zrenia zistená štatistická významnosť na hladine p<0,05 v raste vybraných probiotických kultúr, pričom počty kmeňa Lactobacillus casei v porovnaní s kmeňmi Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus plantarum 96 boli podstatne vyššie (p<0,01) v stredových častiach experimentálnych syrov ako v okrajových častiach. Uvedené rozdiely obsahu jednotlivých probiotických kultúr mohli byť spôsobené rozdielnymi nárokmi na podmienky vnútorného prostredia v stredových a okrajových častiach vzoriek experimentálne vyrobených syrov, čím mohla byť ovplyvnená ich rozmnožovacia schopnosť. Záver Cieľom práce bolo sledovanie kvantitatívnych zmien vybraných probiotických mikroorganizmov v syroch holandského typu po dobu 6 mesiacov zrenia. Pri výrobe syrov boli pridané vybrané probiotické kultúry Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei a Lactobacillus plantarum 96. Zo získaných výsledkov fyzikálno - chemických parametrov neboli zaznamenané preukazné rozdiely v stredných hodnotách a teda neovplyvnili kvalitu skladovaných vzoriek syrov. Z vyhodnotených kvantitatívnych hodnôt sledovaných vybraných probiotických kultúr u jednotlivých vzoriek boli medzi počtom sledovaných probiotických kultúr rozdiely tak na začiatku skladovania syrov ako aj na konci skladovacieho obdobia. Najvyššie hodnoty u všetkých probiotických kultúr boli zaznamenané v mesiacoch február a marec v priemere 2, KTJ/g syra. Opačne, najnižšie hodnoty vykazovali jednotlivé probiotické kultúry v mesiaci apríl, a to v priemere 0, KTJ/g syra. Pri porovnaní výsledkov počtov probiotických kultúr Lactobacillus casei s ostatnými sledovanými probiotickými kultúrami možno konštatovať, že boli najvyššie. Počty probiotickej kultúry Lactobacillus plantarum 96 sa pohybovali od tretieho mesiaca skladovania radovo až 10 8 KTJ/g. 121

122 Rozdiel medzi okrajom a stredom predložených vzoriek syrov bol mierne štatisticky významný, kde vyšší rast vybraných probiotických kultúr bol v stredových častiach než v okrajových častiach jednotlivých skupín syrov. U všetkých skupín syrov, kde boli použité vybrané probiotické kultúry sa dosiahli hodnoty radovo až 10 8 KTJ/g. Tým bol splnený limit legislatívneho a terapeutického minima pre výrobky obsahujúce probiotické baktérie určené na ľudskú výživu. Poděkování: Práca bola podporovaná z projektu VEGA 1/0123/08 a VEGA 1/0638/09 Použitá literatúra 1. Dinakar, P., and V. V. Mistry Growth and viability of Bifidobacterium bifidum in Cheddar cheese. J. Dairy Sci. 77: Herian, K.: Mliekarstvo na Slovensku z pohľadu EÚ a IDF. In: Mliekarstvo, 36, 2005, č. 4, s Chapman, H. R., and M. E. Sharpe Microbiology of cheese, p In R. K. Robinson (ed.), Dairy microbiology. Applied Science Publishers, London, United Kingdom. 4. Lynch, C. M., P. L. H. McSweeney, P. F. Fox, T. M. Cogan, and F. D. Drinan Manufacture of Cheddar cheese with and without adjunct lactobacilli under controlled microbiological conditions. Int. Dairy J. 6: Palo, V.: Význam syrov vo výžive. In: Mliekarstvo, 35, 2004, č. 3, s Kontaktná adresa: Ing. Viera Lovayová Ústav hygieny a technológie mlieka UVL Komenského 73, Košice Viera-l@ .cz 122

123 RŮST BAKTERIÍ ZE STOLICE KOJENCŮ NA KOMERČNĚ DOSTUPNÝCH PREBIOTICÍCH Bunešová Věra, Ročková Šárka, Rada Vojtěch, Vlková Eva Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita v Praze Growth of infant faecal bifidobacteria on prebiotic Summary: Prebiotics have been used as bifidogenic compounds in infants formulas. However, prebiotics can stimulate some harmful bacteria as well. The aim of present study was to test the growth of infant faecal bacteria on commercial prebiotics. Faeces were analysed for bifidobacteria, lactobacilli, E.coli, and clostridia. Bacterial counts were determined by fluorescence in situ hybridization (FISH) fluid method kit (Ribo Technologies) and by cultivation. Then, faecal bacteria were inoculated to cultivation medium containing 2% of galactooligosaccharides (GOS, Vivinal ) or 2% fructooligosaccharides (FOS, Raftilose P95) as a single carbon source. After 24 hours of anaerobic cultivation at 37 C, total anaerobic bacteria, bifidobacteria, clostridia, lactobacilli, and E. coli were quantified by cultivation and FISH glass method. There were two groups of infants in respect to bifidobacteria presence: infants with high number of bifidobacteria (usually 9-10 log CFU/g; 60 infants) and infants without bifidobacteria (11 infants). In group with high counts of bifidobacteria in original faecal sample, bifidobacteria dominated also after cultivation on prebiotics. In samples without bifidobacteria, clostridia and E. coli dominated after subcultivation on Vivinal and Raftilose P95. Lactobacilli were supported by prebiotic in both groups. There were no significant differences between bacterial growth on Vivinal and Raftilose P95. Prebiotics are substances that should selectively stimulate the growth of desirable bacteria such as bifidobacteria and lactobacilli. But it follows fromour results that FOS and GOS may stimulate also other faecal bacteria such as clostridia or coliforms. Úvod Střevní mikroflóra představuje složitý ekosystém, s velkou metabolickou aktivitou, měnící se během života a je důležitým faktorem, který ovlivňuje zdraví jedince [1]. Existuje mnoho vlivů, včetně rozdílné výživy a adaptability, jež působí na složení střevní mikroflóry [2]. Jednou z možností ovlivnění střevní mikroflóry je příjem tzv. funkčních potravin. Jedná se o potraviny obsahující složky, které mají v lidském organismu určitou specifickou fyziologickou a zdraví prospěšnou funkci. Nejsou určeny k léčení konkrétních nemocí, působí na organismus preventivně, tím vytvářejí předpoklady pro udržení zdraví [3]. Mezi tyto potraviny řadíme i potraviny s obsahem prebiotik. Prebiotika jsou látky většinou sacharidové povahy, jež jsou rezistentní přímému metabolizmu konzumenta a podporují aktivitu a rozvoj již přítomných střevních bakterií v těle hostitele a mají tak pozitivní vliv na jeho zdraví [4-6]. První přirozená prebiotika, se kterými se náš organismus setká, jsou obsažená v mateřském mléce. Jejich příjem je předpokladem pro vytvoření vhodných osídlovacích vzorů mikroflóry gastrointestinálního traktu, které potom jedince provází po celý zbytek jeho života [7]. Na druhé straně kritickým bodem použití prebiotik je otázka zda dojde k podpoře specifické skupiny bakterií, jako jsou bifidobakterie nebo laktobacily, protože při jejichž absenci (např. u kojenců porozených císařským řezem) jsou účinky těchto látek někdy dokonce negativní, neboť mohou působit flatulenci a průjmy [8, 9]. Prebiotika jsou často kombinována s probiotiky, tedy s živými mikroorganizmy. Vzniká tak synbiotikum, jež je definováno jako směs probiotik a prebiotik, která hostitele prospěšně ovlivňuje tím, že zlepšuje přežití a usídlení živých dietetických doplňků v gastrointestinálním traktu a to tak, že selektivně stimuluje růst nebo aktivuje metabolizmus jedné bakterie nebo omezeného počtu bakterií podporující zdraví a tím pozitivně působí na hostitele [10]. V poslední době se rozšířila výroba komerčních prebiotik a je otázkou, zda tyto produkty podporují skutečně jen pozitivně působící mikroorganismy. Cílem práce bylo zjistit, které bakterie ze stolice kojenců jsou nejvíce stimulovány dvěma komerčně dostupnými prebiotiky. 123

124 Materiál a metody Byla analyzována mikroflóra stolice 71 plně kojených dětí ve věku 1-6 měsíců. Z nich 63 kojenců bylo porozeno přirozenou cestou, 8 císařským řezem. Počty bakterií byly stanoveny kultivačně s použitím selektivních agarů. Celkové počty anaerobních bakterií byly stanoveny na Wilkins-Chalgren agaru (Oxoid), bifidobakterie na modifikovaném TPY agar (MTPY; Sharlau, Španělsko) s přídavkem mupirocinu (100 mg/l) a ledové kyseliny octové (1 ml/l) podle [11], laktobacily na Rogosa agaru (Oxoid) a bakterie E. coli na chromogenním TBX agaru (Oxoid). Klostridie, bifidobakterie, laktobacily a bakterie E. coli byly stanoveny také pomocí Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) sklíčková metoda. Pro metodu FISH bylo použito soupravy firmy Ribo Technologies (Groningen, Holandsko). Součástí sady jsou rodově či druhově specifické oligonukleotidové sondy značené fluorescein isothiokyanátem. Sonda proniká do buňky a po navázání na ribozomální RNA světélkuje v epifluorescenčním mikroskopu. Množství sledovaných bakterií bylo vyjádřeno jako procento z celkového počtu bakterií stanovených ve fázovém kontrastu ve stejném poli. Bakterie ze stolice kojenců byly zaočkovány do 2 % médií obsahujících komerčně dostupná prebiotika Vivinal (představující galaktooligosacharidy; Domo, Holandsko) nebo Raftilose P95 (představující fruktooligosacharidy; Domo, Holandsko) jako jediné zdroje uhlíku. Po 24 hodinové kultivaci byly kvantifikovány tyto skupiny bakterií: celkové počty bakterií, bifidobakterie, laktobacily, klostridie a E. coli. Pro získání výsledků bylo opět použito kultivační stanovení a fluorescenční in situ hybridizace (FISH) sklíčková metoda. Na základě výsledků bylo určeno, které bakterie byly nejvíce stimulovány testovanými prebiotiky. Výsledky a diskuse Výsledky stanovení počtu bakterií ve stolici kojenců a po kultivaci v médiu s obsahem Vivinal a Raftilose P95 jsou uvedeny v tabulce č. I. Jak u skupiny kojenců porozených přirozeným způsobem, tak u dětí narozených císařským řezem, byly zaznamenány vzorky stolice s obsahem bifidobakterií (BIF+), tak vzorky, kde nebyly bifidobakterie kultivačně detekovány (BIF-). Ve skupině přirozeně porozených dětí bylo (BIF-) 14,5 %, zatímco u kojenců porozených císařským řezem se jednalo o 60 % dětí. Je ovšem nutno říci, že počet sledování ve skupině dětí porozených císařským řezem je velmi malý ve srovnání s druhou skupinou. U všech skupin vzorků byly celkové počty anaerobních bakterií v původním vzorku stolice vyšší než 10 log KTJ/g. Po kultivaci na prebioticích se celkové počty anaerobů pohybovaly okolo 9 log KTJ/ml. Ve vzorcích stolice dětí, u kterých byly kultivačně detekovány bifidobakterie, byly bifidobakterie stanoveny jako dominantní skupina bakterií ve vzorku stolice a to jak kultivačně i metodou FISH. Ačkoliv u těchto dětí nebyly klostridie kultivačně detekovány, tak metodou FISH byly zaznamenány v nízkých hodnotách. U dětí bez bifidobakterií dominovaly ostatní skupiny bakterií, tedy bakterie E. coli, klostridie a laktobacily. I v tomto případě byly u několika vzorků, které byly stanoveny kultivačně bez bifidobakterií zaznamenány bifidobakterie metodou FISH ve velice nízkých počtech. U dětí (BIF-) s klostridiemi, byly klostridie detekovány i po kultivaci na prebioticích a v některých případech dokonce i ve vyšších hodnotách než v původním vzorku stolice, což potvrzuje výsledky, které uvádějí [11], že čisté kultury Clostridium izolované z trávicího traktu kojenců dobře rostou na prebioticích Vivinal i Raftilose. Laktobacily a bakterie E. coli byly prokazatelně detekovány ve všech skupinách kultivačně i metodou FISH. Laktobacily byly u obou skupin dětí podporovány prebiotiky. Přestože výsledky kultivačního stanovení a metody FISH zcela nesouhlasily, tak se metoda FISH ukázala jako vhodná pro stanovení bakterií ve vzorcích pocházejících ze stolice kojenců. Mezi testovanými prebiotickými preparáty nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl. Obě prebiotika podporovala prakticky všechny skupiny bakterií. 124

125 Tabulka I. Počty bakterií ve stolici kojenců a po kultivaci na médiích s obsahem prebiotik. normální porod (n = 63) BIF + (n = 55) BIF - (n = 8) císařský řez (n = 8) BIF + (n = 5) CP BIF počty bakterií (log KTJ/g; log KTJ/ml) % BIF FISH Lb % Lb FISH EC % EC FISH Cl % Cl FISH stolice 10,01 8,94 74,32 5,60 57,73 9,87 19,88 ND 2,04 Vivinal 8,33 7,17 63,47 6,11 54,86 5,64 24,71 ND 3,48 Raftilosa 8,53 7,01 60,26 6,03 63,27 6,11 23,67 ND 2,71 stolice 10,14 ND 0,66 4,79 33,33 8,49 52,96 7,01 16,66 Vivinal 8,77 ND 0 6,44 14,27 7,18 48,22 7,52 23,30 Raftilosa 8,52 ND 0,66 7,49 33,33 6,78 37,33 7,37 24,30 CP BIF % BIF % Lb % EC % Cl Lb EC Cl FISH FISH FISH FISH stolice 10,53 9,72 59,6 8, ,79 69,43 ND 1,67 Vivinal 8,61 7, , ,42 31,19 ND 2,33 Raftilosa 9,09 8,23 63,60 7, ,31 35,40 ND 2,67 stolice 10,22 ND 3,33 7, ,31 36,92 7,62 39,33 BIF - (n = 3) Vivinal 8,90 ND 0 6,65 66,67 5,45 65,59 7,77 36,67 Raftilosa 8,88 ND 0 6,84 66,67 5,67 58,59 7,36 34,67 BIF+ - bifidobakterie kultivačně detekovány; BIF- - bifidobakterie nebyly kultivačně detekovány; CP - celkové počty bakterií; Lb - laktobacily, EC E. Coli; FISH fluorescenční in situ hybridizace; ND nebyly detekovány Závěr Vzhledem k tomu, že testovaná prebiotika podporují rozvoj i jiných než probiotických bakterií, není vhodné jejich podávání kojencům, v jejichž trávicím traktu mohou probiotika chybět. Jako vhodnější řešení pro kojence je použití synbiotik, jež jsou kombinací probiotik a prebiotik. Prebiotika je tedy vhodné podávat spíše dospělým jedincům, protože ti mají bifidobakterie a laktobacily přítomné v tlustém střevě vždy. Poděkování: Práce byla sponzorována granty GAČR 525/08/H060 a MSMT 2B Použitá literatura: 1. Nevoral, J Probiotika a prebiotika. Medical Tribune 13/2008. Dostupné z: < [cit.: ] 2. Sgorbati, B., Biavati, B., Palenzona, D The genus Bifidobacterium. In: Wood, B. J. B., Holzapfel, W. H.: The Genera of Lactis Acid Bakteria. The Lactis Acid Bakteria, Blackie Academic and Professional, Glasgow 1995, Milner, J. A Functional foods and healtj: a US perspective. British Journal of Nutrition. 88: Roberfroid, M Prebiotics: The Concept Revisited. In: Effects of Probiotics and Prebiotics. The Journal of Nutrition. 137: 830S 837S. 5. Rastall, R. A., Gibson G. R Prebiotic olisaccharides: Evaluation of biological activities and potential future developments. In: Tannock GW (ed) Probiotics and Prebiotics, Where Are We Going. Caister Acad. Press Norfolk, England, s Alander, M., Mättö, J., Kneifel, W., Johansson, M., Kögler, B., Crittenden, R., Mattila-Sandholm, T., Saarela, M Effect of Galactooligosaccharide Supplementation on Human Faecal Microflora and on Survival and Persistence of Bifidobacterium lactis Bb-12 in the Gastrointestinal Tract. International Dairy Journal 11,

126 7. Krejsek, J., Kudlová, M., Koláčková, M., Novosad, J Nitrifikace, prebiotika, probiotika a imunitní systém (I. Část: Imunitní systém, principy fungování). Pediatrie pro praxi 2/2007, Gilliland, S.E Probiotics and prebiotics. In: Applied Diary Mikrobiology, Marth, E.H., Steele, J.L. (eds.), Marcel Dekker, New York, Gibson G.R., Rastall R.A Prebiotics: Development and Applicacion. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, Meile, L Mikroorganismen in Lebensmitteln: Umsetzung des probiotischen Koncepts, Lebensmittel Technologie 31: Rada, V., Nevoral, J., Trojanová, I., Tománková, E., Šmehilová, M., Killer, J Growth of infant faecal bifidobacteria and clostridia on prebiotic oligosaccharides in in vitro conditions. Anaerobe Kontaktní adresa: Ing. Věra Bunešová Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita v Praze, Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol, bunesova@af.czu.cz 126

127 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ RŮST BIFIDOBAKTERIÍ V MATEŘSKÉM MLÉCE Ročková Šárka 1, Bunešová Věra 1, Rada Vojtěch 1, Nevoral Jiří 2, Vlková Eva 1, Maršík Petr 3, Sklenář Jan 4 1 Katedra mikrobiologie výživy a dietetiky, Fakulta agrobiologie potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita; 2 Pediatrická klinika Univerzity Karlovy v Praze - Motol; 3 Laboratoř rostlinných biotechnologií, Společná laboratoř Ústavu experimentální botaniky Acad. Sci. ČR, v.v.i. a Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.; 4 Oddělení imunologie, Mikrobiologický ústav AV ČR Acad. Sci. ČR Factors affecting the growth of bifidobacteria in human milk Summary: The growth of 7 strains of bifidobacteria in 15 different samples of human milk was tested. Three strains (2 B.bifidum and 1 B. longum) were isolated from infant faeces. Two strains of B. animalis were isolated from fermented milk products. Remaining two strains (B. bifidum and B. longum) were isolated from commercial probiotic products. Luxuriant growth of B. bifidum in human milk was accompanied with decreasing of ph (up to 4.0) and production of acetic and lactic acid (up to 6 g/l). On the other hand, numbers of viable cells of B. animalis decreased from 6 log CFU/ml to 3 log CFU/ml after incubation in human milk. There were significant differences (P < 0.05) between bacterial counts of B. bifidum and B. animalis in most human milk samples tested. The growth of B. longum in human milk was variable. Resistance to lysozyme and the ability to utilize human milk oligosaccharides (HMO) were identified as the most important factors affecting the growth of bifidobacteria in human milk. In general, strains of human origin (B.bifidum and B. longum) were resistant to lysozyme, while Bifidobacterium animalis was susceptible species. HMO were isolated and purified from four different human milk samples. Again, only B.bifidum and B. longum utilized HMO. We recommend the resistance to lysozyme and the ability to utilize HMO as new criteria for the selection of new probiotic bifidobacterial strains. Úvod: Bifidobakterie jsou grampozitivní, chemoorganotrofní, nesporulující, nepohyblivé, anaerobní, sacharolytické pleomorfní tyčinky s rozmanitým větvením, které jsou hlavní složkou střevní mikroflóry lidí a zvířat. Kolonizace střeva nepatogenními mikroorganismy je podstatná pro zdraví novorozence. Kojením dětí se vytváří intraintestinální prostředí, které je tvořeno jednoduchou flórou z bifidobakterií a trochou dalších mikroorganismů. Bifidobakterie působí jako prevence proti střevním patogenům. Mají příznivý vliv na utváření střevní mikroflóry tím, že produkují organické kyseliny a také tím, že jsou schopny adheze na střevní stěnu, čímž zabraňují kolonizaci střeva jinými bakteriemi. Produkcí kyseliny octové a mléčné snižují hodnotu ph ve střevě a znemožňují množení patogenních a hnilobných bakterií (1). Kombinace antimikrobiální a bifidobakteriální stimulační aktivity v mateřském mléce vede k vysoce specifické schopnosti regulace mikrobiálního složení intestinálního traktu dítěte. Tím, že mateřské mléko podporuje růst bifidobakterií, stává se tak prvním prebiotikem. Mateřské mléko obsahuje celou řadu imunologicky aktivních a mikrobiálních látek (imunoglobuliny, laktoferin, laktoperoxidázu, nukleotidy, к-kasein a α-laktalbunim, haptokorin, oligosacharidy, leukocyty, lysozym a další) (2). Bio-aktivní látky obsažené v mateřském mléce, ovlivňují a chrání imunitní systém dětí, ale také usnadňují vývoj dětí. Mateřské mléko obsahuje zhruba 90 různých oligasacharidů, jejichž funkce není zcela objasněna. Některé oligosacharidy působí v tlustém střevě, kde slouží jako potrava pro prospěšné střevní bakterie, hlavně bifidobakterie. Další významnější složkou mateřského mléka je lysozym. Tento enzym je schopný degradovat vnější buněčnou stěnu grampozitivních bakterií hydrolýzou N-acetylmuramové kyseliny a 2- acetylamino-2deoxy-d-glukózy (3). 127

128 Cíle práce: Hlavním cílem práce bylo testovat růst bifidobakterií v mateřském mléce a testovat citlivost bifidobakterií na lysozym. Dalším cílem práce byla izolace a purifikace oligosacharidů mateřského mléka (OMM) a využívání OMM bifidobakteriemi. Materiál a metody: Použité bakteriální kultury: Celkem bylo testováno 7 kmenů bifidobakterií v 15 různých vzorcích mateřského mléka. Přehled použitých bakteriálních kmenů je uveden v Tabulce I. Izolace kmenů (TPY agar s mupirocinem). Kmeny byly izolovány a identifikovány pomocí API 50CHL, AP ID 32A testů a druhově specifické PCR podle Vlková et al. (4). Testování růstu bifidobakterií v mateřském mléce Vzorky mateřského mléka byly obdrženy z Fakultní nemocnice v Motole. Mateřské mléko bylo před testováním pasterováno při 62,5 C/30 min. Mléko bylo rozplněno po 100 µl do sterilních mikrotitračních destiček s 96ti jamkami (Gama Group, Trhové Sviny, ČR). Kultury bifidobakterií (2 ml) narostlé ve Wilkins-Chalger bujónu (Oxoid, UK) byly odstředěny při ot./5 min, propláchnuty fosfátovým pufrem (ph = 6,5) a resuspendovány ve stejném objemu fosfátového pufru. Z takto připravené suspenze bylo očkováno 10 µl do jamek mikrotitrační destičky. Počáteční koncentrace živých buněk bifidobakterií byla 6,26 ± 0,14 log CFU/ml. Každý kmen byl očkován ve čtyřech opakováních. Po kultivaci v anaerostatech (Anaerobic Plus System, Oxoid, UK) při 37 C/24 h, bylo kultivačně stanoveno množství bifidobakterií podle Vlková et al. (4) a bylo změřeno ph a koncentrace kyseliny mléčné pomocí přístroje Reflektoquant (Merck, Germany). Pro kultivaci bifidobakterií byl použit TPY agar s mupirocinem (100 mg/l). Inkubace probíhala při 37 C po dobu 48 h. Testování růstu bifidobakterií v médiu s oligosacharidy Oligosacharidy byly z mateřského mléka separovány pomocí gelové chromatografie a následně byly jednotlivé frakce oligosacharidů analyzovány pomocí chromatografie na tenké vrstvě. Vybrané frakce obsahující pouze OMM byly smíchány a následně lyofilizovány. Médium na ředicí řadu bylo nadávkováno po 4 ml do penicilínek a do každé penicilínky bylo přidáno 40 mg OMM. Testování růstu bifidobakterií v médiu s oligosacharidy bylo provedeno stejným způsobem jako u mateřského mléka. Stanovení obsahu lysozymu v mateřském mléce a stanovení citlivosti bifidobakterií na lysozym Lysozym byl v mateřském mléce stanoven pomocí lyzační metody, jako kontrolní kmen byl použit Micrococcus luteus ATCC 9341 (5). Přehled použitých bakteriálních kmenů uvádí Tabulka I. U těchto kmenů byl testován vliv přídavku lysozymu (400 μl/ml). Kultury narostlé v TPY médiu (Sharlau, Španělsko) byly přeočkovány do zkumavek (6 opakování pro každý kmen) se stejným médiem a kultivovány při 37 C ve vodní lázni. V hodinových intervalech byla měřena optická densita při 540 nm (OD540) pomocí přístroje DensiLaMetr (Lacheme, ČR). Bezprostředně po zjištění počátku logaritmické fáze růstové křivky byl přidán do poloviny zkumavek lysozym (egg lysozyme, Sigma) v koncentraci 400 μl/ml. Výsledky byly vyneseny do grafů viz Graf III a Graf IV. Výsledky a diskuze: Testování růstu bifidobakterií v mateřském mléce Údaje o růstu bifidobakterií v mateřském mléce jsou shrnuty v Tabulce II. Mezi jednotlivými mateřskými mléky nebyly velké rozdíly. Obecně lze tedy říci, že dárkyně nemá velký vliv na růst bifidobakterií. B. bifidum B, B. longum B, B. bifidum C rostlo 128

129 téměř ve všech vzorcích mateřského mléka. Jedinou výjimkou byl vzorek mléka K, který inhiboval všechny testované bakterie. Kmeny pocházející z kysaných mléčných výrobků (B. animalis A a B. animalis B) v mateřském mléce nerostly a jejich počty po kultivaci poklesy o tři řády. Jedinou výjimku tvoří vzorek mléka G, kde tyto dva kmeny rostly. Vynikající růst, produkce laktátu a pokles ph byl zaznamenán u kmenů B. bifidum B, B. longum B, B. bifidum C (viz Tabulka II). Ve všech vzorcích mateřského mléka téměr nerostlo B. longum. Mateřské mléko je proto nepochybně alespoň pro některé druhy a kmeny lidského původu neporovnatelně lepším zdrojem živin. Což dokumentuje dobrý růst Tabulka II. hlavně u druhu B. bifidum. Obecně se dá říci, že růst lidských kmenů v mateřském mléce byl lepší než růst kmenů animálních. Tabulka I Použité kmeny, jejich původ, citlivost na lysozym, růst na OMM a v mateřském mléce (MM) Kmen Původ Lysozym Růst na OMM Růst v MM B. bifidum A stolice C + + B. longum A stolice C - - B. bifidum B stolice R + + B. animalis A jogurt A C - - B. animalis B jogurt B C - - B. longum B lyofilizát C + + B. bifidum C lyofilizát R + + Tabulka II Růst bifidobakterií v mateřském mléce (MM) kmen Mateřské mléko vzorek A vzorek B vzorek C vzorek D vzorek E vzorek F vzorek G B. bifidum A 6,90±0,32 a 4,82±0,01 a 8,32±0,14 a 7,56±0,15 a 7,30±0,12 a 8,12±0,05 a 7,62±0,07 a B. longum 3,00±0,00 b 3,74±0,17 b 3,94±0,15 b 3,46±0,15 b 3,00±0,00 b 4,08±0,95 b 6,10±0,09 b B. bifidum B 6,25±0,05 c 8,41±0,12 c 8,58±0,07 c 8,16±0,08 c 7,11±0,27 b 7,77±0,05 c 8,80±0,00 c B. animalis A 3,98±0,97 cd 6,13±0,15 c 3,39±0,39 d 3,00±0,00 c 4,83±0,04 c 3,00±0,00 cd 8,34±0,02 c B. animalis B 5,79±0,10 cde 6,08±0,12 d 4,54±0,33 e 5,42±0,40 d 4,59±0,13 d 5,41±0,10 de 7,83±0,20 c B. longum B 5,97±0,06 de 8,57±0,23 e 6,05±0,04 f 5,31±0,14 de 8,75±0,09 d 6,02±0,18 ef 6,03±0,25 d B. bifidum C 7,23±0,03 e 7,29±0,38 e 7,67±0,14 f 7,78±0,03 e 6,52±0,17 e 6,95±0,11 g 7,56±0,06 e kmen Mateřské mléko vzorek H vzorek I vzorek J vzorek K vzorek L vzorek M vzorek N B. bifidum A 7,23±0,02 a 6,16±0,46 a 3,00±0,00 a 3,10±0,17 a 7,16±0,07 a 7,33±0,11 a 7,54±0,04 a B. longum 3,30±0,00 b 3,00±0,00 b 5,32±0,85 b 3,00±0,00 b 7,25±0,04 b 6,08±0,65 b 3,10±0,17 b B. bifidum B 8,42±0,04 c 7,73±0,00 b 8,32±0,09 b 3,60±0,00 b 8,17±0,11 c 7,28±0,13 c 8,36±0,05 b B. animalis A 5,64±0,17 d 4,43±0,06 c 5,18±0,11 b 3,10±0,17 b 7,38±0,20 c 3,20±0,20 c 4,56±0,62 c B. animalis B 5,32±0,04 e 4,88±0,03 d 5,53±0,33 c 3,00±0,00 b 7,22±0,12 d 4,74±0,14 d 5,23±0,32 d B. longum B 8,67±0,01 e 8,04±0,07 de 8,74±0,13 c 6,22±0,43 c 7,96±0,06 d 6,31±0,04 d 6,41±0,62 de B. bifidum C 8,38±0,05 f 7,25±0,13 e 8,10±0,03 c 3,26±0,45 c 6,18±0,16 d 7,53±0,04 d 8,18±0,03 e Všechny hodnoty jsou průměry (v log CFU/g) ze tří měření ± SD. Počáteční koncentrace bifidobakterií byla 6,26±0,14 log CFU/g. Hodnoty ve sloupcích s různými indexy se statisticky významně liší (P < 0,005). Hodnoty v řádcích se statisticky významně liší u B. bifidum B (P < 0,02), B. animalis A a B (P < 0,01). Testování růstu bifidobakterií v médiu s OMM Každý testovaný kmen využíval jiné spektrum monosacharidů a oligosacharidů, jak je vidět z Grafu I. Jednotlivá čísla píků představují jednotlivé frakce oligosacharidů mateřského mléka (OMM). A jak je patrné z Grafu I. Velké rozdíly byly ve využívání píků číslo 20, 24, 28 a 36, které prakticky beze zbytku využívál B. bifidum, zatímco kmen B. animalis tyto frakce 129

130 nevyužíval vůbec nebo jen velmi málo. Rozdíly ve způsobu využívání OMM byly potvrzeny shlukovou analýzou viz Graf II. Graf I Využívání oligosacharidů mateřského mléka bifidobakteriemi Graf II Shluková analýza založená na velikosti plochy píků HMO[µC*min] Stanovení obsahu lysozymu v mateřském mléce Testovaly jsme 15 vzorků nepasterovaného mateřského mléka. Jednotlivé vzorky mateřského mléka se obsahem lysozymu významně liší. V literatuře se uvádí, že mateřské mléko obsahuje až 400 mg/l lysozymu. Tímto pokusem jsme zjistili, že v testovaných vzorcích mateřského mléka byl mnohem menší obsah lysozymu. Bohužel jsme testovali velmi málo vzorků. Soubor testovaných vzorků mateřského mléka je proto třeba rozšířit. Námi naměřená koncentrace lysozymu se v mateřském mléce pohybovala od 9,33 do 98,13 µg/ml. 130

131 Stanovení citlivosti bifidobakterií na lysozym Tabulka I zobrazuje odolnost testovaných kmenů vůči lysozymu. Z našeho pokusu jsme zjistili, že lysozym má vliv na růstovou křivku bifidobakterií. Pouze dva testované kmeny byly vůči lysozymu rezistentní B. bifidum B a B. bifidum C. Ostatní testované kmeny zejména kmeny izolované z mléčných kysaných výrobků B. animalis A a B. animalis B jsou na lysozym citlivé. V Grafu II je znázorněn růst rezistentního kmene Bifidobacterium bifidum B, u něhož i po přidání lysozymu nebyl růst tohoto kmene ovlivněn. Graf IV znázorňuje růst kmene Bifidobacterium animalis B, tento kmen byl po přidáním lysozymu inhibován. Graf III Růst Bifidobacterium bifidum v přítomnosti lysozymu v koncentraci 400 µg/ml Graf IV Růst Bifidobacterium animalis subsp. lactis v přítomnosti lysozymu v koncentraci 400 µg/ml 131

132 Závěr: Z testování bifidobakterií různého původu na schopnost růst v mléce a testování vlivu možných faktorů na růst bifidobakterií lze učinit následující závěry. Kmeny izolovány z kysaných mléčných výrobků (B. animalis ssp. lactis) byly mateřským mlékem inhibovány. Kmen Bifidobacterium bifidum rostl v mateřském mléce nejlépe. B. animalis ssp. lactis je druh citlivý na lysozym a není schopen využívat oligosacharidy mateřského mléka (OMM). Bifidobacterium bifidum je vůči lysozymu rezistentní a dokáže využívat OMM. Kmeny dobře rostoucí v mateřském mléce mohou být použity jako probiotikum pro kojence. Poděkování: Práce byla sponzorována granty GAČR 525/08/H060 a NAZV 1G58097 MZE. Použitá literatura: 1. Benno, Y., Mitsuoka, T Evaluation of the anaerobic method for the analysis of fecal microflora of beagle dogs. The Journal of Veterinary Medical Science, 54, Lönnerdal, B Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. American Journal of Clinique Nutrition, 77, Chipman, D.M., Sharon, N Mechanism of lysozyme action. Science, 165, Vlková, E., Trojanová, I., Rada,V Přežívání bifidobakterií v mléčných výrobcích během záruční doby. Výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2004, VŠCHT Praha, Osserman E. F., Lawlor D. P Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine, 124, Kontaktní adresa: Šárka Ročková, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Česká zemědělská univerzita v Praze Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol; rockova@af.czu.cz 132

133 Plakátová sdělení

134

135 SLEDOVÁNÍ ZMĚNY OBSAHU LAKTÓZY BĚHEM FERMENTACE SYROVÁTKOVÝCH NÁPOJŮ Legarová Veronika, Kouřimská Lenka, Dvořáková Blanka, Gabrielová Alena Katedra kvality zemědělských produktů, FAPPZ, ČZU v Praze Monitoring of fermentation process of cheese whey and mixtures of cheese whey and milk Summary: Bacteria cultures, known as starters, are used in the manufacture of cultured milk products. They are added to the product and allowed to grow there under controlled conditions. In this study the cheese whey was fermented by different thermophillic bacteria starter cultures available from market cultures producer. Acidity changes during the fermentation process were measured by titratable acidity and ph value changes. Changes of lactose content were monitored by MilkoScan FT 120 and by determination of reducing sugars by Luff-Schoorl s method. The lactose changes take place when bacteria ferment lactose to lactic acid. The obtained data were evaluated and the suitability of cultures for fermented whey drinks preparation with regard to content of lactose was discussed. Úvod Sladká syrovátka je vedlejším produktem při výrobě sýrů. Je důležitým zdrojem laktózy, vápníku, mléčných proteinů a rozpustných vitaminů, které způsobují, že tento produkt může být zahrnut mezi funkční potraviny a zdroj plnohodnotných živin 1. Její složení, spolu se složením kyselé syrovátky, která vzniká například při výrobě tvarohů, je uvedeno v tabulce I. Tabulka I Složení syrovátky 2 tekutá syrovátka (% hm) složka sladká kyselá Sušina 6,0 6,5 5,0 6,0 Laktosa 4,5 5,0 3,8 4,3 Mléčná kyselina stopy až 0,8 Tuk 0,05 0,2 0,05 0,2 Čistá bílkovina 0,55 0,55 NPN* 0,18 0,18 Popeloviny 0,5 0,8 * NPN = nebílkovinný dusík (non-protein nitrogen) Původně byla syrovátka nanejvýš koncentrována na prášek a laktóza získávána přímo odpařením a krystalizací. Membránová filtrace poté umožnila produkci syrovátkových koncentrátů a permeátů, které byly využívány pro výrobu laktózy nebo jako krmivo 3. Na začátku 20. století začaly některé závody v Evropě syrovátku sušit na prášek obsahující cca 11 % bílkovin a 72 % laktózy. Problematická však byla kvalita a využitelnost tohoto prášku. Moderní membránové techniky (ultrafiltrace a elektrodialýza) umožnily vyrábět sušenou demineralizovanou syrovátku a koncentrát s % rozpustných bílkovin. Dalšími vhodnými produkty jsou nápoje z fermentované přírodní syrovátky, v nichž je laktóza mléčnými bakteriemi částečně nebo plně hydrolyzována. V posledních 20 letech se značně urychlil vývoj technologií a syrovátková bílkovina se stala nejcennější komponentou syrovátky díky řadě příznivých zdravotních vlivů (od regulace hmotnosti přes regulaci hypertenze po regulaci imunitního systému a absorpci živin) 4. Syrovátka má specifické funkční technologické vlastnosti, takže některé její složky je možné využívat např. k zahušťování nápojů, pro zlepšení struktury masných výrobků a také v pekárenské výrobě, či výrobě zmrzliny a ve farmacii

136 Sušený syrovátkový nápoj je dnes nejpoužívanějším produktem ze syrovátky. Svoje uplatnění našel především jako součást výživy aktivních sportovců, ale dostává se postupně i do povědomí veřejnosti, především jako produkt zdravé výživy 6. Množství syrovátky, které je k disposici pro technologické účely, závisí na výrobě sýrů 7. Produkce sýrů v Evropě byla v roce ,2 mil. t a předpokládá se, že roční nárůst bude činit 2 % 8. Světová produkce sýra dosáhla v r ,2 milionů tun, čemuž odpovídá milionů tun syrovátky 8. Globálně roste produkce sýra a syrovátky o 2 až 3 % ročně. V zemích s rozvinutým mlékárenským průmyslem zpracovávají 50 až 95 % vyprodukované syrovátky. K zemím, které mají ve zpracování syrovátky vedoucí postavení patří Francie, USA a Německo. Kromě sušené syrovátky je nejrozšířenější výroba laktózy, na kterou se využije v Nizozemí 55 % syrovátky, v USA 25 %, v Německu a Itálii 15 %. Výroba bílkovinných koncentrátů je nejvíce rozšířena v Oceánii, kde se na tyto produkty využije 25 % syrovátky, v Dánsku 20 % a v Německu 15 % 9. Laktóza a laktózová intolerance Laktóza se vyskytuje výhradně v mléce savců a je hlavní složkou syrovátky. Má největší podíl na sušině syrovátky, neboť tvoří 70 až 80 % z celkové sušiny 9. Laktóza existuje ve dvou izomerních formách, α-laktóza a β-laktóza 2. Oba izomery se liší prostorovým uspořádáním hydroxylových skupin na C atomu v glukózové molekule a tím také v rozpustnosti, tvaru krystalů, bodu tání a fyziologických účincích 10. β laktóza je hygroskopická a je tedy příčinou hygroskopičnosti sušené syrovátky 11. Laktóza patří do skupiny oligosacharidů; má sladkou chuť, ale její sladivost je oproti sacharóze výrazně nižší (asi 40% sladivosti). Její konzumace vede ke zvýšení hladiny glukózy v krvi; na rozdíl od sacharózy má ale menší kariogenní (kazotvorné) a laxativní (projímavé) účinky 12. Laktóza jako disacharid je tvořena dvěma molekulami monosacharidů, glukózou a galaktózou. Disacharidy musí být v těle rozštěpeny na monosacharidové jednotky, aby mohly být resorbovány z tenkého střeva dále do krve. Ke štěpení laktózy dochází v tenkém střevě, kde je mléčný cukr rozkládán enzymem laktázou 13. Pokud se sníží nebo zcela vymizí produkce tohoto enzymu v kartáčovém lemu tenkého střeva, dochází k deficienci laktázy neboli laktózové intoleranci. Laktózová intolerance není na rozdíl od alergie způsobena reakcí imunitního systému, ale je poruchou metabolickou. Při nedostatku nebo úplné absenci laktázy zůstává mléčný cukr v tenkém střevě částečně nebo zcela nerozštěpen. Osmotickým efektem na sebe pak váže velké množství vody z krevní plazmy, obsah střeva se tím výrazně zvýší. V tlustém střevě rozkládají pak laktózu v trávenině střevní bakterie, za vzniku velkého množství fermentovaných plynů 14. Typickými příznaky laktózové intolerance jsou bolesti břicha, nadýmání, plynatost, křeče, průjmy a zvracení 15. Symptomy se objevují zpravidla půl hodiny po konzumaci laktózy a mohou trvat až tři dny. Doba trvání a intenzita příznaků závisí na množství požité laktózy a na míře deficitu enzymu laktázy. Jelikož je rychlost průchodu tráveniny střevy značně zvýšená, může sekundárně docházet i k snížené digesci a resorpci některých dalších živin 16. Řešením pro osoby s laktózovou intolerancí může být konzumace fermentovaných mléčných výrobků obsahujících živé bakterie mléčného kvašení. Fermentované mléčně výrobky mají také snížený obsah laktózy, čímž se stávají i při nesnášenlivosti laktózy lépe stravitelnými 17. Metodika Sušená syrovátka má využití jako aditivum do mnoha potravinářských výrobků, ale její výroba je energeticky náročná. S rostoucí výrobou sýrů, se rovněž zvyšuje produkce syrovátky, a proto se hledají stále nové možnosti jejího využití. Jednou z možností je výroba syrovátkových nápojů nebo nápojů na bázi směsi sladké syrovátky a mléka. Podstatou práce bylo sledování změn obsahu laktózy v syrovátkových nápojích samotných nebo ve směsi s polotučným mlékem v poměru 25 % mléka a 50 % mléka během fermentace termofilními mlékařskými kulturami. 136

137 Pro přípravu fermentovaných syrovátkových nápojů byly použity stejné suroviny ve shodných poměrech. Hlavní surovinou byla při všech experimentech sušená syrovátka Lactosérum z Jihlavské mlékarny Moravia Lacto a. s. Pro přípravu fermentovaných syrovátkových nápojů a nápojů na bázi směsi syrovátky a mléka byla použita rekombinovaná syrovátka (sušená syrovátka rozmíchaná v teplé pitné vodě, a to vždy 10 g syrovátky ve 100 ml teplé pitné vody) nebo směs rekombinované syrovátky a mléka v poměru 75 % syrovátky a 25 % mléka a 50 % syrovátky a 50 % mléka. Po celou dobu experimentů byl používán stejný typ mléka a to Jihočeské lahodné mléko polotučné, vysokotepelně pasterované od mlékárny Madeta a. s. U všech typů vzorků následovala pasterace při teplotě 78 C po dobu 30 sekund. Na základě konzultací s odborníky z Výzkumného ústavu mlékárenského (VÚM) byly vybrány 4 nejběžnější typy jogurtové kultury a to WV2, J2, RX a KAN IV (Laktoflora, Milcom a.s.). Ve všech případech se jedná o směsné jogurtové kultury, které jsou tvořeny kmeny: Lactobacillus delbrüeckii subsp. Bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Samotná syrovátka a směsi syrovátky a mléka byly za aseptických podmínek očkovány jednotlivými typy kultur (1% zákys) a kultivovány při 43 C po dobu 4 hodin. Doba kultivace je výrobcem (VÚM) doporučena u těchto typů jogurtové kultury 3,5 až 4,5 hodiny. V experimentu byly v přesných hodinových intervalech odebírány vzorky během fermentace a sledovány změny absorbance infračerveného záření a s tím související změny obsahu laktózy pomocí přístroje MilkoScan FT 120 (Foss Analytical A/S, Dánsko, program Improved Milk). Titrační metodou podle Luff-Schoorla byl stanoven celkový obsah redukujících sacharidů. Průběh fermentace byl dále monitorován na základě změn titrační a aktivní kyselost syrovátkových nápojů. Na základě získaných výsledků bylo diskutováno případné doporučení takovýchto fermentovaných syrovátkových nápojů pro osoby trpící laktózovou intolerancí. Výsledky Během fermentace byla sledována aktivní kyselost pomocí ph metru v přesných hodinových intervalech. Z hodnot uvedených v tabulce II je patrné, že vzorky fermentované kulturou KAN IV dosáhly po 4 hodinách fermentace nejnižší hodnoty ph. Vzorky s ostatními typy jogurtové kultury vykazovaly vzájemně podobné hodnoty ph. Tabulka II Změny aktivní kyselosti (ph) během fermentace t [h] 100 % syrovátky KAN IV RX WV2 J2 25 % 50 % 100 % 25 % 50 % 100 % 25 % 50 % 100 % mléka mléka syrovátky mléka mléka syrovátky mléka mléka syrovátky 25 % mléka 0 6,26 6,39 6,41 6,26 6,48 6,5 6,38 6,41 6,43 6,33 6,57 6, ,19 6,37 6,36 6,24 6,37 6,5 6,28 6,28 6,37 6,28 6,43 6,52 1 5,89 6,24 6,14 5,96 6,25 6,3 5,94 6,04 6,30 5,84 6,31 6,36 2 4,74 5,76 6,08 5,85 6,10 6,2 5,87 6,02 6,26 5,80 6,28 6,30 3 4,23 4,48 4,94 5,80 6,01 6,10 5,77 5,95 6,18 5,68 6,15 6,22 50 % mléka 4 3,99 4,31 4,36 5,15 5,68 6,00 5,22 5,32 5,87 4,86 5,34 5,77 t = doba fermentace 0 = hodnota před přídavkem zákysové kultury 0+ = hodnota po přídavku zákysové kultury Obdobné výsledky byly zjištěny i v případě hodnot titrační kyselosti (tabulka III), kde výrazně vyšší hodnoty SH vykazovaly opět vzorky s kulturou KAN IV. Dá se proto usuzovat, že tento typ jogurtové kultury prokysává nejrychleji ze všech čtyř sledovaných kultur. 137

138 Tabulka III Změny titrační kyselosti (v SH) během fermentace t [h] 100 % syrovátky KAN IV RX WV2 J2 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 0 6,71 6,71 8,94 6,26 6,26 8,94 6,15 6,48 6,48 5,98 6,71 6, ,05 7,16 8,05 7,16 7,16 7,16 6,04 7,32 6,93 6,37 6,99 6,82 1 9,17 7,16 8,50 8,05 8,05 7,83 7,16 7,83 7,60 7,27 8,27 7, ,55 11,63 8,94 8,49 8,61 8,27 7,82 8,72 8,94 7,99 8,44 8, ,49 23,25 22,80 9,28 9,17 8,94 8,50 9,84 9,39 10,41 9,61 9, ,06 27,50 30,90 13,86 11,85 10,34 13,19 15,09 11,35 17,27 17,41 12,8 t = doba fermentace 0 = hodnota před přídavkem zákysové kultury 0+ = hodnota po přídavku zákysové kultury Výsledky sledování změn obsahu laktózy během fermentace pomocí přístroje MilkoScan FT 120 jsou uvedeny v tabulce IV. Hodnoty vykazují pouze nepatrný úbytek laktózy bez rozdílu mezi jednotlivými typy jogurtové kultury. Nejnižší hodnoty obsahu laktózy vykazovaly vždy vzorky s přídavkem 50 % mléka bez rozdílu použité kultury. Použití přístroje MilkoScan s programem pro syrové mléko (který je nakalibrován i pro měření laktózy) se v případě sledování změn obsahu laktózy probíhajících při jejím štěpení na glukózu a galaktózu během fermentace nejeví jako optimální. Program není schopen odlišit absorpci infračerveného záření vybraných funkčních skupin laktózy od produktů její první fáze fermentace (glukózy a galaktózy). Řešením by bylo zřejmě použití programu pro analýzu složek fermentovaných mlék, který ale bohužel na laktózu není výrobcem v základní sestavě nakalibrován. Tabulka IV Změny obsahu laktózy (v %) během fermentace zjištěné pomocí přístroje MilkoScan FT 120 t [h] 100 % syrovátky KAN IV RX WV2 J2 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 0 7,37 6,85 6,33 6,91 6,37 5,82 6,99 6,42 5,82 6,98 6,52 5, ,23 6,76 6,31 6,71 6,25 5,72 6,82 6,27 5,72 6,91 6,42 5,86 1 8,11 6,77 6,21 6,83 6,31 5,76 6,90 6,37 5,76 6,94 6,48 5,92 2 7,78 6,86 6,38 6,76 6,28 5,72 6,86 6,30 5,71 6,88 6,43 5,87 3 8,07 6,85 6,15 6,76 6,22 5,68 6,81 6,28 5,70 6,74 6,36 5,85 4 7,16 6,77 6,05 6,60 6,10 5,64 6,69 6,13 5,63 6,62 6,22 5,71 t = doba fermentace 0 = hodnota před přídavkem zákysové kultury 0+ = hodnota po přídavku zákysové kultury Hodnoty změn obsahu redukujících sacharidů zjištěné titrační metodou podle Luff-Schoorla a vyjádřené jako obsah laktózy jsou uvedené v tabulce V. Protože je kromě laktózy touto metodou stanovován i obsah fermentací vzniklých redukujících monosacharidů, neprojeví se při sledování procesu fermentace primární rozklad laktózy na glukózu a galaktózu, ale až jejich následná metabolická přeměna na kyselinu mléčnou. U vzorků, kde byla přidána kultura KAN IV došlo během fermentace k největšímu úbytku redukujících cukrů, a to v průměru o 0,6 %. U vzorků s kulturou RX došlo k úbytku v průměru 138

139 o 0,42 % a u ostatních vzorků byl pokles velice nízký až nepatrný. Obsah redukujících sacharidů byl opět nejnižší u vzorků s přídavkem 50 % mléka. Přepočteme-li, za předpokladu homofermentativní přeměny 1 molekuly laktózy na 4 molekuly mléčné kyseliny, hodnoty největší změny titrační kyselosti u kultury KAN IV (rozdíl 22 SH), vyjde nám, že tato změna odpovídá úbytku 0,47 % laktosy. Tento rozdíl koreluje s hodnotou úbytku redukujících sacharidů, ale je celkově poměrně velmi nízký ta to, abychom mohli tyto výrobky jednoznačně zařadit jako bezproblémové pro lidi trpící laktosovou intolerancí. Nesporným přínosem je ale konzumace kultur, které obsahují enzym laktázu a štěpení laktózy v lidském trávicím traktu napomáhají. Tabulka V Změny obsahu redukujících sacharidů (v %) během fermentace zjištěné metodou Luff-Schoorla KAN IV RX WV2 J2 t [h] 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 50 % mléka 100 % syrovátky 25 % mléka 0 6,80 6,95 5,70 6,62 5,98 5,02 6,43 5,99 5,43 6,69 6,13 5, ,75 6,97 5,65 6,31 5,95 5,01 6,47 6,00 5,47 6,62 5,96 5,62 1 6,53 6,88 5,47 6,30 5,96 5,23 6,45 6,04 5,49 6,62 6,14 5,68 2 6,24 6,38 5,24 6,13 5,91 4,99 6,43 6,00 5,37 6,57 6,03 5,64 3 6,89 6,16 5,26 6,13 5,91 4,74 6,39 5,94 5,43 6,55 6,00 5,60 50 % mléka 4 6,14 6,27 5,24 6,00 5,62 4,74 6,37 5,88 5,42 6,53 6,03 5,56 t = doba fermentace 0 = hodnota před přídavkem zákysové kultury 0+ = hodnota po přídavku zákysové kultury Závěr Cílem práce bylo sledování změn obsahu laktózy během fermentace při použití různého složení výchozí suroviny a různých typů termofilních jogurtových kultur. Byly sledovány kysací křivky vzorků syrovátky a mléka spolu se změnami sacharidů během fermentace pomocí přístroje MilkoScan FT 120 a titrační metodou podle Luff-Schoorla. Ze zjištěných výsledků lze konstatovat, že k největším změnám došlo u kultury KAN IV. Nápoje tohoto typu ale nemohou být jednoznačně doporučeny osobám trpícím laktózovou intolerancí, protože i po 4 hodinové fermentaci zůstává většina laktózy v nápoji nerozštěpena. Poděkování: Výzkum byl podpořen záměrem MŠMT č. MSM Použitá literatura: 1. GONZÁLEZ-MARTÍNEZ, C., BECERRA, M., CHÁFER, M., ALBORS, A., CAROT, J. M., CHIRALT, A. Influence of substituting milk powder for whey powder on yoghurt quality. Trends in Food Science & Technology, 2002, 13(9-10), p BYLUND, G. Dairy processing handbook, 1. vyd., Sweden, Lund: TetraPak, 1995, 436 p. 3. FORMAN, L., MERGL, M. a kol. Syrovátka její využití v lidské výživě a ve výživě hospodářských zvířat. 1. vyd. Praha: Středisko technických informací potravinářského průmyslu Výzkumného ústavu potravinářského průmyslu v Praze, 1979, 343 s. 4. SANDERS, M.E. Overview of Functional Foods: Emphasis on Probiotic Bacteria. International Dairy Journal, 1998, 8(5-6), p SIENKIEWICZ, T., RIEDEL, C. L. Whey and whey utilization. 2. edit. Verlag Th. Mann, Gelsenkirchen-Buer, Germany, 1990, 379 p. ISBN

140 6. WALLACE, A, TERRY, R. E. Handbook of Soil Conditioners - Cheese Whey as a Soil Conditioner, New York, 1998, 596 p. 7. HRUDKOVÁ, A. Čl.: 4378; Vyd.: dostupné z 8. IDF. The Word Dairy Situation Bulletin of the International Dairy Federation Vol. 438, p SUKOVÁ, I., Syrovátka v potravinářství. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 2006, 60 s., ISBN ONWULATA, Ch. I., HUTH, P. J. Whey Processing, Functionality and Health Benefits. Blackwell Publishing and the Institute of Food Technologists, 2008, 400 p. 11. FORMAN, L. a kol. Mlékárenská technologie II. VŠCHT Praha, 1996, 228 s. 12. DAVÍDEK, J., JANÍČEK, G., POKORNÝ, J. Chemie potravin. 1. vyd. Praha: SNTL/ALFA, 1983, 629 s. 13. KLOUDA, P. Základy biochemie. 1. vyd. Nakladatelství Pavel Klouda, 2000, 155 s. ISBN KOLEKTIV AUTORŮ. Lékařská chemie a biochemie. Praha: Avicenum, 1990, 661 s HAMILTON, E., WHITNEY, E. Nutrition, concepts and controversies. Minessota: West publishing company, 1979, 627 p Kontaktní adresa: Ing. Veronika Legarová, Katedra kvality zemědělských produktů, FAPPZ, ČZU v Praze, Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol, legarova@af.czu.cz 140

141 ANALÝZA ROZDÍLŮ MEZI VYBRANÝMI TECHNOLOGICKÝMI UKAZATELI KVALITY MLÉKA U HOLŠTÝNSKÝCH KRAV V KONVENČNÍM A EKOLOGICKÉM CHOVU Sojková Kamila, Hanuš Oto Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín The analysis of the differences between the selected technological parameters of the milk quality in Holstein cattle in the conventional and the ecological system of the breeding Summary: The composition of the milk is influenced by many factors, mainly the system of the feeding. The aim of the paper is the analysis of the differences between the selected technological parameters of the milk quality in Holstein cattle in the conventional and the ecological system of the breeding and compare possible differences between the selected indicators of the technological quality of the milk obtained by the cattle from the convetional and the ecological system of the breeding. To the comparing of the results were used the basic statistical characteristics, the mean values and the standard deviations. Mostly evident differences between both of the systems of the breeding were in the following parameters: alcohol stability (AL), electrical conductivity (VOD), enzymatic coagulation (CAS) and whey volume (SYR). The milk from the ecological breeding had higher values in the parameters AL (0,64 ± 0,1085), SH (8,03 ± 0,9439) and CAS (149 ± 37,35) and lower values in the parametes VOD (3,60 ± 0,3467) and SYR (30 ± 4,707). Úvod Ekologický způsob chovu zvířat a ekologické získávaní mléka způsoby šetrnými k životnímu prostředí má v době patrných změn klimatu čím dál větší význam. 1,3 V současné době je stále málo informací o kvalitě mléka získávaného z ekologického způsobu chovu zvířat. Jeden názor je, že kvalita mléka se ekologickým způsobem chovu nemění. 8 V prvé řadě je důležité zajistit welfare zvířat a neustále zlepšovat jejich zdraví. Ve své práci Sundrum 10 charakterizuje ekologický chov zvířat jako koncept založený na organizačním principu vyváženosti poměrů prodeje výtěžků ke krmivové produkci a chovu skotu stejně jako na souladu ekologických možností stanoviště. Plakolm 4 a Bartussek 2 zmiňují základní body právního rámce ekologického chovu zvířat a mlékařství a tomu odpovídající ekologické ustajovací systémy a budovy pro zvířata a dojnice, včetně technologických systémů zohledňujících přirozené životní nároky zvířat. Pötsch 6 hodnotil důsledky biologického hospodářského způsobu na hodnoty produkce, skladby a struktury zelené hmoty trvalých luk a to z pohledu produkce mléka a nasazení statkových a absence minerálních hnojiv. Analýzu aspektů krmení mléčného skotu v biologicky hospodařících podnicích provedl Steinwidder. 9 Uvedl, že při biologickém způsobu hospodaření jde v průměru o 0,5 MJ NEL/kg sušiny menší koncentraci energie v zelených krmivech, což snižuje dosažitelnou mléčnou užitkovost o 1000 kg za laktaci. Cílem práce je srovnat možné rozdíly mezi vybranými deseti ukazateli technologické kvality mléka (počet somatických buněk PSB; log PSB; alkoholová stabilita AS; titrační kyselost SH; elektrická vodivost mléka VOD; kyselost ph; bod mrznutí mléka BMM; čas koagulace CAS; pevnost sýřeniny PEV; objem syrovátky SYR) získaného v ekologickém chovu při aplikaci pastvy a v konvenčním chovu při aplikaci směsné krmné dávky na bázi konzervovaných krmiv. Materiál a metodika Mléčné vzorky byly odebrány od dojnic holštýnského skotu. Vzorkovalo se v letní sezóně po dva roky. Jednalo se o bazénové vzorky mléka. Čtyři stáda byla zařazena do ekologického režimu, tři stáda byla krmena směsnou krmnou dávkou (TMR) v konvečním režimu. Zvířata z ekologického chovu byla na pastvě, kde složení rostlin bylo následující: Poa pratensis, Dactylis glomerata, Elytrygia repens, Trifolium repens a Taraxacum officinale. Dále byla přikrmována (55 % spotřeby sušiny) směsí TMR: kukuřičná siláž 6 kg; jetelová siláž 5 kg; kukuřičná LKS 2 kg; 141

142 jadrná krmiva 3,5 kg na krávu za den. Zvířata z konvečního chovu byla krmena TMR v následujícím složení: kukuřičná siláž 13 kg; jetelová siláž 9 kg; kukuřičná LKS 5 kg; mláto 3 kg; jadrná krmiva 6 kg na krávu a den. Analýzy vzorků probíhaly pravidelně v ústavní akreditované zkušební laboratoři v Rapotíně. Různé analytické metody byly prováděny podle norem nebo schválených standardních operačních postupů. Pro identifikaci výsledků byly použity následující zkratky: x = aritmetický průměr; sx = směrodatná odchylka; PSB = počet somatický buněk (tis./ml); logaritmus počtu somatických buněk = log PSB; AL = alkoholová stabilita (spotřeba 96% ethanolu při titraci mléka (5 ml) do viditelného vzniku sraženiny v ml); SH = titrační kyselost (ml 2.5 mmol l -1 NaOH roztoku); elektrická vodivost mléka = VOD (ms/cm); kyselost = ph; BMM = bod mrznutí mléka ( C); čas koagulace sýřícím enzymem = CAS (sec.); PEV = pevnost sýřeniny (pevnost sýřeniny = hloubka průniku standardně padajícího tělíska sýřeninou, tzn., že vyjadřuje opačný vztah k pevnosti (mm)); SYR = objem syrovátky (ml; objem syrovátky vypuzené v procesu enzymatického sýření (synerese = vyloučení kapaliny z gelu (sýřeniny), které je způsobeno jeho stažením (kontrakcí)) prostřednictvím smršťujícího se koláče za 60 minut). Ke zpracování výsledků byly použity základní statistické metody. Výsledky a diskuze V tabulce I jsou vyjádřeny průměrné hodnoty a směrodatné odchylky u jednotlivých vybraných ukazatelů technologické kvality mléka u stád krav chovaných konvenčím způsobem. Oproti tomu tabulka II obsahuje průměrné hodnoty a směrodatné odchylky u jednotlivých vybraných ukazatelů technologické kvality mléka u stád krav, které podléhají podmínkám ekologického zemědělství s letní výživou na bázi pastvy. Průměrné hodnoty a směrodatné odchylky u ukazatelů alkoholová stabilita a titrační kyselost (AL = 0,64 ± 0,1085 a SH = 8,03 ± 0,9439) jsou u mléka pocházejícího z ekologického zemědělství podobné jako v pracích Procházka et al. 7 a Kuchtík a Sedláčková 5. Nejvíce patrné rozdíly mezi oběma způsoby chovu jsou v ukazatelích AL, SH, VOD, CAS a SYR. Mléko z ekologicky chovaných stád dosahovalo vyšších hodnot u ukazatelů AL (0,64 ± 0,1085), SH (8,03 ± 0,9439) a CAS (149 ± 37,35) a nižších hodnot u ukazatelů VOD (3,60 ± 0,3467) a SYR (30 ± 4,707). Vykazovalo tak vyšší termostabilitu bílkovin a nižší vodivost, což koresponduje s mírně nižším PSB tamtéž. Ostatní hodnoty technologických ukazatelů se nelišily. Tabulka I Hodnoty technologických ukazatelů v mléce u stád chovaných konvenčně PSB (tis/ml) log PSB AL (ml) SH ( SH) VOD (ms/cm) 142 ph BMM ( C) CAS (sec.) PEV (mm) 1.stádo 214 2,3304 0,60 7,19 4,57 6,60-0, , ,4713 0,50 7,19 4,03 6,64-0, , ,2553 0,30 7,45 4,17 6,88-0, , ,2900 0,30 7,82 4,11 6,71-0, , stádo 231 2,3636 0,60 7,19 4,41 6,60-0, , ,6243 0,70 7,50 4,19 6,68-0, , ,3345 0,27 7,50 4,23 6,85-0, , ,2967 0,38 8,32 3,94 6,67-0, , stádo 364 2,5611 0,80 7,19 4,57 6,62-0, , ,6405 0,40 6,71 4,14 6,68-0, , ,4983 0,27 7,45 4,29 6,90-0, , ,5729 0,29 7,95 4,17 6,69-0, ,8 34 x 287 2,4366 0,45 7,46 4,24 6,71-0, ,8 35 sx 89,52 0,1344 0,18 0,405 0,188 0,102 0, ,1 0,062 1,32 SYR (ml)

143 Tabulka II Hodnoty technologických ukazatelů v mléce u stád chovaných ekologicky PSB (tis/ml) log PSB AL (ml) SH ( SH) VOD (ms/cm) ph BMM ( C) CAS (sec.) PEV (mm) 1.stádo 369 2,5670 0,58 9,79 4,03 6,68-0, , ,0374 0,45 9,07 3,54 6,65-0, , ,3444 0,56 8,67 3,70 6,76-0, , ,3444 0,45 8,51 3,47 6,68-0, , stádo 279 2,4456 0,71 8,95 3,05 6,68-0, , ,8513 0,64 8,71 3,27 6,67-0, , ,4654 0,54 8,75 3,05 6,72-0, , ,1790 0,59 8,63 2,89 6,67-0, , stádo 138 2,1399 0,78 7,55 3,70 6,61-0, , ,3404 0,69 7,83 3,92 6,66-0, , ,5065 0,72 7,19 3,90 6,67-0, , ,3464 0,71 7,31 3,87 6,66-0, , stádo 339 2,5302 0,59 6,51 3,81 6,71-0, , ,5198 0,72 7,39 3,76 6,71-0, , ,5159 0,85 6,75 3,79 6,78-0, , ,3263 0,69 6,83 3,92 6,74-0, ,80 37 x 239 2,3412 0,64 8,03 3,60 6,69-0, ,8 30 sx 86,44 0, ,1085 0,9439 0,3467 0,0422 0, ,35 0,039 4,707 SYR (ml) Závěr V práci jsme se zaměřili na vztahy mezi vybranými technologickými ukazateli kvality mléka u holštýnských krav v konvenčním a ekologickém chovu. Bylo zjištěno, že rozdíly mezi mlékem z ekologického chovu a mlékem z chovu konvečního byly zejména u parametrů AL, SH, VOD, CAS a SYR. U mléka z ekologického chovu byly naměřeny vyšší hodnoty u AL, SH a CAS a nižší hodnoty u VOD a SYR než u mléka pocházejícího z konvečního způsobu chovu. Poděkování Tato práce byla podporována projekty MZe-ČR, NAZV, 1B44036 a MŠMT, MSM a rovněž provedena v rámci aktivit NRL-SM. Použitá literatura: 1. BARTHOLY, J.- PONGRÁCZ, R.: Regional analysis of extreme temperature and precipitation indices for Carpathian Basin from 1946 to Global and Planetary Change, 57, 2007, BARTUSSEK, H.: Haltungssysteme und Stallbau für Rinder im Biobetrieb (Umsetzung der neuen EU- Vorschriften Schwerpunkt Kälber). Bericht BAL Gumpenstein, 27. Viehwirtschaftliche Fachtagung, Bundesanstalt für alpenländische Landwirtschaft Gumpenstein, 2000, BETTS, R. A.- FALLOON, P. D.- GOLDEWIJK, K. K.- RAMANKUTTY, N.: Biophysical effects of land use on climate: Model simulations of radiative forcing and large-scale temperature change. Agricultural and Forest Meteorology, 142, 2007,

144 4. GREIMEL, M.: Wirtschaftlichkeit der Milcherzeugung im biologisch wirtschaftenden Betrieb. Bericht BAL Gumpenstein, 27. Viehwirtschaftliche Fachtagung, Bundesanstalt für alpenländische Landwirtschaft Gumpenstein, 2000, KUCHTÍK, J. SEDLÁČKOVÁ, H.: Composition and properties of milk in White Short haired goats on the third lactation. Czech Journal of Animal Science, 48 (12), 2003, , ISSN PÖTSCH, E. M.: Auswirkung der biologischen Wirtschaftsweise auf pflanzenbauliche Kennwerte im Dauergrünland. Bericht BAL Gumpenstein, 27. Viehwirtschaftliche Fachtagung, Bundesanstalt für alpenländische Landwirtschaft Gumpenstein, 2000, PROCHÁZKA, V. - HANUŠ, O. - JÍLEK, M. - KOPECKÝ, J. - JEDELSKÁ, R.: Kozí mléko z prvovýroby. Zemědělec, 2, 1994, 49, 6, ISSN ROSATI, A.- AUMAITRE, A.: Organic dairy farming in Europe. Liv. Prod. Sci., 90, 2004, STEINWIDDER, A.: Aspekte der Milchviehfütterung im biologisch wirtschaftenden Betrieb. Bericht BAL Gumpenstein, 27. Viehwirtschaftliche Fachtagung, Bundesanstalt für alpenländische Landwirtschaft Gumpenstein, 2000, SUNDRUM, A.: Fütterung und Tiergesundheit im ökologisch wirtschaftenden Betrieb. Bericht BAL Gumpenstein, 31. Viehwirtschaftliche Fachtagung, Bundesanstalt für alpenländische Landwirtschaft Gumpenstein, 2004, Kontaktní adresa: Mgr. Kamila Sojková, Výzkumníků 267, Rapotín,

145 VLIV HODNOTY TEPLOTNĚ-VLHKOSTNÍHO INDEXU (THI) VE STÁJI NA SLOŽENÍ A TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI BAZÉNOVÝCH VZORKŮ MLÉKA Falta Daniel, Skýpala Martin, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtění zvířat, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně The effect of stable temperature-humidity index (THI) on milk content and technological properties in bulk tank milk samples Summary: The aim of the study was to evaluate the effect of stable temperature-humidity index (THI) on milk content and technological properties in bulk tank milk samples. It was analysed 22 week s samples on Univesity farm in Žabčice ( ). Milk originate from Holstein cows with average kg/ lactation. At the same time (in control days) were recorded average daily temperature and average daily relative humidity, subsequently was counted THI by the modified equation (Hahn, 1999). In the pool samples were analysed average values for: fat content (%), protein content (%), density, active acidity (ph), titrable activity (SH), rennet coagulation time (s) and quality of curd (class). It has been found the average daily THI values was in range It means that in particular periods was dairy cows exposured of heat stress (mainly when THI was above 70). We have found higher tendency of occurrence worse curd quality in mentioned periods. In this warmer days was shorter time of rennet coagulation and lower fat content. It was confirmed by correlation coefficient r= -.58 and Others content parameters and technological properties was not affected by THI. Úvod: Skot má arktický fylogenetický původ, proto není kladena na organismus zvířete taková zátěž při nízkých teplotách jako při vysokých. V rozsahu teplot prostředí C se projevuje vzestup teploty na produkci mléka negativně. Vliv tepelného stresu není pouze okamžitý, ale přetrvává u dojnice až do konce laktace [1]. Přestane-li na dojnice působit vysoká teplota a teplotní prostředí je navráceno do teplotního optima (13 16 C), nedojde k úplnému zpětnému zvýšení užitkovosti [2]. Teplotně-vlhkostní index (THI) zahrnuje kombinaci efektu teploty a relativní vlhkosti [3]. KENDALL et al. (2006) [4] používají teplotně vlhkostní index ke stanovení teplotního komfortu, kdy THI > nebo = 72 (odpovídá 25 C a 50% relativní vlhkosti) je obecně považován za horní rozhodující teplotu prostředí pro dojnice, jejímž překročením je způsoben pokles v mléčné užitkovosti. Hodnoty zpřesňují WALTEROVÁ et al. (2009) [5] podle pořadí laktace na hodnotu 69 u dojnic na 2. laktaci a hodnotu 73 u dojnic na vyšší laktaci. Stejně tak CHLÁDEK et al. (2009) [6] zjistili, že na mléčnou užitkovost měl nejvýraznější efekt THI, jeho vliv byl však tvořen převážně teplotou. Syřitelnost představuje základní technologickou vlastnost mléka, která se významnou měrou podílí na kvantitativní a kvalitativní produkci sýrárny. Tuto vlastnost ovlivňují faktory jako: doba srážení (syřitelnost), kvalita sýřeniny, obsah bílkovin, kaseinu, obsah tuku, laktózy, vápníku a hodnota ph [7]. Syřitelnost ovlivňují také další enviromentální faktory, jako je sezónost, stádium laktace a výživa, přičemž tyto rozdíly jsou způsobeny především vlivem změn chemického složení mléka [8][9]. Materiál a metodika: V průběhu 22 týdnů ( ) byly jednou týdně odebrány bazénové vzorky určené k prodeji do mlékárny na Školním zemědělském podniku v Žabčicích, kde je chován holštýnský skot a průměrná užitkovost dosahuje 9500 kg mléka za laktaci. Vzorky představovaly směs ranního a večerního nádoje. Zároveň byly v kontrolní dny zaznamenány průměrné teploty a vlhkosti ve stáji pomocí tří čidel (data loggerů HOBO Rh, Temp) umístěných v kohoutkové výšce krav, ze kterých byl následně vypočítán teplotně-vlhkostní index (THI) dle upravené rovnice [10]. V bazénových vzorcích mléka byly v den odběru stanoveny průměrné hodnoty obsahu tuku (%), obsahu bílkovin (%), hustoty, ph, titrační kyselosti, syřitelnosti (s) a kvality sýřeniny. Syřitelnost byla stanovena pomocí nefelo-turbidimetrického snímače koagulace mléka [11][12], třída sýřeniny 145

146 se hodnotila podle tabulky [13], aktivní kyselost byla měřena ph-metrem CyberScan PC 510 (Eutech Instruments), titrační kyselost byla prováděna dle ČSN čl. 58. Hustota byla stanovena hustoměrem a obsah bílkovin a tuku v mléce pomocí NIR spektrometrie. Pro statistické zpracování a vyhodnocení byly použity programy MS Exell a Statistica 8.0. Výsledky a diskuse: Hodnoty teplotně-vlhkostního indexu (THI) se v námi sledovaném období 22 týdnů pohybovaly od 49,8 do 73,1, z toho v deseti případech se hodnota THI pohybovala nad 70. Průměrné hodnoty zjišťovaných parametrů v bazénových vzorcích uvádí tab. I. Syřitelnost se pohybovala v rozpětí 204 až 318 s. Rozdíl mezi nejlepší a nejhorší syřitelností byl tedy 114 s. Průměrná hodnota syřitelnosti za celé sledované období byla 229,2 s. Kvalita sýřeniny se pohybovala většinou na úrovni 1. třídy kvality. V šesti případech dosahovala úrovně 2. třídy a to zejména v období, kdy index THI převyšoval hodnotu 70. Titrační resp. aktivní kyselost byla průměru 3,7 resp. 6,6. Hustota mléka byla v průměru 1028,6 g/cm 3. Průměrný obsah bílkovin resp. tuku byl zjištěn na úrovni 3,66 % a 3,94 %., přičemž obsah tuku vykazoval druhou nejvyšší variabilitu (16,2 %). Vliv hodnoty THI na obsah tuku v mléce a na syřitelnost mléka je patrný z grafů 1 a 2. Pokud jde o obsah tuku v mléce, tak opačný trend naznačuje, že při vzestupu teploty stájového prostředí (vyjádřené indexem THI) dochází k poklesu obsahu tuku v mléce. Toto tvrzení dokládá i zjištěný korelační koeficient mezi těmito sledovanými parametry (r= -0,46). BURAQUI et al. (2002) [14] uvádějí, že při nárustu THI z 68 na 78 klesá mléčná produkce a snižuje se i procento tuku a bílkovin v mléce. Námi zjištěný výrazný negativní efekt THI a teploty na mléčnou užitkovost dojnic je v souladu s konstatováním většiny autorů zabývajících se tímto problémem, např. [10] [15][16]. Z výsledků dále vyplývá, že se zvyšující se hodnotou THI klesá i doba potřebná ke srážení a mléko se tak sýří lépe. To dokládá i zjištěný korelační koeficient r=-0,58. Pro toto zjištění se nabízí vysvětlení v podobě zvýšené kyselosti mléka v teplejším období roku, ale hodnoty ph a SH to nepotvrzují. Dalším vysvětlením by mohla být změněná syntéza mléka dojnicemi v stresových obdobích, ale tato myšlenka nebyla dosud prozkoumána. Například PŘIBYLA et al. (2008) [17] nalezli statisticky průkazný vliv sledovaného období na syřitelnost mléka. Tabulka I: Průměrné hodnoty zjišťovaných parametrů v bazénových vzorcích mléka během 22 týdnů sledování Průměr Minimum Maximum Sm. odch. Vx (%) Syřitelnost (s) 229, ,74 9,9 Kvalita sýř. (třída) 1,2 1,0 2,0 0,33 27,0 Titrační kyselost (SH) 3,7 3,2 4,1 0,20 5,3 Aktivní kyselost (ph) 6,6 6,35 7,18 0,18 2,7 Hustota (g/cm 3 ) 1028,6 1028,0 1029,5 0,48 0,1 Bílkoviny (%) 3,66 3,11 4,39 0,26 7,1 Tuk (%) 3,94 2,10 4,77 0,64 16,2 146

147 ,5 70 y = 0,0122x 2 0,2633x + 4,857 R 2 = 0, ,5 THI 60 4 % 55 3,5 50 y = 0,1135x 2 + 2,0622x + 60,575 R 2 = 0, , Tuk % THI Polynomický (THI) Polynomický (Tuk %) 2 Graf 1 Vztah mezi hodnotami THI ve stáji a obsahem tuku v mléce THI y = 0,1565x 2 1,3669x + 217,92 R 2 = 0, s y = 0,1135x 2 + 2,0622x + 60,575 R 2 = 0, syřitelnost THI Polynomický (THI) Polynomický (syřitelnost) Graf 2 Vztah mezi hodnotami THI ve stáji a syřitelností mléka Závěr: Hodnoty THI se ve sledovaném období pohybovaly v rozmezí 49,8 73,1, což znamená, že se v určitých časových intervalech, kdy hodnota THI převyšovala 70, dojnice díky nepříznivým podmínkám ve stáji nacházely v tepelném stresu. Nalezli jsme vyšší výskyt horší kvality sýřeniny v tomto období. V teplejších dnech byl rovněž zaznamenán kratší čas doby sýření, který může být deklarován hodnotou koeficientu korelace r = -0,58 a nižší obsah tuku v mléce r = -0,46. Ostatní obsahové parametry a technologické vlastnosti bazénových vzorků mléka nebyly hodnotou THI ovlivněny. 147

148 Poděkování: Příspěvek byl zpracován s podporou Výzkumného záměru č. MSM Biologické a technologické aspekty udržitelnosti řízených ekosystémů a jejich adaptace na změnu klimatu uděleného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky. Použitá literatura: 1. DOLEJŠ, J. et al Limity možností pro omezení tepelného stresu u dojnic, Náš chov, č.7, s TOUFAR, O., DOLEJŠ, J.:. Odraz vlivu extrémních stájových teplot na užitkovost dojnic chovaných v uzavřené stáji. Aktuální otázky bioklimatologie zvířat, 1996, Vydavatelství NOEL 2000 s.r.o., Brno. 3. WEST, J.W.: Effects of Heat-Stress on Production in Dairy Cattle, J. Dairy Sci., 2003, 86: , ISSN KENDALL, P. E., NIELSEN, P. P., WEBSTER, et al.: The effects of providing shade to lactating dairy cows in temperature climate, Livestock Science, 2006, 103: , ISSN WALTEROVÁ, L., ŠAROVSKÁ, L., FALTA, D., CHLÁDEK, G.: Vztah mezi vybranými klimatickými prvky uvnitř a vně stáje dojnic v průběhu roku. Acta univ. agric. et silvic. Mendel Brun., 2009, LVII, No. 4, p , ISSN CHLÁDEK, G., FALTA, D., KOMZÁKOVÁ, I.: Porovnání efektů vybraných mikroklimatických parametrů na mléčnou užitkovost ustájených dojnic. Acta fytotechnica et zootechnica. 2009, sv. 12, č. Mimoriadne číslo, s ISSN X. 7. BUCHBERGER, J., BIECHL, CH., MILLER, M., UTH, M., WILLEKE, H.: Vliv plemene na vhodnost mléka ke zpracování na sýry. Zpravodaj svazu chovatelů a plemené knihy českého strakatého skotu, 2005, č. 1, s. 15, ISSN DAVOLI, R., DALLOLIO, S., RUSSO, V: Effect of k-casein genotype on the coagulation properties of milk. J. Anim. Breed. Genet., 1990, vol. 107, no. 6., s , ISSN TYRISEVA, A.M., VAHLSTEN, T, RUOTTINEN, O. OJALA, M.: Noncoagulation of milk in finnish Ayrshire and Holstein-Friesian cows and effect of herds on milk coagulation ability, J. Dairy Sci., 2004, vol. 87, no. 11, s , ISSN HAHN, G.L.: Dynamic responses of cattle to thermal heat loads. Journal of Animal Science, 1999, ISSN CHLÁDEK, G., ČEJNA, V.: Měření syřitelnosti mléka pomocí nefelo-turbidimetrického snímače. Mléko a sýry vyd. Praha: Česká společnost chemická, 2005, s ISBN PŘIBYLA, L., ČEJNA, V.: Porovnání vizuální a nefelo-turbidimetrické metody pro měření syřitelnosti mléka. Den mléka Praha: ČZU Praha, 2006, s ISBN GAJDŮŠEK, S.: Mlékařství II (cvičení). Brno MZLU, 1999, 92 s. 14. BURAQUI, R., LAHMAR, M., MAJDOUB, A., DJEMALI, M., BELYEA, R.: The relationship of temperature-humidity index with milk production of dairy cows in a Mediterranean climate. Anim. Res., 2002, 51: FALTA, D., WALTEROVÁ, L., SKÝPALA, M., CHLÁDEK, G.: Effect of stable microclimate on milk production of Holstein cows on the 2nd and 3rd lactation. AWETH [online], 2008, ISSN HANUŠ, O., VYLETĚLOVÁ, M., GENČUROVÁ, et al.: Hot stress of Holstein dairy cows as substantial factor of milk composition, Scientia Agriculturae Bohemica, 39, 2008, ISSN PŘIBYLA, L., ČEJNA, V., CHLÁDEK, G.: Variabilita syřitelnosti v bazénových vzorcích kravského mléka. Mléko a sýry 2008, VŠCHT v Praze, 2008, ISBN Kontaktní adresa: Ing. Daniel Falta, Ph.D., Ústav chovu a šlechtění zvířat, AF, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Daniel.Falta@mendelu.cz 148

149 POSOUZENÍ VLIVU VYBRANÝCH TECHNOLOGICKÝCH PARAMETRŮ NA SYŘITELNOST KRAVSKÉHO MLÉKA Skýpala Martin, Přibyla Lubomír, Falta Daniel, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně The effect of chosen milk technological parameters on the rennet coagualtion time of cow milk Summary: Milk coagulation properties are an important aspect in cheese-making production, especially in those countries where dairy industry is based on traditional products and is market-oriented. Milk coagulation properties are influenced by several factors such as age of animals, stage of lactation, composition of ration, season, and breed. The aim of our experiment was evaluated the effect of chosen technological properties (active acidity ph, titratable acidity SH, quality of curd class, milk protein content - %, milk urea content mg/100 ml) on the rennet coagulation time. The object of experiment were milk from cows of Holstein cattle on the first lactation. The samples of milk were devided according to the rennet coagulation time into two groups: group I (better rennet coagulation time; to 200 s; n = 40) and group II (worse rennet coagulation time; above 200s; n = 40). There were found high significant differences (P<0.01) between group I and II in rennet coagulation time (164 s; 244 s), active acidity (ph 6,68; ph 6,78), titratable acidity (7,12 SH; 6,86 SH), quality of curd (1,80 class; 2,48 class). No significant differences were found between group I (better rennet coagulation time) and group II (worse rennet coagulation time) values of the rest parameters. Úvod Syřitelnost mléka vyjadřuje vhodnost syrového mléka pro sýrařské technologie, tzn. vhodnost mléka pro enzymatickou koagulaci. Obvykle není přesně definována prostřednictvím standardů a nejčastěji se jedná o pracovní lokální definice a často i metody [5]. Syřitelnost mléka je ovlivněna několika faktory jako: věk zvířete, stadium laktace, roční období, plemeno [7], obsah celkového kaseinu, vápníku, ph, genetický polymorfismus mléčných bílkovin, krmení [12]. Materiál a metodika K experimentu bylo použito mléko krav holštýnského plemene na 1. laktaci chovaných na ŠZP Žabčice. Krávy byly ustájeny ve stejné stáji a krmeny shodnou krmnou dávkou. Vzorky mléka byly odebírány pomocí zařízení pro odběr vzorků pro kontrolu užitkovosti. Zjišťovala se syřitelnost (s), třída sýřeniny (třída), aktivní kyselost (ph), titrační kyselost (SH), obsah bílkovin (%), močovina (mg/100 ml mléka). Soubor vzorků byl rozdělen do dvou skupin podle syřitelnosti: skupina I (lepší syřitelnost, CS do 200 s.; n = 40), skupina II (horší syřitelnost, CS nad 200 s.; n = 40). Syřitelnost se stanovovala pomocí nefelo-turbidimetrického snímače ([1];[11]), třída sýřeniny se hodnotila podle tabulky ([3];[8]), aktivní kyselost byla měřena ph-metrem CyberScan PC 510 (Eutech Instruments), titrační kyselost byla prováděna dle ČSN čl. 58. Koncentrace močoviny pomocí enzymaticko-konduktometrické metody přístrojem UREAKVANT 2, v laboratoři pro rozbor mléka v Brně-Chrlicích. Výsledky a diskuze Průměrné hodnoty sledovaných ukazatelů ( x), jejich směrodatné odchylky (S x ) a variační koeficienty (V x,% ) jsou uvedeny v tabulce I. Z ní je patrné, že vysoce statisticky průkazně (P<0,01) nižší hodnota syřitelnosti (164 s) byla zjištěna u skupiny I. U skupiny II byla zjištěna hodnota syřitelnosti 244 s. V případě aktivní kyselosti se mléko rychleji sráželo při ph nižším (ph = 6,68) u skupiny I, zatímco u vyšších hodnot syřitelnosti (skupina II) bylo ph vyšší (ph = 6,78). Rozdíl mezi aktivními kyselostmi u obou skupin byl vysoce statisticky průkazný (P<0,01). K obdobným výsledkům došli ve svých pracech [9], [2], [10]. 149

150 Tabulka I Základní statistické charakteristiky sledovaných ukazatelů u jednotlivých skupin Ukazatel x skupina I skupina II S x V x,% x S x V x,% Syřitelnost (s) ,51 12, ,94 11,86 ** Aktivní kyselost (ph) 6,68 0,07 1,04 6,78 0,07 1,09 ** Titrační kyselost (SH) 7,12 0,35 4,95 6,86 0,42 6,14 ** Kvalita sýřeniny (tř.) 1,80 0,90 50,00 2,48 0,63 25,53 ** Bílkoviny (%) 3,45 0,52 15,13 3,36 0,41 12,23 NS Močovina (mg/100 ml) 42,1 7,21 17,14 44,2 12,42 28,11 NS SP - statistická průkaznost, ** - statisticky průkazný vliv (P<0,01), NS - statisticky neprůkazný vliv Naopak titrační kyselost vykazovala vyšší hodnoty v souvislosti s nižší syřitelností u skupiny I (7,12 SH), zatímco nižší hodnota (6,86 SH) byla zaznamenána u skupiny II. Také v tomto případě byl zjištěn vysoce statisticky průkazný rozdíl (P<0,01) u titrační kyselosti mezi oběma sledovanými skupinami. Naše výsledky jsou ve shodě s [4]. S kratší dobou srážení souvisela i lepší kvalita sýřeniny, kdy lepší kvalita (třída =1,80) byla naměřena u skupiny I, zatímco horší kvalitu sýřeniny (třída = 2,48) vykazovaly vzorky mléka u skupiny II. Rozdílné hodnoty kvalit sýřeniny mezi oběma skupinami byly statisticky vysoce průkazné (P<0,01). Námi získané výsledky jsou v souladu s jinými autory ([10]; [7]). Obsah bílkovin (3,45 %) byl zjištěn statisticky neprůkazně vyšší u skupiny I (lepší syřitelnost), v případě skupiny II (horší syřitelnost) byla hodnota obsahu bílkovin 3,36 %. Zjištěné výsledky jsou ve shodě s [7]. Totéž uvádí i [5], který však dodává, že to nemusí být pravidlem. Statisticky neprůkazný rozdíl byl zjištěn i v případě močoviny, kdy vyšší obsah (44,2 mg/100 ml mléka) se vyskytoval u skupiny s horší syřitelností (skupina 2) a nižší hodnotu obsahu močoviny (42,1 mg/100 ml mléka) vykazovalo mléko ve skupině s lepší syřitelností (skupiny I). K podobným závěrům došli ve své práci i [6]. SP Obr. 1 Průměrné hodnoty syřitelnosti u skupin I a II 150

151 Obr. 2 Průměrné hodnoty aktivních kyselostí u skupin I a II Obr. 3 Průměrné hodnoty titračních kyselostí u skupin I a II Obr. 4 Průměrné hodnoty kvality sýřeniny u skupin I a II 151

152 Závěr Syřitelnost mléka vyjadřuje vhodnost syrového mléka pro sýrařské technologie, tzn. vhodnost mléka pro enzymatickou koagulaci. Předmětem našeho experimentu bylo posouzení vlivu vybraných technologických vlastností (aktivní kyselost ph, titrační kyselost SH, kvalita sýřeniny třída, obsah bílkovin - %, obsah močoviny mg/100 ml) na syřitelnost mléka. Objektem sledování byly vzorky mléka krav Holštýnského plemene na I. laktaci. Vzorky mléka byly rozděleny podle syřitelnosti na dvě skupiny: skupina I (lepší syřitelnost; do 200 s; n = 40) a skupina II (horší syřitelnost; nad 200 s; n = 40). Byly nalezeny vysoce statisticky významné rozdíly (P<0,01) mezi skupinami I a II u syřitelnosti mléka (I: 164 s; II: 244 s), aktivní kyselosti (I: ph = 6,68; II: ph = 6,78), titrační kyselosti (I: 7,12 SH; II: 6,86 SH), kvality sýřeniny (I: třída 1,80; II: třída 2,48). Statisticky neprůkazné rozdíly byly nalezeny u obsahu bílkovin (I: 3,45 %; II: 3,36 %) a u obsahu močoviny (I: 42,1 mg/100 ml mléka; II: 44,2 mg/100 ml mléka). Použitá literatura: 1. ČEJNA, V., CHLÁDEK, G. (2005): A coagulation time of individual milk samples and its relationship with a number and phase of lactation in Holstein cows. [in Czech] Sborník: Mléko a sýry. 1. vyd. Praha: Česká společnost chemická, s ESTEVES, C.L.C., LUCEY, J.A., WANG, T., PIRES, E.M.V. (2003): Effect of ph on the gelation properties of skim milk gels made from plants coagulants and chymosin. J. Dairy Sci., 86: GAJDUŠEK, S. (1999): Mlékařství II (cvičení). Brno: MZLU, 92 s. 4. GAJDŮŠEK, S. (2000): Faktory ovlivňující výtěžnost sýrů. Syrotech 2000: Syrarstvo v treťom tisícročí. Žilina., s HANUŠ, O., JANŮ, L., VYLETĚLOVÁ, M., MACEK, A. (2004): Vliv faktorů prvovýroby jako genotypu dojnice, krmení a bakteriální a mykotoxinové kontaminace mléka na jeho technologické ukazatele typu obsah volných mastných kyselin, kysací schopnosti a syřitelnosti. Sborník: Aktuální problémy řízení v chovu skotu, Rapotín, s CHLÁDEK, G., ČEJNA, V. (2005): Vliv obsahu močoviny na chemicko-technologické ukazatele mléka holštýnských dojnic. Sborník Den mléka 2005, ČZU Praha, s , 7. JÕUDU, I., HENNO, M., KAART, T., PŰSSA, T, KÄRT O. (2008): The effect of milk protein contents on the rennet coagulation properties of milk from individual dairy cows. International Dairy Journal, 18: KUCHTÍK, J., ŠUSTOVÁ, K., URBAN, T., ZAPLETAL, D. (2008): Effect of the stage of lactation on milk composition, its properties and the quality of rennet curdling in East Friesian ewes. Czech J. Anim. Sci., 53(2): NÁJERA, A.I., DE RENOBALES, M., BARRON, L.J.R. (2003): Effects of ph, temperature, CaCl 2, and enzyme concentrations on the rennet-clotting properties of milk: a multifactorial study. Food chemistry, 80: OKIGBO, L.M., RICHARDSON, G.H., BROWN, R.J., ERNSTROM, C.A. (1985): Variation in coagulation properties of milk from individual cows. J. Dairy Sci., 68: PŘIBYLA, L., ČEJNA, V. (2006): Porovnání vizuální a nefelo turbidimetrické metody pro měření syřitelnosti mléka. In. Den mléka 2006, Praha: ČZU, s WEDHOLM, A., LARSEN, L.B., LINDMARK-MÅNSSON, H., KARLSSON, A.H., ANDRÉN, A. (2006): Effect of Protein Composition on the cheese-making properties of milk from individual dairy cows. J. Dairy Sci., 89: Poděkování Příspěvek byl zpracován s podporou Výzkumného záměru č. MSM Biologické a technologické aspekty udržitelnosti řízených ekosystémů a jejich adaptace na změnu klimatu uděleného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky. Kontaktní adresa MSkypala@seznam.cz, LPribyla@seznam.cz, Falta.Daniel@seznam.cz, chladek@mendelu.cz 152

153 VLIV STÁDIA LAKTACE A SKLADOVÁNÍ NA SYŘITELNOST KOZÍHO MLÉKA Šustová Květoslava, Konečná Hana, Krupková Daniela, Ferencová Jana Mendelova univerzita v Brně, Ústav technologie potravin The effect of lactation and storage period for renneting of goat milk Summary: The work deals with effect of storage temperature after draw goaty milk on renneting, quality of curd, it's weight, dry matter of goaty cheese and observing changes in composition of chosen parameters of fresh goaty milk during a period. The goal of this work was to review the impact of cooling and freezing of fresh goaty milk, milk stored with temperature lower than 4 C, milk stored at the level of 18 C for two weeks. These meassurements was made with samples immediately after tempering on 37 C than consequently fall of to 20 C and with samples which incubated for 1 an hour at 37 C and consequently fall of to 20 C. Eight samples of goaty milk was observed at the beginning and at the ending of lactational period. It was statistically detected, that the milk storage temperature didn t have conclusive effect on tracked characteristics. 1. Úvod Při výrobě sýru se klade veliký důraz na mikrobiologickou čistotu mléka, kysací schopnost a syřitelnost (Gajdůšek, 2002). Syřitelnost, tedy schopnost mléka srážet se syřidlem a tvořit sýřeninu požadovaných vlastností, je ovlivnitelná více faktory, např. obsahem vápníku, obsahem kaseinu, hodnotou ph, nevhodnou výživou a metabolickými poruchami. Důležitými faktory ovlivňující syřitelnost jsou také doba laktace, kdy mléko na počátku a na konci je méně vhodné na výrobu sýrů, a teplotou skladování mléka po nadojení, kdy při teplotě 4 C dochází ke změnám zastoupení jednotlivých forem Ca a P, zvýší se ph a prodlužuje se doba potřebná ke sražení mléka syřidlem a naopak snižuje výtěžnost (Gajdůšek, 2003). Cílem této práce bylo sledování vlivů způsobu skladování mléka na jeho technologické vlastnosti. 2. Materiál a metodika Pro analýzu bylo v období od října 2007 do května 2008 odebráno 8 vzorků syrového kozího mléka získaných od plemene Bílá krátkosrstá koza, ze soukromé farmy nedaleko Brna. Vzorky byly uskladněny následovně: - Čerstvé mléko, temperované na 20 C ± 1 C a ihned analyzované - Mléko zchlazené na 2,5 C ± 0,5 C temperované na 37 C a ihned analyzované při 20 C - mléko zchlazené na 2,5 C ± 0,5 C, temperované při 37 C po dobu 1 hod ve vodní lázni, analyzované při 20 C ± 1 C, - mléko zmrazené na -18 C ± 1 C po dobu 2 týdnů, následně rozmrazené, temperované na 37 C a ihned analyzované při 20 C ± 1 C, - mléko zmrazené na -18 C ± 1 C po dobu 2 týdnů, následně rozmrazené, temperované při 37 C po dobu 1 hod ve vodní lázni a analyzované při 20 C ± 1 C. Referenčními metodami byly na Ústavu technologie potravin MZLU v Brně stanoveny ukazatele u mléka: sušina, ph, titrační kyselost, tuk, bílkoviny, N-test; u sýřeniny sýřitelnost, jakost sýřeniny, její hmotnost a sušina. U každého skladovaného vzorku bylo sledováno: syřitelnost - schopnost mléka srážet se syřidlem, určená jako doba (s), za kterou dojde k vytvoření prvních vloček sýřeniny působením syřidla přidaného k mléku ve vodní lázni při 35 C. Bylo použito syřidlo Optimo v množství 1 ml 0,5 % syřidla/100 ml mléka (Gajdůšek, 1999), kvalita sýřeniny se posuzovala po inkubaci zasýřeného mléka v termostatu při 35 C po dobu 1 hod a následným vyklopení sýřeniny na Petriho misku. 153

154 hmotnost sýřeniny (g) byla stanovená po 1 minutě odkapávání syrovátky, sušina sýřeniny (%) byla stanovená referenční metodou vysušením 3 g sýřeniny v sušárně Binder při 102 C do konstantní hmotnosti (Gajdůšek, 1999). 3. Výsledky a diskuze Sýřitelnost mléka Ve sledovaném období laktace byla syřitelnost čerstvého mléka nejvyšší v prosinci (230 s), naproti tomu na začátku laktace (v dubnu) se mléko zasýřilo v nejkratší době (110 s). S postupující sezónou zaznamenal srovnatelné výsledky také Kološta (2005), kdy docházelo k prodloužení času srážení mléka, avšak na začátku sezóny zjistil ještě vyšší syřitelnost (delší čas potřebný na srážení mléka) než na jejím konci. Hodnoty syřitelnosti kozího mléka během zpracování uvádíme v tabulce I. Tab I Syřitelnost kozího mléka během zpracování syřitenost syřitelnost zchlazeného mléka (s) datum čerstvého mléka (s) ihned analyzované temperované při 37 C 1 hod syřitelnost zmrazeného mléka (s) ihned analyzované temperované při 37 C 1 hod , , , Průměr 170,6 176,9 170,1 196,2 188,4 Min Max Průměrná syřitelnost čerstvého mléka byla 170,67 s. Mírný nárůst syřitelnosti se projevil u zchlazeného ihned analyzovaného mléka (176,93 s), přičemž u vzorku zchlazeného mléka po temperaci se syřitelnost snížila na 170,12 s. Podobný avšak víc výrazný průběh byl zaznamenán u mléka zmrazeného. Syřitelnost zmrazeného ihned analyzovaného mléka byla výrazně horší (196,2 s) a po inkubaci se též zlepšila (188,37 s). Kvalita sýřeniny Průměrná hodnota kvality sýřeniny čerstvého mléka měla hodnotu 2,93, tedy sýřenina byla převážně měkká, částečně se rozpadala a syrovátka byla mírně zakalená. Koncem zpracovatelské sezóny (listopad - prosinec) měla sýřenina lepší kvalitu (hodnota 2), byla sice méně pevná, ale udržela si tvar. Naopak začátkem sezóny (duben - květen) jsme pozorovali zhoršení kvality sýřeniny, byla velmi nesoudržná, což odpovídalo hodnotě 4. Srovnatelné výsledky ve své práci zaznamenala Boháčová (2005). Začátkem sezóny (květen) pozorovala horší kvalitu sýřeniny (hodnota 3,5) a koncem sezóny (listopad) její zlepšení až na úroveň 2. Ve středu laktace (červen - září) byla kvalita převážně vyrovnaná (hodnoty 2,3). V tabulce II uvádíme hodnoty kvality sýřeniny v průběhu zpracování. Průměrná kvalita sýřeniny u čerstvého mléka byla 2,937 (sýřenina byla nejjakostnější), mírné zhoršení se projevilo u 154

155 zchlazeného i zmrazeného mléka. Nejhorší kvalita se projevila u zchlazeného mléka (3,437), které nemělo možnost se po zchlazení regenerovat a kasein se sice vyvločkoval, ale sýřenina byla nekvalitní. Podobně se u zmrazeného mléka zjistila lepší průměrná kvalita sýřeniny u temperovaných vzorků (kvalita 3,125) než u ihned analyzovaných (kvalita 3,250). Tab II Kvalita sýřeniny kozího mléka během zpracování kvalita sýřeniny kvalita sýř. zchlazeného mléka datum čerstvého mléka ihned analyzované temperované při 37 C 1 hod kvalita sýřeniny zmrazeného mléka ihned analyzované temperované při 37 C 1 hod ,5 2, ,5 2 1, ,5 2,5 4 2,5 2, , , , ,5 Průměr 2,9 3,4 3,25 3,25 3,125 Min. 2 2,5 2,5 2 1,5 Max Tab III Hmotnost sýřeniny kozího mléka během zpracování hmotnost sýřeniny hmot. sýř. zchlazeného mléka (g) datum čerstvého mléka (g) ihned analyzované temperované při 37 C 1 hod hmotnost sýřeniny zmrazeného mléka (g) temperované ihned při 37 C analyzované 1 hod ,56 15,72 15,67 30,92 29, ,05 30,55 29,43 29,83 27, ,73 32,17 30,52 33,41 29, ,90 36,51 30,18 37,78 35, ,36 30,60 29,99 30,03 38, ,43 33,03 37,01 37,09 37, ,45 35,97 43,48 30,72 35, ,94 30,85 36,86 30,03 38,63 Průměr 31,68 30,67 31,64 32,47 34,04 Min. 21,56 15,72 15,67 29,83 27,05 Max. 36,73 36,51 43,48 37,78 38,63 Hmotnost sýřeniny V tabulce III uvádíme hodnoty hmotnosti sýřeniny během zpracování. Průměrná hmotnost sýřeniny u čerstvého mléka byla 31,68 g. U zchlazeného ihned analyzovaného mléka nastalo mírné zhoršení průměrné hmotnosti (30,67 g) a následovně mírné zhoršení vzorků inkubovaných po zchlazení (31,64 g). Podobně se u zmrazeného mléka zjistila vyšší průměrná hmotnost sýřeniny 155

156 u temperovaných vzorků (34,04 g), než u ihned analyzovaných vzorků mléka (32,47 g). Ze zmrazeného temperovaného mléka byla získaná sýřenina s nejvyšší průměrnou hmotností (34,04 g). Naproti tomu nejnižší průměrná hmotnost sýřeniny ze sledovaných vzorků mlék byla u mléka zchlazeného bez temperace ve vodní lázní. Temperované mléko vykazuje nejlepší výsledky této vlastnosti, než mléko netemperované, což má dopad na ekonomiku výroby. Nejnižší hmotnosti sýřeniny byly naměřené u zchlazených mlék 15,72 g a 15,67 g v říjnu, což bylo způsobené chybou v měření. Sušina sýřeniny Obsah sušiny sýřeniny během zpracování (tab. IV) byl nejvyšší u čerstvého mléka průměrně 21,90 %, což bylo ovlivněné chybou měření. U vzorku zchlazeného mléka vykazovalo nižší průměrný obsah sušiny sýřeniny temperované (20,37 %) než ihned analyzované mléko (20,55 %). Podobný trend poklesu ale výraznější, jsme sledovali i u zmrazených mlék. U mléka zmrazeného temperovaného byl průměrný obsah sušiny sýřeniny nižší (19,44 %) než u ihned analyzovaných vzorků (20,80 %). Tab IV Sušina sýřeniny kozího mléka během zpracování datum sušina sýřeniny sušina sýřeniny sušina sýř. zchlazeného mléka (%) zmrazeného mléka (%) čerstvého ihned inkubované ihned inkubované mléka (%) analyzované 1 hod analyzované 1 hod ,47 23,91 23,16 24,46 18, ,48 19,42 19,03 19,95 18, ,72 23,10 22,15 22,47 23, ,10 19,39 20,86 19,63 19, ,17 22,66 21,12 20,03 18, ,99 17,20 16,03 18,56 18, ,31 20,67 19,83 21,93 20, ,99 18,05 20,76 19,40 18,39 Priemer 21,90 20,55 20,37 20,80 19,44 Min. 18,99 17,20 16,03 18,56 18,45 Max. 21,10 23,11 22,15 22,47 23,26 4. Závěr Syřitelnost mléka byla nejdelší v prosinci (230 s) a nejkratší na začátku laktace (120 s). Kvalita sýřeniny byla hodnocena po celé sledované období jako převážně měkká, částečně rozpadavá, syrovátka mírně zakalená. Na začátku laktace (březen duben) byla kvalita sýřeniny velmi špatná, nebyla soudržná. Koncem laktace (říjen listopad) vykazovala sýřenina lepší kvalitu, udržela si tvar. Titrační kyselost (SH) čerstvého mléka měla stoupající charakter. Průměrná kyselost po nadojení byla 6,5 SH. V říjnu a listopadu bylo naměřeno průměrné SH 7,9, což souviselo i se zvýšeným obsahem bílkovin v mléce. Práce se dále zabývala sledováním vlivu chlazení a zmrazování kozího mléka na syřitelnost, kvalitu sýřeniny a výtěžnost. Sledované ukazatele byly hodnoceny u mléka čerstvého, a dále u mléka skladovaného jednak zchlazením na 2 až 3 C a dále zmrazeného na 18 C. Syřitelnost zchlazeného mléka byla mírně horší (176,9 s), při zmrazení se syřitelnost výrazně zhoršila (196,2 s). Zahřátím vzorku na 37 C po dobu 1 hodiny se opět syřitelnost zlepšila, a to u mléka skladovaného chlazením na 170,1 s a u zmrazeného mléka na 188,4 s. Při posuzovaní kvality sýřeniny u mléka skladovaného byla zjištěna nejhorší sýřenina u mléka chlazeného na nízké teploty. Nejlepší kvalitu sýřeniny vykazovaly vzorky mléka uchovávané zamražením a následně ponechané 156

157 1 hod. při teplotě 35 C. Kyselost mléka po zchlazení a také po zamražení mírně poklesla. U mléka skladovaného chlazením bylo naměřeno průměrné SH 5,9 a u mléka skladovaného zamražením 5,8 SH. Vyhodnocení výsledků jednotlivých parametrů párovým t-testem nedokázalo průkazné rozdíly v středních hodnotách, tzn., že způsob skladování zchlazením ani zmrazením na ně nemá velký vliv. 5. Použitá literatura: 1. BOHÁČOVÁ, K. Hodnocení kvality sýrů vyráběných z kozího mléka s. MZLU. Vedoucí diplomové práce Šustová K. 2. FERENCOVÁ, J. Hodnotenie kvality kozích syrov s. MZLU. Vedoucí diplomové práce Šustová K. 3. GAJDŮŠEK, S. Mlékařství II. 2. vyd. Brno: MZLU, s. ISBN GAJDŮŠEK, S. Laktologie. 1. vyd. Brno: MZLU, s. ISBN KOLOŠTA, M. et al., Kvalita surového kozieho mlieka na farme. Mliekarstvo. 2006, č. 4, s Poděkování: Příspěvek byl zpracován s podporou projektu MŠMT NPV II 2B Kontaktní adresa: doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D., Mendelova univerzita v Brně, agronomická fakulta, ústav technologie potravin, Zemědělská 1, Brno, kvetoslava.sustova@mendelu.cz Ing. Hana Konečná, Mendelova univerzita v Brně, agronomická fakulta, ústav technologie potravin, Zemědělská 1, Brno, xkonec13@mendelu.cz. Ing. Daniela Krupková, Mendelova univerzita v Brně, agronomická fakulta, ústav technologie potravin, Zemědělská 1, Brno, xkrupkov@mendelu.cz. 157

158 EFEKTÍVNE VYUŽITIE KRMÍV NA VÝROBU MLIEKA AKO SUROVINY PRE PRODUKCIU KVALITNÝCH SYROV Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína, Sudzinová Janka Centrum výskumu živočíšnej výroby Nitra Effective utilisation of food for production of milk as a raw material for quality cheese production Summary: For the realization of effective intensification of milk production is very important to realize the optimal nutrition with high quality feed components. It means: 1, to know the nutrients demands of milk cows 2, to know the real nutrition value and the quality state of feed 3, to prepare the sufficient amount of feed in desired structure and to utilize it rationally 4, to choose the suitable system and technique of feeding. The unreplaceable part of feed ratio is the rough feed with minimum 35 % of neutrogetergent fibre (cellulose, hemicellulose and lignine) as a source of energy, minerals protein and vitamins, which can cover the nutrition for 36 l milk production via the microbial fermentation in rumen. Výživa vysokoprodukčných dojníc : Zabezpečovanie racionálnej výživy ľudí kladie zvýšené nároky na dosahovanie dobrej kvantitatívnej, ale najmä kvalitatívnej úrovne produktov živočíšnej výroby. Na kvalitu mlieka sú rôzne kritériá, čo závisí od jeho použitia. Ak zameriame pozornosť na problematiku výživy dojníc a efektívnej produkcie mlieka, je nevyhnutné poznať uvažovať aj o ďalších parametroch chovu, ktoré sa výživy síce priamo netýkajú, ale s výživou súvisia. Dôležitý je predovšetkým okruh krmivo príprava krmiva živiny zviera (jeho reakcia) produkcia (reprodukcia, zdravie). Žiadna dojnica na svete sa nikdy nezaujímala o to, či je kŕmená podľa amerických alebo európskych noriem. Jej organizmus a metabolizmus však reaguje veľmi citlivo na to, či sú jej potreby skutočne naplnené na dostatočnú úroveň. Praktická výživa musí preto obsahovať : o hodnotenie jednotlivých parametrov chovu, o výklad súvislostí medzi danými parametrami, o návrh výživárskych postupov. 1. Údaje, ktoré je možné zistiť v kancelárii: a) Súčasná úžitkovosť porovnanie úžitkovosti minulej a nájdenie priestoru pre zvýšenie úžitkovosti. b) Maximálny nádoj je prvý ukazovateľ súčasnej úžitkovosti. Pokiaľ je problém s výživou postihne pokles úžitkovosti najčastejšie dojnice v maximálnej laktácii. c) Zlepšenie mlieka pre nepriame hodnotenie metabolického stavu. Mať dôveryhodné podklady. d) Obsah močoviny a bielkovín v mlieku príčina zmeny je stav bachorovej fermentácie, nesplnený pomer energie a N-látok. e) Obsah tuku v mlieku úroveň bachorovej fermentácie. f) Reprodukcia. g) Zdravotný stav končatín, paznechtov. 2. Informácie zistené v maštali : 1. kondícia, 2. stav výkalov, 3. úroveň ošetrenia paznechtov, 4. úroveň pohody dojníc, 5. prežúvanie, 6. kontrola krmiva v žľabe, 7. chovanie dojníc. 158

159 3. Informácie zo skladu krmív a) kontrola pracovných postupov výroby krmív, b) kontrola kvality krmív. Základom sú preto informácie o vlastnom stáde, pričom je rozhodujúce aké percento sú náklady na krmivo z tržieb za mlieko. Prvým a základným krokom k ekonomicky efektívnemu kŕmeniu dojníc je výroba kvalitných objemových krmív z vlastných zdrojov vo vhodnej štruktúre a čo najväčšia nezávislosť v jadrových krmivách, ktoré spolu s minerálnymi a vitamínovými doplnkami slúžia k doplneniu živinového obsahu v objemových krmivách a zvyčajne sa pripravujú ako zmes krmív. Objemové krmivá sú charakteristické svojou objemnosťou, ktorá je tvorená a podmienená vlákninou (obsah 35 a viac % neutrálne detergentnej vlákniny (NDV) v 1 kg sušiny. NDV vo všeobecnom ponímaní predstavujú bunkové steny, presnejšie je to podiel sacharidov, ktoré tvoria bunkovú stenu (celulóza, hemicelulóza a lignín). NDV je jednoduchý a súčasne aj základný a najvýpovednejší parameter kvality objemových krmív. Tabuľka I Vplyv úrovne stráviteľnosti NDV na produkciu dojníc v prvej polovici laktácie (kg/deň) Stráviteľnosť NDV 45 % 50 % 55 % Príjem sušiny 20,48 22,06 23,30 Príjem NDV 8,50 8,63 9,81 Produkcia mlieka 31,92 33,23 33,41 lit. zdroj : Hoffman a Bauman, 2003 Tabuľka II Vplyv stráviteľnosti NDV na produkciu mlieka v rámci jedného druhu objemových krmív Stráviteľnosť NDV vysoká nízka príjem sušiny kg/deň 20,5 19,9 produkcia mlieka kg/deň 28,5 27,4 4 % FCM % 26,3 25,1 tuk % 3,49 3,48 bielkoviny % 3,13 3,15 laktóza % 4,93 4,91 zviera živ. hmot. kg/deň 0,15 6,10 ph bachora 6,17 6,28 lit. zdroj : Oba a Allen, 1999 Objemové krmivá, ktoré sú nenahraditeľnou a základnou zložkou výživy prežúvavcov, zásadne ovplyvňujú : o funkčnosť a výkonnosť tráviaceho systému prežúvavca, o zdravie, o ekonomickú efektívnosť výroby. Sú dôležitým zdrojom energie (v OK uložená vo forme vlákniny), bielkovín, ML, vitamínov. Systém predžalúdkov a mechanizmus trávenia objemových krmív u prežúvavcov je charakteristický tým, že má: schopnosť prijať naraz pomerne veľké množstvo krmiva systém prežúvania a sprístupnenie živín objemových krmív hlavne pre mikroorganizmy 159

160 mikrobiálne osídlenie a fermentácia v predžalúdkoch žijú mikroorganizmy, ktoré sa veľmi aktívne podieľajú na spracovaní a trávení najmä objemových krmív a ich metabolity, ale aj ich vlastné telá sú hodnotnou potravou pre prežúvavce. V bachore prežúvavcov dochádza k veľmi intenzívnej mikrobiálnej činnosti, ktorá umožňuje využívanie krmív s vysokým obsahom vlákniny. Mikroflóru bachora tvoria baktérie, protozoá a kvasinky. Výsledkom bakteriálnej činnosti bachorovej fermentácie sú mikrobiálne bielkoviny, pričom ich množstvo je veľmi rozdielne a úzko súvisí s priebehom fermentačných procesov a najmä s premenou sacharidov v predžalúdku na monosacharidy a po následnom kvasení až na CO2, CH4 a UMK (octová, propiónová a maslová). Mikrobiálne bielkoviny sa vyznačujú relatívne vysokou nutričnou hodnotou a vysokou stráviteľnosťou, ktorá sa pohybuje medzi % a je stála. Aminokyselinový profil mikrobiálnych bielkovín je blízky požiadavkám dojníc, nakoľko majú stálu skladbu aminokyselín veľmi blízku kazeínu, t.j. mliečnej bielkovine. Keď vyjadríme aminokyselinovú skladbu mlieka číslom 100, potom mikrobiálna bielkovina dosahuje až 82 % tejto hodnoty. K tomu sa približuje sója, ktorá dosahuje %. Z mikrobiálnych bielkovín syntetizovaných v bachore pochádza najväčší podiel aminokyselín absorbovaných v tenkom čreve, pričom intenzita bachorovej syntézy mikrobiálnych bielkovín závisí od skladby kŕmnej dávky. Vybilancovanie aminokyselín pri tvorbe kŕmnych dávok zvyšuje syntézu mliečnych bielkovín, ktoré majú spolu s obsahom tuku a zárodkov v mlieku rozhodujúci význam pre výrobu syrov. Pokiaľ budeme naozaj úspešní chovatelia bachorovej mikroflóry môžeme pomocou mikrobiálnych bielkovín dosiahnuť u vysokoprodukčných dojníc úžitkovosť až 36 litrov prostredníctvom tohto zdroja bielkovín. Tento zdroj bielkovín je tak dokonalý, že k jeho prevodu je potrebná minimálna potreba energie. Pritom náklady na výrobu mikrobiálnych bielkovín sú relatívne najnižšie, mikrobiálne bielkoviny vznikajú hlavne z objemových krmív. Teda záver správna výživa mikroflóry je znakom úspešných chovateľov dojníc. Záver Súčasná doba a podmienky v sektore výroby a produkcie mlieka sa nachádzajú v polohe, kedy si väčšina chovateľov myslí, že je nepoužiteľná. Objemové krmivá sú rozhodujúce k efektívnej výžive dojníc a pre rentabilnú výrobu mlieka. Naše praktické poznatky a skúsenosti z poradenstva ukazujú že ½ až 2/3 KD pre dojnice nespĺňajú požiadavky na vysokú produkciu mlieka. Je to závažné tvrdenie, ktoré sa nedá vykompenzovať nákupom komponentov, ale komplexným pohľadom a systematickou prácou v chovoch ako aj stabilným a odborne kompetentným riadiacim tímom. Kontaktná adresa: Ing. Vladimír Foltys, PhD. Centrum výskumu živočíšnej výroby Nitra Hlohovecká 2, Lužianky, Nitra, SR, foltys@cvzv.sk 160

161 NOVÉ TRENDY V DETEKCII FALŠOVANIA MLIEKA A SYROV Zeleňáková Lucia, Golian Jozef, Zajác Peter Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre New trends in detection of milk and cheese adulteration Summary The goal of our work was to assess the current situation in counterfeiting of the sheep milk and sheep milk products from Slovakia as well as from some countries in the EU. We evaluated the achievements according to the requirements of the valid legal standards. In the years , we realized laboratory analysis aimed to monitor the counterfeiting of sheep milk and its products. We collected samples of the sheep's milk, cheese and sheep cheese (70 samples together) during that period from producers and processors of the milk from various regions of Slovakia, as well as from a trade network in Slovakia and selected countries of the EU. We used PCR for detection. From the total number (20) of the analyzed sheep's milk samples, cow's milk occurrence was detected in 8 samples. From the 30 samples of sheep cheese 12 samples contained a mixture of the cow's milk. The exception was samples of sheep cheese, such as traditional dairy products, which are composed of several kinds of milk (min 50 % sheep's milk, which is declared on the label. We used PCR, so the exact quantities could not be detected. Úvod a prehľad literatúry Kvalita mlieka ako suroviny je veľmi široký pojem, ktorý v sebe zahŕňa súbor výživových, zdravotných, zoohygienických, technologických, ekonomických i estetických požiadaviek. Mlieko a mliečne výrobky zaujímajú v správnej výžive ústredné postavenie vďaka typickým senzorickým vlastnostiam, originálnemu a vyváženému zloženiu, či širokému spektru esenciálnych zložiek, ktoré sú nevyhnutné z hľadiska správnej a preventívnej výživy. Mlieko sa stáva vďačnou surovinou aj pre ďalšie technologické spracovanie, pričom kvalita zohráva aj v tomto prípade podstatnú úlohu (21). Bielkoviny ovčieho mlieka a výrobkov z neho sa vyznačujú vysokou biologickou hodnotou a ich obsah a zloženie sú považované za hlavné faktory determinujúce výťažnosť syrov a kvalitu konečných výrobkov (3). Ovčie mlieko má v porovnaní s kravským mliekom približne o % vyšší obsah bielkovín, z ktorých kazeín tvorí 80 až 85 % Pri analýze tuku v kravskom a ovčom mlieku potvrdili viacerí autori bohatšie zastúpenie mastných kyselín v ovčom mlieku, čo mu dáva osobitné vlastnosti, prejavujúce sa najmä charakteristickou chuťou a vôňou ovčích syrov (12). Základnou technologickou vlastnosťou mlieka je jeho syriteľnosť. Dobrá syriteľnosť mlieka závisí na jeho neporušenom zložení, na obsahu kazeínových bielkovín, ich zložení a genetickom type, na obsahu minerálnych látok a na prirodzenom ph mlieka, ktoré s týmito faktormi súvisia (13). Dôvody na falšovanie ovčieho mlieka Množstvo mlieka u oviec sa mení počas dňa, v priebehu laktácie i s poradím laktácie. Na produkciu mlieka vplýva plemeno, rodičia, početnosť vrhu, výživa, klimatické podmienky, ako i mnohé ďalšie činitele. To nabáda spracovateľov ovčieho mlieka k jeho falšovaniu. Dôvody na falšovanie mlieka sú v prvom rade ekonomické (6, 22). Dôvody, prečo je odhalenie falšovania mlieka dôležité pre spotrebiteľa: - Pri miešaní drahšieho mlieka ovčieho a kozieho s kravským dochádza k redukcii výrobných nákladov a zníženiu produkcie kvalitných výrobkov. - Chrániť konzumentov, ktorí si neprajú konzumovať mlieko iných druhov. Isté percento obyvateľstva sa vyznačuje alergiou na zložky niektorých druhov mliek (8). V mnohých krajinách má detekcia falšovania syrov mimoriadny význam najmä z hľadiska zachovania tradícií ich výroby. Z uvedeného dôvodu získali mnohé syry tzv. ochrannú značku originality (PDO), čo znamená, že sú vyrobené z jedného druhu mlieka a v označení je táto skutočnosť deklarovaná (4, 10). 161

162 Tabuľka I Prehľad krajín produkujúcich ovčie syry (9) Krajina Francúzsko Taliansko Anglicko Španielsko Portugalsko Grécko Turecko Slovensko Bulharsko Maďarsko Syr Roquefort, Abbaye de Belloc, Perail Canestrato Pugliese, Fiore Sardo, Pecorino Romano Friesla, Olde York Castellano, Idiazabal, Manchego, Roncal, Zamorano Serra da Estrela Kefalotiri, Myzithra, Feta Beyaz Peynir, Mihalic Peynir Bryndza Katschkawalj Liptoi Aplikácia PCR metód na detekciu falšovania ovčieho mlieka a výrobkov z neho V ostatných rokoch sa do popredia dostávajú metódy založené na DNA identifikácii, ktoré majú na rozdiel od iných metód význam aj pri analýzach vyzretých syrov, či tepelne ošetrených mliečnych výrobkov. Pozitívom je vysoká citlivosť a nenáročnosť na stav použitej makromolekuly, čo umožňuje jej využitie vo výskume (7). PCR umožňuje selektívne naamplifikovať požadovaný úsek DNA v skúmavke in vitro do miliónového počtu kópií. Metóda napodobňuje replikačný systém, ktorý existuje v každej bunke a realizuje sa pred bunkovým delením, keď dochádza ku zdvojeniu genetického materiálu (1). Na identifikáciu kravských, kozích a ovčích mliek v syroch bola vyvinutá multiplexná PCR (5). Metódy založené na DNA identifikácii majú na rozdiel od iných metód význam pri analýzach vyzretých syrov (18) či tepelne ošetrených mliečnych výrobkov (14). Na dôkaz kravskej mliečnej zložky v ovčích a kozích syroch bol použitý jednoduchý druhovo špecifický detekčný PCR systém orientovaný na mitochondriálny gén kódujúci cytochróm b, ktorý sa v predchádzajúcom výskume osvedčil na dôkaz hovädzieho podielu v mäsových výrobkoch (20). S cieľom kvantifikovať prídavok kravského mlieka vo vzorkách ovčích syrov bola aplikovaná dvojitá PCR technika, ktorá používa normalizovanú kalibračnú krivku na kontrolu problému spojeného s DNA extrakciou a prípravou gélu (16, 17). Táto technika umožňuje detektovať už 0,1 % kravského mlieka v kozích syroch použitím 35 cyklónov duplex PCR. Technika PCR bola použitá na tepelne neupravené, pasterizované a sterilizované zmesi mlieka kravského a ovčieho a kravského a kozieho, s cieľom odhaliť prídavok kravského mlieka s prahom citlivosti 0,1 % (14, 15). DNA technika v kombinácií s PCR, LCR a EIA zameraná na zisťovanie prítomnosti kravského mlieka v ovčom, kozom a byvolom mlieku a zodpovedajúcich výrobkoch je založená na analýze jedného rozdielneho nukleotidu medzi kravskými druhmi a ovčími, kozími a byvolími druhmi (11). Na stanovenie detekčných limitov PCR metódy určenej na determináciu úmyselného falšovania ovčieho mlieka bola použitá klasická PCR. Zvolenou metódou bol stanovený 0,01 % prídavok kravského mlieka do mlieka ovčieho (2). V súčasnosti možno využívať rôzne modifikácie PCR protokolu, tzn. zloženia reakčnej zmesi a nastavenia PCR programu, ktoré sú pre konkrétne účely lepšie ako štandardná PCR (hot-start PCR, touchdown PCR, multiplex PCR, real-time PCR, RT- PCR, alelovo-špecifická PCR, mutagenéza prostredníctvom PCR (23). Cieľom práce bolo aplikovať klasickú PCR metódu pri detekcii falšovania ovčieho mlieka a výrobkov z neho na Slovensku, ako aj v niektorých krajinách EÚ. Zamerali sme sa na stanovenie nedeklarovaného prídavku kravského mlieka. 162

163 Materiál a metodika Výber biologického materiálu Vzorky ovčieho mlieka a výrobkov z neho (20 vzoriek ovčieho mlieka, 30 ovčích syrov, 20 vzoriek bryndze) boli v rokoch náhodne odoberané z prvovýroby a obchodnej siete z rôznych oblastí Slovenska a vybraných krajín EÚ. Následné boli analyzované v Laboratóriu PCR metód na Katedre hygieny a bezpečnosti potravín za účelom detekcie ich falšovania kravským mliekom. Na detekciu bola použitá klasická PCR metóda. Vzorky boli uchovávané vo vzorkovniciach (30 ml v mrazničke po dobu max 8 mesiacov). Izolácia DNA z ovčieho mlieka - genómová DNA bola extrahovaná pomocou centrifugácie, rpn počas 6 min, - odstredený sediment bol zmiešaný s lyzačným roztokom (lyzačný tlmivý roztok, TWEEN, proteináza K) o množstve 200 µl, - 1. záhrev termostat 66 C, 80 minút, 2. záhrev termostat 96 C, 20 minút, - vzorky boli scentrifugované pri rpn počas 1,5 min. Izolácia DNA zo syrov a bryndze - úprava vzorky pre analýzu (požadované množstvo a konzistencia), - prídavok Lysis pufor + proteináza K (100 µm), - 1. záhrev - termostat 66 C, 80 minút, 2. záhrev - termostat 96 C, 20 minút. Komponenty reakčnej zmesi PCR H 2 O; pufor (Go Taq green pufor 5x); tlmivý roztok (Go Taq MgCl 2 25 mm); deoxynukleozidtrifosfáty (AB dntp mix 10 mm); priméry (AdulHD-F 5 - GCCATATACTCTCCTTGGTGACA 3, AdulHD-R 5 - GTAGGCTTGGGAATAGTAGGA 3 ); polymeráza (Go Taq Hot Start Polymerase) Teplotný a časový režim pre PCR Amplifikácia DNA bola realizovaná s využitím vyhrievaného viečka termocykléra. Tabuľka II Použité teplotné profily Teplota Čas Štart 95 C 4 min. Denaturácia 95 C 45 sek. Annealing 61 C 45 sek. Polymerizácia 72 C 90 sek. Elongácia 72 C 7 min. Schladzovanie 20 C 0,01 sek. 40 x Príprava agarózového gélu V ďalšej fáze bola pripravená zmes agarózového gélu (1,2 %): 90 ml destilovaná voda, 10 ml TBE Buffer 10x, 1,2 g agarózy. Zmes nebola miešaná, napučiavala počas 5 minút. Po uplynutí tejto doby bola zmes počas 2 minút zahrievaná (mikrovlna rúra). Nasledovalo premiešanie a opätovný 1 minútový záhrev. Keď bola kvapalina číra, pod prúdom tečúcej vody na teplotu cca 50 C bola následne ochladená. Vzniknutá zmes a prídavok 10 µl etídiumbromidu bol naliaty do elektroforetickej nádoby. Konečná fáza prípravy agarózového gélu pozostávala z vloženia hrebeňa do gélu, pričom prebehlo tuhnutie zmesi. Po stuhnutí gélu (cca 20 minút) sa hrebene opatrne vytiahli. Aplikácia vzoriek a elektroforéza Elektroforetická nádoba zaliata elektroforetickým pufrom (1xTBE) bola nastavená do polohy, v akej prebiehala elektroforéza. Pufor pokrýval gél vrstvou priemerne 2 3 mm. Do každej jamky, ktorá vznikla hrebeňom, bolo aplikovaných 20 µm vzorky vyizolovanej DNA. Elektroforezačný tank sa uzavrel a elektroforéza prebiehala pri konštantnom napätí 125 V počas

164 minút. Po uplynutí času sa gél opatrne vybral, tekutina z neho odtiekla a bola prenesená na transilluminátor, kde nasledovala vizualizácia fragmentov DNA v géle pod UV svetlom a vyhotovenie digitálnej fotografie. Analyzovanie výsledkov PCR pomocou digitálnej fotografie Analyzovanie pomocou dát je nerozlučne spojené s používaním výpočtovej techniky a zároveň softvérového a hardvérového vybavenia počítača potrebného na prenos údajov z fotografie alebo gélu vo formáte toku dát. Získaná digitálna fotografia sa môže analyzovať rôznymi spôsobmi, ktoré umožňujú interaktívnu úpravu sledovaného záberu. Výsledky a diskusia Detekcia falšovania ovčieho mlieka vo vybraných regiónoch Slovenska pomocou PCR metódy V rokoch boli uskutočnené laboratórne analýzy zamerané na sledovanie aktuálnej situácie vo falšovaní ovčieho mlieka na Slovensku. Pomocou PCR metódy bolo analyzovaných 20 vzoriek ovčieho mlieka z rôznych oblastí Slovenska. Porušenie ovčieho mlieka mliekom kravským bolo zaznamenané vo 8 prípadoch. Situáciu na trhu s ovčím mliekom hodnotíme ako menej uspokojivú. Detekcia falšovania ovčieho hrudkového syra a iných syrov vyrobených z ovčieho mlieka Väčšina syrov sa vyrába z kravského mlieka, kým ovčie a kozie syry sa považujú za špeciality s charakteristickou chuťou a vôňou. Pretože ovčie a kozie mlieko je výrazne drahšie ako kravské mlieko a ich produkcia je sezónna, rozšírilo sa falšovanie ovčích a kozích syrov nedeklarovanou prímesou kravskej mliečnej zložky. Z celkového počtu 30 vzoriek ovčích hrudkových syrov a syrov vyrobených výlučne z ovčieho mlieka, ktoré boli odoberané z prvovýroby a obchodnej siete na Slovensku a v niektorých krajinách EÚ, bolo porušených kravským mliekom 12 vzoriek. V zmysle platných právnych noriem ovčie, kozie a byvolie mlieko, ako aj syry vyrobené z ovčieho, kozieho mlieka a byvolieho mlieka a zmesí ovčieho kozieho a byvolieho mlieka nesmú obsahovať kravské mlieko. Výnimku tvoria tradičné mliečne výrobky najmä syrové špeciality, ktoré sú zložené z viacerých druhov mlieka, pričom táto skutočnosť je v označení deklarovaná Počet vzoriek Počet vzoriek, u ktorých bola detektovaná kravská zložka 0 Ovčie mlieko Bryndza Ovčí syr Obr. 1 Podiel vzoriek ovčieho mlieka a výrobkov z neho, u ktorých bola detektovaná kravská zložka Detekcia falšovania bryndze vo vybraných regiónoch Slovenska pomocou PCR metódy V rámci riešenej problematiky boli analyzované aj vzorky bryndze z rôznych oblastí Slovenska. Vzorky boli odobraté z obchodnej siete, ako aj od predajcov špecializujúcich sa výhradne na výrobu a predaj ovčích syrov a výrobkov z ovčieho mlieka. 164

165 Nariadenie Rady (ES) č. 510/2006 definuje pojem Slovenská bryndza ako prírodný biely jemne roztierateľný zrejúci syr s ojedinelými krupičkami, vyrobený tradičným spôsobom mletím vyzretého ovčieho hrudkového syra alebo zmesi ovčieho a kravského hrudkového syra. Podiel ovčieho hrudkového syra je väčší ako 50 %. Najnovší trend u prvovýrobcov a spracovateľov ovčieho mlieka je znižovať legislatívou stanovené podiely ovčej hrudky na rozdiel od hrudky kravskej. Situácia je neuspokojivá hlavne v prípade bryndze. Tá disponuje PGI označením chránené zemepisné označenie. Takýto výrobok musí spĺňať požiadavky v zmysle stanovených kritérií. Pomer ovčej a kravskej zložky často balansuje na hranici únosnosti, pretože v prípade zníženia obsahu ovčej zložky o 1 % by finálny výrobok nemohol niesť označenie Slovenská bryndza. Tabuľka III Popis dráh Číslo dráhy Číslo vzorky 1 16 C 2 17 C 3 18 C Obr. 2 Príklady vizualizácie: amplifikácia DNA Charakteristika vzorky Čerstvý syr vyrobený výlučne z pasterizovaného ovčieho mlieka Čerstvý syr vyrobený výlučne z pasterizovaného ovčieho mlieka Čerstvý syr vyrobený výlučne z pasterizovaného ovčieho mlieka Prítomnosť kravského mlieka vo vzorke negatívna pozitívna negatívna 4 19 C Syr vyrobený zo srvátky ovčieho mlieka pozitívna 5 20 C Syr vyrobený z ovčieho a kozieho mlieka negatívna 6 21 C Syr vyrobený z ovčieho a kozieho mlieka pozitívna 7 1 B Bryndza plnotučná pozitívna* 8 2 B Plnotučná zimná bryndza pozitívna* 9 3 B Bryndza plnotučná pozitívna* 10 4 B Plnotučná bryndza pozitívna* * pozn. Obsah ovčieho hrudkového syra v bryndzi musí byť minimálne 50 % a obsah kravskej zložky 47 % (3 % tvorí soľ). Použitá klasická PCR metóda síce detektovala prítomnosť kravského mlieka vo vzorke, ale bez možnosti presnej kvantitatívnej detekcie. 165

166 Metódy založené na DNA identifikácii majú na rozdiel od iných metód význam aj pri analýzach vyzretých syrov, či tepelne ošetrených mliečnych výrobkov, pretože DNA je tepelne stabilnejšia ako proteíny. Pozitívom je vysoká citlivosť a nenáročnosť na stav použitej makromolekuly, čo umožnilo jej využitie vo výskume. Nevýhodou, ktorá v značnej miere bráni aplikácií PCR techník v mliekarenských podmienkach, je vysoká cena prístrojového vybavenia i pomerne vysoké ceny komponentov reakčnej zmesi, potrebných pre vykonanie PCR analýzy. Nevýhodu je, že amplifikácia je v priamej korelácii s obsahom somatických buniek v kravskom mlieku. Keďže pri autentifikácií nebol známy počet somatických buniek kravského mlieka, nebolo možné presne stanoviť obsah kravskej zložky v rámci skúmanej vzorky. Záver Séria analýz, ktoré boli realizované v Laboratóriu PCR metód na Katedre hygieny a bezpečnosti potravín, bola zameraná na monitoring aktuálnej situácie vo falšovaní ovčieho mlieka a ovčích syrov na Slovensku a vo vybraných štátoch EÚ. Pri detekcii prídavku kravského mlieka do ovčieho hrudkového syra a ostatných syrov vyrobených výlučne z ovčieho mlieka bolo falšovanie kravským mliekom preukázané u 12 vzoriek z celkového počtu 30 vzoriek. Pri testovaní surového ovčieho mlieka určeného na ďalšie spracovanie bol zistený nedeklarovaný prídavok kravského mlieka u 8 vzoriek z celkového počtu 20 vzoriek. Pri analýzach bola použitá klasická PCR, ktorá slúži na kvalitatívnu detekciu. Z hľadiska kvantitatívneho skúšania plánujeme aplikovať real time PCR, pomocou ktorej by sme chceli kvantifikovať prídavok nedeklarovanej zložky. Výhodou PCR metódy je vysoká špecifickosť a stabilita porovnateľná s proteínmi a dobre uchovaná štruktúra jednotlivých buniek. V praxi to znamená, že pri jej využití možno detektovať veľmi nízke prídavky kravskej zložky (0,1 %). Použitá literatúra 1. BAUEROVÁ, M. TURČÁNI, M. OMELKA, R Polymerázová reťazová reakcia. Vysokoškolský učebný text [CD-ROM] Nitra : FPV UKF, BOBKOVÁ, A. ŽIDEK, R. FLIMELOVÁ, E. et al Využitie PCR metódy na dôkaz falšovania mlieka a mliečnych výrobkov. In Potravinárstvo, roč. 3, 2009, č. 1, s. 1 3, ISSN BOROŠ, V Použitie ovčieho a kozieho mlieka pri výrobe netradičných mliečnych výrobkov. In Mliekarstvo, roč. 36, 2005, č. 3, s , ISSN BOTTERO, M. CIVERA, T. AVAMTASO, A. et al Identification of cows milk in buffalo cheese by duplex polymerase chain reaction. In Journal of Food Protection, 65, 2002, p BOTTERO, M. T. CIVERA, T. NUCERA, D. et al A multiplex polymerase chain reaction for the identification of cows, goats and sheeps milk in dairy products. In Int. Dairy J., 13, 2003, p CALVO, J.H. OSTA, R. ZARAGOZA, P Species-specific amplification for detection of bovine, ovine and caprine cheese. In Milchwissenschaft, 57, 2002, p DALMASSO, A A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. In Celular Probes, 18, 2004, p HALKEN, S Early sensitisation and development of allergic airway disease risk factors and predictors. In Paediatr. Respir. Rev., č. 4, s HARBUTT, J A Complete Illustrated Guide to the Cheeses of the World, In: Anness Publishing Inc., New York. 10. HERMAN, L Determination of the animal origin of raw food by species-specific PCR. In Journal of Dairy Research, 68, p KLOTZ, A. EINSPANIER, R Development of a DNA-based screening method to detect cow milk in ewe, goat and buffalo milk and diary products using PCR-LCR-EIA-technique. In Milchwissenschaft, 56, 2001, p KONTOVÁ, M Uplatnenie predností ovčieho mlieka na spracovanie syrov roquefortového typu. In Mliekarstvo, roč. 34, 2003, č. 4, s.16 19, ISSN LEGAROVÁ, V. KOUŘINSKÁ, L Vplyv genetických variant kappa kazeínu na technologické vlastnosti mlieka. In Bezpečnosť a kontrola potravín, II diel (Zborník prác z medzinárodnej vedeckej konferencie). Nitra, 2007, s

167 14. LOPÉZ-CALLEJA, I. GONZALES, I. FAJARDO, V Rapid detection of cows milk in sheeps and goats milk by a speciesspecific polymerase chain reaction technique. In J. Diary Sci, 87, 2004, p LÓPEZ-Calleja, I. GONZALES, I. FAJARDO, V. et al Quantitative detection of goats milk in sheeps milk by real-time PCR. In Food control, 18,2007, p MAFRA, I. ROXO, A. RERREIRA, I.M. et al A novel approach to the quantification of bovine milk in ovine cheeses using a duplex polymerase chain reaction method. In Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 2004, p MAFRA, I. ROXO, A. FERREIRA, I.M. et al A duplex polymerase chain reaction for the quantitative detection of cows milk in goats milk cheese. In Int. Diary J., 2007, 9, p MAYER, H. K Milk species identification in cheese varieties using electrophoretic, chromatographic and PCR techniques. In Int. Dayiry J., 15, 2005, p Nariadenie Rady (ES) č. 510/2006 Štandardný súhrn. 20. PIKNOVÁ, Ľ. KRAHULCOVÁ, J. KUCHTA, T Dôkaz kravskej mliečnej zložky v ovčích a kozích syroch polymerázovou reťazovou reakciou. In Bulletin potravinárskeho výskumu, roč. 41, č. 3, s , ISSN ZELEŇÁKOVÁ, L Validácia kvalitatívnych parametrov RC bovinného testu. In Mliekárstvo, roč. 35, č. 3, 2004, s , ISBN [online] [cit ]. Dost. na internete: < 23. [online] [cit ]. Dost. na internete: < Kontaktná adresa: Ing. Lucia Zeleňáková, PhD., Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku Nitra. e mail: Lucia.Zelenakova@uniag.sk 167

168 POROVNANIE VYBRANYCH METOD STANOVENIA ALKALICKEJ FOSFATÁZY V MLIEKU Golian Jozef, Chovanec Martin, Zajác Peter, Zeleňákova Lucia, Belej Ľubomír Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Comparison of selected methods determination of alcaline phosphtase in milk Summary Výsledky namerané fluorimetrickou metódou (Fluorophos ALP Test System) sme porovnávali s výsledkami nameranými chemiluminiscenčnou metódou (PasLite TM ALP test - Charm 6600). Analyzované boli rovnaké vzorky mlieka pre každú hladinu aktivity ALP (20, 50, 100, 350 a 500 mu.l -1 ) a jednotlivé druhy mlieka. Pre každú koncentračnú hladinu aktivity ALP a pre každý pozorovaný druh mlieka boli analyzované dve vzorky mlieka( 50 vzoriek). Metódy sme porovnávali len na základe percentuálneho podielu hodnôt nameraných oboma metódami pre príslušnú koncentračnú hladinu aktivity ALP. Znamená to, že zhoda metód nastane, keď percentuálny podiel hodnôt zistených oboma metódami je 100 %. Vychýlenie nad 100 % znamená, že metóda Charm ALP zaznamenáva vyššie hodnoty aktivity ALP oproti metóde Fluorophos ALP. Vychýlenie pod 100 % znamená, že metóda Charm ALP zaznamenáva nižšie hodnoty aktivity ALP oproti metóde Fluorophos ALP. Z nameraných a výpočtom upravených hodnôt sme zistili, že 32 % vzoriek meraných metódou Charm ALP malo nižšiu aktivitu ALP ako tie isté vzorky merané metódou Fluorophos ALP. Ostatných 68 % vzoriek malo aktivitu ALP nameranú metódou Charm ALP vyššiu oproti metóde Fluorophos ALP. Aktivita ALP zistená metódou Charm ALP na koncentračnej hladine 20 mu.l -1 bola v priemere o 30 % ± 17 % nižšia oproti metóde Fluorophos ALP. Najpodobnejšie hodnoty aktivity ALP u oboch porovnávaných metód boli na koncentračnej hladine 50 mu.l -1 (111 % ± 32 %) a na hladine 100 mu.l -1 (115 % ± 27 %). Od koncen-tračnej hladiny aktivity ALP 350 mu.l -1 sa hodnoty aktivity ALP začali výrazne odlišovať metódou Charm boli namerané o 60 % ± 27 % vyššie hodnoty aktivity ALP ako metódou Fluorophos ALP. Úvod a prehľad literatúry Mlieko a mliečne výrobky sú pre svoje zloženie považované za biologicky hodnotnú potravinu. Obsah nutričných zložiek prítomných v týchto produktoch je dobrou živnou pôdou pre rast a rozvoj rozmanitej mikroflóry. Táto mikroflóra v mliečnych produktoch môže mať pre konzumenta pozitívne, ale aj negatívne následky. Výrobcovia prichádzajú na trh stále s novými a novými výrobkami, ktoré sú v radoch konzumentov obľúbené a žiadané. Z nutričného a dietetického hľadiska majú tieto výrobky nezastupiteľné postavenie najmä vo výžive detí a starších ľudí. Práve nedostatočne vyvinutý, resp. vyčerpaný a oslabený imunitný systém u týchto vekových skupín však často nie je schopný adekvátne a dostatočne primerane reagovať v prípade infekcie spôsobenej patogénnymi a potencionálne patogénnymi mikroorganizmami. Alkalická fosfatáza (ALP) je enzým [EC ; ortophosphoric monoester phosphohydrolase] prirodzene prítomný v krvi a v mlieku všetkých cicavcov, pričom jej obsah v mlieku jednotlivých živočíšnych druhov je rôzny (Fadiloglu et al., 2004). ALP je nachádzaná v rozličných množstvách vo väčšine tkanív a sekrétov cicavcov. (Shakeel-ur-Rehman a Farkye, 2002). Hodnoty ALP sa môžu podstatne líšiť medzi druhmi a medzi jednotlivcami rovnakého druhu. Mlieko jednotlivých kráv sa môže líšiť obsahom ALP, čo je ovplyvnené mnohými faktormi ako napríklad štádiom vylučovania mlieka (Andrews, 1992). Mastitídne mlieko vykazuje vyššiu aktivitu ALP (Roseiro Barbosa, 1995). Vamvakaki et al. (2005) zistil, že v surovom ovčom mlieku je približne 5-krát viac ALP a kozie mlieko obsahuje zhruba len 1 / 5 ALP v porovnaní s kravským mliekom. Aktivita ALP je použitá ako index účinnosti adekvátnej pasterizácie mlieka, pretože ALP je trochu viac rezistentná ako teplota a čas potrebný na inaktiváciu Mycobacterium tuberculosis, ktorý bol teplotne najstabilnejší patogén známy v mlieku v časoch zavádzania pasterizácie v mliekarenskom priemysle (Andrews, 1992). 168

169 Material a metodika V práci sme porovnávali hodnoty aktivity ALP namerané chemiluminiscenčnou metódou (PasLite TM ALP test Charm 6600) a fluorimetrickou metódou (Fluorophfos ALP) v rovnakých vzorkách. Vzorky boli analyzované oboma metódami pre každú koncentračnú hladinu aktivity ALP (20, 50, 100, 350 a 500 mu.l -1 ). Hodnoty namerané oboma metódami na úrovni každej hladiny aktivity ALP boli percentuálne porovnané a graficky znázornené. Výsledky a diskusia Výsledkami namerané fluorimetrickou metódou (Fluorophos ALP Test System) sme porovnávali s výsledkami nameranými chemiluminiscenčnou metódou (PasLite TM ALP test - Charm 6600). Analyzované boli rovnaké vzorky mlieka pre každú hladinu aktivity ALP (20, 50, 100, 350 a 500 mu.l -1 ) a jednotlivé druhy mlieka. Zistené hodnoty sú uvedené v tabuľke 1 a graficky znázornené v Grafe 1 Pre každú koncentračnú hladinu aktivity ALP a pre každý pozorovaný druh mlieka boli analyzované dve vzorky mlieka. Spolu bolo analyzovaných 50 vzoriek. Vzhľadom na fakt, že sme mali k dispozícií len priemerné hodnoty aktivity ALP pre každú koncentračnú hladinu a každý druh mlieka, sme metódy porovnávali len na základe percentuálneho podielu hodnôt nameraných oboma metódami pre príslušnú koncentračnú hladinu aktivity ALP (Tabuľka 1). Znamená to, že zhoda metód nastane, keď percentuálny podiel hodnôt zistených oboma metódami je 100 %. Vychýlenie nad 100 % znamená, že metóda Charm ALP zaznamenáva vyššie hodnoty aktivity ALP oproti metóde Fluorophos ALP. Vychýlenie pod 100 % znamená, že metóda Charm ALP zaznamenáva nižšie hodnoty aktivity ALP oproti metóde Fluorophos ALP. Z nameraných a výpočtom upravených hodnôt sme zistili, že 32 % vzoriek meraných metódou Charm ALP malo nižšiu aktivitu ALP ako tie isté vzorky merané metódou Fluorophos ALP. Ostatných 68 % vzoriek malo aktivitu ALP nameranú metódou Charm ALP vyššiu oproti metóde Fluorophos ALP. Aktivita ALP zistená metódou Charm ALP na koncentračnej hladine 20 mu.l -1 bola v priemere o 30 % ± 17 % nižšia oproti metóde Fluorophos ALP. Najpodobnejšie hodnoty aktivity ALP u oboch porovnávaných metód boli na koncentračnej hladine 50 mu.l -1 (111 % ± 32 %) a na hladine 100 mu.l -1 (115 % ± 27 %). Od koncentračnej hladiny aktivity ALP 350 mu.l -1 sa hodnoty aktivity ALP začali výrazne odlišovať metódou Charm boli namerané o 60 % ± 27 % vyššie hodnoty aktivity ALP ako metódou Fluorophos ALP. Salter a Fitchen (2006) konštatujú, že výsledky dosahované chemiluminiscenčnou metódou stanovenia aktivity ALP sú porovnateľné s metódou Fluorophos. 169

170 Tabuľka 1 Percentuálne porovnanie aktivity ALP namerané chemiluminiscenčnou (Charm ALP) a fluorimetrickou (Fluorophos ALP) metódou priemerná aktivita ALP (mu.l -1 ) mlieko metóda c (mu.l -1 ) 20 A (%) c (mu.l -1 ) 50 A (%) c (mu.l -1 ) 100 A (%) c (mu.l -1 ) 350 A (%) c (mu.l -1 ) 500 kravské Charm % 84% 107% 155% plnotučné Fluorophos kravské Charm % 126% 88% 148% polotučné Fluorophos kravské Charm % 161% 111% 162% nízkotučné Fluorophos kozie ovčie Charm Fluorophos Charm % 113% 168% 208% Fluorophos A (%) 173% 156% 153% 172% Charm % 72% 102% 127% 164% Fluorophos x (mu.l -1 ) SD (mu.l -1 ) x (mu.l -1 ) SD (mu.l -1 ) x A (%) 70% 111% 115% 160% 163% SD A (%) 17% 32% 27% 27% 8% c - koncentračná hladina aktivity ALP A - percentuálny podiel aktivity ALP nameranej metódou Charm ALP a Fluorophos ALP pre jednotlivé koncentračné hladiny x - priemerná aktivita ALP pozorovaných druhov mlieka pre jednotlivé koncentračné hladiny s - smerodajná odchýlka pre x x A - priemerný percentuálny podiel aktivity ALP nameranej metódou Charm ALP a Fluorophos ALP pre jednotlivé koncentračné hladiny SD A - smerodajná odchýlka pre x A

171 Graf Porovnanie metódy "Charm ALP" a "Fluorophos ALP" aktivita ALP (mu.l -1 ) koncentračná hladina aktivity ALP (mu.l -1 ) Fluorofos ALP 158 Charm ALP Literatúra 1. ANDREWS, A. T., Phosphatases in milk. In: Fox, P.F. (Ed.), Advanced Dairy Chemistry-1. Proteins. Elsevier Applied Science LTD, Exxex, pp FADILOGLU S. et al Inactivation of Alkaline Phosphatase in Milk. In: Food Technol. Biotechnol., Vol. 42, No.1, 2004, p GÖRNER, F. VALÍK, Ľ Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava : Malé centrum, s. ISBN KEPPLINGER, J. M Milk alkaline phosphathase. In: Bezpečnosť a kontrola potravín 2. diel: Zborník prác z medzinárodnej vedeckej konferencie, Nitra : SPU, 2006, s ISBN ROSEIRO DE BIVAR, M. L. BARBOSA, M., Phosphatase activity levels in pasteurized goat s milk.in: J. Soc. Dairy Technol, 48,1995, p SALTER, R. S. FITCHEN, J Evaluation of a Chemiluminescence Method for Measuring Alkaline Phosphatase Activity in Whole Milk of Multiple Species and Bovine Dairy Drinks: Interlaboratory Study. In: Journal of AOAC International,Vol. 89, No. 4, 2006, p , ISSN SHAKEEL-UR REHMAN FARKYE, N.Y Phosphatases. In: Enzymes indigenous to milk, California. Elsevier Science Ltd, Copyright 2002, p VAMVAKAKI, A.-N. ZOIDOU, E. MOATSOU, G. et al., Residual alkaline phosphatase activity after heat treatment of ovine and caprine milk. In: Small Ruminant Research, Dostupné na internete: www. elsevier.com/locate/smallrumres. Kontaktná adresa: doc. Ing. Jozef Golian, Dr., Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku Nitra. e mail: Jozef.Golian.AF@uniag.sk 171

172 STANOVENÍ METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN V MLÉCE Štoudková Hana, Dračková Michaela, Borkovcová Ivana, Haluzíková Tereza, Pospíšil Jan, Vorlová Lenka Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno Determination of fatty acids methyl esters in milk Summary: The aim of this study was established gas chromatography for methyl esters of fatty acids determination in milk. Samples of cow s, goat s and ewe s milk (VFU Brno breeding) were investigated. The fat was obtained from the milk samples by centrifugation. Methanol esterification method using potassium hydroxide catalysis was chosen for preparing the samples of the fatty acids. The fatty acids profiles were determinated as fatty acid methyl esters by gas chromatograph with flame ionisation detector. Analysis were performed with a VB- WAX column (60 m 0.32 mm i.d.) with a film thickness 0.25 µm. The injector temperature was 280 C and detector temperature was 300 C. The initial temperature of 50 C was maintained for 8 min, then raised to 220 C at a rate 10 C/min, maintained for 20 min and then increased to 240 C at a rate of 5 C/min for 25 min. The split was used and nitrogen was the carrier gas. The time of the analysis was 74 min. Standard FAME Mix 37 (Supelco) was used for identification and quantification. Oleic, palmitic, myristic, stearic and laureic acid were the most significant in all type of milk. It was established suitable method for determination fatty acids methyl esters. Úvod Mastné kyseliny jsou hlavní složkou mléčného tuku. Jejich vzájemné zastoupení a pozice v molekulách triacylglycerolů ovlivňují technologické, senzorické a nutriční vlastnosti mléčného tuku. 1 Mléčný tuk obsahuje přes 400 různých mastných kyselin. Při použití soudobých analytických metod jich lze identifikovat kolem 70. Jejich značná část je však v mléčném tuku zastoupena jen ve velmi nízkých až zanedbatelných koncentracích. Jen zhruba z nich má podíl 1 % a vyšší. Tyto masné kyseliny tvoří 90 % všech zastoupených mastných kyselin. Typické jsou mastné kyseliny se sudým a nižším počtem uhlíků v řetězci C4 C18, které tvoří % všech mastných kyselin. Mastné kyseliny s lichým počtem atomů uhlíku se vyskytují v množství zpravidla menším než 1 % všech mastných kyselin. Koncentrace mastných kyselin jsou navíc ovlivněny řadou faktorů (výživou a složením krmné dávky, stádiem laktace, genetikou, plemenem, věkem zvířete, zdravotním stavem a onemocněním mléčné žlázy). Z praktického hlediska se proto v mléčném tuku pomocí plynové chromatografie stanovuje nejčastěji kolem 20 až 30 mastných kyselin, jejichž podíly se pohybují v rozmezí několika desetin až desítek procent z celkového obsahu všech mastných kyselin. 1,2,3 Cílem práce bylo zavedení metody plynové chromatografie pro stanovení methylesterů mastných kyselin v mléce. Materiál a metodika Byly vyšetřeny vzorky kravského, kozího a ovčího mléka, které pocházely z farem České Republiky a chovu VFU Brno. Příprava vzorků tuku z jednotlivých vzorků mléka byla provedena na základě metody popsané v článku autorů Feng a kol. 4 Vzorek mléka se centrifigoval ( otáček.min -1 ) 30 minut při 4 C. Získaná tuková vrstva se nechala rozpustit při pokojové teplotě a následně se opět centrifugovala ( otáček.min -1 ) po dobu 20 minut při pokojové teplotě. Asi 100 mg získaného tuku bylo s 15 ml methanolického roztoku hydroxidu draselného zmýdelňováno při teplotě C po dobu 30 minut pod zpětným chladičem. Po ochlazení se směs zneutralizovala koncentrovanou kyselinou sírovou na methyloranž do růžového zbarvení. Dále byla provedena reesterifikace pod zpětným chladičem opět 30 minut. Po ochlazení se ke směsi převedené do dělící nálevky přidalo 15 ml hexanu a methylestery se vytřepaly do hexanu (15 minut). Po oddělení fází se organická fáze přefiltrovala přes vyžíhaný bezvodý síran sodný. 5 Získaný roztok vzorku byl následně podroben chromatografické analýze. 172

173 Obsah methylesterů mastných kyselin byl stanoven na plynovém chromatografu 6820 GC System (Agilent, USA) s plamenově ionizační detekcí na kapilární koloně VB-WAX, 60 m 0,32 mm, tloušťka filmu 0,25 μm (VICI a ValcoBond, USA). Teplota injektoru byla 280 C, teplota detektoru 300 C a teplotní program: 50 C/8 min; 10 C/min do 220 C výdrž 20 min; 5 C/min do 240 C výdrž 25 min. Jako nosný plyn byl použit N 2. Typ nástřiku split, splitovací poměr 12:1. Celková doba analýzy 74 min. Pro sběr a vyhodnocení dat byl použit software Clarity (DataApex, ČR). Identifikace a kvantifikace byla provedena na základě srovnání se standardem FAME Mix 37 (Supelco). Výsledky a diskuse Validační parametry Pro stanovení validačních parametrů (opakovatelnost nástřiku, meze, linearita, správnost a citlivost metody) byl použit program EffiValidation 3.0. Jednotlivé níže uvedené hodnoty jsou vybrány pro methylestery mastných kyselin, které se ve vzorcích mléka vyskytovaly ve vyšším množství. Opakovatelnost metody byla stanovena z 10 paralelních měření vzorku mléka. Odchylky RSD se pro jednotlivé mastné kyseliny pohybovaly do 8 %. Mez detekce, resp. mez stanovitelnosti byla pro kyselinu máselnou,kapronovou, kaprylovou, kaprinovou, laurovou, myristovou a pentadecanovou 0,05 mg.g -1 tuku, resp. 0,15 mg.g -1 tuku. Pro kyselinu palmitovou, palmitoolejovou, stearovou, olejovou, linolovou a linolenovou byla mez detekce, resp. mez stanovitelnosti stanovena na 1,0 mg.g -1 tuku, resp. 4,0 mg.g -1 tuku. Linearita byla potvrzena výpočtem korelačního a QC koeficientu. Citlivost je daná směrnicí kalibračních křivek pro jednotlivé mastné kyseliny. Tabulka I Linearita a citlivost analytické metody pro methylestery mastných kyselin (program EffiValidation - kalibrační křivky) Linearita Citlivost Analyt Vypočtený R Vypočtený QC Hypotéza Směrnice máselná 0, ,84 True 1170,136 kapronová 0, ,93 True 1356,955 kaprylová 0, ,34 True 1518,067 kaprinová 0, ,22 True 1454,213 laurová 0, ,31 True 1242,890 myristová 0, ,85 True 1112,794 pentadecanová 0, ,55 True 1092,328 palmitová 0, ,13 True 1076,873 palmitoolejová 0, ,65 True 1050,352 stearová 0, ,15 True 1038,955 olejová 0, ,42 True 1081,832 linolová 0, ,00 True 1106,078 linolenová 0, ,00 True 1055,367 Výtěžnost byla zjištěna přídavkem standardů palmitové, myristové, olejové a stearové kyseliny o známé koncentraci k matrici mléka a pohybovala se v rozmezí %. Správnost metody byla ověřena analýzou certifikovaného referenčního materiálu BCR (viz Tabulka II). 173

174 Tabulka II Správnost analytické metody pro methylestery mastných kyselin (program EffiValidation - měření CRM) Popis Předloženo Naměřeno Výtěžnost Přesnost Hypotéza myristová 2,29 1,85 80,70 0,076 True palmitová 25,96 25,96 81,44 0,059 True palmitoolejová 2,58 1,72 66,65 0,356 True stearová 18,29 15,34 83,85 0,354 True olejová 38,30 30,56 79,79 0,502 True linolová 7,05 5,17 73,33 0,351 True linolenová 0,86 0,48 56,36 0,071 True Aplikace metody na analýzu mléka Získaný tuk z vyšetřovaných vzorků kravského, kozího a ovčího mléka byly podrobeny analýze plynovou chromatografií. Následná identifikace a kvantifikace byla provedena na základě srovnání s proměřenou kalibrační křivkou standardu FAME Mix 37 (Supelco). Ukázka chromatografu vzorku kozího mléka je na Obr. 1. Obr. 1. Chromatogram vzorku kozího mléka V největší množství byly zastoupeny kyseliny olejová (18:1), palmitová (16:0), myristová (14:0), stearová (18:0), laurová (C12:0). Linolová (18:2) a linolenová (18:3) kyselina byly přítomny v nižším avšak významném množství. Srovnání procentuálního obsahu z mastných kyselin v kravském, kozím a ovčím mléku je uvedeno v Obr. 2. Kravské mléko obsahuje nejvíce kyseliny olejové (40,8 %), což je 125,89 mg.g -1 tuku. Kyselina palmitová je ve všech druzích mléka obsažena v množství %. V případě kozího a ovčího mléka je tato kyselina nejvíce zastoupenou mastnou kyselinou. Obsah kyseliny stearové byl v kozím mléce o více než polovinu menší (5 %) než v mléce kravském (11,8 %) a ovčím (11,9 %). Významné esenciální mastné kyseliny kyselina linolová a linoleová byly ve vzorcích zastoupeny v nižším množství tzn. do 2,5 %, tedy do 8 mg.g -1 tuku. 174

175 množství (%) máselná kapronová kaprylová kaprinová laurová myristová kravské kozí ovčí penta decanová MeMK palmitová palmito olejová stearová olejová linolová linolenová Obr. 2. Porovnání procentuálního zastoupení nejvíce zastoupených mastných kyselin v kravském, kozím a ovčím mléce Závěr Byla zavedena vhodná metoda plynové chromatografie pro stanovení methylesterů mastných kyselin v mléce. Na základě měření byly pomocí programu EffiValidation 3.0 stanoveny validační parametry. Metoda byla dále aplikována na různé vzorky kravského, ovčího a kozího mléka, které pocházely z farem České Republiky a chovu VFU Brno. Z výsledných hodnot obsahů methylesterů mastných kyselin je zřejmý významný rozdíl v zastoupení mastných kyselin v jednotlivých typech analyzovaných vzorků mlék. Poděkování: Práce vznikla za podpory výzkumného záměru MSM Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Použitá literatura: 1. SAMKOVÁ, E., PEŠEK, M., ŠPIŠKA, J. Vliv mléčného tuku na zdravotní stav konzumentů a možnosti ovlivnění jeho složení v prvovýrobě. In Výrobní zemědělská praxe a potravinářské biotechnologické úpravy pro zvýraznění pozitivních zdravotních vlivů mléka a mléčných výrobků. Rapotín: VÚCHS, 2008, s SAMKOVÁ, E., PEŠEK, M., ŠPIŠKA, J. Mastné kyseliny mléčného tuku skotu a faktory jejich zastoupení. 1. vyd. České Budějovice: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 2008, 90 s. 3. TAYLOR, MW., MacGIBBON, AKH. Fatty acids. In Roginski et al. Encyclopedia of Dairy Science. Amsterdam: Academic press, 2003, vol. 2, p FENG, S., LOCK AL.,GARNSWORTHY, PC. Technical Note: A rapid lipid separation method for determining fatty acid composition of milk. J. Dairy Sci., 2004, vol. 87, no. 11, p ČSN EN ISO Animal and vegetable fats and oils - preparing of methyl esters of fatty acids. Praha:Český normalizační institut, 2001, 40 s. Kontaktní adresa: MVDr. Michaela Dračková, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, Brno, drackovam@vfu.cz

176 OBSAHY SELENU A JÓDU V OVČÍM MLÉCE Rozenská Lenka, Hejtmánková Alena, Miholová Daniela, Kolihová Dana, Hrdličková Kateřina Katedra chemie, Fakulta agrobiologie, přírodních a potravinových zdrojů, Česká zemědělská univerzita v Praze Contents of selenium and iodine in sheep milk Summary The aim of the study was to adapt and validate the method of selenium determination in sheep milk from the ecologic farms situated in the region Benešovsko and to make an orientating screening of its contents of selenium and iodine. Selenium was measured using ETA-AAS with a hydride technique with sample preparation consisting on microwave mineralization. Iodine was determined using HPLC with electrochemical detection and the samples were prepared by alkaline mineralization. The content range of selenium was from 18,96 to 108,77 µg/kg and for iodine from 17,63 to 141,12 µg/kg. From the results, it is visible, that the content of these two elements tends to increase in winter and decreases in summer. In accordance with literature, it may be caused by the feeding differences between summer and winter. Úvod Mléko tvoří jednu ze základních složek lidské výživy a je cenným zdrojem nutričně významných látek. Ovčí mléko je v České republice produkováno minoritně a slouží především k výrobě specifických sýrů a jako alternativa ve výživě lidí, kteří jsou alergičtí na kravské mléko. Ovčí mléko jako možná alternace kravského mléka s sebou přináší potřebu analytického stanovení nutrietů, včetně minerálních látek. 1,2,3 Minerální látky jsou v mléce přítomny jednak v mléčném séru v roztoku či v koloidní formě a jednak jsou vázány na některé organické součásti mléka. 4 Postavení selenu ve výživě prodělalo během posledních desetiletí významný posun. Dříve se soudilo, že se jedná o rizikový prvek, pro organismus škodlivý, ale prokázalo se, že určité množství selenu je pro člověka esenciální a navíc že evropská populace trpí spíše jeho nedostatkem. Optimální denní dávka selenu se pohybuje v poměrně úzkém rozmezí μg. Nad 900 mikrogramů denně selen působí již toxicky, pokud je přijímán v anorganické formě. V organické formě v podobě například selenomethioninu či selenu vázaného na kvasnice, jsou toxické dávky až přes 2000 mikrogramů, a můžou se projevit jako nevolnost, zvracení či nervové napětí. Selen se v organismu skladuje v orgánech, kde dochází k tvorbě bílkovin, a z nich jsou pak syntetizovány selenoproteiny. Selen je součástí mnoha enzymů, zvláště antioxidačního glutathion peroxidázy. 5 Jod se účastní tvorby hormonů štítné žlázy tyroxinu a trijodtyroninu, které v buňkách regulují rychlost metabolismu. Jod má dále vliv na aktivitu alfa-amylázy ve slinivce břišní a je nezbytný pro správný vývoj plodu a dítěte v raných obdobích života. Doporučená denní dávka jódu se uvádí mikrogramů. Problematika příjmu jódu se znovu dostává do popředí zvláště v důsledku zjištění jodového deficitu obyvatelstva, přičemž příjem jodované soli se snižuje v rámci prevence kardiovaskulárních chorob. 6 Předmětem předkládané studie bylo vypracovat a validovat metodiku pro stanovení selenu v ovčím mléce a dále orientační screening obsahů selenu a jódu v ovčím mléce z ekologických farem ve Středočeském kraji. Metody Orientační monitoring obsahů selenu a jódu byl proveden ve vzorcích ovčího mléka, které bylo odebíráno od poloviny července 2007 do konce července Vzorky pocházejí ze čtyř soukromých farem na Benešovsku, zaměřujících se na chov plemen Merino a Romanovská ovce. Vzorky ovčího mléka byly odebrány za stejných podmínek od ovcí, které byly krmeny standardním způsobem bez suplementace selenem či jódem, přes léto na pastvě, v zimě přikrmovány tvrdým pečivem, jablky, krmnou řepou a k dispozici měly seno a slámu. Vzorky byly co nejdříve po nadojení zamraženy a skladovány při teplotě -20 C. 176

177 Pro stanovení selenu bylo použito atomové absorpční spektrometrie s elektrotermickou atomizací, pomocí hydridové techniky. Vzorky byly rozloženy mikrovlnnou mineralizací, a to následujícím postupem: lyofilizované ovčí mléko bylo naváženo do teflonových tlakových nádob, přidány 2 ml HNO3 a 3 ml H2O2 a ponecháno k reakci 60 minut. Poté byly nádobky uzavřeny a vloženy do mikrovlnného mineralizátoru MW-3+ Speedwave (Berghof). Vlastnímu měření předcházela redukce selenu ze šestimocného oxidačního stavu na čtyřmocný pomocí kyseliny chlorovodíkové. Jód byl stanoven metodou iontově párové vysokoúčinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí. Metoda vychází normy International IDF Standard 167:1994. Vzorky byly připraveny alkalickou mineralizací. Výsledky byly zpracovány v programu Excel. Výsledky a diskuze Kontrola kvality analytických dat byla provedena souběžnou analýzou certifikovaného referenčního materiálu H 281 (BCR) Ray grass pro selen a 063 R pro jód. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrné hodnoty obsahů selenu a jódu ze všech odebraných vzorků mléka k určitému datu odběru (tabulka). Obsahy selenu se pohybovaly v rozmezí 18,96 108,77 µg/kg (medián 43,61 µg/kg) a obsahy jódu v rozmezí 17,63 141,12 µg/kg (medián 36,99 µg/kg). Tabulka I Průměrné hodnoty selenu a jódu v závislosti na datu odběru (µg/kg). datum selen jód ,96 35, ,64 36, ,07 25, ,61 28, ,35 25, ,06 74, ,92 73, ,77 42, ,63 141, ,21 106, ,35 53, ,03 72, ,74 17, ,35 46, ,52 45, ,54 40,44 průměr 42,17 54,07 smodch 23,53 31,77 CV (%) 55,80 58,76 medián 36,99 43,61 Přestože hodnoty selenu a jódu v mléce odebraném na různých farmách se mírně liší, z obrázku (obr.1.) je patrný určitý trend zvyšování obsahů selenu a jódu v zimním období, což koresponduje s literaturou 7,8, kde je tento jev vysvětlován jako důsledek změn ve složení stravy v zimním a v letním období. Křivky obsahu selenu a jódu v závislosti na době odběru vykazují obdobný trend. 177

178 V porovnání s kravským mlékem bylo v ovčím mléce nalezeno více selenu a srovnatelně jódu. Vyšší stanovené obsahy selenu v ovčím mléce pravděpodobně souvisí s vyšším procentuálním zastoupením bílkovin v tomto druhu mléka. Vysoké obsahy jódu v ovčím mléce, které publikoval Hampel et al nebyly nalezeny mg/kg selen jod Obr. 1. Obsahy selenu a jódu (µg/kg) v ovčím mléce ve sledovaném období. Závěr Byl optimalizován a validován způsob mikrovlnné mineralizace ovčího mléka pro stanovení selenu metodou ETA-AAS s hydridovou technikou Obsahy selenu v ovčím mléce se pohybovaly v rozmezí 18,96 108,77 µg/kg. Obsahy jodu v ovčím mléce se pohybovaly v rozmezí 17,63 141,12 µg/kg V zimním období je zřetelné zvýšení obsahů selenu a jódu v ovčím mléce, což souvisí s rozdíly ve stravě v zimním a letním období. Ve srovnání s kravským mlékem se mléko ovčí zdá být lepším zdrojem selenu a srovnatelným zdrojem jódu. Práce vznikla za finanční podpory interního grantu FAPPZ ČZU v Praze č /1312/3114 a výzkumného záměru MSM Použitá literatura Hejtmánková A., Žabová V., Trnková E., Dragounová H., Louda F.: Stanovení jódu v mléce a mléčných výrobcích metodou HPLC. Den mléka 2000: sborník referátů z mezinárodní konference, (2000). Křivda B.: Alergie na kravské mléko. Den mléka 2006: sborník referátů z mezinárodní konference, (2006). Štolcová J., Štolc L., Homolka J.: Ovčí mléko v podmínkách České republiky. Den mléka 2006: sborník referátů z mezinárodní konference, (2006). Gajdůšek S.: Laktologie. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno (2003). Šestáková I., Kopanica M.,: Mikroelementy 98: Sborník přednášek XXXII. Semináře o metodice stanovení a významu stopových prvků v biologickém materiálu, Řež u Prahy (Helán J., ed.) str THETA, Český Těšín Řehůřková I., Ruprich J., Borkovcová I., Millerová I.,: Mikroelementy 98: Sborník přednášek XXXII. Semináře o metodice stanovení a významu stopových prvků v biologickém materiálu, Řež u Prahy (Helán J., ed.) str THETA, Český Těšín

179 7 8 9 Hejtmánková A., Kuklík L., Trnková E., Dragounová H.: Iodine concentrations in cow s milk in Central and Northern Bohemia. Czech J. Anim. Sci., 51, (2006). Hejtmánková A., Miholová D., Kolihová D.: Obsah vybraných minerálních látek v ovčím mléce a syrovátce. Den mléka 2008: sborník referátů z mezinárodní konference, (2008). Hampel K., Schöne V., Leiterer M., Jahreis G.: Zusammensetung und ernährungpsychologische Bedeutung von Schafsmilch und Schafsmilchproduktion. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Jena, 4-19 (2004). Kontaktní adresa Mgr. Lenka Rozenská, Česká zemědělská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Praha 6 Suchdol, Česká republika, rozenska@af.czu.cz 179

180 KONTROLA JAKOSTI MÁSLA POMOCÍ NIR SPEKTROSKOPIE Lužová Táňa, Šustová Květoslava, Králíková Marcela, Hrnčířová Kristýna Mendelova univerzita v Brně, Ústav technologie potravin The butter quality control by using of NIR spectroscopy Summary: Our work is about how to use near infrared spectroscopy in process control of butter. Content of water, fat and free fatty acids were determined in chemical laboratory and measured on near infrared spectroscop Antaris. For calibration we use PLS method. The correlation coefficient of calibration was for fat content 0,991, for water content 0,9751, for free fatty acids content 0,9613. The correlation coefficient of validation 0,9822 for fat, 0,9593 for water a 0,6631 for free fatty acids content. From the results of analysis follow suitability of NIR spectrocsopy for determination of fat and water content. The free fatty acids calibration model is appropriate more optimize. Tradiční metody zjišťování kvality a složení mléka a mléčných výrobků jsou pomalé a drahé (1). V předchozích letech získala technika NIR spektroskopie velkou oblibu pro svou schopnost rychle stanovit kvantitativní i kvalitativní informace mnohých produktů (2). Praktické použití NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu je často využíváno pro zjišťování obsahu vody, tuku, bílkovin a laktózy (3). Naše práce se zabývá možností využití blízké infračervené spektroskopie při kontrole jakosti másla. Materiál Pro analytické stanovení obsahu vody, tuku a volných mastných kyselin byly použity vzorky másel stolních, čerstvých, tříčtvrtětučných, másel s obsahem i bez obsahu soli. Vzorky byly analyzovány v laboratoři na Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně. Metody V rámci chemické analýzy byl u vzorků stanoven obsah vody, tuku a číslo kyselosti (obsah volných mastných kyselin). Procento vody v másle bylo stanoveno podle ČSN ISO Principem stanovení je sušení vzorku do konstantní hmotnosti při 102 ± 2 C a zjištění úbytku hmotnosti.. Principem stanovení obsahu tuku podle Gerberovy metody je rozpuštění netukových částí másla koncentrovanou H 2 SO 4, a zjištění obsahu tuku po přídavku amylalkoholu a odstředění. Metoda využívá vlastního butyrometru se stupnicí od 70 do 90%. Obsah volných mastných kyselin mléčného tuku se vyjadřuje jako číslo kyselosti, tj. počet mg KOH potřebného k neutralizaci volných mastných kyselin v 1 g tuku, nebo jako stupeň kyselosti, tj. počet ml KOH, potřebného k neutralizaci volných mastných kyselin ve 100 g tuku. Souběžně s chemickou analýzou probíhalo měření vzorků na FT NIR spektrofotometru. Vzorky byly ponechány při pokojové teplotě. Po změknutí měřeny v rozsahu vlnočtů cm -1 v režimu reflektance, s rozlišením 4, počtem scanů 80. Vzorky byly měřeny na integrační sféře 2krát, pro tvorbu kalibračního modelu bylo následně použito spektrum průměrné. Na základě přiřazení referenčních hodnot k příslušným spektrům byly pomocí programu TQ Analyst vytvořeny kalibrační modely. Výsledky a diskuse Naměřené referenční hodnoty jsou uvedené v tab. I. Velké rozdíly mezi maximálními a minimálními hodnotami jednotlivých vzorků jsou způsobeny jejich různorodostí, byla měřena i másla tříčtvrtětučná. 180

181 Tab. I Výsledky chemického rozboru (n = 25) Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí programu TQ analyst. Tabulky II a III uvádějí kalibrační a validační výsledky příslušných kalibrací. Tab. II Výsledky kalibrace (n = 25) R korelační koeficient, SEC směrodatná odchylka kalibrace, CCV - kalibrační variační koeficient, LR lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody Tab. III Výsledky validace (n = 25) R korelační koeficient, SEP směrodatná odchylka validace, PCV - predikční variační koeficient, LR lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody obsah vody NIR (% y = 0,9507x + 0,834 R = 0,9751 y = 0,943x + 0,9292 R = 0, obsah vody chemicky (%) Kalibrace Validace Lineární (Validace) Lineární (Kalibrace) Obr. 1 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu vody v másle Ke statistickému hodnocení kalibračních modelů byl použit t-test. Mezi referenčními a instrumentálními hodnotami nebyl nalezen statisticky významný rozdíl. 181

182 Závěr Z výsledku výše uváděných je patrné, že NIR spektroskopie je vhodná metoda pro nedestruktivní stanovení obsahu vody a tuku v másle. Kalibrační model pro stanovení obsahu volných mastných kyselin by bylo vhodné nadále optimalizovat dalšími stanoveními a zvýšit tak jeho spolehlivost. Použitá literatura: 1. JANKOVSKÁ, R., ŠUSTOVÁ, K., Analysis of cow milk by Near-infrared spectroscopy. Czech Journal of Food Science, 2003, 21(4): O SULLIVAN, A., O CONNOR, B., KELLY, A., McGRATH, M., Teh use of chemical and infrared methods for analysis of milk and diary products, International Journal of Dairy Technology, 1999, 52(4): SØRENSEN, L., K., JEPSEN, R., Assessment of Sensory Properties of Cheese by Near-infrared Spectroscopy, International Dairy Journal, 1998, 8: Kontaktní adresa: Ing. Táňa Lužová, Mendelova univerzita v Brně, Ústav technologie potravin, Zemědělská 1, , Brno, tel: , tana.luzova@centrum.cz 182

183 SPEKTROFOTOMETRICKÉ HODNOCENÍ BARVY MÁSLA A TUKŮ Jůzl Miroslav, Kozelková Monika, Nováková Lucie, Šustová Květoslava Mendelova univerzita v Brně, Ústav technologie potravin Spectroscopy assessment butter and fat colour Summary: This work deals with advantages of spectroscopy in assessing of butter and fat colour. The aim of this work is to determine an origin of fats on the basis of divergence in coloured spectrum. Spectrofotometer Konica Minolta CM 3500d was used for measuring a colour scheme.this machine measured the whole visible spectrum, nm, and the colour is defined by means of numerical date. The colour is referred in the L*a*b* coloured system (CIELab). The value L* is a lightness and values a*, b* are coordinates of the colour scheme in the chromaticity diagram. A multiple balance of fat's groups is statistically highly evidential (P<0.01) for value a* and b*. And this part of the remise spectrum is fundamental for appraisal of the origin of fats in products. We also found out that specific part of the visible radiation of fats is an area of red light. Due to this area we can differentiate fats. In the future this detection can be used in control methods of revisory authorities. Úvod: Obvykle si první úsudek o jakosti či kvalitě vytváříme zrakem a postupně ho doplňujeme pomocí ostatních smyslů. Barva jako součást vzhledu nám dává předběžné hodnocení, které často rozhoduje o koupi nebo konzumu výrobku [3]. Barevný prostor L*a*b* je jedním z nejčastěji používaných barevných prostorů pro měření barvy objektu a je používán v mnoha oborech. Pomocí systému CIELab, který byl přijatý CIE v roce 1976 zjišťujeme jednotnost barevného prostředí. Mezi optickým nervem a lidským mozkem jsou sítnicové barevné podněty převáděny do tří opozitních hodnot: světlá - tmavá, červená - zelená a modrá - žlutá. CIELab zobrazuje tyto hodnoty na třech osách: L*, a*, b*. Centrální svislá osa představuje světlost (lightness, L*), která má rozsah 0 (černá) až 100 (bílá). Barevné osy nabývají hodnot pozitivních i negativních. +a* je směr do červena, -a* je směr do zelena, +b* je směr do žluta, -b* je směr do modra. Střed je achromatický: jestliže se hodnoty a* a b* zvyšují a bod se pohybuje od středu, sytost barvy se zvyšuje. Nulové hodnoty značí neutrální šedou [4]. Máslo se označuje výrobek s obsahem mléčného tuku nejméně 80 %, avšak méně než 90 %, s obsahem vody nejvýše 16 % a s obsahem mléčných netuků v sušině nejvýše 2 %. Směsný tuk je výrobek získaný ze směsi rostlinných a/nebo živočišných tuků s obsahem tuku nejméně 80 %, avšak méně než 90 % [2]. Materiál a metodika: Materiál K hodnocení byly použity různé druhy másla a rostlinné tuky. Hodnoceno bylo celkem sedm vzorků, a to Čerstvé máslo, Máslo se smetanovým zákysem, Zlatá Haná, Easy a Olivia, Máslo z Vysočiny a Stolní máslo. Metodika Pro hodnocení byly připraveny vzorky z materiálu vychlazeného na teplotu v rozmezí 4-8 C, především z důvodu snadnější manipulace. Samotné měření pak probíhalo při běžné laboratorní teplotě. Od každého druhu byly proměřeny čtyři vzorky v pěti opakováních ve velikosti vzorku, která je dostačující pro překrytí štěrbiny spektrofotometru. Na přesné tloušťce vzorku nezáleží. Potvrdila to pokusná měření v rámci hledání správného metodického postupu měření a přípravy vzorků. K analýze byl použit přístroj Konica Minolta spektrofotometr CM 3500d. Světelný zdroj použitý při měření byl D65, tedy denní světlo. Průměr štěrbiny byl 30mm. Přístroj byl nejdříve nakalibrován, a potom bylo přístrojem změřeno celé viditelné spektrum, tj. od nm a barva byla pak vyjádřena numerickými hodnotami systému L* a*b* (CIELab). 183

184 U získaných výsledků jsme provedli mnohonásobné porovnávání, a to u jednotlivých vzorků mezi sebou, a pak jsme všechny tuky rozdělily do 5 skupin (směsné tuky, máslo se smetanovým zákysem, čerstvá másla, rostlinné tuky, stolní máslo) a mnohonásobně je porovnaly. Pro toto porovnání se použil statistický test Tukey B na hladině pravděpodobnosti 99%. Dále jsme spočítali celkovou odchylku ΔΕ* ab (totální barevnou diferenci) podle vztahu: Δ E * ab = ΔL* +Δa* + Δb* [1]. Jako standart byl zvolen vzorek čerstvého másla. Pokud je hodnota celkové odchylky ΔΕ* ab větší jak dvě, lze již mluvit o pozorovatelném rozdílu při senzorickém hodnocení. Výsledky a diskuze: Tabulka I Mnohonásobné porovnávání vzorků. Vzorky L* a* b* Δ E* ab Zlatá Haná 89,04 a 5,65 a 34,37 a 10,64 Máslo se smet. zákysem 90,39 3,10 b 26,59 b 2,45 Čerstvé máslo (standard) 91,33 3,01 c 24,32 c 0 Olivia 91,18 c 4,38 d 28,43 d 4,33 Easy 91,22 c 4,28 e 28,53 d 4,40 Máslo z Vysočiny 91,38 c 2,86 f 25,12 e 0,82 Stolní máslo 91,73 d 2,44 g 23,98 c 0,77 Horní indexy ukazují průkazné rozdíly (P<0,01) U hodnoty L* existuje statisticky průkazný rozdíl u vzorků Zlatá Haná, Másla se smetanovým zákysem a Stolního másla. Ty se liší od všech. Mezi vzorky Čerstvého másla, Olivia, Easy a Másla z Vysočiny není statisticky průkazný rozdíl. U hodnoty b* je to podobné. Pouze vzorky Zlatá Haná, Másla se smetanovým zákysem a Másla z Vysočiny se lišily od všech. Zatímco hodnota a* ukazuje statisticky průkazné rozdíly u všech vzorků mezi sebou a je tedy pro nás nejvýznamnější při rozlišování jednotlivých druhů tuků a při jejich určování je pro nás rozhodující. Nejvyšší hodnotu Δ E* ab má vzorek Zlatá Haná. Tento tuk má sytější a výraznější barvu než všechny ostatní. Naopak nejvíce se barevně standardu podobal vzorek Stolního másla. Tabulka II Mnohonásobné porovnávání skupin tuků. Skupina L* a* b* Δ E* ab směsné tuky 89,04 a 5,65 a 34,37 a 10,29 máslo se smet. zákysem 90,39 b 3,10 b 26,59 b 2,10 čerstvá másla (standard) 91,35 c 2,93 c 24,72 c 0 rostlinné tuky 91,20 c 4,33 d 28,48 d 4,01 stolní máslo 91,73 d 2,44 e 23,98 e 0,97 Horní indexy ukazují průkazné rozdíly (P<0,01) Tukeyův test ukázal, že mnohonásobné porovnávání skupin tuků je statisticky vysoce průkazné (P<0,01) jak pro hodnoty a*, tak i pro hodnoty b*. Nejvyššího průměru hodnoty a* a b* dosáhla skupina směsných tuků, naopak nejnižší vykazovala skupina stolních másel. Právě tyto části remisního spektra se tedy jeví jako zásadní pro posuzování původu tuků v produktech. Nejvyšší hodnotu Δ E* ab dosáhla také skupina směsných tuků. 184

185 Kromě numerických hodnot byla barva definována i remisním spektrem, což je výsledek měření v celém viditelném spektru, tj. od 380 do 780 nm. Obr.1. Remisní spektrum vzorků: Zlatá Haná, Máslo se smetanovým zákysem, Čerstvé máslo, Olivia, Easy. Z obrázku je patrné, že spektrum není jednotné. Spektra Čerstvého másla, Másla se smetanovým zákysem, Easy a Olivie leží blízko u sebe. Jediná křivka, která se odděluje od ostatních patří vzorku Zlaté Hané. Nejvyšší hodnoty L* jsou patrné v oblasti od 650 do 700 nm. Tato oblast vlnových délek odpovídá světlu červené barvy. Přitom ve skutečnosti vidíme máslo jako odstíny žluté barvy. V oblasti od 400 do 500 nm se nejvíce projevuje rozdíl v měření mezi jednotlivými vzorky. Závěr: Práce byla zaměřena na snahu o vytvoření metodiky pro hodnocení barvy u vybraných mléčných výrobků a dále na potvrzení hypotézy, jestli můžeme na základě barevnosti od sebe rozpoznat jednotlivé skupiny mléčných, rostlinných a směsných tuků. Z výsledků potom můžeme usuzovat, že základní hypotéza se potvrdila. Můžeme tedy říci, že produkty s rozdílným původem tuku lze od sebe rozeznat na základě hodnocení barvy. A to na základě hodnocení barvy spektrofotometricky, neboť se jasně dokázala důležitost měření celého remisního spektra. Na základě měření jsme zjistily, že charakteristickou oblastí záření jednotlivých vzorků tuků, je oblast s nižší vlnovou délkou světla. Barevná souřadnice a* definující oblast červené barvy se jevila v našem pokusu jako ideální k rozlišení jednotlivých skupin vzorků. Toto zjištění by mohlo v budoucnu najít uplatnění v kontrolních metodách, kdy by byl nakalibrovaný přenosný spektrofotometr schopen ihned určit původ tuku v produktech ve spotřebitelské síti. Másla podle našich výsledků mají sice méně výraznou sytost barvy, nicméně spotřebitel nenakupuje jen posle barvy. Je nutné podotknout, že tato práce je jakýmsi začátkem v ověřování myšlenky, že na základě barevnosti určíme původ tuků. A to proto, že pro hodnocení bylo použito jen sedm různých druhů tuků (každý ve čtyřech vzorcích). Navíc tyto vzorky pocházely z jedné šarže a jednoho produkčního období. Pro přesnou deskripci potřebuje tato práce víceleté pozorování všech druhů tuků a jejich dlouhodobý výzkum. K analýze by měly být použity vyšší počty vzorků širšího sortimentu másel, směsných tuků a rostlinných tuků, neboť jedním z mnoha vlivů na barevnost tuků může být technologický postup výroby. 185

186 Použitá literatura: 1. McLaren, K Development of CIE 1976 (LAB) uniform color space and color-difference. Journal of the society of dyers and colourists, 1976, č. 92, s ISSN Nařízení rady (ES) č. 2991/94 ze dne 5. prosince 1994, kterým se stanovují normy pro roztíratelné tuky. 3. Nováková, L. Využití spektrometrie k hodnocení kvality másla. Brno : Mendlova univerzita v Brně, s. Diplomová práce. Vedoucí práce doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. 4. Sojčat, Z. Nauka o barvě a světle: Studijní opora k předmětu.brno.vysoké učení technické v Brně, Kontaktní adresa: Ing. Miroslav Jůzl, Ph.D., Mendelova univerzita v Brně, agronomická fakulta, ústav technologie potravin, Zemědělská 1, Brno, mendelu.cz, Ing. Monika Kozelková, Mendelova univerzita v Brně, agronomická fakulta, ústav technologie potravin, Zemědělská 1, Brno, mendelu.cz. 186

187 ZMĚNY DUSÍKATÝCH LÁTEK V PŘÍRODNÍCH SÝRECH V ZÁVISLOSTI NA PODMÍNKÁCH ZRÁNÍ A SKLADOVÁNÍ Pachlová Vendula 1), Buňka František 2), Buňková Leona 3), Weiserová Eva 3), Hladká Kristýna 1), Kráčmar Stanislav 1) 1) Ústav biochemie a analýzy potravin, FT UTB ve Zlíně 2) Ústav technologie a mikrobiologie potravin, FT UTB ve Zlíně 3) Ústav technologie tuků, tenzidů a kosmetiky, FT UTB ve Zlíně Changes of nitrogenous substances in nature cheese depending on ripening and storage condition Summary: The aim of the work was to describe the development of free amino acids and its derivates (asparagic acid, threonine, serine, asparagine, glutamic acid, glutamine, proline, glycine, alanine valine, methionine, cysteine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, histidine, arginine, ornithine, citruline and γ-aminobutyric acid) and protein profile in 4 layers of Dutch-type cheese depending on 3 ripening/storage regimes during a 168-day period. Free amino acids were analysed by means of ion-exchange chromatography and protein profile using SDS-PAGE. The highest content of free amino acids was determined in cheeses stored in a ripening cellar at a temperature of 10 C during the whole observation period. Lower free amino acids content was determined in samples which were moved into a cold storage device (5 C) after 38 days of storage in a ripening cellar (10 C). The lowest concentrations of free amino acids were detected in cheeses which were moved into a cold storage device (5 C) after 23 days of storage in a ripening cellar (10 C). Úvod Přírodní sýry patří k celosvětově nejrozšířenějším mléčných výrobkům a zahrnují několik skupin produktů lišících se zejména způsobem srážení mléka, podmínkami při zpracování sýřeniny a při zrání. Každá skupina přírodních sýrů má své charakteristické podmínky zrání, které se vzájemně odlišují zejména použitou teplotou, relativní vlhkostí zracích prostor, obalem (pokud se aplikuje) a četností speciálních operací (propichování, omývání během zrání aj.). U jednotlivých skupin sýrů rovněž existuje jiná optimální délka zrání, která se může pohybovat od několika dnů po několik týdnů či měsíců a ve výjimečných případech i po několik let. K nejpopulárnějším přírodním sýrům, zejména v kontinentální Evropě, patří bezesporu sýry eidamského typu, u kterých se jako optimum zrání za běžných podmínek udává 6 8 týdnů. 1 4 Zrání sýrů zahrnuje mikrobiologické, resp. biochemické změny, které je možné podle McSweeney 2 rozdělit na primární a sekundární procesy. K primárním procesům řadíme přeměnu laktózy za vzniku kyseliny mléčné (popř. dalších metabolitů jako je oxid uhličitý, laktáty, acetáty, propionáty, diacetyl aj.), dále pak proteolýzu (konečným produktem jsou volné aminokyseliny) a u většiny přírodních sýrů v omezeném rozsahu i lipolýzu (konečným produktem jsou volné mastné kyseliny). Sekundární procesy zahrnují reakce, při kterých jsou zejména volné aminokyseliny a volné mastné kyseliny přeměňovány na těkavé složky aroma. Jedná se například o procesy deaminace, dekarboxylace, transaminace, eliminace, desulfurace aj. 2,4 8 Optimální průběh zrání, který je kromě dodržování přísných hygienických podmínek ovlivňován zejména teplotou a délkou zrání, podmiňuje vývoj aroma a konzistence charakteristické pro daný typ sýrů. 5,6 Podle Komprda a kol. 9 nebo Novella-Rodrígues a kol. 10 se může rychlost výše zmíněných reakcí v jednotlivých částech přírodního sýra odlišovat, což se může projevit nehomogenní distribucí meziproduktů a produktů primárních a sekundárních procesů ve hmotě vzorku. Novella-Rodrígues a kol. 10 a Komprda a kol. 11 poukazují na skutečnost, že odlišná rychlost reakcí v jednotlivých částech přírodních sýrů je dána především různými podmínkami pro růst mikroorganizmů a aktivitu jejich enzymatických systémů. Tyto podmínky jsou dány například obsahem dostupného kyslíku, vodní aktivitou a s tím souvisejícím obsahem NaCl. S postupující dobou zrání se rozdíly mezi jednotlivými částmi přírodních sýrů obvykle zmenšují a dochází k relativnímu vyrovnání chemického složení jednotlivých vrstev. Prací zabývajících se vývojem distribuce dusíkatých látek vzniklých při primárních anebo sekundárních procesech v přírodních sýrech není publikováno 187

188 mnoho. Pokud jsou takové publikace k dispozici, pak se obvykle omezují pouze na sledování změn na okraji a v jádře sýrů (např. Komprda a kol. 9,11 ). Článek, který by se zabýval změnami distribuce dusíkatých látek ve více jak 2 vrstvách v průběhu zrání, nebyl autory nalezen. Ačkoliv je proces zrání klíčový pro jakost finálního produktu, jedná se zároveň i o poměrně nákladnou operaci, na jejíž optimální průběh musí výrobci vynakládat nemalé prostředky (údržba zracích sklepů, náklady na energie a lidské zdroje, manipulační technika, finanční náklady na prodlevu mezi výrobou a expedicí produktu aj.). 12 Proto se v poslední době stupňuje zájem řady výzkumných týmů o nalezení metod akcelerace zracího procesu, které na jedné straně zkrátí potřebnou dobu zrání, ale na druhé straně významně nezhorší funkční a senzorické vlastnosti finálního výrobku. 5,12 K takovým metodám akcelerace můžeme zařadit zejména: (i) zvýšenou zrací teplotu; (ii) přídavek speciálních enzymů; (iii) chemicky anebo fyziálně modifikované bakteriální buňky; (iv) geneticky modifikované mikroorganizmy; (v) doplňkové kultury; anebo (vi) extrakty z již vyrobených a prozrálých sýrů. 2,6 V dnešní době lze v prostředí střední a východní Evropy zaznamenat jiný fenomén, a to dřívější vyskladnění nevyzrálých produktů do distribuční sítě. U sýrů eidamského typu se tato doba dokonce zkracuje až na 2 4 týdny. V distribuční síti a následně u spotřebitelů jsou produkty skladovány za chladírenských teplot (obvykle 4 6 C), které jsou však významně nižší než činí optimum pro zrací procesy výše zmíněných produktů. Všeobecně převládá názor, že takovéto zkrácení doby zrání bez odpovídající akcelerační techniky, bude mít za následek přírodní sýr s jinými (mnohdy horšími) senzorickými i funkčními vlastnostmi ve srovnání s produktem, který zrál standardní dobu při optimálních podmínkách (zejména teplotních) Detailnější charakteristika změn jakosti zapříčiněné zkrácením doby zrání a následnou distribucí a skladováním za chladírenských teplot však v dostupné literatuře nalezena nebyla. Cílem práce bylo srovnat vybrané vlastnosti přírodních sýrů (obsah volných aminokyselin a proteinový profil), u nichž byl zrací proces předčasně ukončen a které byly následně skladovány při chladírenské teplotě, s produkty, u kterých probíhal zrací proces při optimálních teplotních podmínkách. Distribuce testovaných složek byla u přírodních sýrů zraných/skladovaných za různých podmínek sledována v celkem 4 vrstvách produktu. Materiál a metody Vzorky eidamských sýrů (obsah sušiny 50 % w/w a obsah tuku v sušině 30 % w/w) byly získány jako část standardní výroby od producenta z České republiky vyrábějícího přírodní sýry z pasterovaného mléka. Sýry byly vyrobeny podle stejného technologického postupu ve stejný den a z každé šarže bylo pro účely této studie odebráno 108 cihel. Eidamské cihly (1,2 1,4 kg; cca 9 cm vysoké, 9 cm široké a 14 cm hluboké) byly po uzavření do cryovacového obalu uloženy do zracího sklepa s teplotou 10 ± 2 C. Po 23 dnech (od počátku výroby) bylo 32 cihel přemístěno ze sklepa do lednice (5 ± 1 C), kde probíhalo další skladování (dále označeno jako A). Po 38 dnech zrání (od počátku výroby) bylo do lednice přemístěno dalších 24 cihel (dále označeno jako B). Zbylá část cihel z každé šarže (označeno jako kontrola) zůstala po celou dobu pokusu ve zracím sklepě (celkem 168 dnů). Odběry vzorků ze sklepa (a později i z lednice) byly realizovány v 1., 2., 3., 4., 7., 10., 13., 16., 20., 23., 27., 30., 34., 38., 43., 49., 56., 63., 70., 84., 98., 112., 126., 140., 154. a 168. dnu od počátku výroby (v den 1 byly sýry vyrobeny, vylisovány a uloženy do solné lázně, v den 2 byly sýry vyjmuty ze solné lázně, zabaleny do cryovacového obalu a uloženy do zracího sklepa). Pro chemické analýzy odebírány vždy 2 paralelní cihly z každého režimu zrání/skladování. Z každé odebrané cihly byl příčně vykrojen středový pás (cca 9 cm vysoký, 9 cm široký a 2 cm hluboký). Tento středový pás byl rozdělen na 4 vrstvy: 7 mm od okraje (vrstva I; okraj), dalších 14 mm (vrstva II), dalších 14 mm (vrstva III) a zbylý střed (vrstva IV). Každá z těchto vrstev byla v jednotlivých odběrových dnech analyzována. Pro analýzu obsahu volných aminokyselin a elektroforetickou analýzu byly vzorky jednotlivých vrstev sýra nejprve lyofilizovány s použitím přístroje Christ Alpha 1 4 (Christ, Německo). 188

189 Volné aminokyseliny byly z lyofilizovaných vzorků extrahovány litno-citrátovým pufrem a stanoveny postupem dle Buňkové a kol. 17 Využita byla iontově výměnná kapalinová chromatografie s použitím Automatického Analyzátoru Aminokyselin AAA400 (Ingos, ČR). Stanoveno bylo celkem 22 aminokyselin a jejich derivátů asparagová kyselina, treonin, serin, asparagin, glutamová kyselina, glutamin, prolin, glycin, alanin, valin, metionin, cystein, izoleucin, leucin, tyrozin, fenylalanin, lyzin, histidin, arginin, ornitin, citrulin, γ-aminomáselná kyselina. Příprava vzorků pro SDS-PAGE (sodium dodecylsulfát polyakrylamidová gelová elektroforéza) byla provedena podle postupu publikovaného v Lazárková a kol. 18 K elektroforetické separaci byl použit systém pufrů dle Laemmli 19 a vertikálního elektroforetického zařízení (Biorad). Vizualizace byla provedena pomocí barvení Coomassie Brilliant Blue 20 a výsledky byly zhodnoceny s využitím softwaru Ultra Quant TM 6.0 (Ultra-Lum. Inc., USA). Výsledky obsahu volných aminokyselin byly statisticky vyhodnoceny s využitím Kruskall- Wallisova testu a Wilcoxonova testu. 21 Dále bylo využito Pearsonových korelačních koeficientů. Výsledky elektroforézy byly podrobeny shlukové analýze. Pro vyhodnocení byl využit program Unistat 5.5 (Unistat Ltd., UK). Výsledky a diskuze Modelové šarže přírodních sýrů eidamského typu byly analyzovány v průběhu 168 dnů zrání za tří odlišných podmínek zrání/skladování s cílem (i) detekovat změny v distribuci vybraných složek v jednotlivých vrstvách přírodního sýra; a (ii) popsat změny přírodního sýra v důsledku jeho předčasného vyskladnění z optimálních zracích podmínek do chladírenských teplot. Vývoj celkového obsahu analyzovaných volných aminokyselin v jednotlivých vrstvách u kontrolního vzorku v průběhu 168 dnů zrání je prezentován na Obr. 1, části A. Z výsledků vyplynulo, že celkový obsah volných aminokyselin v II. a III. vrstvě se u kontrolních vzorků od 20. dne prakticky nelišil (P 0.05) a tento stav byl následující 4 odběrové dny znovu potvrzován (23., 27., 34. a 38. den). Od 27. dne bylo vyrovnání II. a III. vrstvy (z hlediska obsahu volných aminokyselin) pozorováno i u vzorků A. Proto byly od 43. dne analyzovány již pouze 3 vrstvy I. vrstva (okraj), II. vrstva (vzniklá spojením předchozích II. a III. vrstvy) a IV. vrstva (střed). Od 98. dne analýz bylo možné pozorovat vyrovnávání celkového obsahu volných aminokyselin (P 0.05) také mezi II. vrstvou (vzniklou od 43. dne spojením II. a III. vrstvy) a IV. vrstvou, a to jak u kontrolních vzorků (viz Obr. 1, část A), tak také u vzorků A a B (data nejsou prezentována). Proto byly od 140. dne analyzovány pouze 2 vrstvy I. vrstva (okraj) a IV. vrstva (vzniklá spojením ostatních vrstev). Již od 2. dne analýz (do konce experimentu 168 dne) byl u kontrolních vzorků v IV. vrstvě detekován signifikantně vyšší celkový obsah volných aminokyselin (P<0.01) ve srovnání s I. vrstvou (Obr. 1, část A). Tento rozdíl (P<0.01) byl zaznamenán také u vzorků A a B od 27. resp. 43. dne analýz (rovněž do konce experimentu v 168. dnu; data nejsou prezentována). U všech režimů zrání/skladování platilo, že s narůstající dobou zrání/skladování se celkový obsah volných aminokyselin v jednotlivých vrstvách zvyšoval (P<0.01). Ze srovnání vývoje celkového obsahu volných aminokyselin u jednotlivých režimů zrání/skladování vyplynulo, že v odpovídajících si vrstvách byl signifikantně nejvyšší obsah (P<0.01) detekován u kontrolních vzorků, následovaly vzorky B a nejnižší obsah byl ve vzorcích A. Pro IV. vrstvy je výše zmíněný vývoj prezentován na Obr. 1, části B (pro ostatní vrstvy data nejsou prezentována). 189

190 A Obsah volných aminokyselin (g/kg) B C Doba zrání (dny) Obr. 1. Závislost obsahu volných aminokyselin (g/kg) v jednotlivých vrstvách přírodního sýra na době zrání/skladování. A suma volných aminokyselin během zrání ve zracím sklepě (10 C); I. vrstva; II. vrstva; bez symbolu III. vrstva; IV. vrstva. B suma volných aminokyselin ve IV. vrstvě; vzorky přesunuté po 23 dnech do lednice (5 C); vzorky přesunuté po 38 dnech do lednice (5 C); vzorky uchovávané po celou dobu ve zracím sklepě (10 C). C obsah volného leucinu; vzorky přesunuté po 23 dnech do lednice (5 C); vzorky přesunuté po 38 dnech do lednice (5 C); vzorky uchovávané po celou dobu ve zracím sklepě (10 C). Vyjádřeno jako průměr, chybové úsečky reprezentují S.D. (n = 16). Celkový obsah volných aminokyselin byl vypočten jako součet 22 testovaných aminokyselin a jejich derivátů. Z hlediska obsahu byl nejvýznamnější volnou aminokyselinou leucin, a to v průběhu celého 168denního experimentu. Pro ilustraci je vývoj obsahu leucinu ve IV. vrstvě u výrobků uchovávaných v režimu A, B a kontrolních vzorků zobrazen na Obr. 1, části C. Nejvyšší obsahy volného leucinu byly v jednotlivé dny analýz zaznamenávány u kontrolních vzorků ve IV. vrstvě (Obr. 1, část C; P<0.01), naopak nejnižší koncentrace byly detekovány v I. vrstvě u vzorků A (data nejsou prezentována; P<0.01). Vývoj obsahu většiny ostatních aminokyselin a některých jejich derivátů (asparagová kyselina, treonin, serin, asparagin, glutamová kyselina, glutamin, prolin, glycin, alanin, valin, metionin, cystein, izoleucin, fenylalanin, lyzin, histidin a γ-aminomáselná kyselina) měl obdobný trend a pozitivně koreloval s vývojem obsahu leucinu, což vyplývá z vysokých korelačních koeficientů (P<0.001) pohybujících se v intervalu ( ). Výjimku tvořily aminokyseliny: tyrozin (korelační koeficient ; P 0.05), 190

191 arginin (korelační koeficient ; P 0.05) a dále ornitin a citrulin (korelační koeficienty respektive ; P<0.01). Vzdálenost Vzorky Obr. 2. Dendrogram shlukové analýzy výsledků proteinového profilu IV. vrstev sýrů eidamského typu. Čísla v ose Y reprezentují dobu zrání/skladování a písmena režim zrání/skladování (A vzorky přesunuté po 23 dnech do lednice (5 C); B vzorky přesunuté po 38 dnech do lednice (5 C); C vzorky uchovávané po celou dobu ve zracím sklepě (10 C)). SDS-PAGE analýzou byly v průběhu 168denního experimentu detekovány proteiny o velikosti 3 31kDa, přičemž počet detekovaných proteinů se s narůstající dobou zrání/skladování zvyšoval (z původních cca 14 pro 1. den a I. vrstvu na finálních cca 34 pro 168. den a IV. vrstvu u kontrolních vzorků). Výsledky stanovení proteinového profilu vzorků sýrů v jednotlivých vrstvách byly zpracovány pomocí shlukové analýzy. Z výsledků jednoznačně vyplývá, že se proteinový profil v jednotlivých vrstvách odlišuje a významně se mění rovněž s narůstající dobou zrání (dendrogram není uveden). V Obr. 2 jsou zobrazeny výsledky IV. vrstev vzorků skladovaných ve 3 různých režimech zrání/skladování. Rovněž z tohoto dendrogramu vyplynulo, že dochází k významným změnám proteinových profilů vzorků s narůstající dobou zrání/skladování. Obr. 2 rovněž ukazuje na odlišný proteinový profil IV. vrstev vzorků, které jsou uchovávány v různých 191

192 režimech zrání/skladování. Nárůst obsahu volných aminokyselin a měnící se proteinový profil v průběhu zracích procesů je popisován v řadě studií. 1,3,13,15 Tyto změny souvisí s enzymatickou aktivitou extra- i intracelulárního proteolytického aparátu starterových a non-starterových LAB. Některé volné aminokyseliny však mohou vznikat i při sekundárních biochemických procesech, např. glutamová kyselina z α-ketoglutarátu činností aminotransferáz. 2,4,6,8 Rozdíly v intenzitě proteolytických procesů v jednotlivých vrstvách sýrů pravděpodobně souvisí s různými mikroenvironmentálními podmínkami v jednotlivých vrstvách, které ovlivňují metabolizmus LAB Proteolytické změny, které ve sledovaných vzorcích přírodních sýrů probíhaly, byly významně ovlivněny režimem zrání/skladování. Pomalejší nárůst obsahu volných aminokyselin v důsledku nižších teplot zrání/skladování popisují i Al-Otaibi & Wilbey. 14 Z výsledků obsahu jednotlivých volných aminokyselin vyplynulo, že zejména arginin a tyrozin mají odlišný průběh ve srovnání s ostatními volnými aminokyselinami. Arginin a jeho katabolizmus má poměrně specifické postavení mezi ostatními volnými aminokyselinami. Podle Christensen a kol. 8 využívají LAB volný arginin nejen k syntéze svých proteinů a peptidů (jako ostatní aminokyseliny), ale přednostně také k získávání energie. Dochází zde ke konverzi volného argininu za vzniku amoniaku, ornitinu (s meziproduktem citrulinem), CO 2 a adenosintrifosfátu. Obsah volného argininu v naší studii byl po celou dobu experimentu velmi malý (<0,03 g/kg), a to bez ohledu na režim zrání/skladování. Pravděpodobně docházelo k tomu, že uvolněný arginin byl prakticky ihned použit k (i) syntéze nových proteinů nebo (ii) produkci energie. Průběh posledně zmíněné možnosti podporuje i narůstající obsah ornitinu a citrulinu v průběhu zrání. Na nízké obsahy volného argininu v průběhu 180denního zrání poukazuje také Fenelon a kol. 3 Rovněž tyrozin patří k volných aminokyselinám, které jsou v rámci sekundárních biochemických procesů poměrně rychle metabolizovány za vzniku řady senzoricky aktivních látek. 6,8 Tyrozin je rovněž prekurzorem pro vznik tyraminu biogenního aminu, jehož vysoké koncentrace (cca 100mg/kg) se v přírodních sýrech mohou vyskytovat a ohrozit tak jejich bezpečnost pro konzumenta. 2,4,17 Závěr Z této studie jednoznačně vyplynulo, že předčasné ukončení zracího procesu u sýrů eidamského typu a jejich skladování při chladírenských podmínkách ovlivní proteolytické procesy probíhající v těchto produktech. Výsledkem je tedy přírodní sýr jiný než ten, který zrál potřebnou dobu v optimálních teplotních podmínkách. Rovněž bylo zjištěno, že v průběhu zrání dochází k vyrovnávání obsahu volných aminokyselin v podpovrchových vrstvách přírodního sýra. Ke konci experimentu již existovaly rozdíly obsahu volných aminokyselin pouze mezi okrajovou 0,7mm vrstvou a zbytkem přírodního sýra. Tyto procesy vyrovnávání však režimem zrání/skladování ovlivněny nebyly. Poděkování: Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM Použitá literatura: 1. Bergamini, C. V., Hynes, E. R., Zalazar, C. A., (2006). Influence of probiotic bacteria on the proteolysis profile of a semi-hard cheese. International Dairy Journal, 16, McSweeney, P. L. H., (2004). Biochemistry of cheese ripening. International Journal of Dairy Technology, 57, Fenelon, M. A., O Connor, P., Guinee, T. P., (2000). The effect of fat content on the microbiology and proteolysis in cheddar cheese during ripening. Journal of Dairy Science, 83, McSweeney, P. L. H., Sousa, M. J., (2000). Biochemical pathways for the production of flavour compounds in cheese during ripening: A review. Lait, 80, McSweeney, P. L. H., Hayaloglu, A. A., O Mahony, J. A., Bansal, N., (2006). Perspectives on cheese ripening. Australian Journal of Dairy Technology, 61,

193 6. Smit, G., Smit, B. A., Engels, W. J. M., (2005). Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiology Reviews, 29, Gorostiza, A., Cichoscki, A. J., Valduga, A. T., Valduga, E. V., Bernardo, A., Fresno, J. M., (2004). Changes in soluble nitrogenous compounds, caseins and free amino acids during ripening of artisanal prato cheese; a Brazilian semi-hard cows variety. Food Chemistry, 85, Christensen, J. E., Dudley, E. G., Pederson, J. A., Steele, J. L., (1999). Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek. 76, Komprda, T., Smělá, D., Novická, K., Kalhotka, L., Šustová, K., Pechová, P., (2007). Content and distribution of biogenic amines in Dutch-type hard cheese. Food Chemistry, 102, Novella-Rodrígues, S., Veciana-Nogués, M. T., Izquerdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M. C., (2003). Distribution of biogenic amines and polyamines in cheese. Journal of Food Science, 68, Komprda, T., Burdychová, R., Dohnal, V., Cwiková, O., Sládková, P., Dvořáčková, H., (2008). Tyramine production in Dutch-type semi-hard cheese from two different producers. Food Microbiology, 25, Forde, A., Fitzgerald, G. F., (2000). Biotechnological approaches to the understanding and improvement of mature cheese flavour. Current Opinion in Biotechnoloby, 11, Topcu, A., Saldamli, I., (2006). Proteolytical, chemical, textural and sensorial changes during the ripening of turkish white cheese made of pasteurized cows milk. International Journal of Food Properties, 9, Al-Otaibi, M. M., Wilbey, R. A., (2004). Effect of temperature and salt on the maturation of white-salted cheese. International Journal of Dairy Technology, 57, Pinho, O., Ferreira, I. M. P. L. V. O., Mendes, E., Oliviera, B. M., Ferreira, M., (2001). Effect of temperature on evolution of free amino acid and biogenic amine contents during storage of Azeitao cheese. Food Chemistry, 75, Bertola, N. C., Califano, A. N., Bevilacqua, A. E., Zaritzky, N. E., (2000). Effects of ripening conditions on the texture of Gouda cheese. International Journal of Food Science and Technology, 35, Buňková, L., Buňka, F., Hlobilová, M., Vaňátková, Z., Nováková, D., Dráb, V., (2009). Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus. European Food Research and Technology, 229, Lazárková, Z., Buňka, F., Buňková, L., Holáň, F., Kráčmar, S., Hrabě, J., (2009). Effect of different heat sterilization regimes on the quality of canned processed cheese. Journal of Food Process Engineering, DOI: /j x. (v tisku) 19. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, Sambrook, J., Russel, D. W., (2001). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3 rd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York. 21. Agresti, A. (1984). Analysis of ordinal categorical data. John Wiley & Sons, Inc, New York, 284 p. Kontaktní adresa: Ing. Vendula Pachlová, Ústav biochemie a analýzy potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T. G. Masaryka 275, Zlín, tel.: , pachlova@ft.utb.cz. 193

194 MLIEKO AKO STABILNÝ ZDROJ MINERÁLNYCH PRVKOV PRE TVORBU KOSTÍ Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Centrum výskumu živočíšnej výroby Nitra, Hlohovecká 2, Lužianky, SR The milk as a stable source of minerals for building of bones Summary: The milk is an important source of minerals for building of body skeleton. The optimal combination of their levels is substantial for maximized utilisation. Directive 852/2004 EC laying down the health rules for the production and placing on the market of milk and milk based products, prescribes requirements that must be met by raw milk used for the human food production. Raw milk according to this rules used for the cheese production contains 0,93g of Calcium (variability 9,9%), 0,12g of Magnesium (variability 8,3%) and 0,96g of Phosphorus (variability 10%) per litre in average. This documents the stability of studied minerals level over seasons of year. Mlieko je významným zdrojom minerálnych látok pre stavbu kostí. Najdôležitejšie sú vápnik, fosfor, a horčík. Ich kombinácia je potrebná na optimálne vstrebávanie vápnika. V práci sa zaoberáme štúdiom obsahu týchto prvkov v mlieku v priebehu roka. Materiál a metódy V priebehu jedného roka sme pravidelne 1 krát mesačne vyšetrovali bazénové vzorky mlieka 12 poľnohospodárskych podnikov, ktoré sú vytypované mliekarňou spracujúcou mlieko na tvrdé, dlhozrejúce syry, ako podniky so stabilnou výberovou kvalitou suroviny, a ktorých mlieko sa na tento účel zváža samostatne. Týmto sú intenzívne motivované k sústavnej starostlivosti o kvalitu svojej produkcie. Vzorky tak boli odoberané z chovov, ktoré produkujú mlieko zodpovedajúce predpísaným limitom počtu somatických buniek (do 400tis./ml), celkového počtu mikroorganizmov (do 100tis./ml) a s negatívnym výskytom inhibičných látok podľa Nariadenia európskeho parlamentu a rady (ES) č. 853/2004. Prevládajúce chované plemeno na týchto farmách je holsteinské a slovenské strakaté. Analyzovali sme taktiež mliečne výrobky tejto mliekarne. Vo vzorkách sme stanovili obsah základných zložiek - tuku, bielkovín a laktózy - infračerveným absorpčným analyzátorom Milkoscan FT 120 a obsah minerálnych látok po spopolnení atómovou absorpčnou spektrometriou UNICAM 939 Solar. Výsledky a diskusia V tabuľke 1 sú uvedené výsledky a základné štatistické údaje zloženia sledovaných vzoriek mlieka. V tejto tabuľke uvádzame i minimálne hodnoty pre jednotlivé zložky predpísané normou pre surové kravské mlieko, označené ako limity STN Obsah bielkovín bol v priemere 3.23 g/100g, norma uvádza min. obsah bielkovín 2.8 g/100g, avšak základný obsah bielkovín na speňažovanie mlieka je 3.2 g/100g. Mliečne bielkoviny zaujímajú významné postavenie medzi živočíšnymi bielkovinami i z nutričného hľadiska, pretože majú priaznivé zloženie aminokyselín. V porovnaní s vaječným bielkom majú vyšší obsah lyzínu a tryptofanu. Bielkoviny mlieka tvoria viacero frakcií, z ktorých najdôležitejšie sú kazeín (pribl. 80%), a srvátkové bielkoviny, albumíny a globulíny. Z technologického hľadiska má najväčší význam obsah kazeínu v mlieku, ktorý viaže vápnik pri výrobe syrov. Obsah laktózy bol v priemere 4.78 g/100g. Z hodnôt uvádzaných v norme pre BTS (8.5 g/100g) a základný obsah bielkovín pre speňažovanie mlieka (3.2 g/100g) vychádza, že minimálny obsah laktózy by mal byť 4.6 g/100g. Mliečny cukor laktóza má význam pre technológiu kyslomliečnych produktov, ktorých výroba spočíva v mikrobiálnej fermentácii laktózy na kyselinu mliečnu. Vznikom kyslého prostredia sa mliečne bielkoviny zrážajú a vytvárajú gélovitú konzistenciu. 194

195 Tabuľka I Základné štatistické údaje výsledkov sledovaných bazénových vzoriek mlieka tuk bielkoviny laktóza Vápnik Ca Horčík Mg Fosfor P n=132 g/100g mlieka g/l mlieka priemer min max št. odch var. koeficient% limit STN Priemerný obsah tuku bol 3.88 g/100g. Norma uvádza min. obsah tuku 3.2 g/100g. Na speňažovanie sa ako základná hodnota udáva 3.6 g/100g. Nutričná hodnota mliečneho tuku spočíva v širokom spektre mastných kyselín, čo mu dodáva charakteristickú chuť, v obsahu esenciálnych mastných kyselín s vyšším počtom konjugovaných násobných väzieb a v tom, že je nositeľom vitamínov rozpustných v tuku, najmä vitamínu A, ktorý pochádza zo zelených krmív, jako aj vitamínu D, ktorý podporuje dobré vstrebávanie a využitie vápnika, obmedzuje jeho stratu obličkami. V kosti povzbudzuje jeho premenu a prestavbu, znižuje riziko zlomenín. Pre stavbu kostí sú v mlieku významné prvky vápnik, fosfor a horčík. Vyskytujú sa najviac vo forme vápenatých a horečnatých fosforečnanov. Ich kombinácia je potrebná na optimálne vstrebávanie vápnika. Komplexné soli vápnika a fosforu hydroxylapatit a karbonátapatit tvoria štruktúrny základ kostí Tabuľka II Obsah bielkovín, Ca, Mg, a P v mlieku v priebehu roka Mesiac odberu Bielkoviny (g/100g) Vápnik Ca (g/l) Horčík Mg (g/l) Fosfor P (g/l) november december január február marec apríl máj jún júl august september Obsah vápnika v sledovaných vzorkách bol priemerne 0,93g/liter mlieka, s variačným koeficientom 9.9%, čo je nižšia hodnota ako uvádza doplnkový ukazovateľ normy. Treba však poznamenať, že tento ukazovateľ patrí k najstarším, od roku 1988 nebol revidovaný, je nepovinný, žiadna mliekareň ho nemá zavedený v kontrole dodávaného mlieka, a jeho znížená hodnota je zrejme daňou za čoraz vyššiu úžitkovosť dojníc. Mlieko je teda stabilným zdrojom vápnika v ľudskej výžive. Vápnik sa v mlieku nachádza v dvojsýtnych a trojsýtnych fosforečnanoch, ktoré spájajú kazeínové komplexy vo forme kazeínanu vápanatého, čo podmieňuje jeho schopnosť vytvárať pôsobením syridla (proteolytický enzým) pevnú zrazeninu bez zmeny kyslosti. 195

196 Polovica horčíka v organizme sa nachádza priamo v bunkách celého tela, druhá polovica sa spolu s kalciom a fosforom ukladá v kostiach. Len jedno percento horčíka je v krvi, a preto je dôležité, aby hladina horčíka bola vyrovnaná. Dostatočný prísun tohto minerálu pomáha spevniť kosti. V sledovanom mlieku bol obsah horčíka v priemere 0,12g/l, mimoriadne stabilný, s najnižším variačným koeficientom 8.3%. Obsah fosforu v mlieku je taktiež významný pre zabezpečenie stavby kostí. V sledovaných vzorkách mlieka bola jeho hladina priemerne 0.96g/l, s variačným koeficientom 10%. Pomerne nízke variačné koeficienty zistených hodnôt svedčia o tom, že pozorované minimálne, ako i maximálne hodnoty sú len sporadické, bez štatistického významu. Stabilitu hladín sledovaných prvkov v mlieku počas celého roka bez ohľadu na ročné obdobie dokumentuje graf na obrázku biel. g/100g Ca (g/l) Mg (g/l) P (g/l) nov dec jan feb mar apr máj jún júl aug sep mesiac Obr. 1. Obsah bielkovín, Ca, Mg a P v mlieku v priebehu roka s vyznačením maximálnych a minimálnych hodnôt zistených v danom mesiaci. Záver Mlieko je významná potravina podporujúca zdravie so širokými možnosťami spracovania na pestrý sortiment výrobkov. V oblasti so zvýšenou starostlivosťou o mlieko sa produkuje mlieko výberovej kvality, čo umožňuje výrobu potravín zodpovedajúcich svojej nutričnej funkcii. Použitá literatura: 1. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 853/ STN Surové kravské mlieko na mliekarenské ošetrenie a spracovanie Kontaktní adresa: Ing. Katarína Kirchnerová, PhD. Centrum výskumu živočíšnej výroby Nitra Hlohovecká 2, Lužianky, Nitra, SR, kirchnerova@cvzv.sk 196

197 HODNOCENÍ SLADKÉ CHUTI V MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH Kateřina Čmejlová, Zdeňka Panovská, Alena Váchová, Jana Řeřichová Vysoká škola chemicko-technologická, Ústav chemie a analýzy potravin Evaluation of sweet taste in milk products Summary: It is increasing the interest of public in products with the name light nowadays, that is why producers of food are more interested in the materials, which are making the product less energetic. One group of these materials are alternative sweeteners (e.g. saccharin, aspartame, acesulfame-k; sucralose from the new ones). Products from milk are present in the group of products which are sweetened with these sweeteners to form products called light. The main object of this study was to verify methods of evaluation of milk products; it was used the sensory profile to evaluate milk products (yogurt drinks) sweetened with different sweeteners. We compared samples from Czech market sweetened with sucrose and alternative sweeteners (mixture of aspartame and acesulfame-k). The evaluation was taking place in the sensory laboratory and was provided by expert panel of 14 assessors, 79 % of women and 21 % of men in age of The method of sensory profile was used for evaluation. Samples were presented randomly in cups coded with four-digit number; the amount of sample was 20 ml. No difference was observed between the samples, what indicates, that the milk products sweetened with alternative sweeteners are accepted in the same way as products containing sucrose. Úvod V poslední době roste zájem veřejnosti o dietní potraviny s označením light, proto výrobci potravin obrací svou pozornost k surovinám, které by snížily obsah energie výrobku. Jednou z těchto surovin jsou nízkoenergetická sladidla (např. sacharin, aspartam, acesulfam-k, z novějších pak sukralosa). Mezi výrobky, které jsou doslazovány právě těmito sladidly, patří i ochucené výrobky mléčné (jogurty, jogurtové nápoje či tvarohy). Mnoho autorů studovalo využití nízkoenergetických sladidel pro použití v mléčných výrobcích. Hyvoneon a Slotte studovali vliv různých sladidel (xylitol, sorbitol, fruktosa, cyklamát a sacharin sacharosa byla použita jako reference) na kvalitu jogurtu. Všechna sladidla, s výjimkou sacharinu, byla vyhovující pro slazení jogurtu, sacharin je však možné použít ve směsi s xylitolem, který maskuje jeho hořkou chuť. Kvalita dietních jogurtů vyrobených z odstředěného mléka, dužniny z ovoce láhevníku (Annona muricata) a tří sladidel (aspartamu, sukralosy a fruktosy) byla hodnocena Fonsecou a Nevesem. Energetická hodnota a senzorický profil byl porovnáván s výrobkem slazeným sacharosou. Výsledky ukázaly, že energetická hodnota všech zkoumaných jogurtů byla nižší než výrobku se sacharosou a preferované pořadí bylo: výrobek s aspartamem > fruktosou > sukralosou. 1. Keating a White zkoumali využití sladidel pro vývoj kvalitního nízkokalorického jogurtu. Kontrolní jogurt (slazený sacharosou) a jogurt slazený sorbitolem a aspartamem byly hodnoceny vysoko. Tato sladidla nevykazovala žádnou přetrvávající pachuť. Naopak vzorky obsahující dihydrochalkon neohesperidinu byly trvale hodnoceny nízko, pravděpodobně pro charakteristickou hořkou a přetrvávající chuť sladidla. Ve stejné studii byly jogurty hodnoceny konzumentským panelem a výsledky ukazují, že je preferován jogurt slazený sacharosou následovaný vzorkem slazeným aspartamem, jogurt slazený acesulfamem-k vykazoval podle konzumentů hořkou pachuť. 2. Greig, Bayley a Mansfield dokazovali stejnou sladkost přidané sacharosy (2 %) a aspartamu (0,14 %) v jogurtu, s výsledkem, že vzorky s aspartamem mají lehce sladkou, doznívající pachuť, která není přítomná u vzorků se sacharosou. Redlinger a Setser naopak dokazují, že nesladké pachuti 0,22% aspartamu a 25% sacharosy v modelovém smetanovém krému nebyly významně odlišné. Nicméně, tyto nesladké pachuti byly významně nižší než jejich odpovídající reziduální sladká chuť, tedy sladkost, která doznívá po spolknutí vzorku. Reziduální sladkost sacharosy a aspartamu v modelových krémech však nebyla významně odlišná a odpovídala počáteční sladké chuti. King, Lawler a Adams popisují doznívající sladkou chuť jogurtu slazeného aspartamem jako křídovou, nezdravě sladkou a kovovou

198 Na českém trhu je možné najít mléčné výrobky slazené sacharosou, ale i aspartamem a acesulfamem-k, popř. jejich směsí. Úkolem této práce bylo ověřit metodiku pro hodnocení mléčných výrobků pro další studie. Jako výchozí byla zvolena metoda senzorického profilu, kterou byly hodnoceny dva jogurtové nápoje dostupné v prodejní síti slazené odlišnými sladidly. Materiál a metody V práci byly hodnoceny vzorky jogurtových nápojů z prodejní sítě doslazované sacharosou a nízkoenergetickými sladidly (směs aspartamu a acesulfamu-k), vzorek slazený sacharosou měl příchuť lesního ovoce, vzorek slazený nízkoenergetickými sladidly byl s příchutí grepu s malinou. Vzorky byly předkládány v náhodném pořadí, v nádobkách označených čtyřmístným náhodným číselným kódem, objem vzorku byl 20 ml. Hodnocení probíhalo metodou senzorického profilu s využitím grafické nestrukturované stupnice o délce 100 mm. Krajní body stupnice byly označeny slovním popisem, viz Tabulka I. Kromě senzorického profilu měli hodnotitelé zapsat, jakou ovocnou chuť ve vzorku rozpoznali. Hodnotitelé byli také vyzváni, aby zaznamenali své další postřehy volným slovním popisem. Tabulka I Deskriptory a jejich krajní hodnoty použité v senzorickém profilu deskriptor 0 = 100 = celková příjemnost chuti nepříjemná příjemná intenzita vůně neznatelná velmi silná intenzita sladké chuti neznatelná velmi silná příjemnost sladké chuti nepříjemná příjemná intenzita kyselé chuti neznatelná velmi silná příjemnost kyselé chuti nepříjemná příjemná intenzita ovocné chuti neznatelná velmi silná příjemnost ovocné chuti nepříjemná příjemná Hodnocení se zúčastnilo 14 odborných hodnotitelů, 79 % žen a 21 % žen ve věku let, zaměstnanci senzorické laboratoře (panel S) a firmy, jejíž hlavní činností je výroba zmrzliny (panel Z). Všichni hodnotitelé byli seznámeni s úlohou. Hodnotitelé byli vyzváni, aby opakovaně ochutnali jeden vzorek a postupně ohodnotili deskriptory uvedené ve formuláři. Po dokončení hodnocení prvního vzorku měli účastníci hodnocení zneutralizovat chuť bílým pečivem a vypláchnout ústa vodou. Následovalo hodnocení druhého vzorku. Výsledky hodnocení byly statisticky zpracovány v programu Statistica 8.0 pomocí analýzy rozptylu. Výsledky Výsledky hodnocení pro všechny hodnotitele ukazuje graf, který shrnuje srovnání vzorků, (Obrázek 1). Ačkoli je z výsledků patrné, že největší rozdíly mezi vzorky jsou v intenzitě sladké chuti, nebyly mezi vzorky statisticky významné rozdíly na hladině významnosti 5 % nalezeny. Tuto skutečnost (pro deskriptor intenzita sladké chuti) ukazuje krabicový graf uvedený jako Obrázek

199 celková příjemnost chuti příjemnost ovocné chuti intenzita vůně intenzita ovocné chuti 10 0 intenzita sladké chuti A B příjemnost kyselé chuti příjemnost sladké chuti intenzita kyselé chuti Obr. 1 Senzorický profil vzorků jogurtového nápoje mm A vzorek B Průměr Průměr±SmOdch Průměr±1,96*SmOdch Obr. 2 Krabicový graf ukazující srovnání hodnocení jednotlivých vzorků Pro bližší náhled na hodnocení byly porovnávány i výsledky panelů, při čemž nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly na hladině významnosti 5 %, což znamená, že hodnotitelé hodnotili jednotlivé deskriptory podobně. I tady je však z průměrných hodnocení možno vypozorovat, že největší rozdíly se vyskytují ve výsledcích hodnocení pro deskriptor intenzita sladké chuti (ukazuje krabicový graf na Obrázku 3). Tento fakt je nejspíš ovlivněn odlišnou citlivostí hodnotitelů na sladkou chuť, tzn. faktem, že každý jedinec vnímá sladkou chuť odlišně v závislosti na tom, jak je sám zvyklý doslazovat pokrmy. 199

200 mm S panel 200 Z Průměr Průměr±SmOdch Průměr±1,96*SmOdch Obr. 3 Krabicový graf ukazující srovnání hodnocení jednotlivých panelů Ovocná chuť vzorků byla popisována podobně. Vzorek slazený směsí alternativních sladidel byl popisován příchutěmi jahodová, malinová, mangová, višňová, či lesního ovoce. Vzorek slazený sacharosou byl označován jako borůvkový, jahodový, ostružinový, malinový, nebo s příchutí lesního ovoce. Z toho lze vyvodit, že se hodnotitelé nechali spíše vést texturou vzorku, protože oba vzorky obsahovaly drobná zrníčka lesních plodů, resp. malin. Slovní popis vzorků označoval jako lepší vzorek slazený sacharosou, protože se podle hodnotitelů v druhém vzorku vyskytovaly cizí, umělé pachuti. To však není potvrzeno senzorickým profilem, protože vzorky se v hodnocení deskriptoru celková příjemnost chuti významně nelišily (p > 0,05). Závěr Hodnocení vzorků jogurtových nápojů slazených různými sladidly neprokázalo rozdíly v oblibě vzorků ani ve vnímané intenzitě sladké chuti, vzorky byly ve všech deskriptorech senzorického profilu hodnoceny podobně, z čehož je možné usuzovat, že jogurtové nápoje slazené alternativními sladidly jsou konzumenty přijímány stejně jako produkty slazené sacharosou. Poděkování Tato práce vznikla za podpory grantu MSM Použitá literatura: 1. PINHEIRO, M. V. S. OLIVEIRA, M. N. PENNA A. L. B. TAMIME, A. Y. The effect of different sweeteners in low-calorie yogurts a review. International Journal of Dairy Technology, November 2005, vol. 58, no. 4, s KEATING, K. R. WHITE, C. H. Effect of Alternative Sweeteners in Plain and Fruit-Flavoured Yogurts. Journal of Dairy Science, 1990, vol. 73, no. 1, s KING, B. M. ARENTS, P. DUINEVELD, C. A. A. A comparison of aspartame and sucrose with respect to carryover effects in yogurt. Food Quality and Preference, 2003, vol. 14, s Kontaktní adresa: katerina.cmejlova@vscht.cz Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, Praha 6, Dejvice

201 VNÍMÁNÍ KOVOVÉ CHUTI V MLÉKU Řeřichová Jana, Panovská Zdeňka, Váchová Alena, Čmejlová Kateřina Ústav chemie a analýzy potravin, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Perception of metallic taste in milk Summary: This study deals with the sensory perception of metallic taste in milk. Metallic taste is sometimes classified among basic tastes that are sweet, salty, sour, bitter and umami. The perception of metallic taste is a combination of olfaction-taste. Metallic taste have for example divalent metals namely iron. Iron is sometimes used for fortification of food (e.g. infant formula, bread, pasta, cereal flour that is stored for only short time, salt, sugar and milk), because they are essential for people. Milk is relatively poor in iron (0.2 mg/kg). Iron is sometimes used for fortification of diary products (e.g. Cheddar cheese, Mozzarella cheese, Harvati cheese, yogurt and chocolate milk). This study deals with perception of metallic taste ferrous sulfate in milk. The evaluation was carried out by students and staff from ITC PRAGUE. Two description methods were used for evaluations, the best estimate threshold and paired comparison test. Results show, that matrix sample has influence on the best estimate threshold. The lower detection threshold was found for ferrous sulfate in milk 0.5 % fat ( g/l) and higher detection threshold had ferrous sulfate in milk 3.5 % fat ( g/l). Detection thresholds were confirmed by paired comparison test. Úvod Za základní chutě jsou v současné době považovány sladká, hořká, kyselá, slaná a umami. Podle normy ČSN ISO 5492 je mezi základní chutě zařazena i chuť kovová 1. Ta se od ostatních liší tím, že jde o kombinovaný počitek čichově-chuťový 2. Kovovou chuť způsobují různé soli dvojmocných kovů, které se liší svými senzorickými vlastnostmi 3. Za standard kovové chuti je považován heptahydrát síranu železnatého (FeSO 4.7H 2 O) 4,5.V potravinách se na železo díváme ze dvou hledisek, jednak jako na nežádoucí složku z obalů, výrobních zařízení, nádobí a nástrojů, ale na druhou stranu také jako na složku, kterou se některé potraviny fortifikují. Vnímání kovové chuti síranu železnatého je značně individuální. Rozdíl v prahu citlivosti se mezi jednotlivými hodnotiteli může lišit až o tři řády 6. Železo je pro lidský organizmus esenciální a jeho příjem potravou je často deficitní. Proto je snaha o jeho fortifikaci. Doporučený příjem železa se liší podle věku a pohlaví. Pro kojence je doporučený příjem železa 6 mg/den, pro děti 10 mg/den, pro muže mg/den a pro ženy mg/den, v těhotenství se doporučuje zvýšit příjem železa na 30 mg/den (lit. 7 ). Nedostatek železa postihuje více než jednu miliardu lidí na celém světě a může způsobovat anémii, narušení termoregulace a funkce imunitního systému, záněty jazyka a ústních koutků a může způsobit problémy v těhotenství 3,7. Deficit železa je nejvyšší v rozvojových zemích a nejčastěji jsou jím postiženy ženy a děti 3. Aby se zabránilo deficitu železa u některých rizikových skupin, byla zavedena v řadě zemí jeho fortifikace 7. Fortifikace potravin V Evropské unii je v platnosti od 1. července 2007 směrnice EU 2006/1925/EC, která harmonizuje fortifikaci potravin. Povoluje přidávat do potravin vitamíny a minerální látky, které jsou uvedeny v seznamu. Sjednocuje tak legislativu jednotlivých států a usnadňuje jednotný evropský trh s potravinami a volný pohyb zboží. V EU je v současné době povoleno přidávat více než 80 odlišných chemických látek 8. Podle této směrnice je povoleno do potravin přidávat např. následující sloučeniny železa: uhličitan, citrát, glukonát, fumarát, laktát a síran železnatý, citrát železito-amonný, difosforečnan sodno-železitý, difosforečnan železitý, sacharát železitý, bisglycinát železitý a elementární železo 9.V České republice vstoupila v platnost od 1. července 2008 Vyhláška č. 225/2008 Sb., kterou se stanovují požadavky na doplňky stravy a na obohacování potravin. Tuto vyhlášku vydalo ministerstvo zdravotnictví a zapracovává příslušné předpisy Evropského společenství

202 Železem se může obohacovat dětská výživa, chléb, cereální mouka (skladována jen krátkou dobu), kakao, sojová a rybí omáčka, kari koření, cukr, sušené mléko aj., i v těchto případech však může dojít k nechtěné barvené změně a vzniku kovové chuti produktů 11,12. Fortifikace mléka a mléčných výrobků Kravské mléko přirozeně obsahuje poměrně malé množství železa (0,2 mg/kg) a tento obsah se liší mezi jednotlivci (je závislý na období laktace, ale ne na krmivu). Distribuce železa v mléce je 14 % v mléčném tuku, 24 % v kaseinu, 29 % v syrovátkových bílkovinách a 32 % je v nízko-molekulární-hmotnostní frakci. Ve smetaně je rozdělení železa % v kaseinu, % v syrovátkových bílkovinách a % je v nebílkovinné frakci 13. Fortifikace mléka a mléčných výrobků železem je považována za možný přístup ke snížení potíží z nedostatku železa. Nicméně, výsledky týkající se organoleptických změn, dostupnosti a distribuce železa ve tkáních jsou protichůdné. Tyto modifikace jsou závislé na různých faktorech např. fyzikálněchemických (mocenství železa, rozpustnost, stupeň chelatace a tvorba komplexů). Proto je potřeba zjistit co a jaké faktory ovlivňují vlastnosti mléka a mlékárenských výrobků po jejich obohacení železem 13. Pro fortifikaci mléka a mléčných výrobků železem mohou být použity tři kategorie sloučenin železa, a to sloučeniny, které jsou zcela rozpustné ve vodě a v mléku (patří sem dvojmocné a trojmocné soli železa). Tyto sloučeniny mohou interagovat se složkami mléka a měnit tak jejich senzorické vlastnosti. Do druhé kategorie patří elementární železo, jde o prášek s různou velikostí částic vyrobený redukcí H 2, CO nebo elektrolyticky. Elementární železo je nerozpustné ve vodě, proto může být použito pouze pro fortifikaci pevných dehydratovaných potravin. Poslední kategorií jsou komplexy železa s proteiny nebo fosfoproteiny. Takto vázané železo po přidání do mléka nereaguje s jeho dalšími složkami 13. Různé studie se zabývají problematikou fortifikace mléčných výrobků různými formami železa, kde byl sledován vliv přidaného železa na změnu senzorických a technologických vlastností. Byla snaha obohacovat jím některé mlékárenské výrobky např. sýry Čedar, Mozzarella, Cottage, jogurty a čokoládové mléko 13. V tabulce jsou uvedeny vybrané studie zabývající se touto problematikou. Tabulka I Studie zabývající se fortifikací mléčných výrobků Mléčný výrobek Forma přidaného železa Citace Sýr Čedar Sýr Mozzarella White soft sýr chlorid železitý, komplex železa s kaseinem, komplex železa s bílkovinami syrovátky železo chelatované v kaseinu a proteinu, chlorid železitý elementární železo, chlorid železitý, síran železnatý Zhang D. (1991) 14 Rice W.H. (1998) 15 El-samaragy Y.A. (1995) 16 Pekařský a cottage sýr citrát železito-amonný Sadler A.M. (1973) 17 Harvati sýr chlorid železitý Jackson S. (1992) 18 Jogurt Čokoládové mléko železo chelatované v kaseinu a proteinu fumarát železnatý, pyrofosfát železitý, síran železnatý Hakmat S. (1997) 19 Hurell R.F. (1991)

203 Experimentální podmínky Tato práce se zabývá stanovením prahu citlivosti síranu železnatého přidaného do mléka a změnou jeho senzorických vlastností. Pro hodnocení byla použita metoda slovního popisu, pak byl stanoven práh citlivosti a pro jeho ověření byla použita párová zkouška. Práh citlivosti byl stanoven metodou BET dle normy ISO Pro hodnocení se používá sada šesti vzrůstajících koncentrací vzorku, jejichž koncentrace se zvyšuje s konstantním faktorem. Hodnotitelé mají za úkol v každé koncentraci ohodnotit sadu tří vzorků a určit, který vzorek je odlišný (v sadě je vždy jeden vzorek s příslušnou koncentrací sledované látky a dva obsahují čistý vzorek) 21. BET se vypočítá jako geometrický průměr nejvyšší nedetekované koncentrace a nejnižší detekované koncentrace 21,22. Párová zkouška je způsob, při kterém jsou podněty předkládány ve dvojicích pro porovnání na základě nějakého určitého kritéria. Hodnocení bylo povedeno podle normy ČSN EN ISO 5495 a výsledky byly vyhodnoceny na hladině významnosti 5 % (lit. 23 ). Pro přípravu vzorků bylo použito mléko s tučností 0,5 % a 3,5 % koupené v tržní síti a heptahydrát síranu železnatého s čistotou 99,0 % (výrobce Penta). Hodnocení se účastnili studenti a zaměstnanci VŠCHT Praha ve věku 20 až 50 let. Vzorky byly hodnotitelům předkládány v kádinkách označených čtyřmístným číselným kódem. Výsledky a diskuse Hodnotitelé byli nejprve požádáni, aby slovně ohodnotili předložený vzorek mléka se síranem železnatým, aniž by věděli, co mléko obsahuje. V nižších koncentracích nebyli hodnotitelé schopni rozpoznat kovovou chuť a vzorek popisovali spíše neutrálně, ve vyšších koncentracích vyskytujících se nad prahem citlivosti již kovovou chuť bezpečně rozpoznali a vzorek popisovali jako kovový. Pro hodnocení prahu citlivosti v mléce s obsahem tuku 3,5 % byla použita koncentrační řada v rozmezí koncentrací 0,0057 g/l až 0,5560 g/l s faktorem ředění 2,5. Skupinový práh citlivosti vypočtený jako geometrický průměr jednotlivých hodnot byl pro síran železnatý v mléce s obsahem tuku 3,5 % 0,0287 g/l. Na obrázku č.1 je procentuální zastoupení individuálních prahů citlivosti v panelu hodnotitelů. Rozložení prahů citlivosti BET mezi jednotlivými hodnotiteli pro mléko 3,5 % tuku 40,0 % BET 30,0 20,0 10,0 0,0 0,009 0,0225 0,0563 0,1406 koncentrace [g/l] Obr. 1. Rozložení prahů citlivosti mezi jednotlivými hodnotiteli pro mléko s obsahem tuku 3,5 % Hodnocení párovou zkouškou se zúčastnilo 20 hodnotitelů (4 muži a 16 žen). Hodnotu pod prahem citlivosti nebyli hodnotitelé na hladině významnosti 5 % schopni rozpoznat. Koncentraci nad prahem citlivosti rozpoznali. Výsledky jsou uvedeny v tabulce II. 203

204 Tabulka II Párová zkouška: mléko 3,5% tuku FeSO 4.7H 2 O c=0,004 a 0,04 g/l Koncentrace FeSO 4.7H 2 O [g/l] Počet správných odpovědí Počet špatných odpovědí Kritická hodnota (α = 0,05) 0, , Pro hodnocení prahu citlivosti v mléce s obsahem tuku 0,5 % byla použita koncentrační řada v rozmezí koncentrací 0,0009 g/l až 0,0889 g/l také s faktorem ředění 2,5. Skupinový práh citlivosti vypočtený jako geometrický průměr jednotlivých hodnot byl pro síran železnatý v mléce s obsahem tuku 0,5 % 0,0095 g/l. Na obrázku č.2 je procentuální zastoupení individuálních prahů citlivosti v panelu hodnotitelů. Rozložení prahů citlivosti BET mezi jednotlivými hodnotiteli pro mléko 0,5 % tuku 40,0 % BET 30,0 20,0 10,0 0,0 0,0036 0,009 0,0225 0,0563 Koncentrace [g/l] Obr. 2. Rozložení prahů citlivosti mezi jednotlivými hodnotiteli pro mléko s obsahem tuku 0,5 % Hodnocení párovou zkouškou se zúčastnily dvě skupiny hodnotitelů. První 16-ti členná skupina (2 muži, 14 žen) obdržela k hodnocení koncentraci 0,002 g/l, která se nachází pod prahem citlivosti. Tuto koncentraci nebyli hodnotitelé schopni na hladině významnosti 5 % rozpoznat. Druhá 17-ti členná skupina hodnotitelů (5 mužů, 12 žen) obdržela k hodnocení koncentraci 0,03 g/l nacházející se nad prahem citlivosti. Tuto koncentraci již byli hodnotitelé schopni rozpoznat. Výsledky hodnocení jsou uvedeny v tabulce III. Tabulka III Párová zkouška: mléko 0,5% tuku FeSO 4.7H 2 O c=0,002 a 0,03 g/l Koncentrace FeSO 4.7H 2 O [g/l] Počet správných odpovědí Počet špatných odpovědí Kritická hodnota (α = 0,05) 0, , Pro porovnání vlivu matrice na vnímání přidaného síranu železnatého jsou v tabulce IV uvedeny hodnoty prahu citlivosti síranu železnatého v demineralizované, destilované, vodovodní vodě a v mléce s obsahem tuku 0,5 a 3,5 %. 204

205 Tabulka IV Porovnání prahů citlivosti FeSO 4.7H 2 O ve vodě a v mléku (lit. 24 ) Matrice Individuální hodnota BET [g/l] Minimální Maximální Skupinový BET [g/l] Demineralizovaná voda 0,0005 0,0067 0,0021 Destilovaná voda 0,0008 0,0067 0,0025 Vodovodní voda 0,0011 0,0067 0,0043 Mléko s 0,5 % tuku 0,0036 0,0563 0,0095 Mléko s 3,5 % tuku 0,0090 0,1406 0,0287 Jak je z této tabulky patrné, tak nejnižší práh citlivosti je v demineralizované vodě. Práh citlivosti pro mléko s obsahem tuku 0,5 % je blízký prahu citlivosti ve vodě vodovodní Práh citlivosti pro mléko s obsahem tuku 3,5 % je nejvyšší ze všech sledovaných matric. Z toho vyplývá, že čím je matrice složitější a obsahuje větší množství rozpuštěných látek (např. vyšší množství tuku ve vzorku mléka nebo rozdíl demineralizovaná voda a voda vodovodní), tím je vyšší i práh citlivosti síranu železnatého. Závěr Vnímání kovové chuti je značně ovlivněno matricí, ve které je síran železnatý rozpuštěný. Jak je z výsledků patrné, tak obsah tuku hraje ve vnímání síranu železnatého důležitou roli, protože pro mléko s obsahem tuku 0,5 % byl stanoven práh citlivosti na 0,0095 g/l, kdežto pro mléko s obsahem tuku 3,5 % byl tento práh 0,0287 g/l. Stanovené prahy citlivosti byly ověřeny párovou zkouškou. Při koncentracích nacházejících se pod prahem citlivosti nebyli hodnotitelé na hladině významnosti 5 % schopni rozpoznat vzorek s přídavkem síranu železnatého, ale koncentraci nad prahem citlivosti již rozpoznali. Vnímání kovové chuti je značně individuální, z výsledků je patrný poměrně velký rozptyl v citlivosti jednotlivých hodnotitelů. Poděkování: Tato práce vznikla za podpory grantu MSM Použitá literatura: 1. ČSN ISO 5492, 1999: Senzorická analýza Slovník, Český normalizační institut, Praha. 2. ČSN ISO 3972, 2001: Senzorická analýza Metodologie - Metoda zkoumání citlivosti chuti, Český normalizační institut, Praha. 3. Yang H. H., Lawless H. T., 2006: Time-intensity characteristics of iron compounds, Food Quality and Pereference, 17: Stevens D. A., Smith R. F., Lawless H. T., 2006: Multidimensional scaling of ferrous sulfate and basic tastes, Physiology and Behavior, 87: Lawless H. T.,Schlake S.,Smythe J., Lim J.,Yang H., Chapman K. and Bolton B., 2004: Metalllic Taste and Retronasal Smell, Chemical Senses, 29: Panovská Z., 2009: Sensitivity of assessors to ferrous salts, Czech Journal of Food Sciences, 27: S7-S Kvasničková A., 2001: Minerální látky a stopové prvky, esenciální minerální prvky ve výživě, Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha. 8. REGULATION (EC) No 1925/2006 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL on the addition of vitamins and minerals and of certain other substances to foods, Official Journal of the European Union, Brussels,

206 9. VYHLÁŠKA 225/2008 Sb. ze dne 17. června 2008 kterou se stanoví požadavky na doplňky stravy a na obohacování potravin, Ministerstvo zdravotnictví. 10. Hurrell R.F., 2002: Fortification: Overcoming Technical and Practical Barriers, The Journal and Nutrition, 132: 806S-812S. 11. Epke E.M., Lawless H.T., 2007: Retronasal smell and detection thresholds of iron and cooper salts, Physiology and Behavior, 92: Gaucheron F., 2000: Iron fortification in dairy industry, Trends in Food Science and Technology, 11: Zahag D., Mahoney A.W., 1991: Iron fortification of process Cheddae cheese, Journal of Dairy Science, 74: Rice W.H., McMahon D.J., 1998: Chemical, physical, and sensory charakteristics of Mozzarella cheese fortified using protein-chelated iron or ferric chloride, Journal of Dairy Science, 81: El-samragy Y.A., Mahran G.A., Khorishid M.A and ABD-Rabou N.S., 1995: Chemical composition, organoleptic properties and nutritive valueof White sofe cheese as affected by iron fortification, Egyptian conference for diary science and technology, Le Care 4-6 novembre. 16. Adler A.M., Lacroix D.E., and Alford J.A., 1973: Iron content od Baker s and Cottage cheese made from fortified skim milk, Journal of Dairy Science, 36: Jackson S., Lee K., 1992: Fortification of cheese whith microencapsulated iron, Cult. Dairy Prod. J., 27: Hekat S., and McMahon D.J., 1997: Manufacture and quality of iron-fortified yogurt, Journal of Dairy Science, 80: Hurrell R.F., Reddy M.B., Dassenko S.A., Cook J.D. and Shepherd D., 1991: Ferrous fumarate fortification of chocolate drink powder, British Journal Nutrition, 65: Work T.M., Camire M.E., 1996: Phenolic acid detection thresholds in processed potatoes, Food Quality and Pereference, 7: ISO 13301, 2002: Sensory analysis Metodology General guidance for measuring odour, flavour and taste detection thresholds by a three-alternative forced-choice (3-AFC) procedure, Switzerland. 22. ČSN EN ISO 5495, 2009: Senzorická analýza - Metodologie - Párová porovnávací zkouška, Úřad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, Praha. 23. Řeřichová J, 2009: Senzorické vnímání kovové chuti, Diplomová práce, VŠCHT v Praze, Ústav Chemie a analýzy potravin. Kontaktní adresa: VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6 Dejvice 206

207 POROVNÁNÍ HLAVNÍCH SLOŽEK MLÉKA Z KONVENČNÍHO A EKOLOGICKÉHO ZEMĚDĚLSTVÍ Kouřimská Lenka 1, Legarová Veronika 1, Poděbradská Jana 1, Vejvodová Zuzana 1, Hering Pavel 2 1 Katedra kvality zemědělských produktů, FAPPZ, Česká zemědělská univerzita v Praze 2 Českomoravská společnost chovatelů a.s. Comparison of the main milk components from conventional and organic farming Summary: Though both organic and conventional food products must fulfil the same quality, hygiene and safety legislation criteria, the EU and the Czech organic farming legislation defines some specific conditions for plant and animal production and processing. This study compares 341 conventional and 364 organic samples of raw cow milk analyzing their main components (fat, proteins, lactose and non-fat solids content) together with their freezing point, somatic cell count (SSC) and total mesophilic bacteria count (TMBC). Statistically significant differences were not found in the case of the proteins, freezing point and non-fat solids. Organic and conventional milk samples differ statistically in the content of fat, lactose, SSC and TMBC. Úvod Zájem o ekologické zemědělství a zejména o jeho produkty, tedy o biopotraviny, se stále zvyšuje. Na základě narůstající poptávky se zvyšuje počet ekologických zemědělců i zpracovatelů jejich produkce. Otázkou zůstává, zda ekologické zemědělství a jeho produkty přinášejí spotřebitelům zdravější a bezpečnější biopotraviny, což je jedním z nejčastějších důvodů, proč lidé tyto výrobky kupují. Podmínky živočišné produkce a její následné zpracování v potravinářském průmyslu jsou upraveny legislativně zákony České republiky, směrnicemi a nařízeními Evropského parlamentu, Rady a Komise (ES) a souvisejícími vyhláškami a prováděcími předpisy. Některé předpisy jsou totožné pro konvenční i pro ekologické zemědělství (EZ) a jejich produkci, jiné zahrnují určité odlišnosti, které jsou podstatou dělení produktů na běžné či ekologické produkty (EP) a potraviny. Předpisem, který striktně odlišuje EZ od ostatních forem zemědělské produkce je Zákon o ekologickém zemědělství č. 242/2000 Sb. ve znění pozdějších předpisů a Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 16/2006, kterou se provádějí některá ustanovení Zákona o ekologickém zemědělství. S tímto zákonem následně souvisejí Nařízení Rady (ES) č. 834/2007 a Nařízení Komise (ES) č. 889/2008, později upravená Nařízeními Rady (ES) č. 1254/2008 a č. 967/2008. Uvedené předpisy stanovují základní pravidla pro EZ, vyhláška a zejména Nařízení Rady a Nařízení Komise pak blíže definují pravidla pro EZ a EP ve všech fázích produkce, přípravy a distribuce ekologických produktů a jejich kontrolu a pro jejich označování a propagaci. EZ a EP obecně jsou definované jako celkový systém řízení zemědělského podniku a produkce potravin, který spojuje osvědčené environmentální postupy, vysokou úroveň biologické rozmanitosti, ochranu přírodních zdrojů, uplatňování přísných norem pro dobré životní podmínky zvířat a způsob produkce. Cílem je získávat produkty vysoké jakosti za použití postupů, které nepoškozují životní prostředí, zdraví lidí, zdraví rostlin nebo zdraví a dobré životní podmínky zvířat, získané za použití přírodních látek a procesů. Se Zákonem o ekologickém zemědělství souvisí Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 16/2006, kde je mimo jiné stanoveno, které druhy hospodářských zvířat mohou být chovány v EZ. V České republice se jedná pouze o skot, koně, prasata, ovce, kozy, králíky, drůbež, ryby a středoevropské ekotypy včely medonosné. Dalším, již detailnějším předpisem, je Nařízení Rady (ES) č. 834/2007, které blíže popisuje pravidla a principy EZ a EP po obecné stránce, ale také konkrétně uvádí pravidla pro živočišnou a rostlinnou produkci, produkci zpracovaných potravin, jejich označování, kontrolní mechanismy a definuje pravidla pro obchodování se třetími zeměmi. Nejpodrobněji se EZ a EP zabývá Nařízení Komise (ES) č. 889/2008, které stanoví prováděcí pravidla k výše uvedenému Nařízení Rady (ES). Stanovuje pravidla produkce živočišné i rostlinné, její zpra- 207

208 cování, balení, přepravu a skladování ekologických produktů, v dalších částech jejich označování a kontrolu. Z pravidel živočišné produkce, které jsou pro odlišení obou způsobů produkce významné jednoznačně vyplývá, v čem jsou oba produkční systémy rozdílné. Živočišná produkce v EZ je vázána na půdu a ekologickou rostlinnou produkci, která má odlišné pěstitelské postupy a používání hnojiv a pomocných půdních látek. Používání pesticidů, které může vést k přítomnosti reziduí v produktech, je výrazně omezeno a využívá se zejména preventivních opatření. Hospodářská zvířata mají být krmena krmivy pocházejícími z EZ a tím je maximálně omezený příjem reziduálních látek do těl zvířat v krmivech. Krmiva získávaná mimo EP jsou povolena pouze omezeně a jsou konkrétně definována. Udržování dobrého zdravotního stavu hospodářských zvířat chovaných v režimu EZ je klíčové. Podpora zdraví zvířat je mimo výběr vhodného plemene podporována také umožněním volného pohybu zvířat, pobytu ve výbězích a využíváním pastvy a umožněním uspokojení etologických potřeb zvířat. V ekologických chovech se klade důraz na prevenci, není ovšem povoleno používat z preventivních důvodů chemicky syntetizovaných alopatických léčiv. Tato jsou povolena pouze v případě nemoci či poranění zvířete a měla by být používána omezeně a v minimálním množství. V případě onemocnění zvířete nebo jeho zranění se při léčbě upřednostňuje použití fytoterapeutických přípravků či homeopatických produktů. V rámci EZ je rovněž stanoven limit pro léčení zvířete podáváním chemických syntetizovaných alopatických veterinárních léčiv nebo antibiotik, a to tak, že v průběhu dvanácti měsíců může být zvíře podrobeno této léčbě maximálně třikrát. Pokud je tento limit překročen, nelze produkty tohoto zvířete považovat za ekologické. Ochranná lhůta při podávání alopatických veterinárních léčiv zvířeti je v EZ dvojnásobná oproti lhůtám zákonně stanoveným (používaným mimo EZ). Pokud lhůta není pro dané léčivo stanovena, pak činí v EZ 48 hodin. Není povoleno používání látek určených pro stimulaci růstu nebo produkce a používání hormonů či obdobných látek s cílem řízení reprodukce. Také desinfekční a čistící prostředky pro dodržování hygieny ve stájích, případně přípravky a hubení hmyzu a jiných škůdců jsou přesně definované. Řada výzkumných prací se zaměřuje na zjišťování obsahu jednotlivých složek v mléce a porovnání obsahu těchto látek v mléce z konvenčních a ekologických chovů. Obsahem vitamínů a selenu v mléce se zabývali například Emanuelson a Fall 1, kde byly do výzkumu zařazeny farmy, které mají více než 40 krav a které mají obdobou geografickou polohu. Výsledkem tohoto výzkumu bylo zjištění, že ekologické farmy mají nižší produkci mléka oproti farmám konvenčním. Statistické analýzy nevykázaly žádné významné rozdíly v obsahu β-karotenu, retinolu nebo selenu v mléce obou typů farem, ovšem u alfa-tokoferolu byl obsah významně nižší u farem ekologických. Autoři uvádí, že pravděpodobným důvodem odlišných výsledků je rozdíl ve výživě a krmných režimech mezi oběma typy produkce. Obsahem vitamínů v mléce se zajímali i Ellis a kol. 2 ve 12 měsíční panelové studii, do které bylo zařazeno 17 ekologických a 19 konvenčních farem. Vzorky mléka ze sběrných mléčných cisteren byly analyzovány na obsah vitamínu A, vitamínu E a β-karotenu. Výsledkem bylo zjištění, že mléko z konvenčních chovů má vyšší obsah vitamínu A, zatímco nebyly významné rozdíly v obsahu vitamínu E či β-karotenu v obou typech chovů. Bylo zjištěno, že kromě způsobu chovu má významný vliv na obsah těchto vitamínů sezóna a úroveň krmení. Ke stejnému závěru pokud jde o obsah tokoferolu a β-karotenu došel také Bisig a kol. 3. Další důležité látky v mléce a mléčných výrobcích jsou mastné kyseliny (MK), které mají pozitivní vliv na zdraví lidí, včetně mono- a polynenasycených MK (zejména n-3) a konjugované kyseliny linolové (CLA). Obsah těchto látek v mléce a rozdíl mezi konvenčním a ekologickým mlékem byl předmětem několika studií, jejichž výsledky vykazovaly opačná zjištění 4. Někteří autoři uvádí vyšší obsah CLA v mléce ekologickém, jiní v mléce konvenčním. Obvykle však nebyly využity dostatečně reprezentativní vzorky. Ellis a kol. 4 proto provedli novou studii, do které byly zahrnuty ekologické (n=17) i konvenční (n=19) farmy ve Velké Británii a ve které byly analyzovány vzorky mléka z vybraných farem s ohledem na způsob chovu, krmení zvířat a se zaměřením 208

209 na sezónní faktory ovlivňující množství těchto látek v mléce. Studie přinesla zjištění, že ekologické a konvenční mléko se výrazně neliší co do obsahu nasycených MK, avšak mononenasycené MK měly vyšší obsah v mléce konvenčním, oproti tomu polynenasycené MK byly ve větším měřítku zjištěny v mléce ekologickém. Poměr poly- k mononenasyceným MK byl vyšší v ekologickém mléce. Obsah n-3 MK byl v ekologickém mléce přibližně 1,7krát vyšší, podíl CLA nebyl typem produkce ovlivněn. Sezónní vlivy a vliv způsobu výživy na obsah MK v mléce potvrzují i další studie z jiných zemí (Německo, Itálie), stejně tak vyšší podíl n-3 MK v ekologickém mléce 3,5,6. Uvádí se významný vliv pastvy na obsah nasycených i nenasycených MK a antioxidantů v mléce. Z jiného pohledu zkoumá obsah konjugovaných linolových kyselin v mléce a mléčných výrobcích Bisig a kol. 3, který porovnává nejen jejich obsah v syrovém mléce, kde potvrzuje výše uvedené závěry, ale zkoumá také vliv dalšího zpracování mléka a změny v poměru CLA ve výsledných produktech. Autoři zjistili, že výsledky jsou obdobné jako u syrového mléka. V sýrech a dalších mléčných výrobcích z ekologického mléka se potvrzuje vyšší obsah CLA než z konvenčního. Dále uvádí nižší množství kyseliny linolové (LA) až o 31 % v ekologických mléčných výrobcích a poměr CLA/LA pak zjišťuje v ekologických mléčných tucích o 131 % vyšší než v konvenčních a uvádí, že tento poměr je možné využít při odlišování ekologických produktů od konvenčních. Významný pokles obsahu CLA uvádí pouze při mikrovlnném ošetření mléka a slaném sýru, kde byla ztráta CLA až 53 %. Jako jednoznačný závěr uvádí, že zpracování a skladování mléčných produktů obecně nemění koncentraci CLA v mléčném tuku. Rozdíly v ustájení a krmení zvířat mohou ovlivnit mikrobiologickou kvalitu mléka. Tento předpoklad byl potvrzen srovnáním aerobní sporulující mikroflóry v mléce ekologického a konvenčního původu 7. V mléce z konvenčních farem byl zjištěn vyšší počet termotolerantních organismů (41,2 % vs. 25,9 % v ekologickém) a Ureibacillus thermosphaericus (85,7 %). Mléko z ekologických farem naopak vykazovalo větší množství organismů Bacillus cereus (81,3 %). Vyšší výskyt těchto mikroorganismů v ekologickém mléce by mohl mít původ v odlišném způsobu ustájení a odlišných krmných směsích. Mléčné produkci v České republice se věnovali Hanuš a kol. 8,9, kteří se zaměřili na kvalitu mléka a celkový stav v chovech dojnic u nás. Autoři zjistili nižší obsah bílkovin v ekologickém mléce; celkové počty mikroorganismů, obsah tuku a laktózy byly srovnatelné v ekologických a konvenčních chovech. Počet somatických buněk v mléce byl příznivější v chovech ekologických. Navíc v těchto chovech nebyl zaznamenán výskyt reziduí inhibičních látek, což je zřejmě způsobeno sníženým nasazením antibiotik k léčbě mastitid. Poněkud nečekaně byla zjištěna zřetelně vyšší koncentrace acetonu v mléce jako zplodiny energetického metabolismu, která se zvyšuje při energetickém deficitu zvířat a tukovém katabolismu. V ekologických chovech byl obsah acetonu 5,34 mg/l oproti 2,56 mg/l v chovech konvenčních. Po shrnutí všech zjištění byla kvalita mléka obou typů produkce shledána v mnoha parametrech jako srovnatelná. Materiál a metody Data pro studii byla získána z bazénových vzorků syrového kravského mléka. Vzorky byly odebírány v souladu s platnými předpisy ČSN , ČSN EN ISO /2007 a ČSN Odběr vzorků probíhal od června 2007 do června Vzorky představovaly směs ranního a večerního nádoje. Sledované farmy byly dodavateli mléka se zastoupením plemen České strakaté, Holštýnské a jejich kříženci s různými genetickými podíly. Farmy se nacházely v oblasti severních Čech. Celkem bylo analyzováno 341 bazénových vzorků syrového mléka z konvenčních chovů a 364 z chovů ekologických. Sledovaná byla kvalita syrového mléka pomocí obsahu tuku, bílkovin, laktózy, tukuprosté sušiny, bodu mrznutí, celkového počtu mikroorganismů a počtu somatických buněk. Ke konzervaci byly použity tablety Broad Spectrum Microtabs D&F (Control Systems, USA) a Heeschenovo činidlo (ČSN ). Analýza vzorků probíhala okamžitě po doručení vzorků do akreditované laboratoře na přístroji CombiFoss FT 6000 (Foss-Electric), který se skládá z Milkoscanu FT 6000 (pro stanovení tuku, bílkovin a laktózy) přístroje a Fossomatic FC (pro stanovení počtu somatických buněk. Celkový počet mikroorganismů byl stanoven na přístroji Bactocount IBC 50 (Bentley In- 209

210 struments). Výsledky byly zpracovány v programu Statistica, verze 8 (StatSoft Inc.) a porovnány pomocí t-testu se samostatnými odhady rozptylů. Výsledky a diskuse Při statistickém porovnání dvou souborů výsledků mléka z konvenčního a ekologického zemědělství předcházelo interpretaci samotného t-testu posouzení průkaznosti rozdílu mezi rozptyly s použitím F-testu (α = 0,05) 10. Popisné charakteristiky analyzovaných vzorků mléka jsou uvedeny v tabulkách I a II. V tabulce III jsou uvedeny výsledky t-testu pro nezávislé vzorky, dle p oboustranného. Tabulka I Popisné charakteristiky vzorků mléka z konvenčního chovu CPM PSB Tuk Bílkoviny Laktóza TPS BM (tis.ktj/ml) (tis./ml) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g) ( C) min ,24 2,87 4,58 8,09-0,513 max ,71 3,68 5,07 9,06-0,540 průměr ,94 3,26 4,84 8,65-0,528 sm.odch ,25 0,15 0,09 0,18 0,005 medián ,91 3,27 4,85 8,67-0,529 Tabulka II Popisné charakteristiky vzorků mléka z ekologického chovu CPM PSB Tuk Bílkoviny Laktóza TPS BM (tis.ktj/ml) (tis./ml) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g) ( C) min ,47 2,45 4,41 7,82-0,510 max ,64 3,85 5,24 9,21-0,692 průměr ,89 3,25 4,87 8,66-0,528 sm.odch ,33 0,19 0,12 0,22 0,017 medián ,90 3,24 4,89 8,68-0,526 Tabulka III Výsledky t-testu porovnání vzorků konvenčního a ekologického mléka CPM PSB Tuk Bílkoviny Laktóza TPS BM (tis.ktj/ml) (tis./ml) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g) ( C) p 0,023 < 0,001 0,018 0,726 0,001 0,440 0,689 Z výsledků je vidět, že hodnoty bodu mrznutí, obsahu bílkovin a tukuprosté sušiny jsou srovnatelné. Nebyl zde prokázán statisticky významný rozdíl, protože hodnoty p (0,689; 0,726 a 0,440) byly vyšší než zvolená hladina významnosti α = 0,05. Statisticky průkazné rozdíly na hladině významnosti α = 0,05 byly zjištěny u obsahu tuku a celkového počtu mikroorganismů (p hodnoty 0,018 a 0,023). S 95 % jistotou byla mezi porovnávanými soubory zjištěna v těchto parametrech odlišnost konvenčního mléka od ekologického. Další statisticky průkazné rozdíly na hladině významnosti α = 0,01 byly zjištěny u obsahu laktózy a počtu somatických buněk (p hodnoty 0,001 a méně než 0,001). S 99 % jistotou se v těchto parametrech lišil analyzovaný soubor mléka ekologického od mléko konvenčního. Zjištěné závěry se v některých případech shodují se závěry v literatuře, ale někde se liší od výsledků studií jiných autorů 8,9. Může to být způsobeno mnoha dalšími faktory ovlivňujícími složení mléka (plemeno, výživa, zdravotní stav, věk, stádium a pořadí laktace). Dalším důvodem může být také rozdílný počet statisticky zpracovaných vzorků mléka. 210

211 Závěr V práci byly porovnány hlavní složky a některé další parametry 341 bazénových vzorků syrového mléka z konvenčních chovů a 364 vzorků z ekologických chovů. U bílkovin, bodu mrznutí a tukuprosté sušiny nebyl prokázán statisticky významný rozdíl mezi konvenčním a ekologickým zemědělstvím. U obsahu tuku, laktózy, počtu somatických buněk a celkového počtu mikroorganismů byly zjištěny statisticky průkazné rozdíly. Poděkování: Výzkum byl podpořen záměrem MŠMT č. MSM Použitá literatura: 1. EMANUELSON, U., FALL, N Vitamins and selenium in bulk tank milk of organic and conventional dairy farms, in Honing van der, Y. (eds.), Book of Abstracts of the 58th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Wageningen Academic Publishers, Dublin, pp , ISBN: ELLIS K.A., MONTEIRO, A., INNOCENT, G.T., GROVE-WHITE, D., CRIPPS, P., McLEAN, W.G., HOWARD, C.V., MIHM, M. Investigation of the vitamins A and E and beta-carotene content in milk from UK organic and conventional dairy farms. Journal of Dairy Research, 2007, vol. 74, no. 4, pp BISOG, W., EBERHARD, P., COLLOMB, M., REHBERGER, B. Influence of processing on the fatty acid composition and the content of conjugated linoleic acid in organic and conventional dairy products - a review, Le Lait, 2007, vol. 87, pp ELLIS, K.A., INNOCENT, G.T., GROVE-WHITE, D., CRIPPS, P., McLEAN, W.G., HOWARD, C.V., MIHM, M. Comparing the Fatty Acid Composition of Organic and Conventional Milk. Journal of Dairy Science, 2006, vol. 89, pp MOLKENTIN, J., GIESEMANN, A.. Differentiation of organically and conventionally produced milk by stable isotope and fatty acid analysis, Analytical and bioanalytical chemistry, 2007, vol. 388, no. 1, pp BUTLER, G., NIELSEN, J.H., SLOTS, T., SEAL, Ch., EYRE, M.D., SANDERSON, R., LEIFERT, C. Fatty acid and fat-soluble antioxidant concentrations in milk from high- and low-input conventional and organic systems: seasonal variation. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2008, vol. 88, no. 8, pp COOREVITS, A., JONGHE De, V., VANDROEMME, J., REEKMANS, R., HEYRMAN, J., MESSENS, W., VOS De, P., HEYNDRICKX, M. Comparative analysis of the diversity of aerobic spore-forming bacteria in raw milk from organic and conventional dairy farms. Systematic and Applied Microbiology, 2008, vol. 31, pp HANUŠ, O., ROZSYPAL, R., ROUBAL, P., VORLÍČEK, Z., GENČUROVÁ, V., VYLETĚLOVÁ, M., KOPECKÝ, J. Kvalita mléka v ekologických chovech, Mlékařské listy zpravodaj, č. 101, s HANUŠ, O., GENČUROVÁ, V., ŠPIČKA, J., VYLETĚLOVÁ, M., SAMKOVÁ, E., SOJKOVÁ, K., JEDELSKÁ, R., KOPECKÝ, J. Možné přínosy mléka z konvenčního a ekologického zemědělství zdravé humánní výživě, in Sborník příspěvků z mezinárodního semináře na téma Výrobní zemědělská praxe a potravinářské biotechnologické úpravy pro zvýraznění pozitivních zdravotních vlivů mléka a mléčných výrobků. Rapotín, , s LOUDA, Z. Řešené příklady v systému Statistica. 1. vyd.praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, 2004, 100 s. Kontaktní adresa: Dr. Ing. Lenka Kouřimská, Katedra kvality zemědělských produktů, FAPPZ, ČZU v Praze, Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol, kourimska@af.czu.cz. 211

212 OPTIMALIZACE VSÁDKOVÉ HYDROLÝZY LAKTOSY V RŮZNÝCH SUBSTRÁTECH Pocedičová Klára, Čurda Ladislav, Diblíková Lenka Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6 Optimization of lactose hydrolysis in different substrates in batch process Summary: The enzyme β-galactosidase belongs to the hydrolases, and can be used to prepare delactosed products for people suffering by lactose intolerance. The enzyme is suitable for the synthesis of galactooligosaccharides (GOS) as well. These saccharides have a positive impact on the human organism. Lactose in the buffer, whey after the production of cheese with ph adjusted to 6.75 and the UF-permeate were used for experiments, the concentration of substrates was 45 g.l -1 (lactose in buffer and UF-permeate) and 60 g.l -1 (whey). 4 different concentrations of the enzyme Maxilact LX 5000 (0.6, 1.2, 2.4 and 3.6 U.mL -1 ) were used for these experiments. Data shows that for 80% degree of lactose hydrolysis in buffer and UF permeate is required minimum enzyme activity 0.6 U.mL -1, while for the whey after the production of cheese is necessary to use higher activity of enzyme (2.4 U.mL -1 ). This difference could be due to present of whey proteins in medium, which may influence the enzyme activity. Úvod: Intolerance laktosy je projevem poruchy metabolismu. Problémy s ní se začínají objevovat v období dospívání, kdy dochází k poklesu tvorby β-galaktosidasy. Nedostatkem tohoto enzymu trpí % světové populace. Některé etnické skupiny jsou postiženy podstatně více, např. u eskymáků se intolerance laktosy vyskytuje až u 80 % populace 1. Z tohoto důvodu se začaly vyrábět výrobky s nízkým obsahem laktosy a delaktosované výrobky. Podle zákona č. 110/1997 Sb. 2 a vyhlášky č. 54/2004 Sb. 3 je v případě výrobků s nízkým obsahem laktosy přípustné maximálně 1 % laktosy, u delaktosovaných výrobků je maximální množství 10x nižší, tedy 0,1 %, a tyto výrobky nesmí navíc obsahovat volnou galaktosu. Pro přípravu výrobků s hydrolyzovanou laktosou se využívá enzym β-galaktosidasa z kvasinkového zdroje (K. lactis), jelikož tento enzym má vysokou hydrolasovou aktivitu 4. Obr. 1. Zastoupení lidí ve světě trpících laktosovou intolerancí 5 β-galaktosidasa (EC ) je enzym z řady hydroláz, nazývaný také laktasa. Tento enzym je možné izolovat z různých zdrojů 5, nejvíce jsou však využívány mikrobiální a to především kvasinky a plísně 6. Nejvíce prozkoumanou je β-galaktosidasa izolovaná z E. coli 7. Působením tohoto enzymu dochází k rozkladu laktosy na základní monosacharidy glukosu a galaktosu, dále mohou vznikat oligosacharidy, jedná se pouze o různé akceptory reagujících při reakci, pokud je akceptorem voda dochází k již zmíněné hydrolýze 8. Poměr mezi transglykosylační 212

213 a hydrolasovou aktivitou enzymu je ovlivněn mnoha faktory, jedná se o koncentraci a zdroj použitého enzymu, dále je ovlivněn koncentrací substrátu a reakčními podmínkami (ph, teplota, čas) 9. V této práci jsme se zaměřili na vliv koncentrace enzymu Maxilact LX 5000 a typu substrátu na průběh hydrolýzy laktosy. Experimentální část: Vsádkové pokusy Pro experimenty ve vsádkovém uspořádání byly použity 3 různé substráty (laktosa ve fosfátovém pufru, syrovátka po výrobě sýrů s upraveným ph 6,75 a UF-permeát). Koncentrace substrátů byla 45 (laktosa v pufru a UF-permeát) a 60 g.l -1 (syrovátka). Použitým enzymem byl Maxilact LX 5000 o 4 následujících koncentracích: 0,6; 1,2; 2,4 a 3,6 U.mL -1. Pokusy trvaly 240 minut, za konstantní teploty 37 C. V průběhu experimentu byly odebírány vzorky, které byly následně inaktivovány v termobloku (95 C/10 minut). Ve vzorcích byl stanoven obsah sacharidů pomocí HPLC 10. Metoda byla oproti předchozímu postupu modifikována použitím Pb 2+ kolony místo Ca 2+. Obr. 2. Zjednodušený postup experimentu 1) Plastové 50mL zkumavky se substrátem, 2) Termoblok, 3) Termoblok na inaktivaci vzorků Z naměřených dat byl vypočten stupeň hydrolýzy laktosy: c S = c Glk Lak 100 S [%] stupeň hydrolýzy laktosy c Glk [mmol.l -1 ] koncentrace laktosy během experimentu c Lak [mmol.l -1 ] počáteční koncentrace laktosy Výsledky a diskuze: V průběhu pokusů byly odebírány vzorky, u kterých bylo stanoveno zastoupení a obsah sacharidů (Obr. 3-5). Z grafů je patrné, že čím vyšší koncentrace enzymu je použita tím rychleji hydrolýza probíhá, což je v souladu se studíí 11. Při použití nejnižší zvolené koncentrace, dochází k 80% hydrolýze (zvoleno na základě zákona č. 110/1997 Sb. 2, vyhlášky č. 54/2004 Sb., 3 pro výrobky s nízkým obsahem laktosy je nejvyšší povolená koncentrace laktosy 1 %, což odpovídá zvolenému stupni hydrolýzy laktosy) při použití dvou substrátů a to laktosy v pufru (viz Tab I) a UF-permeátu. Průběhy stupňů hydrolýzy v závislosti na koncentraci enzymu jsou znázorněny na Obr

214 Obr. 3. Zastoupení laktosy a glukosy v experimentech s laktosou v pufru Obr. 4. Zastoupení laktosy a glukosy v experimentech s UF-permeátem Obr. 5. Zastoupení laktosy a glukosy v experimentech se syrovátkou 214

215 Pokud se zaměříme na syrovátku, jsou zde vidět velké rozdíly v rychlosti reakce, v porovnání s předchozími substráty, 80% stupně hydrolýzy bylo dosaženo až při použití třetí zvolené koncentrace enzymu, tedy 2,4 U.mL -1, což může být způsobeno přítomností bílkovin syrovátky, které dle studie 12 snižují aktivitu enzymu. Studie 13 se také zabývá vlivem bílkovin syrovátky na aktivitu β-galaktosidasy, ovšem dochází ke zcela opačnému závěru, jejich vlivem dochází ke zvýšení aktivity enzymu, ovšem není zcela specifikováno, zda se jedná o vliv na transglykosylační či hydrolasovou aktivitu. Obr. 6. Stupeň hydrolýzy pro jednotlivé substráty Tabulka I Přehled stupňů hydrolýzy pro jednotlivé substráty a koncentrace enzymu substrát c enzymu [U.mL -1 ] S max [%] S 80 [min] 0, Laktosa v pufru 1, , , , syrovátka 1,2 68-2, , , UF-permeát 1, , , maximální stupeň hydrolýzy laktosy čas kdy bylo dosaženo 80% hydrolýzy laktosy S max S 80 Závěr: Z naměřených výsledků vyplývá, že vsádková hydrolýza probíhá nejlépe ve fosfátovém pufru, ve kterém je při nejnižší koncentraci (0,6 U.mL -1 ) dosaženo totální hydrolýzy laktosy. Pro syrovátku a UF-permeát je pro dosažení alespoň 80% hydrolýzy laktosy nejvhodnější koncentrace enzymu Maxilact LX 5000 kolem 3 U.mL -1. Poděkování: Tato práce byla financována z účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT č. 21/2010) a výzkumného záměru MŠMT

216 Literatura: 1. Turek B.: Laktózová intolerance. Výživa/potravinářská bezpečnost, (2006). 2. Zákon č.110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích 3. Vyhláška 54/2004 Sb., o potravinách určených pro zvláštní výživu a způsobu jejich použití 4. Tello-Solis, S. R., Jimenez-Guzman, J., Sarabia-Leos, C., Gomez-Ruiz, L., Cruz-Guerrero, A. E., Rodriguez-Serrano, G.: Determination of the secondary structure of Kluyveromyces lactis β-galactosidase by circular dichroism and its structure activity relationship as a function of the ph. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, (2005) Panesar P. S., Panesar R., Singh R. S., Kennedy J. F., Harish Kumar: Microbial production, immobilization and applications of β-d-galactosidase. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 81, (2006). 7. Mahoney R. R.: Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chemistry 63, (1998). 8. Splechtna B., Nguyen T., Haltrich D.: Comparison between discontinous and continous lactose conversion processes for the production of prebiotic galacto-oligosaccharides using β-galactosidase from Lactobacillus reuteri. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, (2007). 9. Gaur, R., Pant, H., Jain, R., & Khare, S. K.: Galacto-oligosaccharides synthesis by immobilized Aspergillus oryzae β-galactosidase. Food Chemistry 97, (2006). 10. Hellerová K., Čurda L.: Kontinuální, enzymová příprava galaktooligosacharidů s částečnou optimalizací doby zdržení v membránovém reaktoru. Výsledky přehlídek a sborník přednášek z konference Mléko a sýry: (2008). 11. Rustom I. Y. S., Foda M. I., López-Leiva M. H.: Formation of oligosaccharides from whey UF-permeate by enzymatic hydrolysis analysis of factors. Food Chemistry 62, (1998). 12. Matioli G., Moraes F. F., Zanin G. M.: Operational stability and kinetics of lactose hydrolysis by β-galactosidase from Kluyveromyces fragilis. Maringá 25, 7-12, (2003). 13. Jiménez-Guzmán J., Sarabia-Leosa Ch., Cruz-Guerreroa A. E., Rodriguez-Serranoa G. M., López- Munguía A., Lorena Gómez-Ruiza L., García-Garibay M.: Interaction between β-lactoglobulin and lactase and its effect on enzymatic activity. International Dairy Journal 16, (2006). Kontakní adresa: Pocedičová Klára, Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6, hellerok@vscht.cz 216

217 HYDROLÝZA SYROVÁTKOVÝCH BÍLKOVIN PEPSINEM Diblíková Lenka, Čurda Ladislav, Pocedičová Klára Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha Whey protein hydrolysis with pepsin Summary: Native β-lactoglobulin is highly resistant against pepsin digestion. Therefore, it can be easily isolated from whey during enzymatic hydrolysis. We used fresh whey ultrafiltration retentate (membrane with cut-off 50 kda, pressure MPa, temperature 35 C) for pepsin hydrolysis of whey proteins. A small stirred reactor (volume 100 ml) was applied. The enzymatic reaction took 180 minutes at 40 C and ph 3.5 (10% HCl). Enzyme was inactivated by increasing ph to value 7 (10% NaOH). Samples of the hydrolyzate were consequently analyzed by RP-HPLC (PLRP-S column, 30 nm, 8 µm, 150 4,6 mm, column temperature 40 C, flow rate 1 ml.min -1, UV detection at 220 nm). We observed the effect of pepsin concetration ( g.100 ml -1 ) on β-lactoglobulin yield to determine optimal amount of enzyme for the reaction. Temperature (30-50 C) a ph ( ) effects were also examined. According to the results obtained, we assessed optimal conditions for pepsin hydrolysis of whey proteins. After 180 minutes of the enzymatic reaction with pepsin concentration g.100 ml -1, more than 99% of α-lactalbumin was splitted. No loss of β-lg was observed. The highest β-lactoglobulin yield and purity was obtained at ph 3.5 and temperature 40 C. β-lg isolation by pepsin is a selective method that provides protein fraction with a high purity and protein yield suitable for further processing. Úvod Syrovátka je jedním z nejvýznamnějších vedlejších produktů mlékárenského průmyslu. Vzniká při výrobě sýrů a tvarohu 1. Celosvětově její produkce neustále narůstá, v dnešní době se pohybuje přibližně kolem 160 milionů tun ročně 2. Mnoho mlékáren se proto potýká s problémem, jak toto obrovské množství dále zpracovat. V závislosti na použité technologii, rozlišujeme syrovátku sladkou a kyselou. Sladká syrovátka vzniká při srážení kaseinové frakce mléka účinkem enzymu chymosin 3,4. Obsahuje řadu cenných složek, zejména syrovátkové bílkoviny, laktosu, soli, vitaminy a kaseinomakropeptid 1,5,6. Syrovátkové bílkoviny (WP) představují heterogenní skupinu proteinů vysoké nutriční hodnoty a technologicky zajímavých funkčních vlastností. Hlavní bílkovinou syrovátky je β-laktoglobulin, tvořící více než 50 % WP. Využívá se zejména při přípravě emulzí, gelů nebo pěn v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.velká pozornost je proto věnována jeho izolaci a purifikaci 6,7. Mezi nejběžnější metody frakcionace WP patří: membránové filtrace, iontově-výměnná chromatografie, selektivní srážení, enzymové metody, atd. 8,9,10. Většina těchto metod je však použitelná pouze v laboratorním měřítku. Průmyslovému využití brání jejich složitost, časová náročnost, cena, nízká výtěžnost, úroveň degradace produktu nebo nízká selektivita 8. Jednou z nejčastěji používaných metod izolace hlavní bílkoviny syrovátky je hydrolýza pepsinem, kde se využívá odolnosti nativního β-lg vůči působení této proteasy 11. Ta je dána stabilní konformací tohoto globulárního proteinu, která vyplývá z jeho uzavřené struktury a z přítomnosti intramolekulárních S-S můstků 12. Pepsin je trávicí enzym, který vzniká v žaludku většiny obratlovců. Rozkládá bílkoviny za vzniku směsi různých peptidů o nízké molekulové hmotnosti (3-30 aminokyselinových zbytků). Jedná se o protein s jediným řetězcem, jehož terciární strukturu tvoří dva shodné laloky. Vzniká v buňkách žaludeční sliznice jako proenzym pepsinogen. Ten je v žaludku aktivován působením dříve vzniklých molekul pepsinu. Aktivita tohoto enzymu je nejvyšší v silně kyselém prostředí (ph 1,5 3,5), nad ph 6 je inaktivován denaturací 13. Cílem této práce bylo nalézt optimální podmínky hydrolýzy syrovátkových bílkovin pepsinem a posoudit vliv ph a teploty na obsah β-lg v získané bílkovinné frakci. 217

218 Materiály a metody Charakteristika suroviny Byla použita čerstvá odstředěná kravská syrovátka z výroby Eidamu (Moravia Lacto a.s., Jihlava, ČR). Výchozí surovina byla filtrována na filtrační jednotce ARNO 700 (Mikropur, s.r.o., Hradec Králové, ČR; obr.1) s keramickými tříkanálovými membránami společnosti TAMI- Industries (Hermsdorf, Německo) typu Clover. Podpůrná vrstva membrán je tvořena směsí oxidů hliníku, titanu a zirkonia, separační vrstva je u mikrofiltačních membrán z oxidu zirkoničitého, u ultrafiltračních membrán z oxidu titaničitého. Délka membrány je 550 mm, průměr 10 mm, průměr kanálu 3,5 mm, filtrační plocha 0,02 m 2. Mikrofiltace byla provedena na membráně o velikosti pórů 1,4 µm, při 35 C a tlaku 0,125 MPa, ultrafiltrace na membráně s cut-off 50 kda při tlaku 0,250 MPa. U všech získaných produktů byla poté provedena následující stanovení: stanovení celkového obsahu bílkovin dle Kjeldahla, vážkové stanovení sušiny, stanovení tučnosti acidobutyrometricky, stanovení obsahu popelovin, stanovení bodu mrznutí pomocí kryoskopu (Marcel, Polsko) 14. Vodivost a ph bylo měřeno na přístrojích Eurotech Instruments a WTW 340i. Retentát po ultrafiltraci (RUF, koncentrační faktor tři) byl následně použit pro enzymovou reakci s pepsinem. Obr. 1. Laboratorní filtrační jednotka ARNO 700 s keramickými membránami Enzymová reakce Hydrolýza probíhala v malém míchaném reaktoru o objemu 100 ml. Hodnota ph výchozí suroviny byla upravena na požadovanou hodnotu pomocí 10% HCl a byl přidán enzym BC pepsin (1:3000, Biocatalysts. Ltd., UK). Reakce probíhala min při zvolené teplotě. V průběhu hydrolýzy byly odebírány vzorky v časech: t = 0; 10; 20; 30; 60; 90; 135 a 180 minut, ihned ředěny 0,5% kyselinou trifluoroctovou a analyzovány pomocí RP-HPLC. Inaktivace enzymu, po skončení hydrolýzy, bylo dosaženo úpravou ph na hodnotu 7 pomocí 10% NaOH. Vzorek hydrolyzátu po inaktivaci byl, bez ředění TFA, analyzován metodou RP-HPLC. Stanovení β-laktoglobulinu Pro analýzu frakcí syrovátkových bílkovin byla využita metoda HPLC v reversní fázi s gradientovou elucí 15. Použita byla polymerní kolona PLRP-S (30 nm, 8 µm, 150 4,6 mm) s nástřikem 20 µl a UV detekcí při 220 nm, teplota kolony byla 40 C a průtok 1 ml.min -1. Jako eluent A byl použit roztok 0,1% k. trifluoroctové (TFA) v ultračisté vodě a jako eluent B 0,1% roztok TFA ve směsi acetonitril:ultračistá voda (80:20). Celková délka analýzy byla 30 minut. Data byla vyhodnocena dle kalibrační křivky standardů bílkovin (Sigma Aldrich, s.r.o., ČR). 218

219 Výsledky a diskuse Syrovátka Syrovátka byla mikrofiltrována a následně ultrafiltrována na filtrační jednotce ARNO 700 za podmínek popsaných v oddíle Materiály a metody. Složení a vlastnosti použitých surovin, meziproduktů i konečných produktů filtrace uvádí tabulka I. Hodnoty jsou aritmetickým průměrem nejméně dvou paralelních stanovení. Tabulka I Složení a vlastnosti použitých surovin a produktů filtrace Surovina Hrubé bílkoviny [% hm.] Sušina [% hm.] ph Tučnost [% hm.] Popeloviny [% hm.] Vodivost [ms.cm -1 ] Bod tuhnutí [ C] Syrovátka 0,736 5,59 6,4 0,1 0,44 5,36-0,452 PMF 0,720 5,37 6,4 0,0 0,42 5,32-0,444 RMF 0,734 5,55 6,4 0,1 0,34 5,33-0,448 PUF 0,141 4,10 6,0 0,0 0,37 5,29-0,396 RUF (CF=3) 1,542 7,20 4,5 0,0 0,51 6,20-0,574 Izolace β-laktoglobulinu a) Vliv koncentrace enzymu Výchozí surovinou byl ve všech experimentech retentát po ultrafiltraci s koncentračním faktorem tři. Hydrolýza probíhala v malém míchaném reaktoru o objemu 100 ml. Základní experiment byl proveden za podmínek ph 3,5; teplota 40 C; doba reakce minut. Cílem tohoto prvotního pokusu bylo stanovit vhodnou dávku enzymu (0,005; 0,010; 0,025; 0,050 g.100 ml -1 substrátu), sledovat průběh hydrolýzy a stanovit dobu hydrolýzy za daných podmínek. Závislost výtěžnosti frakce na koncentraci enzymu představuje Obr. 2. Při základním experimentu bylo zjištěno, že optimální koncentrace enzymu pro dobu reakce 180 minut je 0,050 g.100 ml -1 substrátu. Během hydrolýzy nedošlo ke ztrátám β-lg. α-la byl rozštěpen z více jak 99 % za vzniku nízkomolekulárních látek. Při nižších dávkách enzymu výtěžnost α-la vzrostla. Produkt získaný po 180 minutách hydrolýzy při koncentraci pepsinu 0,005 g.100 ml -1 suroviny navíc obsahoval přibližně 40 % nerozštěpeného α-la. výtěžnost [%] b-lg a-la ,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 koncentrace E [g/100 ml] Obr. 2. Závislost výtěžnosti frakcí na dávce enzymu 219

220 b) Vliv ph reakce Byl sledován vliv ph v rozmezí hodnot 2,5-4,5 na průběh enzymové reakce a na výtěžnost β-lg. Hydrolýza probíhala při teplotě 40 C; při koncentraci enzymu 0,025 g.100 ml -1 substrátu; po dobu 90 minut. Vlastnosti a složení získaných hydrolyzátů jsou prezentovány v tabulce II. Závislost výtěžnosti frakcí na ph reakce zobrazuje Obr. 3. Tabulka II Složení a vlastnosti inaktivovaných hydrolyzátů s pepsinem vliv ph Vzorek Hrubé bílkoviny [% hm.] Sušina [% hm.] Popeloviny [% hm.] Koncentrace α-la [mg.ml -1 ] Koncentrace β-lg [mg.ml -1 ] Výchozí surovina 1,542 7,20 0,51 1,911 5,714 Hydrolyzát při ph 2,5 1,469 7,24 1,05 0,020 5,391 Hydrolyzát při ph 3,0 1,482 7,19 0,98 0,037 4,522 Hydrolyzát při ph 3,5 1,509 7,34 0,92 0,135 6,204 Hydrolyzát při ph 4,0 1,510 7,13 0,80 0,750 5,076 Hydrolyzát při ph 4,5 1,540 7,12 0,70 1,790 5,096 Z tabulky II je patrné, že optimální ph enzymové reakce je ph 3,5. Za těchto podmínek byla získána frakce β-lg s výtěžností 100 %. Po 90 minutách hydrolýzy byl α-la rozštěpen z více jak 93 %. S rostoucím ph roste rovněž koncentrace α-la v hydrolyzátu. Při ph 4,5 k hydrolýze téměř nedochází, což již může být způsobeno částečnou inaktivací enzymu denaturací. V hydrolyzátu zůstává 94 % α-la nerozštěpeno. výtěžnost [%] b-lg a-la ,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 ph 5,0 Obr. 3. Závislost výtěžnosti frakcí na ph reakce c) Vliv teploty reakce V dalších experimentech byl pozorován vliv teploty v rozmezí C na množství β-lg v získané bílkovinné frakci. Hydrolýza byla provedena při ph 3,5; koncentraci enzymu 0,025 g.100 ml -1 substrátu; po dobu 90 minut. Závislost výtěžnosti frakcí na teplotě zobrazuje Obr. 4. Vlastnosti a složení získaných hydrolyzátů jsou prezentovány v tabulce III. 220

221 Tabulka III Složení a vlastnosti inaktivovaných hydrolyzátů s pepsinem vliv teploty Vzorek Hrubé bílkoviny [% hm.] Sušina [% hm.] Popeloviny [% hm.] Koncentrace α-la [mg.ml -1 ] Koncentrace β-lg [mg.ml -1 ] Výchozí surovina 1,542 7,20 0,51 1,911 5,714 Hydrolyzát při 30 C 1,490 7,18 0,86 0,282 4,377 Hydrolyzát při 35 C 1,494 7,21 0,88 0,198 4,815 Hydrolyzát při 40 C 1,512 7,26 0,90 0,135 6,204 Hydrolyzát při 45 C 1,521 7,60 0,90 0,087 5,316 Hydrolyzát při 50 C 1,535 7,39 0,94 0,040 4,607 výtěžnost [%] b-lg a-la teplota [ C] Obr. 4. Závislost výtěžnosti frakcí na teplotě Při sledování vlivu teploty bylo zjištěno, že s rostoucí teplotou dochází k poklesu koncentrace α-la v hydrolyzátu. U v ýtěžnosti β-laktoglobulinu byl pozorován podobný trend jako při sledování vlivu ph, tj. výtěžnost narůstá do 40 C (resp. ph 3,5) a pak klesá. Optimální teplota reakce je tedy 40 C. Při této teplotě navíc nedochází ve významné míře k denaturaci proteinů. Závěr Na základě získaných výsledků byly stanoveny optimální podmínky hydrolýzy syrovátkových bílkovin pepsinem. Při koncentraci enzymu 0,050 g.100 ml -1 substrátu bylo po 180 minutách enzymové reakce rozštěpeno více než 99 % α-laktalbuminu, nedošlo přitom ke ztrátám β-lg. Nejvyšší výtěžnosti β-laktoglobulinu bylo dosaženo při teplotě 40 C a ph 3,5. Hydrolýza s pepsinem je vysoce selektivní metoda separace syrovátkových bílkovin, která umožňuje získat frakci β-laktoglobulinu o vysoké výtěžnosti a čistotě. Poděkování: Tato práce vznikla za podpory MŠMT ČR(MSM ) a společnosti Membrain s.r.o., Stráž pod Ralskem, Česká republika. 221

222 Použitá literatura: 1. DOULTANI, S.; TURHAN, K.N.; ETZEL, M.R. Fractionation of proteins from whey using cation exchange chromatography. Process Biochemistry, 2004, vol. 39, s FOX, P.F.; GUINEE, T.P.; COGAN, T.M.; McSWEENEY, P.H.L. Fundamentals of Cheese Science; Aspen Publishers, Inc.: Gaithersburg, Maryland, TOLKACH, A.; KULOZIK, U. Fractionation of whey proteins and caseinomacropeptide by means of enzymatic crosslinking and membrane separation techniques. Journal of Food Engeneering, 2005, vol. 67, s GREITER, M.; NOVALIN, S.; WENDLAND, M.; KULBE K.D.; FISCHER, J. Desalination of whey by electrodialysis and ion exchange resins: analysis of both processes with regard to sustainability by calculating their cumulative energy demand. Journal of Membrane Science, 2002, vol. 210, s BRAMAUD, C.; AIMAR, P.; DAUFIN, G. Thermal isoelectric precipitation of α-lactalbumin from a whey protein concentrate: influence of protein-calcium complexation. Biotechnology and Bioengineering, 1995, vol. 47, s ZYDNEY, A.L. Protein separations using membrane filtration: new opportunities of whey fractionation. International Dairy Journal, 1998, vol. 8, s LOZANO, J.M.; GIRALDO, G.I.; ROMERO, C.M. An improved method for isolation of β-lactoglobulin. International Dairy Journal, 2008, vol. 18, s GUZEY, D.; McCLEMENTS, D.J. Characterization of β-lactoglobulin-chitosan interactions in aqueous solutions: A kalorimetry, light scattering, electrophoretic mobility and solubility study. Food Hydrocolloids, 2006, vol. 20, s MIRALLES, B.; MARTÍNEZ-RIDRÍGUEZ, A.; SANTIAGO, A.; van de LAGEMAAT, J.; HERAS, A. The occurrence of Maillard-type protein-polysaccharide interaction between β-lactoglobulin and chitosan. Food Chemistry, 2007, vol. 100, s MONTILLA, A..; CASAL, E.; MORENO, F.J.; BELLOQUE, J.; OLANO, A.; CORZO, N. Isolation of bovine β-lactoglobulin from complexes with chitosan. International Dairy Journal, 2007, vol. 17, s KONRAD, G.; LIESKE, B.; FABER, W. A large-scale isolation of native β-lactoglobulin: characterization of physicochemical properties and comparison with other methods. International Dairy Journal, 2000, vol. 10, s KINEKAWA, Y.; KITABATAKE, N. Purification of β-lactoglobulin from whey protein concentrate by pepsin treatment. Journal of Dairy Science, 1996, vol. 76, s TELLO-SOLÍS, S.R.; ROMERO-GARCÍA, B. Thermal denaturation of porcine pepsin: a study by circular dichroism. International Journal of Biological Macromolecules, 2001, vol. 28, s CVAK, Z.; PETEROVÁ, L.; ČERNÁ, E. Chemické a fyzikálně-chemické metody v kontrole jakosti mléka a mlékárenských výrobků. VÚPP Středisko potravinářských informací, Praha THOMÄ, C.; KRAUSE, I.; KULOZIK, U. Precipitation of caseinomacropeptides and their simultaneous determination with whey proteins by RP-HPLC. International Dairy Journal, 2006, vol. 16, s Kontaktní adresa: Lenka Diblíková, Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, , Praha 6 diblikoe@vscht.cz 222

223 NEKULTIVAČNÉ METÓDY ŠTÚDIA MIKROFLÓRY POTRAVINÁRSKYCH VÝROBKOV Ženišová Katarína 1, Chebeňová Viera 1, Brežná Barbara 1, Kuchta Tomáš 1, Pangallo Domenico 2 1 Výskumný ústav potravinársky, Bratislava; 2 Ústav molekulárnej biologie SAV, Bratislava Non-cultivure methods studying the microflora of food products Summary: A new non-culture method for studying microbial communities of prokaryotic and eukaryotic microorganisms in food products was developed and applied to Slovenská bryndza cheese. The method is based on polymerase chain reaction (PCR) and utilizes the generic diversity in size of DNA sequences of the internal transcribed spacer (ITS) between the genes for ribosomal RNA. In the case of bacteria (prokaryotic organisms), internal transcribed spacer (ITS) between 16S and 23S rrna is targeted. A "forward" PCR primer is the published G17 and as a "reverse" one, our newly developed combination of primers G R and G + R. The ITS between 5,8S rrna and 26S rrna, and the published primers ITS3 and ITS4 are used for identification of eukaryotic microorganisms (yeasts and moulds). Preliminary information on microbial diversity can be obtained by electrophoresis of the PCR products of different sizes. Further information on the size of individual PCR products can be obtained if one of the primers is fluorescently labelled by FAM dye and the product is analysed by capillary electrophoresis with fluorescence detection. The next step of the proposed method is cloning and sequencing of PCR products of different sizes. The method is illustrated on the microflora of Slovakian bryndza Cheese. ÚVOD V súčasnosti sa na štúdium baktérií a kvasiniek v tradičných potravinách používajú kultivačné metódy. Do popredia sa však postupne dostávajú molekulárno-biologické metódy využívajúce polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) a sekvenovanie DNA. Cieľom našej práce bolo identifikovať prokaryotické a eukaryotické mikroorganizmy v tradičnom potravinárskom výrobku, Slovenskej bryndzi. Na predchádzajúcu štúdiu realizovanú hlavne kultivačnými metódami sme nadviazali nekultivačnými metódami založenými na PCR, klonovaní a sekvenovaní 16S rdna. Prirodzenú mikroflóru Slovenskej bryndze tvoria hlavne baktérie mliečneho kysnutia (LAB), ktoré sú najviac zodpovedné za jej kvalitu a na túto skupinu mikroorganizmov sme sa preto najviac zamerali. MATERIÁL A METÓDY Vzorky Slovenskej bryndze Vzorky Slovenskej bryndze sme získali od výrobcov uvedených v tabuľke. Izolácia DNA z bryndze Asepticky sa odobrali 2 g bryndze a inkubovali v 20 ml citrátu sodného so sklenenými guľôčkami veľkosti menšej ako 10 6 μm (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) pri 45 C počas 30 min. Potom, sa premiešali a centrifugovali počas 10 min pri g. Odstránila sa tuková vrstva a zvyšný supernatant. Sediment sa suspendoval v 1 ml tlmivého roztoku TE a suspenzia sa opäť centrifugovala počas 10 min pri g. Zo sedimentu sa DNA izolovala chaotropickou extrakciou na tuhej fáze s použitím súpravy DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko). Amplifikácia DNA PCR sa vykonala v objeme 50 μl. Každá reakcia obsahovala 1 μl roztoku templátu DNA, 1,5 U HotStarTaq Plus DNA polymerázy, 1x reakčný tlmivý roztok pre DNA polymerázu, 4 mmol l -1 MgCl 2, 0,8 mmol l -1 každého dntp a 500 nmol l -1 každého priméru. Na amplifikáciu DNA húb sa použili priméry ITS3 (GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC) a ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC; obr. 1) a na amplifikáciu bakteriálnej DNA priméry G17 (GTG AAG TCG TAA CAA GG), a zmes GplusR (CGT CCT TCA TCG GCT) a GminusR (CGT CCT TCA TCG CCT; obr. 2). PCR prebiehala v PCR cykléri GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) 223

224 s teplotným programom pozostávajúcim z úvodnej denaturácie pri 95 C počas 5 min, z 30 cyklov denaturácie pri 94 C počas 1 min, annealingu pri teplote 55 C počas 2 min a polymerizácie pri 72 C počas 3 min, a záverečnej polymerizácie pri 72 C počas 3 min. PCR produkty sa separovali elektroforézou v 2,5% agarózovom géli a vizualizovali UV žiarením po interkalácii etídiumbromidom. Obr. 1.: Ilustračná fotografia profilov amplifikovaných bakteriálnych DNA z bryndze; 1 - Červený Kameň, 2 - Turčianske Teplice, 3 - Ružomberok (sídlo výrobcu danej vzorky bryndze), L Štandard molekulových hmotností n x 100 bp. Obr. 2.: Ilustračná fotografia profilov amplifikovaných hubových DNA z bryndze; 1 -Tisovec, 2 Červený Kameň, 3 - Zvolenská Slatina (sídlo výrobcu danejvzorky bryndze), L - Štandard molekulových hmotností n x 100 bp. Všetky separované fragmenty DNA pre jednotlivé vzorky sa z agarózového gélu vyrezali a následne prečistili použitím súptavy QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). 224

225 Identifikácia klonov Prečistené amplikóny sa naklonovali do vektora pdrive (Qiagen) pomocou súpravy PCR Cloning Kit (Qiagen) a kompetentných buniek E. coli DH5α. Klony sa kultivovali na LB agare obsahujúcom 100 g ml -1 ampicilínu sodného. Identifikácia selektovaných transformantov sa vykonala pomocou PCR s primérmi M13F-40 (GTT TTC CCA GTC ACG AC) a M13R (AAC AGC TAT GAC CAT G) orientovanými na sekvencie plazmidu pdrive za reakčných podmienok pozostávajúcich z úvodnej denaturácie pri 95 C počas 2 min, 35 cyklov denaturácie pri 94 C počas 1 min, annealingu pri teplote 58 C počas 1 min a polymerizácie pri 72 C počas 1 min 30 s, a záverečnej polymerizácie pri 72 C počas 10 min. Obr. 3: Ilustrácia identifikácie klonov v bryndzi; 1 až 3 - plazmid s vloženou cudorodou DNA, 4 - plazmid bez cudzorodej DNA, L - Štandard molekulových hmotností n x 100 bp. Klony s inzertom sa prečistili s použitím súpravy QIAquick PCR Purification Kit a sekvenovali s primérom M13F-40 na prístroji ABI 3100-Avant Genetic Analyser s využitím súpravy Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Seguencing Kit (Applied Biosystems) na Ústave molekulárnej biológie, Prírodovedeckej fakulty v Bratislave. Získané sekvencie sa porovnali s databázou GenBank. Zoznam zatiaľ identifikovaných amplikónov je uvedený v Tab. I a II. Obr. 4: Príklad záznamu sekvencie DNA pri Sangerovom sekvenovaní 225

226 Streptococcus thermophilus CNRZ1066, complete genome Length= Features flanking this part of subject sequence: 1895 bp at 5' side: IS861, transposase (orf2), IS3 family, truncated 4573 bp at 3' side: rod shape-determining protein MreC Score = 713 bits (386), Expect = 0.0 Identities = 386/386 (100%), Gaps = 0/386 (0%) Strand=Plus/Minus Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Query 1 CGTCCTTCATCGGCTTCTAGTGCCAAGGCATCCACCGTGCGCCCTTATTAACTTAACCTT 60 Sbjct CGTCCTTCATCGGCTTCTAGTGCCAAGGCATCCACCGTGCGCCCTTATTAACTTAACCTT Query 61 ATTTTTGGCCTTTCGACCTAACTCATTAAATATTCACAGCGTTTCGGTTTATTTTCTTGT 120 Sbjct ATTTTTGGCCTTTCGACCTAACTCATTAAATATTCACAGCGTTTCGGTTTATTTTCTTGT Query 121 TACTATCTATATGTAATTACTTACATATGGAATTTGATATAGATATTCAATTTTCAATGG 180 Sbjct TACTATCTATATGTAATTACTTACATATGGAATTTGATATAGATATTCAATTTTCAATGG Query 181 ACAATACTTGAATCTTTCGATTCAATGGAGCCTAGCGGGATCGAACCGCTGACCTCCTGC 240 Sbjct ACAATACTTGAATCTTTCGATTCAATGGAGCCTAGCGGGATCGAACCGCTGACCTCCTGC Query 241 GTGCAAAGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAGCTAAGGCCCCACAAGACCTCTCAAAACTAAAT 300 Sbjct GTGCAAAGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAGCTAAGGCCCCACAAGACCTCTCAAAACTAAAT Query 301 AAGAAACTCAAGTACATTCCGTTTTTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCG 360 Sbjct AAGAAACTCAAGTACATTCCGTTTTTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCG Query 361 ATACGGCTACCTTGTTACGACTTCAC 386 Sbjct ATACGGCTACCTTGTTACGACTTCAC Obr. 5: Amplikón (C4) z bryndze Červený Kameň mal 386 bp a porovnaním sekvencií v databáze (NCBI) bol na 100% identifikovaný ako Streptococcus thermophilus Presnejšiu informáciu o veľkosti jednotlivých PCR produktov možno získať metódou f-its, založenou na PCR orientovanej na medzerníkovú oblasť (internal transcribed spacer, ITS) s jedným primérom označeným fluorescenčným farbivom FAM. V prípade kvasiniek sa použil fluorescenčne označený primér ITS4, pre baktérie fluorescenčne označený primér G17. Vzniknuté PCR produkty sú v súčastnosti pripravené na analýzu kapilárnou elektroforézou s laserovou detekciou, ktorá dokáže určiť veľkosť amplikónov s presnosťou 1 bp. VÝSLEDKY Tab. I: Zoznam osekvenovaných amplikónov hubovej DNA zo vzoriek bryndze Vzorka bryndze (podľa sídla výrobcu) Veľkosť amplikónu(bp) Najpríbuznejší druh podľa databázy GenBank Tisovec 240 Yarrowia lipolytica Tisovec 244 Galactomycas geotrichum Červený Kameň 381 Debaryomyces hansenii Zvolenská Slatina 369 Mucor fragilis 226

227 Tab. II: Zoznam osekvenovaných amplikónov bakteriálnej DNA zo vzoriek bryndze Vzorka bryndze (podľa sídla výrobcu) Veľkosť amplikónu (bp) Najpríbuznejší druh podľa databázy GenBank Červený Kameň 315 Lactobacillus delbrueckii Červený Kameň 315 Lactobacillus delbrueckii Červený Kameň 315 Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus Červený Kameň 329 Lactobacillus delbrueckii Červený Kameň 385 Streptococcus thermophilus Červený Kameň 386 Streptococcus thermophilus Červený Kameň 386 Streptococcus thermophilus Červený Kameň 416 Lactococcus lactis ssp. lactis Červený Kameň 472 Lactococcus raffinolactis Červený Kameň 549 Escherichia coli Turčianske Teplice 386 Streptococcus thermophilus Turčianske Teplice 386 Streptococcus thermophilus Turčianske Teplice 416 Lactococcus lactis ssp. cremoris Turčianske Teplice 472 Lactococcus raffinolactis Turčianske Teplice 488 Leuconostoc pseudomesenteroides Ružomberok 327 Lactobacillus brevis Ružomberok 386 Streptococcus macedonicus Ružomberok 386 Streptococcus macedonicus Ružomberok 416 Lactococcus lactis Ružomberok 416 Lactococcus lactis ssp. lactis Ružomberok 416 Lactococcus lactis ssp. cremoris DISKUSIA A ZÁVER Metóda sa ukázala ako vhodná na štúdium mikroflóry potravinárskych výrobkov, pričom nevyžadovala špeciálne separačné postupy (DGGE). Identifikovali sme mikroorganizmy prítomné v bryndzi na konci výroby. Vďaka použitiu univerzálnych primérov pre kvasinky a mikroskopické huby bolo možné identifikovať kvasinky a aj plesne. Boli identifikované nasledovné druhy kvasiniek: Yarrowia lipolytica, Galactomycas geotrichum, Debaryomyces hansenii a mikroskopická huba Mucor fragilis. Z kyslomliečnych baktérii boli identifikované rody Streptococcus a Lactococcus, ktoré sú pravdepodobne najviac zodpovedné za jej kvalitu a zdravotnú neškodnosť. POUŽITÁ LITERATÚRA 1. Randazzo, C. L., Torriani, S., Akkermans, A. D. L., De Vos, W. M. and Vaughan, E. E. (2002). Diversity, dynamics, and activity of bacterial communities during production of an artisanal sicilian cheese as evaluated by 16S rrna analysis. Appl Environ Microbiol 68, s White, T. J., Bruns, T., Lee, S. and Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications ed. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J. pp New York: Academic Press. POĎAKOVANIE Táto práca vznikla s podporou projektov APVV a LPP Kontaktná adresa: Ing. Katarína Ženišová Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, Bratislava 26, Slovensko zenisova@vup.sk 227

228 MIKROFLÓRA SYROVÉHO KOZÍHO MLÉKA ZMĚNY V POČTECH VÝZNAMNÝCH SKUPIN MIKROORGANISMŮ Kalhotka Libor 1, Šustová Květoslava 2, Kvasničková Blanka 1, Lužová Táňa 2, Šárka Havlíková 3, Záhora Jaroslav 1 1 Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, 2 Ústav technologie potravin, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, 3 Milcom a.s. VÚM Tábor The Microflora raw goat s milk changes in counts significant groups microorganisms Summary Goat s milk is similar to cow s milk in its basic composition. On average, goat s milk contains about 12,6 % dry matter (3,4 % protein, 3,8 % fat, 4, 3 % laktose and 0,8 % mineral matter) (HERIAN, 2008). Goat s milk is used for straight consumption and production of dairy products. The important qualitave factor of goat s milk is microbial contamination. Total counts of microoraganisms, lactic acid bacteria, coliform bacteria, psychtotrophic microorganisms and enterococci have been checked in samples of milk. Microbial analysis have been carried out by pour plate cultivation. On average, these counts of microorganisms have been checked - total counts of microoraganisms 1,1 x 10 6 CFU/ml, lactic acid bacteria 1,9 x 10 3 CFU/ml, coliform bacteria 2,9 x 10 2 CFU/ml, psychtotrophic microorganisms 6,0 x 10 5 CFU/ml and enterococci 6,0 x 10 2 CFU/ml. Úvod Chov koz je rozšířen nejen v chudých oblastech světa, kde sehrává existenční úlohu, ale i v oblastech rozvinutých. Nedá se měřit jen ekonomickými kritérii, ale má kromě vlivu na výživu lidí také velký dopad na ekologii prostředí, sociální strukturu venkova, tvorbu krajiny a agroturistiku [6]. Pastevního chovu koz lze mimo jiné využít jako alternativy pro šetrné hospodaření v krajině s ohledem na měnící se klima. Kozí mléko se v základním složení podobá mléku kravskému, v průměru obsahuje okolo 12,6 % sušiny, 3,4 % bílkovin, 3,8 % tuku, 4,3 % laktosy a 0,8 % minerálních látek [6]. Kozí mléko se využívá k přímému konzumu nebo se z něj vyrábí mléčné výrobky. Důležitým kvalitativním faktorem kozího mléka, se kterým je při jeho využití nutno počítat, je i mikrobiální kontaminace. Mezi významné skupiny mikroorganismů mající vliv na kvalitu mléka patří celkový počet mikroorganismů (CPM), psychrotrofní mikroorganismy, koliformní bakterie, bakterie mléčného kysání, enterokoky, sporotvorné anaerobní bakterie a řada dalších. Celkový počet mikroorganismů překračující hodnoty dané legislativou nás informuje o nedostatečné hygieně při získávání mléka, nedostatečném vychlazení, chybách při skladování mléka, možné sekundární kontaminaci. Jako psychrotrofní mikroorganismy jsou označovány mikroorganismy (bakterie, kvasinky a plísně), jejichž tepelné optimum růstu je mezi 0 C a 15 C a jejichž tepelné maximum je pod 20 C [3]. Nejčastěji izolovaným rodem z mléka je r. Pseudomonas, potom r. Flavobacterium a r. Alcaligenes [1]. Samotný růst psychrotrofních mikroorganismů v mléce nezpůsobuje vážné problémy, protože jsou většinou (výjimkou je Alcaligenes tolerans) devitalizovány pasterací [1]. Mnohé psychrotrofní bakterie izolované ze syrového mléka však produkují extracelulární enzymy, které degradují bílkoviny a lipidy mléka. Například více než 70 % izolovaných a identifikovaných Pseudomonas fluorescens vykazuje proteolytickou a lipolytickou aktivitu [7]. Kažení mléka psychrotrofními mikroorganismy je třeba chápat jako komplexní proces související s jejich rozsáhlou metabolickou aktivitou [2]. Psychrotrofní mikroorganismy patří k ubikvitárně rozšířeným, zdrojem kontaminace mléka může být tedy voda, půda, vzduch, rostliny, zvířata a člověk. Jako koliformní označujeme bakterie rodů Escherichia, Enterobacter, Citrobacter a Klebsiella [1]. Původním stanovištěm koliformních bakterií je zažívací trakt lidí a zvířat. Navzdory tomu jejich přítomnost v mléce nemůžeme podle nich dávat do bezprostřední souvislosti s fekáliemi, ale s tím, že se prostřednictvím fekáliemi kontaminovaného mléka dostávají na plochy, které se s mlékem stýkají a kde si při nedostatečné sanitaci koliformní bakterie ve zbytcích mléka vytvoří sekundární stanoviště. V mléce jsou proto koliformní bakterie spolehlivým indikátorem primární a sekundární kontaminace [4]. Významnou skupinou mikroorganismů v syrovém mléce jsou bakterie mléčného 228

229 kysání (BMK). Tato skupina je tvořena 13 rody gram-pozitivních bakterií z nichž nejvýznamnějšími jsou rody Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus a Enterococcus [8]. Do mléka se dostávají primárně z trav na pastvě a sekundárně z prostředí, kde se manipuluje s mlékem. BMK mají nesporný význam při výrobě kysaných mléčných výrobků a sýrů, jejich činnosti je však nutno zabránit dodržováním hygieny a rychlým a důkladným zchlazením mléka při jeho uchovávání po nadojení [4]. Zvláštní pozornost je potřeba věnovat enterokokům. Enterokoky představují velkou část autochtonních bakterií spojených se savčím gastrointestinálním traktem, často se ale vyskytují také v půdě, vodě a na rostlinách. Přítomnost enterokoků v mléčných výrobcích je označována jako indikace nedostatečných sanitačních podmínek v průběhu získávání a zpracování mléka. Rozhodující kontaminace mléka enterokoky pochází z dojícího zařízení a rostlinného krmiva [5]. Kvalita hygieny mléka má mikrobiologický význam, který se mění, pokud jde o druhy a počty, podle podnebí, počasí, pastvy, laktace, ustájení, zdravotního stavu, vedení stáda atd. Pokud je obsah bakterií příliš nízký, nejen že se poruší patogenní mikroflóra, ale i přirozená nepatogenní, která má výrazný vliv na vlastnosti mléčných výrobků, vyrobených ze syrového mléka [9]. Kritéria hygienické kvality kozího mléka jsou uvedena v Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004. Provozovatelé potravinářských podniků musí zavést postupy, aby obsah mikroorganismů při 30 C (na ml) byl v syrovém mléce Pokud je však mléko určeno pro výrobu mléčných výrobků ze syrového mléka postupem, který nezahrnuje tepelnou úpravu musí mléko obsahovat mikroorganismů na ml. Cílem této práce bylo stanovit významné skupiny mikroorganismů kontaminující syrové kozí mléko. Materiál a metody Ve vzorcích kozího mléka z faremního chovu odebíraného v průběhu 24 h (ranní dojení - a, odpolední b) byly standardními metodami stanovovány tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM) na PCA whit skimmed milk (Biokar Diagnostics, France) při 30 C za 72 h. Bakterie mléčného kysání (BMK) na MRS agaru (Biokar Diagnostics, France) při 37 C za 72 h. Koliformní bakterie (Koli) na VRBL (Biokar Diagnostics, France) při 37 C za 24 h. Psychrotrofní mikroorganismy na PCA whit skimmed milk (Biokar Diagnostics, France) při 6 C za 10 dní. Enterokoky na COMPASS ENTEROCOCCUS AGAR (Biokar Diagnostics, France) při 44 C za 24 h. Po ukončení kultivace byly na jednotlivých Petriho miskách odečteny narostlé kolonie a výsledek vyjádřen v KTJ na ml. Výsledky a diskuse V průběhu čtyř měsíců byly ve vzorcích kozího mléka stanovovány: celkový počet mikroorganismů, počty bakterií mléčného kysání, koliformních bakterií, psychrotrofních mikroorganismů a enterokoků. Výsledky analýz jsou uvedeny v Tabulce I. Z výsledků je patrné, že celkový počet mikroorganismů se po celé sledované období pohyboval v rozmezí KTJ/ml, průměr za celé období pak činil 1,1 x 10 6 KTJ/ml. Průměrná hodnota za laktaci je podle údajů v literatuře 1.1 x 10 5 KTJ/ml [10]. Nařízení ES č. 853/2004 udává pro syrové kozí mléko limit resp mikroorganismů na ml. Vzorky mléka vykazovaly v 9. měsíci horší mikrobiologickou kvalitu, když několikanásobně překročily stanovený hygienický limit. I přes tento extrémní nárůst, značící porušení hygieny při získávání a uchovávání mléka, však po zbytek sledovaného období nepřesáhly počty mikroorganismů u tohoto chovu požadovaný limit. Počty psychrotrofních mikroorganismů se pohybovaly v rozmezí KTJ/ml (průměr za celé sledované období činil 6,0 x 10 5 KTJ/ml). Počty těchto bakterií by v mléce neměly přesáhnout na ml [4]. V 9. a 10. měsíci, však dosáhly průměrné počty psychrotrofů velmi vysokých hodnot, přesahujících hranici hygienické kvality. Tyto vysoké hodnoty také způsobily překročení doporučené hodnoty za celé sledované období. Počty bakterií mléčného kysání byly relativně nízké a pohybovaly se u v rozmezí řádově KTJ/ml (průměr za celé 229

230 sledované období činil 1,9 x 10 3 KTJ/ml). Jejich negativní vliv na kvalitu syrového mléka je omezen rychlým a důkladným zchlazením mléka při jeho uchovávání po nadojení. Počty koliformních bakterií se pohybovaly v rozmezí desítek až několika tisíc v 1 ml (průměrně za celé sledované období byl 2,9 x 10 2 KTJ/ml). Jako doplňkový údaj pro kravské mléko se uvádí hodnoty nižší jak 1000 KTJ na ml [4], vezmeme-li tedy v úvahu volnější limity dané nařízením ES pro kozí mléko nejsou námi zjištěné hodnoty nikterak vysoké, přesto by měla být této skupině bakterií věnována zvýšená pozornost. Množství enterokoků se pohybovalo v rozmezí několika desítek až několika tisíc na ml, přičemž průměr za celé období činil 6,0 x 10 2 KTJ/ml. Za pozornost stojí, že na rozdíl od ostatních skupin bakterií, jejichž počty byly po celé sledované období, s několika výše zmíněnými výjimkami, víceméně stejné, počty enterokoků vykazovaly ve druhé polovině sledovaného období vzrůstající tendenci. To může znamenat sílící kontaminaci prostředí. Rozhodující kontaminace mléka enterokoky pochází z dojícího zařízení a rostlinného krmiva a v syrovém mléce jsou enterokoky jednoznačně indikátory nedostatečné dekontaminace nářadí a zařízení. Jako termorezistentní bakterie, přežívají některé druhy předepsané pasterační teploty a proto jsou normální součástí pasterovaného mléka [5]. Tabulka I Počty mikroorganismů ve vzorcích kozího mléka v KTJ/ml měsíc vzorek CPM BMK Koli Psychrotrofní m. Enterokoky 7. a 1.6 x x x 10 3 ns b 5.1 x x x 10 3 ns 8. a 1.2 x x x x x 10 2 b 1.3 x x x x x a 3.5 x x x x b 4.3 x x x x a 1,6 x x x x x 10 3 b 3.1 x x x x x 10 3 Průměr za celé období 1.1 x x x x x 10 2 ns nestanovováno, a- ranní dojení, b odpolední dojení Závěr Z výsledků analýz je patrné, že počty mikroorganismů ve vzorcích kozího mléka až na výjimky (CPM - v 9. měsíci, psychrotrofní mikroorganismy - v 9. a 10. měsíci a tím také v průměru za celé období) nepřesahují limity dané legislativou (CPM) nebo doporučeními (psychrotrofní mikroorganismy). Zvýšená pozornost by měla být rovněž věnována nežádoucím koliformním bakteriím a enterokokům. Je tedy nezbytné dodržovat zásady hygieny při získávání mléka po celou dobu laktace, třebaže je většina kontaminujících mikroorganismů zničena následným tepelným ošetřením mléka. Poděkování Projekt vznikl s podporou projektu MŠMT 2B08069 Národní program výzkumu - NPV II, program 2B - ZDRAVÝ A KVALITNÍ ŽIVOT - Výzkum vztahů mezi vlastnostmi kontaminující mikroflóry a tvorbou biogenních aminů jako rizikových toxikantů v systému hodnocení zdravotní nezávadnosti sýrů na spotřebitelském trhu a Výzkumného záměru č. MSM Biologické a technologické aspekty udržitelnosti řízených ekosystémů a jejich adaptace na změnu klimatu 230

231 Použitá literatura 1. BURDOVÁ, O. (1998): Kvalita mliečnych výrobkov v závislosti od mikrobiálnej kontaminácie surového mlieka. Mliekarstvo 29 č. 4, p ČANIGOVÁ, M. (2000): Zmeny v mlieku spôsobené činnosťou psychrotrofných mikroorganizmov. Mliekarstvo 31 č. 2, p ČERNÝ, V., HAVLÍKOVÁ, Š., KVASNIČKOVÁ, E. (2008): Využití impedančních metod v mlékárenské praxi: stanovení skupiny psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléce. Mlékařské listy, zpravodaj 106, p GÖRNER, F., VALÍK, Ľ. (2004): Aplikovaná mikrobiológia požívatín. MALÉ CENTRUM, Bratislava, ISBN : , 528 s. 5. GREIFOVÁ, M., GREIF, G., LEŠKOVÁ, E., MÉRIOVÁ, K. (2003): Enterokoky ich hodnotenie v mliekarenskej technológii. Mliekarstvo 34 č. 2, p HERIAN, K. (2008): Ovčie a kozie mliekarstvo na Slovensku. Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků V. Sborník referátů ze semináře s mezinárodní účastí MZLU v Brně, p , ISBN: JAMRICHOVÁ, S. (2000): Faktory ovplyvňujúce trvanlivosť mlieka a mliečnych výrobkov. 1. časť surové mlieko. Mliekarstvo 31 č. 3, p JAY, J.M., LOESSNER, M.J., GOLDEN, D.A. (2005): Moderm Food Microbiology. Springer Science, NY USA, 790 s. ISBN: KALANTZOPOULOS, G. (2003): Kvalita ovčieho a kozieho mlieka z pohľadu IDF. Mliekarstvo 34 č. 4, p KOUŘIMSKÁ, L., DVOŘÁKOVÁ, B. (2008): Kvalita kozího mléka v průběhu laktačního období. Sborník z konference Den mléka 2008, 23.9.ČZU v Praze, p , ISBN: Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ze dne 29. dubna 2004, kterým se se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu. Adresa Ing. Libor Kalhotka, Ph.D., Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika, xkalhotk@node.mendelu.cz 231

232 ŠTÚDIUM ÚČINKU FAKTOROV PROSTREDIA NA TECHNOLOGICKY NEŽIADUCU MIKROFLÓRU Liptáková Denisa, Medveďová Alžbeta, Píšová Zuzana, Valík Ľubomír, Hybenová Eva Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave, Slovensko The effect of environmental factors on technological undesirable microflora Summary: The effects of temperature and ph values on the growth of Mucor circinelloides, isolated from traditional Slovak sheep cheese bryndza were studied. The growth parameters, such as the growth rate Gr and lagphase duration λ were validated and used for secondary modeling in characterization of mathematical growth of Mucor circinelloides in dependence on temperature and active acidity. The optimal temperature of 27 C was calculated from the experimental values. With increasing temperature of cultivation, the growth rate was noticed as increasing, which can be described with equations: ln Gr = *T *T (R 2 = 0.973). The descent of duration of lagphase can be described with equations: lag = e -0,073T ( R² = ). It was noticed that the ph value had no special effect on inhibition or a partial inhibition of growth of Mucor circinelloides. Prediction of combined dependence of radial growth and duration of lag-phase on temperature and ph value can be described with equations: ln Gr = *T *T *pH (R 2 = 0.973) and ln lag = *T *T *pH (R 2 = 0.916). Počas spracovania potravinárskych surovín až na finálne produkty, a ich následného skladovania a distribúcie, môže za určitých podmienok dochádzať ku ich kontaminácii. Veľký význam z hľadiska kontaminácie potravín zohrávajú práve vláknité huby, čo spôsobuje výrobcom ekonomické straty, ktoré sú len ťažko vyčísliteľné, ich význam však môže byť aj pozitívny, napríklad v zrení širokej škály syrov 1. Kontaminujúce mikromycéty môžu spôsobovať zmeny v textúre produktu, zapríčiňovať vznik nepriaznivých alebo netypických senzorických vlastností daného produktu a mnohé z týchto mikroorganizmov môžu v značnej miere ohroziť zdravie spotrebiteľa, hlavne kvôli produkcii mykotoxínov. Druhy rodu Mucor sú schopné rastu v rozmedzí teplôt od 5 do 37 C, pričom pokrývajú povrch média. Optimálna teplota rastu je okolo 25 C 2. Mucor circinelloides je málo tolerantný na znížené hodnoty aktivity vody, neschopný rastu pod hodnotou a v nižšou ako 0,9 1. Kolónie Mucor circinelloides sú bledosivé alebo žltkasté, pri vyšších teplotách skôr hnedé, rastúce relatívne rýchlo. Tvoria typické cenotické mycélium, t. j. bez prepážok. Sporangiofóry sú sympodiálne vetvené, nesúce guľaté sporangiá sivej až čiernej farby. Sporangiospóry sú okrúhle až mierne elipsoidné, s priemernou veľkosťou 4 až 8 µm 3. Zástupcovia rodu Mucor boli izolovaní z rôznych druhov syrov, napríklad z povrchu talianskeho syra Taleggio, alebo z Kuflu, syru, ktorý sa vyrába z nepasterizovaného odstredeného mlieka bez zákysových kultúr 4. V minoritnom zastúpení v porovnaní s rodom Penicillium a G. candidum bol M. circinelloides izolovaný zo syrov Norvegia a Jarlsberg, pričom sa zistilo, že zdrojom kontaminácie pri výrobe týchto syrov bol vzduch v prevádzke 5. Laurenčík a kolektív sledovali výskyt a diverzitu kvasiniek a vláknitých húb v bryndzi, remeselnom, mäkkom, roztierateľnom syre pripravovanom zo surového ovčieho mlieka alebo zmesi ovčieho a kravského mlieka. Vzorky obsahovali 10 2 (KTJ/g) vláknitých húb na gram mokrej váhy, pričom prevládajúcim druhom bola vláknitá huba Mucor circinelloides v. Tieghem 6. Dynamika rastu húb sa najčastejšie opisuje pomocou radiálnej rastovej rýchlosti, ľahko stanovenej makroskopickým pozorovaním, teda meraním priemeru kolónií. Primárny model vyvinutý Baranyim a kol. 7 bol prispôsobený tak, aby lepšie popísal radiálny rast kolónií Penicillium roqueforti 8, A. flavus 9, P. brevicompactum 10 a termorezistentných húb 11. Radiálny rastový faktor sa však dá vypočítať aj pomocou jednoduchej lineárnej rovnice navrhnutej Dantignym a kol.: r (mm) = Gr (t λ), kde parametre Gr je radiálna rastová rýchlosť a λ je trvanie lag-fázy

233 Cieľom našej práce bolo experimentálne popísať dynamiku radiálneho rastu huby M. circinelloides, v závislosti od hodnoty ph (od 5,0 do 7,0) pri teplotách kultivácie od 5 do 40 C. Na základe výsledkov získaných z rastových čiar bolo ďalej cieľom analyzovať vplyv už uvedených faktorov prostredia na jej rastové parametre v sekundárnom modelovaní a nakoniec získané výsledky primárneho a sekundárneho modelovania podrobiť validácii. Výsledky a diskusia Pri teplote 5 C začala kolónia M. circinelloides rásť po deviatich dňoch od začiatku inkubácie, čomu zodpovedala dĺžka lag-fázy λ= 125,7 h a rastová rýchlosť bola 0,63 mm.h -1. Obr. 1. Dynamika rastu M. circinelloides 29 L 1 v závislosti od rôznej hodnoty ph pri teplote 5 C. Zvýšením inkubačnej teploty na 10 C, kolónie začali na povrchu média vyrastať po štyroch dňoch inkubácie. Rýchlosť radiálneho rastu M. circinelloides v exponenciálnej fáze sa zvýšila takmer štvornásobne na hodnotu 0,247 mm.h -1. Ďalším zvýšením teploty sa dynamika rastu M. circinelloides významne urýchlila. Napríklad pri teplote inkubácie 18 C radiálna rastová rýchlosť nadobudla hodnoty Gr = 0,843 až 0,865 mm.h -1, pričom viditeľnú kolóniu sme mohli odmerať už po 48 hodinách kultivácie. Aj keď začiatok rastu kolónie nastal vo veľmi podobnom čase ako pri teplote 15 C, rýchlosť radiálneho rastu bola o 30 % vyššia a lag-fáza sa prirodzene skrátila na priemerné hodnoty 28,2 h. Pri teplote 25 C (obr. 2) bola priemerná rastová rýchlosť Gr = 1,093 mm.h -1, čo predstavuje 1,25-násobné urýchlenie dynamiky rastu v porovnaní s teplotou 21 C. Obr. 2. Dynamika rastu M. circinelloides 29 L 1 v závislosti od rôznej hodnoty ph pri teplote 25 C. 233

234 Napriek tomu, že Hocking a Miscamble 2 uvádzajú ako optimálnu teplotu pre rast Mucor circinelloides teplotu 25 C, izolát Mucor circinelloides 29 L 1, s ktorým sme pracovali, rástol najrýchlejšie pri teplote 30 C, a teda sa dá predpokladať, že teplota blízka 30 C bude jeho optimálnou teplotou. Táto skutočnosť bola potvrdená aj najvyššou radiálnou rastovou rýchlosťou, ktorá pri 30 C dosiahla hodnotu Gr = 1,217 mm.h -1. Ďalším zvýšením kultivačnej teploty na 37 C sa priemerná radiálna rýchlosť rastu mikromycéty M. circinelloides znížila o 66 % v porovnaní s teplotou 30 C (Gr = 0,737 mm.h -1 ). Zmena aktívnej kyslosti prostredia v intervale ph od 5,0 do 7,0 nemala výrazný vplyv na rast sledovanej vláknitej huby pri všetkých testovaných teplotách, a preto sme sa rozhodli sledovať dynamiku rastu M. circinelloides aj pri dvoch, pre väčšinu mikroorganizmov, výrazných hodnotách ph, a to ph 4,5 a ph 8,0. Ako inkubačnú teplotu sme zvolili teplotu 30 C, ktorá sa javila ako optimálna pre sledovaný izolát. Avšak ani tieto limitné hodnoty aktívnej kyslosti významnejšie neovplyvnili hodnoty radiálnej kyslosti a dĺžky lag-fázy M. circinelloides (tab. 1). Podobné výsledky sme pozorovali v práci Hudecovej a kolektívu, pričom sme zistili, že kým pri kultivácii Geotrichum candidum na platniach s kvasničným extraktom a sušeným odstredeným mliekom stúpajúca teplota zvyšovala rastovú rýchlosť, na druhej strane, vplyv ph (5,0 až 7,0) na rast G. candidum bol štatisticky nevýznamný 12. Tabulka I Rastové parametre M. circinelloides 29 L 1 v závislosti od hodnoty ph pri teplote 30 C. Hodnota ph Gr Lag R 2 4,5 1,621 16,0 0,999 5,0 1,136 12,6 0,997 5,5 1,168 13,8 0,999 6,0 1,286 14,4 0,999 6,5 1,25 15,0 0,998 7,0 1,241 15,2 0,998 8,0 1,679 16,6 0,996 Závislosť rastových parametrov od faktorov prostredia bolo možné popísať polynomickými funkciami, ktoré reprezentujú empirický prístup k zosumarizovaniu odoziev rastových rýchlostí v celej oblasti sledovaných teplôt 13. Vplyvom stúpajúcej kultivačnej teploty sa na povrchu agarového substrátu rast M. circinelloides zrýchľoval (obr. 3), čo bolo možné popísať nasledovnou matematickou rovnicou: ln Gr = -0,006*T 2 + 0,326*T 4,191 (R 2 = 0,973). Obr. 3. Vplyv teploty na radiálnu rastovú rýchlosť M. circinelloides 29 L

235 Cole a Keenan 14 sledovali vplyv teploty na rast Zygosaccharomyces bailii v modelovom ovocnom nápoji a vplyv teploty na lag-fázu popísali funkciou lag =a. e bx. Tento model (obr. 4) sme použili aj v našej práci, pričom skracovanie trvania lag-fázy v závislosti od stúpajúcej teploty inkubácie bolo možné charakterizovať rovnicou v tvare: lag = 116,62e -0,073T (R² = 0,879). Obr. 4. Vplyv teploty na trvanie lag-fázy M. circinelloides 29 L 1. Spoločný vplyv teploty a ph hodnoty na rastové parametre mikromycéty M. circinelloides bolo možné popísať nasledovnými rovnicami (1, 2) s vysokými korelačnými koeficientmi: ln Gr = -4,22 + 0,325*T - 0,00597*T 2 + 0,00644*pH (R 2 = 0,973) (1) ln lag = 5,617-0,126*T + 0,00108*T 2 0,050*pH (R 2 = 0,916) (2) Funkcie popisujúce závislosť rastových parametrov M. circinelloides od teploty kultivácie sme podrobili validácii podľa Baraniho a kol. 15 a výsledky sme zosumarizovali do tab. 2. Validáciou sme zistili nezhody medzi pozorovanými rastovými parametrami M. circinelloides a vypočítanými z príslušného modelu počas kultivácie na garových platniach 27,9 % a 37 %, pričom tieto výsledky sú v súlade s inými autormi, podľa ktorých sa diskrepancie najčastejšie pohybujú v intervale od 10 do 30 %, v niektorých prípadoch aj 46 až 52 % 15,16. Tabulka II Indexy validácie pre modely popisujúce závislosť rastových parametrov M. circinelloides 29 L 1 od teploty kultivácie. Typ modelu A f B f % D f (%) Lag = 116,62e -0,073T 1,279 1,061 27,9 ln Gr = -0,006*T 2 + 0,326*T 4,191 1,37 1,198 37,0 235

236 Záver Izolát M. circinelloides 29 L 1 vykazoval dobrý rast pri teplotách od 5 do 30 C. Pri teplote 37 C sa dynamika rastu znížila o 66 % v porovnaní s 30 C a pri 40 C sme už nepozorovali rast študovanej mikromycéty. Aktívna kyslosť v rozsahu 4,5 až 8,0 neovplyvňovala dynamiku rastu vláknitej huby. Hlavným prínosom tejto práce bolo získanie prvých informácií charakterizujúcich dynamiku rastu M. circinelloides na povrchu optimálnych živných médií platňovou metódou v závislosti od meniacich sa faktorov vnútorného a vonkajšieho prostredia. V práci sa využili moderné postupy prediktívnej mykológie. Predmetom budúceho štúdia by mohlo byť sledovanie rastových charakteristík M. circinelloides v závislosti od kombinovaného vplyvu aktivity vody a teploty v modelovom živnom médiu a priamo v hrudkových syroch, kde by zaujímavú úlohu zohrávala aj huba Geotrichum candidum a iné skupiny mikroorganizmov prítomné v natívnom syre. Použitá literatura: 1. Dantigny, P. - Guilmart, A. - Bensoussan, M.: Basis of predictive mycology. International Journal of Food Microbiology, 2005, 100, s Hocking, A.D. Miscamble, B.F. : Water relations of some Zygomycetes isolated from food. Mycological Research, 1995, 99, s Malíř, F. Ostrý, V. a kol.: In Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. Brno: Národní centrum ošetrovatelství a nelékařských zdravotních odborů. 1.vyd. 2003, s Hayaloglu, A.A. Kirbag, S.: Microbial quality and presence of moulds in Kuflu cheese. International Journal of Food Microbiology, 2007, 115, s Kure, C.F. Skaar, I. Brendehaug, J.: Mould contamination in production of semi-hard cheese. International Journal of Food Microbiology, 2004, 93, s Laurenčík, M. Sulo, P. Sláviková, E. et al.: The diversity of eukaryotic microbiota in the traditional Slovak sheep cheese Bryndza. International Journal of Food Microbiology, 2008, 127, s Baranyi, J. - Roberts, T. A. - Mcclure, P. : A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology, 10, 1993, s Valík Ľ. Baranyi J. Görner F.: Predicting fungal growth: the effect of water activity on Penicillium roqueforti. International Journal of Food Microbiology, 1999, 47, s Gibson, A.M. Baranyi, J. Pitt, J.I. et al.: Predicting fungal growth: the effect of water activity on Aspergillus flavus and related species. International Journal of Food Microbiology, 1994, 23, s Membré, J.M. Kubaczka, M.: Predictive modelling approach applied to spoilage fungi: growth of Penicillium brevicompactum on solid media. Letters in Applied Microbiology, 2000, 31, s Valík, Ľ. Piecková, E.: Growth modelling of heat resistant fungi: the effect of water activity. International Journal of Food Microbiology, 2001, 63, s Hudecová, A. Liptáková, D. Valík, Ľ. Medveďová A.: Vplyv teploty a aktívnej kyslosti na rast geotrichum candidum v mlieku a v mliečnom agare. Zborník přednášek konference Mléko a Sýry 2008, Praha, 2008, s Ross, T. McMeekin, T.A.: Predictive microbiology: review paper. International Journal of Food Microbiology,1994, 23, s Cole, M.B. - Keenan, M.H.J.: A quantitative method for estimating shelf life of soft drinks using a model system. Journal of Industrial Microbiology, 1987, 2, s Baranyi, J. Pin, C. Ross, T.: Validating and comparing predictive models. International Journal of Food Microbiology, 1999, 48, s Samapundo, S. - Devlieghere, F. - de Meulenaer, B. - Geeraerd, A. H. - van Impe, J. F. - Debevere, J. M.: Predictive modelling of the individual and combined effect of water activity and temperature on the radial growth of Fusarium verticilliodes and F. proliferatum on corn. International Journal of Food Microbiology, 105, 2005, s Kontaktní adresa: Ing. Liptáková Denisa, PhD., Ústav biochemie, výživy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technologie STU, Radlinského 9, Bratislava, SR. 236

237 ANTIBIOTICKÁ REZISTENCIA ENTEROKOKOV IZOLOVANÝCH Z RÔZNYCH ZDROJOV V PRVOVÝROBE MLIEKA Čanigová Margita, Krebs-Artimová Anna, Kročko Miroslav, Ducková Viera Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov, FBP Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra Antibiotic resistance of enterococci isolated from different sources in dairy farm Summary: In the work, presence of enterococci in different samples was determined. Samples of first milk strips, swabs from teat skin, swabs from gum part of teat cup, bulk tank milk and rinse water after sanitation of milking machine in chosen farms were investigated. Suspected isolates, which grew out on Slanetz-Bartley agar and Bile esculin azide agar, were tested and confirmed for their classification to the genera of Enterococcus (E). The species identification was realised by commercial EN-COCCUS test and was confirmed by PCR method. Antibiotic resistance of identified strains was determined by disc diffusion method. E. faecalis (47.37 %) was predominant strain in first milk strips. Members of E. group III (durans/hirae) dominated in samples of swabs from treat skin (44 %) and swabs from gum part of teat cup (53.13 %). In bulk tank milk dominated E. faecalis (34 %) and also species like E. faecium, E. durans and E. group III were detected. E. faecalis constituted as many as 68.5 % of strains isolated from rinse water after sanitation of milking machine. Resistance to the vancomycin was detected in 10 % of isolates from the most common identified species E. faecalis, but resistance to the teicoplanin was not detected. Isolates of enterococci from milk samples showed the most common resistance to the tetracycline. Úvod Fenomén vzniku rezistencie sprevádza každé novoobjavené antibiotikum zavedené do širšieho liečebného používania. K problematickej skupine baktérií, u ktorých sa v posledných rokoch zisťuje rezistencia na antibiotiká patria aj enterokoky. Enterokoky rezistentné na rôzne druhy antibiotík sa v posledných desiatich rokoch izolovali z rôznych surovín a potravín živočíšneho pôvodu, vrátane mlieka. Otázkou stále ostáva, čo je zdrojom kontaminácie mlieka enterokokmi. Prítomnosť enterokokov v mlieku a mliečnych výrobkoch sa považovala za znak zlej hygieny pri získavaní a spracovaní surového mlieka. Dnes sa vie, že niektoré kmene enterokokov sa podieľajú na tvorbe chuti a arómy syrov alebo môžu pôsobiť aj ako probiotiká (1). Enterokoky predstavujú veľkú časť autochtónnych baktérií spojených s gastrointestinálnym traktom cicavcov. V tráviacom systéme ľudí a zvierat je dominujúcim druhom E. faecalis. Enterokoky nie sú spájané len s teplokrvnými živočíchmi, ale často sa vyskytujú v pôde, povrchových vodách, na rastlinách a zelenine (2). Pravidelne sa nachádzajú na dojacích strojoch alebo na iných pomôckach a zariadeniach používaných v prvovýrobe mlieka. Napr. Artimová (3) v steroch gumových častí dojacieho stroja zistila priemerne 6, enterokokov, pričom najčastejšie izolovaným bol druh E. faecium. Kagkli et al. (4) pri zisťovaní zdrojov kontaminácie mlieka enterokokmi vyšetrovali výkaly zvierat, kožu ceckov vemena a dojacie zariadenia. Nezistili súvis medzi prevládajúcimi druhmi enterokokov v kravských fekáliách a v surovom mlieku. Za hlavný zdroj kontaminácie mlieka enterokokmi označili dojacie zariadenia, do ktorých sa enterokoky dostali z krmív. Zvýšený podiel enterokokov v mikroflóre dojacích strojov môže byť aj následkom teplotnej a chemickej selekcie pri ich nedostatočnej dekontaminácii nízkymi koncentráciami a nedostatočnou teplotou sanitačných roztokov. Zo štúdie Gelsomino et al. (5) vyplýva, že po dezinfekcii dojacích zariadení chlórovými dezinfekčnými roztokmi sa v zariadeniach častejšie vyskytoval druh E. casseliflavus ako E. faecalis. Z výskumu Ziarno (6) vyplýva, že na povrchu dojacieho zariadenia a vo vode, ktorá sa použila na umývanie vemena kráv sa vyskytovali hlavne druhy E. casseliflavus a E. faecalis. V surovom kravskom mlieku sa najčastejšie izoloval druh E. faecalis, nasledovaný druhmi E. faecium, E. durans/hirae, E. mundtii (7,8). Za posledných desať rokov pribudli štúdie dokazujúce u izolátov enterokokov z mlieka rezistenciu na rôzne typy antibiotík používaných aj v liečbe ľudí. Napr. Araya et al. (9) u enterokokov izolovaných zo surového mlieka zistili rezistenciu na erytromycín, tetracyklín, 237

238 chloramfenikol a u 8 % izolátov aj na vankomycín. Šustáčková et al. (10) u izolátov enterokokov zo surového mlieka zistili rezistenciu na chloramfenikol, tetracyklín a erytromycín. Prítomnosť kmeňov enterokokov rezistentných na antibiotiká sa zisťuje aj v rôznych mliečnych výrobkoch. Pre zabránenie ďalšieho nárastu rezistentných kmeňov mikroorganizmov je potrebné seriózne zvažovať používanie antibiotík vo veterinárnej medicíne a monitorovať suroviny a potraviny živočíšneho pôvodu vrátane mlieka na výskyt rezistentných kmeňov mikroorganizmov. Cieľom tejto práce bolo zistiť prítomnosť enterokokov v rôznych zdrojoch v prvovýrobe mlieka, izolovať ich, identifikovať a potvrdiť citlivosť na rôzne antibiotiká. Materiál a metódy Odobraté vzorky prvých odstrekov mlieka, sterov z kože ceckov vemena, sterov z gumovej časti dojacích strojov a bazénových vzoriek mlieka na dvoch vybraných poľnohospodárskych podnikoch sa spracovali štandardnou zrieďovacou metódou. Počty enterokokov sa zisťovali na selektívnom diagnostickom médiu Slanetz-Bartley (Biokar Diagnostic, Francúzsko) kultiváciou pri teplote C po hodinách. Počty enterokokov sa vyjadrili ako aritmetický priemer. Z platní Slanetz Bartley agaru sa náhodne izolovali vyrastené suspektné kolónie. Príslušnosť k rodu Enterococcus sa potvrdila rastom izolovaných kolónií na selektívnom žlčeskulín-azidovom médiu (Biokar Diagnostic, Francúzsko) po 24 hodinách kultivácie pri C, príslušnosťou ku G + baktériám, negatívnym katalázovým a pozitívnym PYRA testom (Lachema, Česká republika). Potvrdené kmene (celkom 206) sa druhovo identifikovali pomocou komerčného EN COCCUS testu (Lachema, Česká republika). Izoláty enterokokov identifikované pomocou EN COCCUS testu (Lachema, Česká republika) ako druh E. faecalis sa podrobili potvrdeniu pomocou PCR metódy s použitím nasledovnej sekvencie primerov For: ATC AAG TAC AGT TAG TCT, Rev: ACG ATT GAA AGC TAA CTG (941bp). Z čistej 24 hodinovej kultúry sa pomocou komerčného kitu InstaGene matrixu (BioRad, USA) pripravil lyzát z ktorého sa 5µl pridalo do 20µl mixu pripraveného z: 2,5µl 10 x PCR buffer (Fermentas, Germany), 0,5µl 10mM dntp set (Fermentas, Germany), 2,5µl MgCl 2 (Fermentas, Germany), 0,2µl Taq polymerázy (Fermentas, Germany) a 0,5µl z každého 10pmol/µl primeru (Fermentas, Germany). Teplotný profil sa nastavil podľa Kariyama et al. (11). Elektroforetická separácia DNA fragmentov sa uskutočnila v 2 % agarózovom géli pri 200 V, 180 ma, 15 min. U identifikovaných kmeňov rodu Enterococcus sa hodnotila citlivosť k antibiotikám diskovou difúznou metódou na Mueller Hinton agare (HiMedia Laboratories, India) použitím antibiotických diskov s koncentráciou Ampicillin (AMP) 10 mcg/disk, Erythromycin (ERY) 15 mcg/disk, Tetracycline (TET) 30 mcg/disk, Vancomycin (VAN) 30 mcg/disk, Gentamicin (GEN) 10 mcg/disk, Teicoplanin (TEI) 30 mcg/disk (HiMedia Laboratories, India). Zaradenie jednotlivých kmeňov medzi rezistentné, stredne rezistentné a citlivé sa uskutočnilo podľa kritérií CLSI (12). Výsledky a diskusia Vo vzorkách mlieka z prvých odstrekov sa najčastejšie identifikoval druh E. faecalis 47,37 %, E. durans/hirae 36,84 % a E. casseliflavus 10,53 %. Z kože ceckov vemena až 44 % izolátov patrilo medzi E. group III, teda E. durans/hirae. Z tohto zdroja sa ďalej izoloval E. casseliflavus 12 % izolátov a E. faecalis 28 %. Prítomnosť týchto druhov enterokokov podľa viacerých autorov (5,6) dokazuje nedostatočnú hygienu vemena pred dojením a tým je možné vysvetliť aj ich prienik do ceckového kanálika vemena. Rovnaké druhy, avšak s iným zastúpením, sa zistili po identifikácii izolátov enterokokov zo sterov gumových častí nástrčiek dojacích strojov. Dominantné zastúpenie (53,13 %) mali druhy E. durans/hirae. Okrem E. faecalis, E. casseliflavus a E. faecium sa biochemickými testami potvrdila aj prítomnosť nie často sa vyskytujúceho druhu E. pseudoavium. V bazénových vzorkách mlieka v súlade so zisteniami aj iných autorov (7,8) sa najčastejšie potvrdzovala prítomnosť druhu E. faecalis. Prehľad o zastúpení druhov rodu Enterococcus izolovaných z rôznych zdrojov v prvovýrobe mlieka poskytuje obr

239 Izoláty [%] Obr. 1. Zastúpenie enterokokov izolovaných z rôznych zdrojov v prvovýrobe mlieka. 1 E. casseliflavus, 2 E. faecalis, 3 E. faecium, 4 E. durans/hirae, 5 E. mundtii, 6 E. pseudoavium, 7 Enterococcus sp. Izoláty druhu E. faecalis potvrdené biochemickým EN - COCCUS testom sa potvrdzovali PCR metódou. Potvrdenie 7 rôznych izolátov E. faecalis znázorňuje obr. 2. PCR metódou sa potvrdili všetky izoláty druhu E. faecalis predtým určené EN-COCCUS testom, čím sa dokázala vysoká záchytnosť EN- COCCUS testu pre tento druh, potvrdená aj Jurkovičom (13). Obr. 2 Potvrdenie druhu E. faecalis u 7 izolátov enterokokov (číslo 7,45,46,48,49,50,51) pomocou PCR metódy. 100bp DNA marker (Fermentas, Germany), E. faecalis CCM 4224, amplifikované produkty DNA izolátov E. faecalis (941bp) U všetkých druhovo určených enterokokov sa zisťovala ich antibiotická rezistencia na šesť vybraných antibiotík. V prípade enterokokov pochádzajúcich z prvých odstrekov mlieka sa u 5 % izolátov (druh E. faecalis) dokázala rezistencia na vankomycín, vôbec sa nepotvrdila rezistencia na ampicilín a teikoplanin - obr. 3. Keďže sa nezisťovalo, či ide o rezistenciu získanú alebo geneticky danú, nedá sa uviesť o aký typ rezistencie sa jedná. Aj u enterokokov pôvodne odizolovaných z kože ceckov (12 % izolátov) a z gumovej časti nástrčiek dojacích strojov (6 %) sa zistila rezistencia na vankomycín, pričom na ostatné antibiotiká sa rezistencia nezistila. Tieto zistenia by mohli naznačovať, že enterokoky pôvodne pochádzali zo zažívacieho traktu liečených zvierat a potvrdzujú nedostatočnú hygienu na poľnohospodárskych podnikoch. Je zaujímavé, že u enterokokov izolovaných pôvodne z bazénových vzoriek mlieka sa rezistencia na vankomycín nezistila. Súvisí to zrejme s náhodným výberom kolónií na izoláciu alebo s pomerne nízkym 239

240 výskytom vankomycín-rezistentných kmeňov enterokokov. Zistilo sa však prekvapujúco vysoké percento izolovaných kmeňov rezistentných na tetracyklín (50 %). Rezistenciu enterokokov izolovaných zo surového mlieka uvádzajú aj iní autori (9,10). 30 Izoláty [%] VAN TET ERY GEN AMP TEI Obr. 3 Rezistencia enterokokov pôvodne izolovaných z prvých odstrekov mlieka k vybraným druhom antibiotík. Obr. 4 znázorňuje rezistenciu na vybrané antibiotiká všetkých kmeňov druhu E. faecalis. 100 %-ná citlivosť sa dokázala na teikoplanin a 90 %-ná na vankomycín, pričom 10 % izolátov vykazovalo rezistenciu na vankomycín. Podstatne vyššiu rezistenciu na vankomycín zistil u enterokokov izolovaných z mlieka napr. Citak (7). Izoláty [%] AMP ERY GEN TEI TET VAN citlivé rezistentné stredne rezistentné Obr. 4 Antibiotická rezistencia kmeňov E. faecalis izolovaných z rôznych zdrojov v prvovýrobe mlieka. V práci sú prezentované čiastkové výsledky vyšetrovania prítomnosti rezistentných kmeňov enterokokov z rôznych zdrojov, ktoré prichádzajú do úvahy ako možný zdroj kontaminácie mlieka pri jeho získavaní v prvovýrobe. Potvrdil sa výskyt enterokokov s rezistenciou na antibiotiká vrátane vankomycínu, ktorý sa v súčasnosti pokladá za antibiotikum poslednej voľby pri liečení ľudí. Je potrebné zistiť, či ide o rezistenciu na antibiotiká získanú alebo vrodenú. Na základe získaných výsledkov je potrebné ďalej študovať schopnosť takýchto druhov enterokokov prežívať tepelné ošetrenie mlieka, a tým ich prienik do reťazca mliečnych výrobkov. 240

241 Poďakovanie Práca vznikla za finančnej podpory grantovej výskumnej úlohy VEGA projektu č. 1/0410/09. Použitá literatúra 1. COGAN, T.M. REA, M.C. GELSOMINO, R. et al Enterococci in food fermentations: Functional and safety aspects. In Armis, 2001, no. 4547, p GREIFOVÁ, M. GREIF, G. LEŠKOVÁ, E. et al Enterokoky ich hodnotenie v mliekarenskej technológii. In Mliekarstvo, roč. 34, 2003, č. 2, s ARTIMOVÁ, A Výskyt enterokokov v podmienkach prvovýroby mlieka. In III. Vedecká konferencia doktorandov s medzinárodnou účasťou. Nitra:SPU, 2008, s , ISBN KAGKLI, M.D. VANCANNEYT, M. HILL, C. et al Enterococcus and Lactobacillus contamination of raw milk in farm dairy environment. In International Journal of Food Microbiology, vol. 114, 2007, no. 2, p GELSOMINO, R. VANCANNEYT, M. CONDON, S. et al Source of Enterococci in a Farmhouse Raw-Milk Cheese. In Applied and Enviromental Microbiology,vol. 68, 2002, no. 7, p ZIARNO, M Bakterie rodzaju Enterococcus w mleku i przetworach mleczarskich. In Medycyna Wet, vol. 62, 2006, no. 2, p CITAK, S. GUNDOGAN, N. MEND, A Occurence, isolation and antibiotic resistance of Enterococcus species isolated from raw milk samples in Turkey. In Milchwissenschaft, vol. 61, 2006, no. 2, p ARIZCUN, C. BARCINA, Y. TORRE, P Indentification of lactic acid bacteria isolated from Roncal and Idiazábal cheeses. In Lait, vol. 77, 1997, no. 6, p ARAYA, M. DAVIDOVICH, G. CHAVES, C et al Identification of Enterococcus sp. isolated from raw milk samples coming from the metropolitan area of Costa Rica and evaluation of its antibotic sensibility pattern. In Archivos latinoamericanos de nutricio, vol. 55, 2005, no. 2, p ŠUSTÁČKOVÁ, A. NÁPRAVNÍKOVÁ, E. NAVRÁTILOVÁ, P. et al Potraviny živočišného původu jako vektor rezistence k antibakteriálním látkam. In Zborník z medzinárodného vedeckého seminára Aktuálne problémy riešené v agrokomplexe.nitra: SPU, 2003, s , ISBN KARIYAMA, R. MITSUHATA, R. CHOW, J. W. et al Simple a reliable multiplex PCR assay fo surveillance isolates of vancomycin-resistant Enterococci. In J. Clin. Microbiol., vol.38, 2000, p CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Disc Susceptibility Tests; Approved Standard Ninth Edition, M2 A9. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA, 37 p. 13. JURKOVIČ, D Identifikácia enterokokov izolovaných z bryndze. In Bulletin Československej spoločnosti mikrobiologickej, roč. 47, 2006, s Kontaktná adresa Doc. Ing. Margita Čanigová, CSc.; Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov, FBP Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra, tr. A. Hlinku č Nitra Slovenská republika; margita.canigova@uniag.sk 241

242 DRUHOVÉ ZASTOUPENÍ A REZISTENCE ENTEROKOKŮ IZOLOVANÝCH ZE SYROVÉHO A PASTEROVANÉHO OVČÍHO MLÉKA 1 Cupáková Šárka, 1 Dušková Marta, 1 Janštová Bohumíra, 1 Necidová Lenka, 1,2 Karpíšková Renáta 1 Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno; 2 Centrum laboratorních činností Brno, Státní zdravotní ústav Praha Species distribution and resistance of enterococci isolated from raw and pasteurized sheep's milk Summary: The aim of this work was to monitore the species distribution of enterococci in raw and pasteurized sheep's milk and the resistance to antimicrobial agents in E. faecalis and E. faecium isolates. Genus and species specific identification was performed by polymerase chain reaction method. Resistance to antimicrobial agents was determined using the disk diffusion method. The presence of enterococci was observed in 100% of samples of raw and pasteurized milk. From raw milk species E. faecalis (81.0%) and E. mundtii (4.8%) were isolated, from pasteurized milk species E. faecalis (65.0%) and E. faecium (2.5%). Other isolates were identified only as Enterococcus spp. All E. faecalis isolates were resistant to clindamycin, resistance to cephalothin and ofloxacin was also found a total of 8 isolates were resistant simultaneously to all three of those substances. E. faecium isolate from pasteurized milk was resistant to cephalothin and ofloxacin. No resistance to vancomycin, hly-gentamicin and hly-streptomycin has been observed. Finally, enterococci are commnoly found in raw and pasteurized sheep's milk, the dominant species is E. faecalis. All isolated were resistant to at least 1 antimicrobial substance tested. Enterokoky se běžně vyskytují jako saprofyté a komenzálové střevního traktu nejen teplokrevných zvířat, ptáků a člověka, ale také plazů či hmyzu. Dále se běžně nacházejí v prostředí půdě, povrchových a odpadních vodách, či na rostlinách a zelenině (6). V humánní medicíně jsou významnými původci nosokomiálních nákaz, často jsou rezistentní k běžně používaným antimikrobiálním látkám (cefalosporinům, klindamycinu, aztreonamu). Rezistentní i multirezistentní kmeny enterokoků jsou izolovány také z potravin a dalších environmentálních vzorků (7, 12) Cílem prezentované studie bylo sledování druhového zastoupení enterokoků v syrovém a tepelně ošetřeném ovčím mléce a u druhů E. faecalis a E. faecium hodnocení rezistence k antimikrobiálním látkám. Materiál a metody: Odběr vzorků ovčího mléka byl prováděn na ekologické ovčí farmě v okrese Vsetín na Valašsku, Česká republika. Vzorky byly odebírány od května do října 2008 v pravidelných časových intervalech. Celkem bylo odebráno a vyšetřeno 41 vzorků, z toho 21 vzorků syrového a 20 vzorků pasterovaného ovčího mléka. Pasterace mléka probíhala stacionárním způsobem při teplotě 63 C po dobu 30 minut. Vzorky byly zchlazeny na teplotu 6 C a při této teplotě transportovány do laboratoře. Základní zpracování vzorků spočívalo v homogenizaci 25 ml vzorku s 225 ml pufrované peptonové vody (Oxoid, Basingstoke, VB) a následné aerobní inkubaci homogenátu při teplotě 37 C po dobu hodin. Pomnožený vzorek byl vyočkován na povrch Slanetz-Bartley agaru (Oxoid, Basingstoke, VB), naočkované plotny byly inkubovány aerobně při teplotě 37 C po dobu hodin. Po ukončení inkubace byly pro každý testovaný vzorek izolovány dvě charakteristické kolonie pro konfirmaci a druhovou identifikaci. Rodová konfirmace byla provedena metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) zaměřenou na detekci rodově specifického tuf-genu (4). Druhová identifikace byla provedena opět metodou PCR založenou na detekci druhově specifických úseků genu soda (8). U izolátů E. faecalis a E. faecium byla diskovou difúzní metodou testována rezistence k vybraným antimikrobiálním látkám ampicilin (AMP), ampicilin+sulbaktam (AMS), cefalotin (CLT), klindamycin (CLI), erytromycin (ERY), gentamicin vysoká hladina (GEN), chloramfenikol (CMP), ofloxacin (OFL), penicilin (PEN), streptomycin vysoká hladina (STR), 242

243 teikoplanin (TEI), tetracyklin (TET) a vankomycin (VAN). Stanovení bylo provedeno podle metodiky CLSI (1), antibiotické disky byly získány od firmy Oxoid (Basingstoke, VB) a pro STR od firmy BioRad (Marnes-la-Coquette, Francie). Vyhodnocení bylo provedeno dle kriterií uvedených v CLSI (2), pro cefalotin v NCCLS (11) a pro klindamycin v SFM (3). Výsledky a diskuse: Přítomnost enterokoků byla zaznamenána u 100 % vzorků syrového a u 100 % vzorků pasterovaného ovčího mléka. Ze syrového mléka bylo izolováno a rodově identifikováno 42 izolátů enterokoků, z toho 34 izolátů druhu Enterococcus faecalis (81,0 %), 2 izoláty E. mundtii (4,8 %), 6 izolátů se nepodařilo metodou PCR druhově identifikovat. Z pasterovaného mléka bylo izolováno 40 izolátů enterokoků 26 izolátů E. faecalis (65,0 %), 1 izolát E. faecium (2,5 %), 13 izolátů bylo zařazeno pouze rodově jako Enterococcus spp. Na výskyt druhů E. faecalis a E. faecium v syrovém ovčím mléce upozorňují i jiní autoři, ve své studii uvádí 70% zastoupení izolátů E. faecalis a 30% výskyt druhu E. faecium, oba druhy byly izolovány i z měkkého ovčího sýru bryndza (5). Také další autoři izolovali z bryndzy několik druhů enterokoků - E. faecalis, E. faecium a E. durans, přičemž v jejich případě byl dominantním druhem E. faecium (9). Na výskyt E. faecium v ovčích sýrech upozorňuje i další studie (10). Tabulka I Přehled rezistentních izolátů E. faecalis a E. faecium Antimikrobiální látka Syrové mléko Pasterované mléko E. faecalis E. faecium E. faecalis E. faecium % % Počet izolátů Ampicilin Ampicilin/sublaktam Cefalotin 44,0-31,0 100 Erytromycin Gentamicin Chloramfenicol Klindamycin Ofloxacin 26,5-15,5 100 Penicilin G Streptomycin Teikoplanin Tetracyklin Vankomycin Všechny izoláty E. faecalis ze syrového i pasterovaného ovčího mléka byly rezistentní ke klindamycinu, dále byla zjištěna rezistence k cefalotinu a ofloxacinu (viz. Tabulka I). Celkem 8 izolátů E. faecalis (6 syrové mléko, 2 pasterované mléko) bylo rezistentních současně ke všem třem uvedeným antimikrobiálním látkám. Izolát E. faecium z pasterovaného mléka byl rezistentní k cefalotinu a ofloxacinu. U žádného izolátu nebyla zjištěna rezistence k vankomycinu, vysoké hladině gentamicinu či streptomycinu a dalším testovaným klinicky významným látkám. Na citlivost enterokoků izolovaných ze syrového ovčího mléka či bryndzy k vankomycinu poukazují i práce dalších autorů (5, 9). Na rozdíl od našich výsledků byla u enterokoků ze syrového ovčího mléka zaznamenána rezistence k ampicilinu, erytromycinu, gentamicinu a tetracyklinu. U izolátů E. faecium z ovčích sýrů byla popsána rezistence k erytromycinu, levofloxacinu, nitrofurantoinu a norfloxacinu, podobně jako v našem případě nebyly zachyceny izoláty rezistentní ke glykopeptidům, vysokým hladinám gentamicinu a streptomycinu, chloramfenikolu a β- laktamovým antibiotikům (10). 243

244 Závěr: Z výsledků studie vyplývá, že enterokoky se v syrovém i pasterovaném ovčím mléce běžně vyskytují, dominantním druhem byl v našich podmínkách Enterococcus faecalis. Z dalších druhů enterokoků byl použitou metodou PCR v minoritním zastoupení identifikován E. mundtii v syrovém a E. faecium v pasterovaném ovčím mléce. Všechny izoláty E. faecalis a E. faecium byly rezistentní nejméně k jedné testované antimikrobiální látce. Na druhou stranu, ale nebyla zjištěna rezistence k žádnému kliniky významnému antibiotiku což může souviset s celkově dobrým zdravotním stavem zvířat i ekologickým způsobem chovu ovcí. Poděkování: Práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Použitá literatura: 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard Ninth Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute document M2-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute, USA, 2006a. 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting; Sixteenth Informational Supplement. CLSI document M100-S16. Clinical and Laboratory Standards Institute, USA, 2006b. 3. Comite de l Antibiogramme de la Société Francaise de Microbiologie. Communique SFM, Créteil Cedex, CUPÁKOVÁ, Š., POSPÍŠILOVÁ, M., KOLÁČKOVÁ, I., KARPÍŠKOVÁ, R. Genus-specific identification of enterococci by PCR method. Acta Vet. Brno, 2005, vol. 74, no. 4, p DUCKOVA, V., CANIGOVA, M., KROCKO, M. Enterococcus species isolated from sheep milk in Slovak Bryndza cheese and their antibiotic susceptibility. Milchwissenschaft, 2009, vol. 64, no. 1, p FRANZ, CHMAP., HOLZAPFEL, WH., STILES, ME. Enterococci at the crossroads of food safety? Int. J. Food Microbiol., 1999, vol. 47, no. 1-2, p GIRAFFA, G. Enterococci from foods. FEMS Microbiol. Rev., 2002, vol. 26, no. 2, p JACKSON, CH., FEDORKA-CRAY, PJ., BARRETT, JB. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol., 2004, vol. 42, no. 8, p JURKOVIC, D., KRIZKOVA, L., DUSINSKY, R., BELICOVA, A., SOJKA, M., KRAJCOVIC, J., EBRINGER, L. Identification and characterization of enterococci from bryndza cheese. Lett. Appl. Microbiol., 2006, vo. 42, no. 6, p MANNU, L., PABA, A., DAGA, E., COMUNIAN, R., ZANETTI, S., DUPRE, I., SECHI, LA. Comparison of the incidence of virulence determinants and antibiotics resistance between Enterococcus faecium strains of dairy, animal and clinical origin. Int. J. Food Microbiol., 2003, vol. 88, no. 2-3, p National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals. Approved standard M31-A. NCCLS, Wayne, TEMPLER, SP., ROHNER, P., BAUMGARTNER, A. Relation of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates from foods and clinical specimens. J. Food Prot., 2008, vol. 71, no. 10, p Kontaktní adresa: Mgr. Marta Dušková, Ústav hygieny a technologie mléka, FVHE, VFU Brno, Palackého 1-3, Brno, , duskovam@vfu.cz 244

245 SLEDOVÁNÍ FYZIOLOGICKÝCH A BIOCHEMICKÝCH CHARAKTERISTIK LISTERIA MONOCYTOGENES IN VITRO Pechačová Marta 1, Němečková Irena 1, Kunová Gabriela 2, Roubal Petr 2, Peroutková Jitka 2 1 MILCOM a.s., Praha; 2 Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o. Monitoring of physiological and biochemical characteristic of Listeria monocytogenes in vitro Summary: Listeria monocytogenes is alimentary pathogene to evoke disease listeriosis. Density of bacteria needed for colonization of digestive tract and to development illness is 10 9 for healthy person and for enfeebled person only Raw milk is a source of contamination at the dairies. Listeria monocytogenes is fully inhibited by pasterization, therefore positive find in final product is always recontamination. Enhanced risk is given of variability of growth condition, range of temperature is 2-45 C, range of acidity is 4,4-9 ph. Listeria is not inhibited even by high concentracion of sodium chloride. Listeria monocytogenes is able to stick to the surface of technology equipment, it is often part of biofilms. There is higher risk in locality with hard water. Úvod Na modelových pokusech in vitro u 6 kmenů Listeria monocytogenes, izolovaných z mlékárenské výroby, výroby salámu a zpracování zeleniny, byly sledovány biochemické a fyziologické aktivity in vitro s ohledem na parametry mlékárenské technologie (1). Byla sledována rezistence po průchodu zažívacím traktem tj. odolnost ke žlučovým kyselinám a nízkému ph. Také byla ověřena účinnost pasterace používané při výrobě sýrů. Na modelových pokusech byl ověřen vliv matrice vzorku (bujón, smetana, tvaroh) na termizaci výrobků a byly stanoveny parametry pro výrobu bezpečné potraviny při eventuální rekontaminaci suroviny listerií. Byla testována rezistence vůči zvýšené koncentraci NaCl (5-7 %) v závislosti na teplotě skladování. Na speciálním agaru byl proveden test pohyblivosti Listeria monocytogenes v závislosti na ph (ph 4,5; 7) a teplotě (6, 22, 37 C). Výsledky Odolnost k sanitačním prostředkům byla testována pomocí fenolu a to koncentraci 0,2 a 0,5 g/100 ml. Žádný kmen nebyl rezistentní už při koncentraci 0,2 g/100 ml. Dva kmeny byly tolerantní (pokles o %). Koncentrace 0,5 g/100 ml byla inhibující pro všechny kmeny. Rezistence ke žlučovým solím byla zkoušena ve dvou koncentracích, 0,3 a 0,7 %. Nižší koncentrace inhibovala tři kmeny, koncentrace 0,7 %, čtyři kmeny ze šesti. Teplota a ph ovlivňuje také pohyblivost listerií. Pohyblivost byla testována na BBL- Motility Test Medium vpichem (obr. 1 a 2). Výsledky jsou uvedeny v tabulce I. Tabulka I Test pohyblivosti kmenů Listeria monocytogenes (L-1 až L-6) v závislosti na ph a teplotě. Kmen LM K 22 C ph 4,5 22 C K 6 C ph 4,5 6 C K 37 C ph 4,5 37 C L L /- - L L L /- - L

246 Obr. 1 Pozitivní test pohyblivosti provedený vpichem do BBL média Obr. 2 Negativní test pohyblivosti provedený vpichem do BBL média Dále byla testována odolnost vůči různým koncentracím NaCl (2, 5 a 7 %) při 6 a 22 C. Při obou teplotách a koncentraci NaCl 2 % růst nebyl ovlivněn. Koncentrace 5 % NaCl již inhibuje růst listerií, výraznější inhibice je při 22 C. Při 7 % NaCl je vysoká inhibice u obou teplot, rezistence se pohybuje od 0,001 do 1,9 %. Termizační efekt při teplotě 65 C s výdrží 5 minut je nedostačující, výdrž 10 minut při stejné teplotě byla pro 5 kmenů 100 % inhibiční. Byl zkoušen vliv terminačního záhřevu v závislosti na matrici vzorku (bujón, tvaroh, smetana). Nejnižší termizační efekt byl prokázán u smetany. Výsledky pokusu jsou znázorněny v grafech č

247 Obr. 3 Termizační efekt v bujónu při teplotě 65 C s výdrží 5 a 10 minut. Obr. 4 Termizační efekt v tvarohu při teplotě 65 C s výdrží 5 a 10 minut. Obr. 5 Termizační efekt ve smetaně při teplotě 65 C s výdrží 5 a 10 minut. 247

248 Závěr Pro výrobu bezpečných potravin je třeba dodržovat při ošetření mléka šetrnou pasteraci 74 C/40 s pro 100% inhibici listerií. Při termizaci je třeba dodržet podmínky 65 C/10 minut. Na termizační efekt má významný vliv matrice vzorku resp. její obsah bílkovin, tuku a aktivita vody a w. Listeria monocytogenes je rezistentní vůči vysoké koncentraci NaCl (5 a 7 %) a žlučovým kyselinám, ph 3 působí 100 % inhibičně. Poděkování: Práce vznikla díky finanční podpoře MŠMT 2B08050 a MSM Použitá literatura: 1. Purkrtová S., Pilchová T., Ďurišová J., Demnerová K., Pazlarová J. (2009): Podmínky tvorby biofilmů u Listeria monocytogenes. Mlékařské listy, 112, Gelbíčková T., Šťástková Z., Pospíšilová M., Karpíšková R. (2008): Charakteristika izolátů Listeria monocytogenes z mléčných výrobků. Veterinářství (58), 5, Kontaktní adresa: MILCOM a.s., Ke Dvoru 12 a, peroutkova@milcom-as.cz 248

249 PREŽÍVANIE VYBRANÝCH PROBIOTICKÝCH MIKROORGANIZMOV V JOGURTOCH POČAS ICH SKLADOVANIA V PRIEBEHU ROČNÝCH OBDOBÍ Lovayová Viera, Burdová Oľga Ústav hygieny a technológie mlieka, Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach Survival selected probiotic microorganisms in yogurt during storage behavior annual period Summary The study evaluated the survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium animalis spp. lactis in yoghurt during storage. Yoghurt produced in laboratory conditions were incubated at 43 C 3.5 h. and stored at 4 C. The samples will monitor changes in acidity (ph and SH) and microbiological properties of yogurt, which were evaluated at 1, 3, 7, 14 and 21 days of storage. Experiments were carried out from April 2008 to January Results showed significant differences between different types of probiotic bacteria. The technology used in yogurt production laboratory conditions proved to be correct and suitable for breeding of probiotic microorganisms. The microbiological analysis showed that there was an increase in the numbers of probiotic bacteria. Numbers of Bifidobacterium animalis spp. lactis is increased from 0.3 x10 9 cfu / g to 1.7 x10 9 cfu / g in the first 7 days, regardless of season. Lactobacillus acidophilus bacterial counts increased from 0.8 x10 9 cfu / g to 5.5 x10 9 cfu / g during the 7 days of storage in four seasons. Statistical significance was between decreasing ph and increasing numbers of individual species of bacteria observed in the samples. It can be said that there was a higher increase in the bacterial genus Lactobacillus acidophilus during the observation period. Quantitative representation of Lactobacillus acidophilus at the end of storage replied quantity of probiotic bacteria to achieve a minimum therapeutic, while the numbers of the genus Bifidobacterium animalis spp. lactis were the order of 2, in 1 / g lower than the number of species of Lactobacillus acidophilus. Úvod Spotreba mlieka a mliečnych výrobkov sa stáva stále viac stredom pozornosti odborníkov pre výživu ľudí a tieto produkty sa postupne objavujú na trhu v stále väčšom množstve, širšom sortimente a vyššej akosti. V posledných rokoch je venovaná značná pozornosť možnosti zlepšenia zdravotného stavu človeka úpravou črevnej mikroflóry. Všeobecným trendom je príklon k zdravej výžive. Probiotické potraviny, vrátane mliečnych výrobkov, hrajú významnú úlohu v ľudskej výžive. Najskôr boli definované ako potraviny obsahujúce živé mikroorganizmy, ktoré aktívne zlepšujú zdravie a udržujú v rovnováhe mikroflóru čreva. V súčasnej dobe sú vymedzené ako produkty, ktoré obsahujú mikrobiálne bunky, alebo ich časti, a majú blahodarný vplyv na zdravie hostiteľa. Pri výrobe sa osvedčili najmä baktérie rodu Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus. V dnešnej dobe sa výrazne zvýšil počet mikrobiálnych druhov, ktoré sú obsiahnuté v probiotických mliečnych produktoch (napr. kyslomliečne výrobky, syry). Potraviny sú hlavným zdrojom príjmu probiotík a medzi fermentovanými mliečnymi produktmi zostává najvýznamnejším výrobkom jogurt. Celosvetovo je predávaných viac než 100 rôznych probiotických výrobkov a spotreba potravín obsahujúcich Lactobacillus acidophilus a bifidobaktérie je pozorne sledovaná. K zaisteniu zlepšenia zdravia je podstatné, aby potraviny vyhovovali nárokom minimálnej koncentrácie probiotík 10 6 cfu (colony-foming unit) v 1ml -1 alebo g -1 výrobku aj na konci doby spotreby. Na životnosť probiotických kultúr vo fermentovanom mlieku pôsobí rada faktorov, najmä výsledná kyslosť produktu, dostupnosť živín, rozpustnosť a možnosť permeácie kyslíka cez obal výrobku. Stabilita probiotických kultúr vo výrobkoch je dôležitým problémom, na ktorý je zameraná hlavná pozornosť. Štúdia hodnotila prežívanie Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium animalis ssp. lactis v jogurtoch počas ich skladovania. Materiál a metodika V práci sa analyzovalo 320 vzoriek bielych jogurtov vyrobených z kravského mlieka s rozdielnym počtom somatických buniek. Analyzovali sa vzorky bieleho jogurtu technologicky vyrobeného v laboratórnych podmienkach. Vzorky sa hodnotili po dobu jedného mesiaca, päť krát v danom mesiaci. Analyzovaná bola vždy trojica vzoriek u každého typu vzoriek. 249

250 V surovom kravskom mlieku sa stanovovali nasledovné parametre: tuk, beztuková sušina, hustota, bielkoviny, obsah vody, teplota ( C), ph, elektrická vodivosť pomocou infračerveného analyzátora - Ekomilk. Počty somatických buniek boli stanovené na Fossomaticu 90. Rezíduá inhibičných látok boli zisťované pomocou DELVO testu s testovacím mikroorganizmom Bacillus stearothermophilus var. calidolactus. Kultivácia celkového počtu mikroorganizmov v surovom kravskom mlieku sa previedla na štandardnom agare PCA - Plate Count Agar (Hi Media). Na vyšetrenie koliformných baktérií sa použil Endov agar Base (Hi Media). Pre stanovenie počtu mikroorganizmov rodu Lactobacillus acidophilus bola použitá pôda M 641 Lactobacillus MRS AGAR Hi Media so selektívnym činidlom. Pre stanovenie počtu mikroorganizmov rodu Bifidobacterium bola použitá pôda M 1396 Bifidobacterium Agar Hi Media. Pri mikrobiologickom hodnotení vzoriek experimentálne vyrobených jogurtov (vzorka A, vzorka B) sa v týždenných intervaloch sledovala životaschopnosť probiotických baktérií. Do pripravených sterilných Petriho misiek so živnou pôdou sa naočkoval 0,1 ml sterilnou pipetou z pripraveného desaťnásobného riedenia. Inokulum bolo rozotrené po povrchu kultivačnej pôdy sterilnou hokejkou. Médium sa nechalo stuhnúť a inkubovalo sa v anaerostate za pridania vyvíjača a indikátora anaerobiózy obrátené hore dnom. V anaerostate pri teplote 37 o C po dobu 3 dní za anaeróbnych podmienok. Zistené hodnoty boli spracované do tabuliek a grafov pomocou programu Microsoft Excel. Pre zistenie štatistickej významnosti bol použitý párový T-test presných pravdepodobností (GaphPad Prism 5). Výsledky a diskusia Rozbor surového kravského mlieka sa vykonával vždy v deň technologickej výroby jogurtov počas všetkých ročných období. Priemerný obsah tuku za štyri ročné obdobia bol 4,02 %. Najvyšší obsah tuku bol vykázaný v jarnom a jesennom období. Priemerná hodnota mliečnych bielkovín kravského mlieka počas experimentálneho obdobia bola 3,59 %. Obsah beztukovej sušiny sa v kravskom mlieku počas sledovaných období mierne zvyšoval (až na letné obdobie, kedy hodnota beztukovej sušiny klesla na 8,78 %). V sledovaných obdobiach došlo k výraznejšiemu poklesu obsahu laktózy v zimnom období, kedy dochádza k nízkemu príjmu energie a bielkovín z krmiva za súčasného zvýšenia obsahu vlákniny v kŕmnych dávkach. Priemerné hodnoty laktózy boli 4,61 g/100 g. V kravskom mlieku boli hodnoty aktívnej kyslosti relatívne pomerne stabilné (priemerná hodnota ph bola 6,7). Priemerná titračná kyslosť hodnoteného kravského mlieka zo všetkých štyroch ročných období bola 6,2 SH. Počty somatických buniek sa pohybovali v značnom širokom rozpätí hodnôt, kde v zimnom období sa zaznamenal priemerne najnižší počet ( tis./ml). V letnom období hodnoty somatických buniek prekročili normou stanovené hodnoty ( tis./ml). Priemerné hodnoty mikroorganizmov v bazénových vzorkách mlieka boli nasledujúce: CPM - 2, /ml, psychrotrofné mikroorganizmy - 6, /ml a koliformné baktérie - 1, /ml. Priemerné počty mikroorganizmov v mlieku po prevedení laboratórnej pasterizácie pri 85 C/5 sek. Boli nasledovné: CPM - 8, /ml, psychrotrofné mikroorganizmy 1, /ml. Počty koliformných baktérií boli negatívne, čo svedčí o správne prevedenej pasterizácií. Pasterizačný efekt bol 99,9%. Vo vzorkách bielych jogurtov bolo stanovované kvalitatívne a kvantitatívne zastúpenie probiotických mikroorganizmov a zároveň sa merala titračná a aktívna kyslosť výrobkov ihneď po výrobe a potom 5 krát v týchto časových intervaloch 1, 3, 7, 14 a 21 dní. Počiatočné ph u oboch skupín jogurtov sa pohybovalo v rozmedzí 4,09-4,79. Medzi prvým dňom a 7. dňom skladovania došlo len k nepatrnému poklesu ph pod počiatočnú hodnotu. K najväčšiemu poklesu ph došlo na 21. deň u vzoriek probiotických jogurtov v jesennom a zimnom období, kedy sa konečné ph pohybovalo medzi 3,85-3,92. Medzi kontrolnými jogurtmi a jogurtmi obsahujúcimi Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium animalis ssp. lactis pri porovnaní hodnôt ph nebol signifikantný rozdiel na hladine 250

251 p <0,05. Výsledky analýzy ukázali vzťah medzi ph a životaschopnými probiotickými kmeňmi. Životaschopnosť probiotických kmeňov bola nižšia pri klesajúcom ph. Rast probiotických kmeňov bol vyšší, keď sa ph jogurtov pohybovalo medzi 4,04 a 4,4. Pri kvantitatívnom zisťovaní celkového počtu baktérií a probiotických baktérií v jarnom období, došlo k výraznému nárastu počtov baktérií mliečneho kvasenia z počiatočnej hodnoty 4, KTJ/ml na konečnú hodnotu 5, KTJ/ml. V prvých siedmych dňoch merania bol tento nárast prudký, od siedmeho dňa po ukončenie analýzy pozvoľna klesal, ale len o jeden rad. Tak isto aj u sledovaných probiotických baktérií Bifidobacterium animalis ssp. lactis sa pozoroval nárast počtov baktérií na siedmy deň skladovania a to radovo 1, KTJ/ml z pôvodných 0, KTJ/ml. Napriek poklesu počtov bifidobaktérii na konci doby skladovania možno konštatovať, že počty boli stále vo významných hodnotách radu U stanovenia probiotických baktérií Lactobacillus acidophilus na konci prvého týždňa došlo k miernemu poklesu ich počtov (graf 1). Jednalo sa zrejme o adaptáciu týchto mikroorganizmov na vonkajšie podmienky. V ďalších dňoch ich počet rástol až na konečnú hodnotu 0, KTJ/ml. Graf 1. Zastúpenie baktérií mliečneho kvasenia (BMK) a probiotických baktérií v jarnom období V letnom období sa zaznamenal najväčší nárast u probiotickej kultúry Lactobacillus acidophilus aj napriek tomu, že sa jednalo o mlieko s vysokým obsahom somatických buniek ( /ml). Prvý deň merania bol ich počet 1, KTJ/ml a posledný deň 0, KTJ/ml. Najväčší nárast počtu baktérii bol zaznamenaný medzi siedmym až dvadsiatym prvým dňom experimentu. U baktérií Bifidobacterium animalis ssp. lactis došlo po troch dňoch skladovania jogurtov k ich miernemu poklesu, ale v nasledujúcich dňoch skladovania počet bifidobaktérii rástol a ustálil sa na hodnote 0, KTJ/ml. V letnom období došlo k štatisticky významnému nárastu (p<0,0001) počtov po celú dobu skladovania u baktérií Lactobacillus acidophilus a baktérií mliečneho kvasenia (graf 2). Probiotická baktéria Bifidobacterium animalis ssp. lactis vykazovala štatisticky významné mierne stúpanie počtov počas skladovania, a to na hladine významnosti p<0,006. Graf 2 Zastúpenie baktérií mliečneho kvasenia (BMK) a probiotických baktérií v letnom období 251

252 V sledovaných jogurtoch u baktérií mliečneho kvasenia došlo v jesennom období k výraznému zvýšeniu ich počtov. Jednalo sa o nárast z pôvodnej hodnoty 5, KTJ/ml na konečnú hodnotu 5, KTJ/ml, čo je navýšenie o dva rady. Počet baktérií mliečneho kvasenia sa pohyboval po celú dobu analýzy v rade Po štrnástich dňoch merania ich počet veľmi prudko stúpol oproti počiatočnej hodnote. Lactobacillus acidophilus ako aj Bifidobacterium animalis ssp. lactis vykazovali počas siedmych dní analýzy hodnoty rádovo 10 7 KTJ/ml. V ďalších dňoch sa ich počet znižoval až na konečnú hodnotu 0, a 0, KTJ/ml (graf 3). Graf 3 Zastúpenie baktérií mliečneho kvasenia (BMK) a probiotických baktérií v jesennom období Najvýznamnejšie počty v zimnom období preukázali baktérie Bifidobacterium animalis ssp. Lactis, kde hodnoty na začiatku skladovania sa pohybovali v rade 0, KTJ/ml. V priebehu ďalších dní skladovania jogurtov sa počty bifidobaktérii veľmi rýchlo zvyšovali a na konci sledovaného obdobia dosiahli hodnoty 0, KTJ/ml. Počty baktérií mliečneho kvasenia sa v prvých troch dňoch pohybovali radovo 10 6, ich nárast pokračoval od siedmeho dňa skladovania až po konečnú hodnotu 6, KTJ/ml. Množstvo baktérií Lactobacillus acidophilus sa po dobu analýzy pohyboval od tretieho dňa skladovania v rade od 0, KTJ/ml na hodnotu 0, KTJ/ml na dvadsiaty prvý deň skladovania jogurtov (graf 4). Graf 4. Zastúpenie baktérií mliečneho kvasenia (BMK) a probiotických baktérií v zimnom období Na základe zistených výsledkov možno konštatovať, že vzhľadom k svojmu obsahu dosahujúcemu hodnoty minimálne radovo 10 6 KTJ/ml na konci skladovacieho obdobia všetkých sledovaných baktérií (BMK, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium animalis ssp. lactis) u bielych jogurtov vyrobených v laboratórnych podmienkach v priebehu štyroch ročných období, bolo u týchto experimentálnych jogurtov splnené terapeutické minimum pre výrobky obsahujúce probiotické baktérie určené pre ľudskú výživu. 252

253 Záver Cieľom práce bolo sledovanie zmien počtu baktérií mliečneho kysnutia u jogurtov s probiotickou kultúrou počas skladovania. Vo vzorkách jogurtov sa sledovali zmeny mikrobiologickej kvality so zameraním na rody Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium animalis ssp. lactis, acidita formou titračnej a aktívnej kyslosti. V priebehu skladovania aktívna kyslosť u všetkých vzoriek mala mierne klesajúcu tendenciu. Titračná kyslosť sa zvyšovala, ale na 7. a 14. deň boli zaznamenané výkyvy v priemere o 9,5 SH. Z mikrobiologického hľadiska sme zaznamenali vyšší nárast baktérií rodu Lactobacillus acidophilus počas sledovaných období. Kvantitatívne zastúpenie Lactobacillus acidophilus na konci skladovania odpovedalo množstvo probiotických baktérií pre dosiahnutie terapeutického minima. Pričom počty rodu Bifidobacterium animalis ssp. lactis boli rádovo o 2, v 1/g nižšie oproti počtom rodu Lactobacillus acidophilus. Práca bola podporovaná z projektu VEGA 1/0123/08 Kontaktná adresa: Ing. Viera Lovayová Ústav hygieny a technológie mlieka UVL Komenského 73, Košice Viera-l@ .cz 253

254 NIEKTORÉ METÓDY SELEKTÍVNEHO STANOVENIA PROBIOTICKÝCH KULTÚR MLIEČNYCH BAKTÉRIÍ. Urdová Katarína, Koreňová Janka Výskumný ústav potravinársky, Bratislava, Slovenská republika Some methods for selective determination of probiotic dairy bacteria Summary: For probiotic dairy products the EU Regulations are in force, laying down both the minimum content of a probiotic strain in 1 g of a product and the minimum daily intake of such a product, if this bears a health claim on package. These provisions have the aim to insure that the intake of live probiotic microorganisms by a consumer is of such an amount that declared health benefits can be evinced. To evaluate the viability of probiotic bacteria in given amount reliable methods for selective determination in mixture of all microorganisms of a product are important. The overview gives the information on available methods and practical verification for selective determination using dairy bacteria L. casei, L. acidophilus, L. rhamnosus and Bifidobacterium spp. Methods according to ISO standards, technical standards by providers of cultures and methods selected from scientific publications were used. Original probiotic cultures provided by suppliers (Chr. Hansen and Danisco, Denmark) were used as standards. ÚVOD Probiotické potraviny sú definované ako potraviny obsahujúce živé mikroorganizmy, ktoré aktívne zlepšujú zdravie konzumenta úpravou rovnováhy mikroflóry v črevách so stimulačným efektom na tráviace procesy a imunitu organizmu [1, 2, 3, 4, 11]. Medzi najbežnejšie probiotiká patria baktérie mliečneho kysnutia laktobacily a bifidobaktérie. Laktobacily sa prirodzene vyskytujú v mlieku, obilninách a iných rastlinách a v pôde, tiež tvoria dôležitú zložku zdravej gastrointestinálnej mikroflóry cicavcov. Produkujú enzýmy a vitamíny skupiny B, zvyšujú stráviteľnosť bielkovín, sacharidov a tukov. Niektoré kmene laktobacilov zvyšujú biologickú dostupnosť vápnika a produkujú antimikrobiálne látky inhibujúce významné enteropatogény (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens) [2, 6, 7]. Celkovo, jedným z najzaujímavejších mikroorganizmov z hľadiska jeho využitia ako pomocnej látky vo výžive je Lactobacillus acidophilus [8, 9]. Bifidobaktérie sú grampozitívne baktérie, ktoré metabolizujú cukry a produkujú kyselinu mliečnu odlišným spôsobom ako je to pri rode Lactobacillus. Majú však niekoľko veľmi podobných vlastností: schopnosť produkovať organické kyseliny a metabolity podobné antibiotikám, schopnosť prežívať a rásť v anaeróbnom prostredí črevného traktu, kde potláčajú rozvoj enteropatogénov, najmä Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Proteus sp [7, 8]. Pre zachovanie zdravotného účinku probiotickej potraviny je potrebné udržať koncentráciu živých probiotických baktérií v produkte v koncentrácii 10 6 KTJ/ g produktu počas výroby, skladovania až po konzumáciu [5, 11]. Štúdie výsledkov mikrobiologických analýz probiotických výrobkov z obchodných sietí v zahraničí však poukazujú na nízku viabilitu probiotík v týchto výrobkoch [5, 9, 10]. Tento stav poukazuje na potrebu zavedenia normovaných pracovných metód selektívneho merania počtu probiotických mikroorganizmov a kontrolnom vyšetrovaní výrobkov s prínosom pre výrobcu aj spotrebiteľa. V práci ponúkame prehľad niektorých dostupných metód, ktoré sme overili na 15 kyslomliečnych výrobkoch zo slovenskej obchodnej siete. MATERIÁL A METÓDY Bakteriálne kultúry: Vybrané probiotické kultúry L. casei, L. acidophilus, L. rhamnosus a Bifidobacterium spp. deklarované na obaloch výrobkov boli selektívne stanovované v 15 druhoch kyslomliečnych nápojov zahrňujúcich jogurtový nápoj s probiotickou kultúrou L. casei (vz. č. 1), jogurtové mlieko 254

255 s probiotickou kultúrou L. casei (vz. č. 2), fermentovaný mliečny nápoj s probiotickou kultúrou (vz. č. 3), zakysané mlieko s probiotickou kultúrou (vz. č. 4, 5, 6, 7), acidofilné mlieko s probiotickou kultúrou (vz. č. 8, 9, 10, 11), jogurtový nápoj s probiotickou kultúrou Bifidobacterium longum (vz. č. 12, 13), probiotický zakysaný nápoj s probiotickou kultúrou Bifidobacterium sp., L. acidophilus, L. rhamnosus (vz. č. 14, 15). Výrobky boli zakúpené v slovenskej obchodnej sieti. Každý výrobok bol analyzovaný z troch balení, bezprostredne pred uvedeným dátumom spotreby (3 0 dní). Ako štandardné vzorky selektívne stanovovaných mikroorganizmov boli použité zbierkové kultúry z Českej zbierky mikroorganizmov a originály probiotických kultúr poskytnutých dodávateľmi priamo od výrobcu kultúr: L. casei-431, Chr. Hansen, Dánsko, L. casei CCM 1752, CCM Brno, ČR, L. acidophilus LA-5, Chr. Hansen, Dánsko, Howaru Dophilus, Danisco, Dánsko, L. rhamnosus VT 1, ÚTMT VŠCHT Praha, ČR, Bifidobacterium lactis BB-12, Chr. Hansen, Dásnko, Bifidobacterium longum BB 536, Danisco, Dánsko Použité metódy: Metóda úpravy vzoriek a 10 - násobných riedení podľa STN EN ISO Pred inokuláciou kultúr na platne pomocou rozteru boli tieto desiatkovým riedením riedené 6 8 krát v peptónovom riediacom roztoku. Na predsušené platne s príslušným agarovým médiom bolo inokulované 200 μl nariedenej vzorky a rozotrené hokejkou po celej ploche. Následne boli platne inkubované za nižšie popísaných podmienok. Stanovenie počtu kyslomliečnych baktérií podľa STN ISO: MRS 22 C: Selektívne stanovenia L. casei na MRS agare počas aeróbnej kultivácie pri 22 C počas 6 dní podľa [14]. MRS agar (Merck, Nemecko) bol pripravený v destilovanej vode podľa návodu, následne sterilizovaný autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. MRS 5,2: Selektívne stanovenie L. acidophilus na MRS agare s ph 5,2 anaeróbnou kultiváciou počas 72 h, pri 43 C podľa [11]. Použité médium: MRS agar s ph 5,2 bolo pripravené rozpustením MRS agaru v destilovanej vode podľa návodu a následne bola upravená hodnota ph pomocou pomocou 1.0 M HCl na 5,2. Takto pripravené médium bolo sterilizované autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. MRS V: Selektívne stanovenie L. casei a L. rhamnosus anaeróbnou kultiváciou pri 37 C počas 72 h (MRS V_37 C) a L. rhamnosus anaeróbnou kultiváciou pri 43 C počas 72 h (MRS V_43 C) podľa [11]. Použité médium MRS agar s vancomycínom bolo pripravené rozpustením MRS agaru v destilovanej vode podľa návodu, do ktorého bol pridaný pracovný roztok vankomycínu v objeme 2 ml pracovného roztoku vancomycínu/ 1 l agaru. Takto pripravené médium bolo sterilizované autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. Pracovný roztok vancomycínu bol pripravený rozpustením 0,05 g vancomycínu (Sigma, USA) v 100 ml destilovanej vody. MRS NNLP: Selektívne stanovenie Bifidobacterium spp. na MRS NNLP agare počas anaeróbnej kultivácie pri 37 C počas 72 h, podľa [9, 11]. MRS NNLP agar bol pripravený podľa návodu rozpustením MRS agaru v 96 % objemu destilovanej vody a sterilizovaný autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. Po ochladení na 50 C boli pridané zvyšné 4 % vody s rozpustenými inhibítormi a vitamínmi vysterilizovanými filtráciou (0,22 0,45 μm). Koncentrácie inhibítorov a vitamínov vo výslednom objeme agaru boli: chlorid lítny: 3 g/ l; nalidixinová kyselina: 15 mg/ l; neomycín sulfát: 100 mg/ l; paramomycin sulfát: 200 mg/ l a L cysteín HCl: 0,5 g/ l. MRS M: Selektívne stanovenie Bifidobacterium spp. na MRS agare s mupirocínom anaeróbnou kultiváciou pri 37 C počas 72 h podľa [13]. MRS agar s mupirocínom bol pripravený rozpustením MRS agaru v destilovanej vode podľa návodu, následne sterilizovaný autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. Po vychladení bol pridaný 5 ml cysteín hydrochloridu zásobného roztoku na 1 liter média a 2,5 ml mupirocín zásobného roztoku na 1 l média. Cysteín hydrochlorid zásobný roztok bol pripravený rozpustením 10 g hydrochloridu cysteínu (Merck, Nemecko) v 100 ml destilovanej vody a sterilizované autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. Mupirocín zásobný roztok bol pripravený rozpustením 100 mg mupirocínu (Merck, Nemecko) v 10 ml destilovanej vody a sterilizovaný filtráciou (0,45 μg). 255

256 MRS CC: Selektívne stanovenie L. acidophilus na MRS agare s klindamycínom a ciprofloxacínom anaeróbnou kultiváciou počas 72 h pri 37 C podľa [12]. MRS agar s klindamycínom a ciprofloxacínom bol pripravený rozpustením MRS agaru v destilovanej vode podľa návodu, následne sterilizovaný autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. Po sterilizácii bolo do vychladeného média s teplotou 50 C pridané 5 ml zásobného roztoku ciprofloxacínu na 1 l média a 0,5 ml zásobného roztoku klindamycínu na 1 l média. Zásobný roztok ciprofloxacínu bol pripravený rozpustením 2 mg ciprofloxacin hydrochloridu (Sigma, USA) v 10 ml destilovanej vody a následne sterilizovaný filtráciou (0,22 μm). Zásobný roztok klindamycínu bol pripravený rozpustením 2 mg hydrochloridu klindamycínu (Sigma, USA) v 10 ml destilovanej vody a následne sterilizovaný filtráciou (0,22 μm). BA s a BA m: Selektívne stanovenie L rhamnosus a L. acidophilus na BA agare s maltózou (L rhamnosus) a na BA agare so sorbitolom (L. acidophilus) anaeróbnou kultiváciou pri 37 C počas 72 h podľa [11]. BA sorbitol agar a BA - maltóza agar: po príprave a sterilizácii (autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút) základného média (zloženie: 10 g tryptónu; 10 g hovädzieho bujónu; 5 g kvasničného autolyzátu; 1 g Tween 80; 2,6 g K 2 HPO 4; 5 g acetátu sodného; 2 g citrátu tri amónneho; 0,2 g MgSO 4. 7 H 2 O; 0,05 g MnSO 4. 4 H 2 O; 12 g agaru pre bakteriológiu; 1 l destilovanej vody) bol pridaný 20 % roztok sorbitolu alebo maltózy do finálnej koncentrácie 2 %. MRS CDL: Selektívne stanovenie Bifidobacterium spp. na MRS agare s s dicloxacillinom, chloridom lítnym a hydrochloridom cysteínu anaeróbnou kultiváciou pri 37 C počas 72 h podľa [15]. MRS agar s dicloxacillinom, chloridom lítnym a hydrochloridom cysteínu bol pripravený rozpustením MRS agaru v destilovanej vode podľa návodu, následne sterilizovaný autoklávovaním pri 121 C počas 15 minút. Po sterilizácii bolo do vychladeného média s teplotou 50 C pridané 5 ml zásobného roztoku dicloxallicin zásobného roztoku (10 mg monohydrátu sodnej soli dicloxallicinu rospustiť v 100 ml destilovanej vody a sterilizovať filtráciou (0,45 μm)), 10 ml zásobného roztoku chloridu lítneho (2 g LiCl zmiešanými s 18 g destilovanej vody sterilizovať filtráciou (0,45 μm)) a 5 ml hydrochloridu cysteínu zásobného roztoku na 1 l média. VÝSLEDKY A DISKUSIA Bola zisťovaná prítomnosť 4 probiotických kmeňov L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus a Bifidobacterium spp. v 15 kyslomliečnych výrobkoch získaných zo slovenskej obchodnej siete. Každý kmeň bol hodnotený dvomi až tromi rôznymi metódami. Na kultiváciu čistých kultúr, ako aj na selektívnu kultiváciu kmeňov z probiotických výrobkov boli použité rovnaké metódy. Ako najvhodnejšie metódy boli vyhodnotené tie, ktoré mali najpresnejšie výsledky pre štandardné vzorky probiotických kultúr a zároveň mali dobrú selektivitu pre zmesné kultúry. Z 15 výrobkov len v jednom nebola stanovená sledovaná kultúra ani jednou z metód (Bifidobacterium spp. vo výrobku č. 15). Najvhodnejšia metóda na selektívnu kultiváciu L. casei z výrobkov sa ukázala kultivácia na MRS agare s vancomicínom, pri teplote 37 C, anaeróbne počas 72 h. Táto metóda poskytovala zhodné výsledky (porovnateľná veľkosť, farba a počet kolónií), aj pri viacerých opakovaniach, zatiaľ čo metóda MRS 22 C pri opakovniach poskytla rôzne výsledky. Čistá kultúra L. casei (L. casei-431, Chr. Hansen, Dánsko a L. casei CCM 1752, CCM Brno, ČR) rástla pri oboch metódach v rovnakých počtoch. Toto naše zistenie potvrdzuje výsledky, ktoré dostali [11], ktorí kultivovali L. casei ako z čistej kultúry, tak aj z probiotických výrobkov získaných z obchodných sietí. Na kultiváciu L. acidophilus z výrobkov rovnako aj z čistej kultúry boli najspoľahlivejšími metódami anaeróbna kultivácia na MRS agare s clindamycinom a cicprofloxacinom, pri teplote 37 C počas 72 h a na MRS agare s ph 5,2 anaeróbnou kultiváciou počas 72 h pri 43 C. Obe tieto metódy dávali opakovateľné výsledky čo do počtu, tvaru a farby rastených kolónií. Kultivácia na BA agare so sorbitolom pri 37 C počas 72 h sa ukázala ako nespoľahlivá pre selektívnu kultiváciu s výrobkov, pretože nedávala porovnateľné výsledky (rôzna veľkosť, farba a tvar kolónií). Tharmaj et al. [11] za najvhodnejšie média pre kultiváciu L. acidophilus vo výrobkoch označujú kultiváciu 256

257 na BA agare so sorbitolom pri 37 C, alebo MRS s ph 5,2 agare pri 43 C obe pri anaeróbnych podmienkach počas 72 h. Na selektívne rozlíšenie L. rhamnosus zo zmesi laktobacilov bola použitá metóda anaeróbnej kultivácie na MRS agare s vancomycínom pri 43 C počas 72 h. Je spoľahlivá aj v odlíšení L. rhamnosus od L. casei na základe selektívneho pôsobenia teploty. Podobne konštatuje [11]. Najúspešnejšia kultivácia Bifidobacterium spp. bola pri teplote 37 C na MRS agare s mupirocínom anaeróbne počas 72 h. Rast Bifidobacterium spp. z výrobkov bol na médiu MRS-NNLP nejasný z dôvodu nízkej odlíšiteľnosti od iných kultúr a nereprodukovateľnosti výsledkov. Tieto zistenia sa zhodujú s výsledkami autorov [9], ktorí MRS - NNLP agar neodporúčajú pre počítanie Bifidobacterium spp. vo výrobkoch. Naproti tomu sú výsledky [11] rovnako ako [16], ktorí dosiahli najlepšie výsledky pri kultivácii na MRS - NNLP agare a tento odporúčajú pre selektívnu kultiváciu bifidobaktérii zo zmesných kultúr. Najvhodnejšie nami zistené metódy pre selektívnu kultiváciu vybraných kyslomliečnych baktérií sú zhrnuté v Tabuľke I. Tabuľka I. Súhrn najvhodnejších metód pre selektívnu kultiváciu L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus a Bifidobacterium spp. Číslo výrobku Sledovaný kmeň Najvhodnejšia metóda 1, 2, 3 L. casei MRS - V pri 37 C 4, 5, 6, 8, 9, 10, 14, L. acidophilus, MRS - CC a MRS 5,2 14 L. rhamnosus MRS - V pri 43 C 12, 13, 14 Bifidobacterium spp. MRS - M Prehľad výsledkov získaných použitými metódami pre selektívnu kultiváciu sledovaných mikroorganizmov a priemer z výsledkov analýz 3 balení z každého výrobku v 3 riedeniach po 2 paralelkách je v Tabuľke II. 257

258 Tabuľka II. Prehľad výsledkov získaných použitými metódami pre selektívnu kultiváciu sledovaných mikroorganizmov a priemer z výsledkov analýz 3 balení z každého výrobku v 3 riedeniach po 2 paralelkách (x = nezistené, y = nemerané) Číslo testovaného výrobku Sledovaný mikroorganizmus 1 L. casei 2 L. casei 3 L. casei 4 L. acidophilus 5 L. acidophilus 6 L. acidophilus 7 L. acidophilus 8 L. acidophilus 9 L. acidophilus 10 L. acidophilus 11 L. acidophilus Bifidobacterium longum Bifidobacterium longum Bifidobacterium spp. L. acidophilus L. rhamnosus Bifidobacterium spp. Metóda hodnotenia Priemerné Použité Teplota Prístupnosť Doba hodnoty KTJ/ g médium inkubácie kyslíka inkubácie MRS -V 37 C anaeróbne 72 h 6, ± 2,6 MRS 22 C aeróbne 6 dní x MRS -V 37 C anaeróbne 72 h 3, ± 0,1 MRS 22 C aeróbne 6 dní 4, ± 1,7 MRS -V 37 C anaeróbne 72 h 9, ± 1,7 MRS 22 C aeróbne 6 dní 1, ± 0,4 MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,8 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,7 BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 2, ± 0,3 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,2 BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 8, ± 3,0 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h x BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 2, ± 0,3 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h x BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 1, ± 1,0 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h 1, ± 1,2 BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,4 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,1 BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 7, ± 0,7 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h 6, ± 0,2 BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 2, ± 7,0 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h x BA - s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - M 37 C anaeróbne 72 h 7, ± 0,7 MRS - NNLP 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CDL 37 C anaeróbne 72 h x MRS - M 37 C anaeróbne 72 h 9, ± 0,8 MRS - NNLP 37 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,8 MRS - CDL 37 C anaeróbne 72 h x MRS - M 37 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,3 MRS - NNLP 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CDL 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CC 37 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,2 MRS 5,2 43 C anaeróbne 72 h 1, ± 0,5 BA -s 37 C anaeróbne 72 h x MRS - V 37 C anaeróbne 72 h 7, ± 2,4 MRS - V 43 C anaeróbne 72 h 8, ± 5,3 BA -m 37 C anaeróbne 72 h y MRS - M 37 C anaeróbne 72 h x MRS - NNLP 37 C anaeróbne 72 h x MRS - CDL 37 C anaeróbne 72 h x 258

259 Literatúra: 1. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, Amerian Córdoba Park Hotel, Córdoba, Argentina, 1-4 October Quillien, G.: Probiotiká. Syntetická správa Flair-Flow Europe. VÚP Bratislava, Kuchta M, Pružinec P. et al. Probiotiká, ich miesto a využitie v medicíne. Bonus CCS, Bratislava, 2006, s Fuller, R.: Probiotics in human medicine. Gut, 32, 1992, s (Urgeová). 5. Shah, N..: Probiotic Bacteria: Selective Enumeration and Survival in Dairy Foods. Journal of Dairy Science, 83 (4), 2000, Michalík, I. - Urminská, D. - Bauerová, M. - Šilhár, S. - Sokol, J. - Ouwehand, A. - Kirjavainen, P. - Shortt, C. - Salminen, S.: Probiotics: Mechanism and Established Effects. International of Dairy Journal, 9, 1999, s Shahani, K. - Fernandes, H., Amez, V.: Imunologic and therapeutic modulation of gastrointestinal microecology by Lactobacilli. Microecology and Therapy. 18, 1989, s Hughes, D. B., Hoover, D. G.: BIFIDOBACTERIA - Their Potential for Use in American Dairy Products. Food Technology, 45 (4), 1991, p Dave, R. I. - Shah, N. P.: Evaluation of Media for Selective Enumeriation of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, and Bifidobacteria. Journal of Dairy Science, 79, 1996, Shah, N.P. Lankaputhra, W.E.V. - Britz M. Kyle, W. S. A.: Survival of L. acidophilus and Bifidobacterium bifidum in Commercial Yoghurt during Refrigerated Storage. Int. Dairy J., 5, 1995, p Tharmaraj, N.- Shah, N.P.: Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria. Journal of Dairy Science, 86, 2003, p International standard ISO 20128:2006, IDF 192: Milk products Enumeration of presumptive Lactobacillus acidophilus on selective medium Colony count technique at 37 C. 13. Draft ISO/WD... I IDF : Milk products Enumeration of presumptive bifidobacteria Colony count technique at 37 C. 14. Chr. Hansen, technical bulletin P-13: Enumeration of L. paracasei subsp. paracasei in fermented milk products Guidelines, nov Chr. Hansen, technical bulletin P-12:Alternative method for enumeration of Bifidobacteria in fermented milk products Guideline, nov Moriya, J. Fachin, L Gândara, A. L. N. Viotto, W. H.: Evaruation of Culture Media for Counts of Bifidobacterium animalis in the Presence of Yoghurt Bacteria, Department of Food Technology, 37, 2006, p Kontaktná adresa: Katarína Urdová, Priemyselná 4, P.O.Box 25, Bratislava 26, Slovenská Republika urdova@vup.sk 259

260 ANALÝZA MLÉČNÝCH VÝROBKŮ SLOVINSKÉHO TRHU NA KVANTITATIVNÍ ZASTOUPENÍ PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU BIFIDOBAKTERIUM Burdychová Radka 1, Šulcerová Hana 1, Bogovič-Matijašić Bojana 2, Obermajer Tanja 2, Rogelj Irena 2 Mendelova univerzita v Brně 1, University of Ljubljana, Biotechnical faculty 2 Analysis of milk product from slovenian market for the quantitative occurance of probiotic bacteria Summary: In last years, there are lots of probiotics milk products available in markets. There is no exception in slovenian market. Very important requirements are that probiotic bacteria survive the production, transportation conditions and storage of products in sufficient numbers. Moreover, their activity and viability could not be lost. and Finally, methods for selective identification and quantification of probiotic used during manufacture of the product should be available. In this work, fermented milk products from slovenian market with declared probiotic bifidobacteria were screened. The products were analyzed directly after they were bought in market and at the end of expiration period. For selective enumeration of probiotic bifidobacteria, MRS-cystein agar and anaerobic cultivation at 37 C for 72 hours were used. Presumptive colonies which were grown after cultivation were confirmed using PCR. The numbers of bifidobacteria in all products were higher than 10 6 CFU/g of product which is in agreement with legislative requirements of both, Slovenia and Czech republic. The exception was the product Proviant (Natura), in which the number of bifidobacteria was only 10 5 CFU/ml at the day when was bought in a market and also at the end of expiration period. Probiotika jsou podle definice Organizace spojených národů pro výživu a zemědělství (FAO), Světové zdravotnické organizace (WHO) a Mezinárodní organizace pro probiotika a prebiotika (4) živé nepatogenní mikroorganismy převážně lidského původu, které konzumované v přiměřeném množství příznivě ovlivňují zdravotní stav konzumenta (2, 3). Název probiotikum pochází z řečtiny a znamená pro život. Pro výrobu klasických mléčných výrobků se používají čisté mlékařské kultury. Ty se používají zejména pro regulaci technologických kroků a mikrobiologických pochodů při výrobě mléčných výrobků. Enzymy, které jsou produkovány mikroorganismy, jsou velmi důležité při zracích pochodech (především proteázy a lipázy). Při výrobě mléčných výrobků se využívá relativně málo mikrobiálních druhů. Tradiční bakterie mléčného kvašení (BMK), které jsou obvykle používány pro výrobu kysaného mléka a sýrů, náleží do rodů Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus a Lactobacillus. Pro výrobu kysaných mléčných výrobků se používají některé základní směsi bakteriálních kultur. Kysané mléko se vyrábí pomocí kultur Lactobacillus acidophilus nebo L. acidophilus a Bifidobacterium sp. (tzv. AB kultura), Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. a L. casei (ABC kultura) nebo Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. a Streptococcus thermophilus (ABT kultura). Pro výrobu jogurtu se jako startovací kultura používá Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrüeckii subsp. bulgaricus (6). Při výběru druhů pro výrobu určitého výrobku se musí brát v úvahu délka fermentace a produkty vytvořené metabolismem bakterií. Mikroorganismy využívané v technologii výroby kysaných mléčných výrobků a jejich počty uvádí vyhláška č. 77/2003 Sb. Cílem této práce bylo analyzovat fermentované mléčné výrobky s deklarovanou probiotickou kulturou rodu Bifidobacterium ze slovinského trhu a určit, zda jejich kvantitativní zastoupení odpovídá požadavkům slovinské a české legislativy. Materiál a metody Analyzovány byly fermentované mléčného nápoje s probiotickou kulturou rodu Bifidobacterium, vždy po třech výrobcích stejného druhu a jedné šarže. Přehled analyzovaných výrobků udává Tab. 1. Výrobky byly analyzovány v den zakoupení v tržní síti a na konci doby minimální trvanlivosti. Příprava vzorků pro analýzu a příslušná ředění byla provedena dle ČSN EN ISO Pro selektivní stanovení bifidobakterií byla použita půda MRS-cystein a 260

261 anaerobní podmínky kultivace (37 C, 72 h). Z jednotlivých Petriho misek byl pro PCR konfirmaci vybrán takový počet kolonií, který odpovídal druhé odmocnině z celkového počtu narostlých presumptivních kolonií jednotlivých druhů. Tyto kolonie byly konfirmovány pomocí PCR. Výsledky a diskuse V tab. I jsou uvedeny názvy výrobků, číslování vzorků a deklarované druhy probiotických bakterií v analyzovaných mléčných výrobcích ze slovinského trhu. Tab. I: Analyzované mléčné výrobky ze slovinského trhu a deklarované druhy probiotických bakterií Název výrobku Bifidus Natur, proviact (TUŠ) Probiotični tekoči jogurt TUŠ Zelene doline, Mlekarna Celeia Jogurt EGO Ljubljanske mlekarne Bifidus (jogurt), Yoviland Vipava Deklarované druhy probiotických bakterií L. acidophilus La-5 L. casei Bifidobacterium BB 12 Číslo vzorku B. lactis 2 L. acidophilus La-5 Bifidobacterium BB 12 B. lactis L. acidophilus Actifidus Nature, Delisse Bifidobacterium 5 Proviact, Naturis Bifidobacterium L. acidophilus St. thermophilus Bifidus Naturalis Sensia, Dukat Bifidobacterium 7 BA Bifidus active FORTIS vanilla, Nestlé Bifidobacterium 8 PCR pro konfirmaci bakterií rodu Bifidobacterium byla provedena dle ROY a SIROIS (2000) (5). U analyzovaných bakteriálních kolonií byl amplifikován specifický PCR produkt předpokládané velikosti (asi 914 bp). Výsledky jsou uvedeny na obr Obr. 1: Agarózová gelová elektroforéza PCR produktů specifických pro rod Bifidobacterium (914 bp). M: 100 bp ladder (New England, Biolabs), běh č. 1: PCR produkt amplifikovaný z DNA sbírkového kmene Bifidobacterium lactis DSM 10140, běh č. 2: PCR produkt amplifikovaný z jedné presumptivní kolonie narostlé na půdě MRS-cystein 261

262 Na obr. 2 jsou uvedeny počty bakterií rodu Bifidobacterium v jednotlivých fermentovaných mléčných výrobcích v den zakoupení v tržní síti a na konci doby jejich minimální trvanlivosti. Výsledky jsou statisticky zpracovány na hladině významnosti α = 0,05. Pro statistické vyhodnocení výsledků (mnohonásobné porovnání) byl použit Tukey test (P < 0,01). 10 Bifidobacterium sp. - den zakoupení Bifidobacterium sp. - konec doby minimální trvanlivosti 8 log KTJ/g číslo výrobku Obr. 2: Počty bakterií rodu Bifidobacterium v mléčných výrobcích ze slovinského trhu v den zakoupení výrobků a na konci doby jejich minimální trvanlivosti Z obr. 2 je patrné, že se počty bifidobakterií na konci doby minimální trvanlivosti snížily, v porovnání s jejich počty v den zakoupení výrobků v tržní síti. Počet bifidobakterií se u všech výrobků pohyboval nad minimální požadovanou hodnotou 10 6 KTJ/ml výrobku, což je hodnota, která je v souladu s legislativními požadavky Slovinské i České republiky. Výjimkou byl výrobek Proviant (Naturis), u kterého byl v den zakoupení v tržní síti i na konci doby minimální trvanlivosti stanoven počet bifidobakterií pouze řádově 10 5 KTJ/ml. U tohoto výrobku tedy nebyly dodrženy legislativní požadavky. Významným faktorem ovlivňujícím počty bifidobakterií ve výrobcích je přítomnost kyslíku, který může často pronikat přes obalový materiál. DAVE a SHAH (1996) (1) sledovali rozdíly v počtech bakterií rodu Bifidobacterium mezi jogurty skladovanými ve skleněných a plastových obalech. Protože jsou bifidobakterie anaerobní, větší množství jich bylo detekováno ve výrobcích ve skleněných obalech. Pokles počtu bifidobakterií tedy byl zřejmě způsoben typem obalu, neboť výrobky byly v obalech plastových. Použitá literatura: 1. DAVE, R.I., SHAH, N.P. Evaluation of Media for Selective Enumeration of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, and Bifidobacteria. Journal of Dairy Science. 1996, vol. 79, no. 9, s FAO/WHO. Guidelines for the evaluation of probiotics in food Dostupný z WWW: 3. REID, G. Safe and efficacious probiotics: what are they? Trends Microbiol., 2006, vol. 14, s REID, G. SANDERS, M. E., GASKINS, H. R., GIBSON, G. R., MERCENIER, A., RASTALL, R., ROBERFROID, M., ROWLAND I., CHERBUT, C., KLAENHAMMER, T. R. New scientific paradigms for probiotics and prebiotics. J Clin Gastroenterol., 2003, vol. 37, s

263 5. ROY, D., SIROIS, S. Molecular differentiation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of ldh gene. FEMS Microbiology Lett., 2000, vol. 191, s TAMINE, A. Y., MARSHALL, M. E., ROBINSON, R. K. Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria. Journal of Dairy Research. 1995, vol. 62, no. 1, s Kontaktní adresa: Ing. Hana Šulcerová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, tel.: , hana.sulcerova@seznam.cz. Ing. Radka Burdychová, Ph.D., Institut celoživotního vzdělání, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, burdycho@mendelu.cz. 263

264 POUŽITÍ GRAMOVA BARVENÍ PRO DETEKCI AUTOLÝZY LACTOBACILLUS HELVETICUS Ondráčková Iva a, Solichová Kateřina a, Fiala Jaromír b a Milada Plocková a a Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha b Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT Praha Usage of Gram-staining for autolysis detection of Lactobacillus helveticus Summary: Lactobacillus helveticus strains are used as a starter or adjunct culture during hard cook cheese manufacture and their proteolytic system is regarded as one of the most efficient among LAB. The proteolytic system affects positively cheese ripening by release of intracellular enzymes into cheese matrix. Release achieved by disintegration of the cell wall by peptidoglycan hydrolases, i.e. autolysis, is essential for cheese ripening. Evaluation of the rate of autolysis is one of the fundamental criterions for strain selection. Change of the cell coloration using Gram-staining during autolysis measurement in phosphate buffer was detected. The lysed cells were red in contrast to no-lysed cells coloured in blue-violet. The strains showing high autolytic activity in phosphate buffer displayed higher presence in red stained cells. Quantification of red cells presence was accomplished by light microscopy observation and calculated as an average of five pictures. For usage of Gram-staining as supplemental method for autolysis detection, the quantification by flow cytometry is required. Úvod: Lactobacillus helveticus je používán jako hlavní nebo doplňková zákysová kultura při výrobách sýru s vysokodohřívanou sýřeninou italského (Grana, Parmasan), švýcarského (Emmental), holandského (Edam) nebo cheddarského typu, jelikož disponuje vysokou intracelulární proteolytickou aktivitou, která pozitivně ovlivňuje zrání sýrů (1,7). Podmínkou ovlivnění zrání sýru intracelulárními proteolytickými enzymy je otevření bakteriální buňky, tzv. autolýza, a uvolnění těchto enzymů do těsta sýru. Míra autolýzy jednotlivých kmenů L. helveticus je jedním ze zásadních kritérií při výběru kmenů pro výrobu sýru (3,4,5). Existuje mnoho metod in vitro k průkazu autolýzy, které ovšem dostatečně přesně nepředpovídají autolytické chování bakteriální kultury při výrobě sýru (in situ). Jedná se například o stanovení počtu životaschopných buněk pomocí plotnové metody, detekci intracelulárních komponent (DNA, RNA, enzymy- především aminopeptidasy), mikroskopické pozorování buněk, stanovení přímé proteolytické aktivity, detekce lytické aktivity (difuzní agarová zkouška, zymogram), nebo spektrofotometrické stanovení úbytku zákalu bakteriální suspenze v nutričně chudém prostředí (pufry) (2,5,7), Historicky sloužilo Gramovo barvení k rozlišení bakterií na dvě skupiny, které se vzájemně liší stavbou buněčné stěny. Bylo zjištěno, že u L. helveticus lze pozorovat změnu zbarvení buněk při stanovení autolýzy v pufru s použitím tohoto barvení (6). Původně Gram-pozitivní buňky L. helveticus (modro-fialové zbarvení) mění barvu a jeví se jako Gram-negativní (růžovo-červené). Tato Gram-labilita je diskutována u některých mikroorganismů (např. Bacillus spp.), ale nikdy nebyla spojována s autolýzou u Lactobacillus helveticus. Cíl práce: Cílem této práce bylo zjistit, zda lze Gramovo barvení použít jako doplňkovou metodu k průkazu míry autolýzy. 264

265 Materiál a metody: Seznam použitých kmenů V této práci bylo použito osm kmenů L. helveticus poskytnutých od a) CIRM-BIA (Rennes, Francie) CNRZ 32J, CNRZ 414, CIRM-BIA 99, CIRM-BIA 104 a CIRM-BIA 107, b) CCDM (Praha, Česká republika) CCDM 466, c) Sbírka mikroorganismů Technologie mléka a tuků (VŠCHT Praha, česká republika) CH1 a BROI. Sledování autolýzy v pufru Buňky osmi testovaných kmenů byly namnoženy v MRS bujónu při 42 C po dobu 12 hodin, poté dvakrát promyty destilovanou vodou a převedeny do fosfátového pufru (0,1 mol.l -1, ph 7,0). V pufru byly následně kultivovány v mikrotitračních destičkách po dobu 4h při 42 C v cele přístroje Biotek. Každou hodinu byla stanovena absorbance bakteriální suspenze při 650 nm a odebrán vzorek buněk pro vytvoření fixního preparátu, který byl následně obarven dle Grama a poté zkoumán mikroskopicky. Procento autolýzy bylo vypočítáno dle rovnice 1: Rovnice 1: autolýza (%) = [(A 0h A t )/ A 0h ] x 100 kde A 0h je počáteční stav absorbance a A t jsou absorbance během kultivace v časech 1, 2, 3 až 4 hodiny. Sledování autolýzy v MRS Buňky osmi testovaných kmenů byly zaočkovány (1 obj. %) a kultivovány při 42 C v MRS bujónu se sníženým obsahem glukosy (5 g/l) po dobu 72 h. Každé tři hodiny byla stanovena absorbance bakteriální suspenze při 650 nm a odebrán vzorek buněk pro vytvoření fixního preparátu, který byl následně obarven podle Grama a poté zkoumán mikroskopicky. Mikroskopie Fixní preparáty obarvené podle Grama byly pozorovány optickým mikroskopem při tisíci násobném zvětšení. Z každého fixního preparátů bylo pořízeno pět různých snímků. Výsledky: Sledování autolýzy v pufru U kmenů L. helveticus pozorujeme rozdíl v míře autolýzy, dle rovnice 1, během kultivace ve fosfátovém pufru. Tento rozdíl je zřejmý již po první hodině kultivace, kdy se jako vysokoautolytický projevují kmeny 32J a 414 a jako nízko-autolytický kmeny CH1 a BROI. Po čtyřech hodinách kultivace jsme identifikovali dva kmeny s extrémním autolytickým chováním kmen 414 (nejvyšší autolýza v pufru) a BROI (nejnižší autolýzy v pufru) (obr. 1). 265

266 Obr. 1. Grafické znázornění rozdílů autolýzy měřené ve fosfátovém pufru pro sledované kmeny s vyznačením kmenů s extrémním autolytickou aktivitou L. helveticus 414 a L. helveticus BROI. Všechny kmeny byly během kultivace ve fosfátovém pufru, po obarvení dle Grama, mikroskopicky sledovány. Pozorujeme, že během kultivace se v preparátu objevují kromě modro-fialových buněk, signalizující Gram-positivitu L. helveticus, i buňky růžovo-červené naznačující Gram-negativní chování. U všech preparátů pozorujeme zvyšování zastoupení červených buněk úměrně se zvyšováním míry autolýzy určené dle rovnice 1 (Obr. 2). U kmenu 414 se zastoupení buněk jevících se jako Gram-negativní během kultivace zvyšuje z 26,1% (0 h) na 46,2 % (4 h), zatímco u kmene BROI dochází jen k nepatrnému zvýšení z 17,7 % (0 h) na 21,1 % (4 h). Obr. 2. Sledování změny zbarvení buněk v časech 0h a 4h během kultivace ve fosfátovém pufru pro kmeny s extrémním autolytickou aktivitou a) L. helveticus 414, b) L. helveticus BROI. Sledování autolýzy v MRS Ke změně zbarvení buněk L. helveticus dochází i při růstu MRS bujónu. Pro všechny studované kmeny pozorujeme po zaočkování (lag fáze) a v stacionární fázi růstu přítomnost jak Grampozitivních tak Gram-negativních buněk. V exponenciální fázi pozorujeme přítomnost výhradně přítomnost Gram-pozitivních buněk na rozdíl od fáze odumírání, kde se naopak vyskytují pouze buňky jevící se jako Gram-negativní (Obr. 3). 266

267 Obr. 3. Schematické znázornění sledovaní změny zbarvení všech sledovaných kmenů L. helveticus v průběhu kultivace v MRS bujónu. Legenda- růstová fáze: 1 Lag fáze, 2 Logaritmická fáze, 3- Konec logaritmické fáze, 4 Stacionární fáze, 5 Fáze odumírání. Závěr: Byla pozorována změna zbarvení Gram-pozitivních buněk L. helveticus na Gram-negativní jak při vytvoření stresových podmínek kultivací v prostředí bez nutričních komponent (fosfátový pufr), tak v průběhu růstu kultury (v latentní fázi), kdy také dochází k bakteriální lyzi a smrti buněk. Buňky byly sledovány světelným mikroskopem a kvantifikace byla provedena pouze jako průměr ze zastoupení červených a modrých buněk z pěti pořízených fotografií preparátu. Pokud by bylo možné kvantifikovat odlišné zbarveni buněk pomocí průtokové cytometrie (5), mohla by se metoda s využitím Gramova barvení používat k průkazu autolýzy. Poděkování: Tato práce byla podpořena grantem MŠMT Použitá literatura: 1. Bockelmann, W The proteolytic system of starter and non-starter bacteria: components and their importance for cheese ripening. Int. Dairy J. 5: Boutrou, R., Sepulchre, A., Gripon, J.-C., and V. Monnet Simple tests of predicting the lytic behavior and proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci. 81: Crow, V.L., Coolbear, T., Gopal, P.K., Martley, F.G., McKay, L.L., and H. Riepe The role of autolysis of lactic acid bacteria in ripening of cheese. Int dairy J. 5: Kenny, O., FitzGerald, R.J., O Cuinn, G., Beresford, T.P., and K. Jordan Comparative analysis of the autolytic potential of Lactobacillus helveticus strains during Cheddar cheese ripening. Int. J. of Dairy Tech 58: Lortal, S., and M.P. Chapot-Chartier Role, mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese. Int. Dairy J. 15: Ondrackova, I., Kucerova, K., Horackova, S., Svirakova, E., and M. Plockova Usage of Gramstaining for autolysis detection. 4 th IDF Dairy Science and Technology Week, Rennes, France (poster). 7. Valence, F., Deutsch, S.-M., Richoux, R., Gagnaire, V., and S. Lortal Autolysis and related proteolysis in Swiss cheese for two Lactobacillus helveticus strains. J. Dairy Res. 67: Kontaktní adresa: Ing. Iva Ondráčková, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6, Česká republika. Iva.Ondrackova@vscht.cz, tel:

268 VÝBĚR VYSOKO-AUTOLYTICKÝCH KMENŮ LACTOBACILLUS HELVETICUS POMOCÍ DETEKCE GENŮ KODUJÍCÍCH PEPTIDOGLYKAN HYDROLASY Ondráčková Iva a, Valence-Bertel Florence b, Plocková Milada a a Sylvie Lortal b a Ústav Technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha b Science et Technologie du Lait et de l Oeuf, INRA Rennes High autolytic Lactobacillus helveticus strain selection using detection of peptidoglycan hydrolases genes Summary: Lactobacillus helveticus is mainly used in cheese manufacture as starter culture. Its intracellular proteolytic enzymes influence positively cheese ripening. The autolysis of the bacterial cell is crucial for intracellular enzyme release Autolysis is defined as a degradation of peptidoglycan by enzymes having hydrolytic specificity, i.e. peptidoglycan hydrolases (PGHs). It was shown that Lactobacillus helveticus strains differed in their autolytic activity among each other but it s still not known an origin of this difference. The goal of this study was to select a high autolytic strain of Lactobacillus helveticus on the genomic basis, to detect presence or absence of potential PGH genes, and to explain the reason of different autolytic activity among Lactobacillus helveticus strains. The genetic diversity of 25 Lactobacillus helveticus strains from different origin and biotope was evaluated by pulsed field gel electrophoreses (PFGE) and the difference of autolytic activity among these strains was showed previously by method using buffer solution. The specific primer was designed for each of the nine potential PGH genes identified by annotation of L. helveticus DPC 4571 genome previously. These primers were used for detection of presence and transcription of appropriate nine potential PGH genes using PCR and RT-PCR for all tested strains. All nine potential PGH genes were systematically presented and transcribed to mrna for all studies strains. The difference in autolytic activity is nor due to deviation of presence in PGH genes neither of malfunction of transcription in the bacterial cells. Úvod: Při výrobě sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou se používají jako zákysové kultury kmeny L. helveticus disponující vysokou intracelulární proteolytickou aktivitou, která může velice pozitivně ovlivňovat zrání sýrů. Podmínkou ovlivnění zrání proteolytickým systémem je ovšem otevření bakteriální buňky, tzv. autolýza, a uvolnění proteolytických enzymů do těsta sýru. Autolýza je definována jako štěpení peptidoglykanu enzymy s peptidoglycan hydrolasovou specificitou, a je jedním ze zásadních kritérií při výběru kmenů pro výrobu sýru. Kmeny Lb. helveticus se mezi sebou liší v autolytických aktivitách, ale stále nejsou objasněny příčiny těchto rozdílů. V roce 2008, Callanan a kol. (1), byl publikován první kompletně sekvenovaný a anotovaný genom L. helveticus, a to vysoko-autolytického kmenu DPC 4571 (4,5,6). Pro tento kmen bylo identifikováno devět potenciálních genů s peptidoglykan hydrolasovou specificitou (obr. 1). Cíl práce: Cílem této práce bylo zjistit, jestli je možné vybírat k výrobě sýrů vysoko-autolytické kmeny Lactobacillus helveticus na základě genového vybavení, tedy přítomnosti či nepřítomnosti genů kódujících peptidoglykan hydrolasy, a zároveň alespoň částečně objasnit příčinu rozdílů v autolýze mezi jednotlivými kmeny. 268

269 Obr. 1: Schematické znázornění rozložení genů kódujících peptidoglycan hydrolasy v genomu sekvenovaného L.helveticus (kmen DPC 4571). Materiál a metody: U sbírky 25 kmenů L.helveticus pocházejících z různých zdrojů byla prokázána genetická rozmanitost použitím gelové elektroforézy v pulzním poli (PFGE) a byl prokázán rozdíl v autolytických aktivitách pomocí metody v pufrových systémech. Na základě analýzy devíti známých genů kódujících peptidoglycan hydrolasy pro L.helveticus DPC 4571 bylo zkonstruováno devět specifických párů primerů, které byly navržené pomocí srovnávací analýzy sekvenovaných genomů kmenů L. acidophilus NCFM a L.helveticus DPC4571 programem CLUSTALW a Primer3. Tyto primery byly uplatněny při detekci přítomnosti a transkripce příslušných devíti genů pomocí PCR, resp. RT-PCR, u všech testovaných kmenů. Tabulka I Primery pro detekci přítomnosti a transkripce genů kódujících peptidoglykan hydrolasy Gen Jméno primeru Sekvence (5' -3') Velikost PCR produktu (bp) T m ( C) t e (s) Lhv_190 Lhv_190 Fwd:1 ATGAAGAAGAGACTTTTGACCAGCA Lhv_190 Re:1 TTGCTTCGGCATAAGTATTGG Lhv_191 Lhv_191 Fwd:2 GTTTTATCCAGATTGAGCTTTGTGA Lhv_191 Re:2 TAGCCCATCACAACAACAGG Lhv_549 Lhv_549 Fwd:1 AGCGTAAAGACTGTTGTTCGTGT Lhv_549 Re:1 TCGTCATCACCGCAGAAGTA Lhv_649 Lhv_649 Fwd:3 GGGATCGAGCTGAATCAAGA Lhv_549 Re:3 GTACATCGTAATGCCCTTTTC Lhv_1059 Lhv_1059 Fwd:2 TGAGAAGCGAAGTTCACAGG Lhv_1059 Re:1 GCCAACATTGACGTTTGAAG Lhv_1295 Lhv_1295 Fwd:1 GAATACTGCTCGGCCACAAA Lhv_1295 Re:1 AGTGGCAAGGAACACCATGT Lhv_1307 Lhv_1307 Fwd:1 GTGCTATCCATGTTAAAGCTTGTG Lhv_1307 Re:1 AACATCCTAAACCGCTGTCG Lhv_1433 Lhv_1433 Fwd:1 GGGACTACTTACCGCAATCCTAA Lhv_1433 Re:1 ACGCCAGTTAGCACGAGAAT Lhv_2053 Lhv_2053 Fwd:1 CGGCAACAATATCAACATGG Lhv_2053 Re:1 CGTTAAGACCACGCCAGTTA

270 Výsledky: PFGE Bylo prokázáno, že sledované kmeny L. helveticus byly geneticky odlišné (Obr. 2). Štěpení genomické DNA bylo provedeno pomocí restrikční endonukleasy SrgAI a příbuznost mezi kmeny byla určena pomocí BioNumerics ( Dice, UPGMA a poziční odchylka 3,3 %). Obr. 2. Dendrogram PFGE pro studované kmeny L. helveticus. PCR U všech 25ti sledovaných kmenů L. helveticus bylo přítomno všech devět sledovaných PGH (Obr. 3). Kmeny se neliší v autolýze na základě přítomnosti či nepřítomnosti genů kódujících peptidoglykan hydrolasy. a) b) Obr. 3: Příklady identifikace dvou peptidoglykan hydrolas a) Lhv_190 a b) Lhv_191 pomocí PCR s využitím navržených specifických primerů (Tab. I). Popis sloupců: 1-1kb Ladder, 2- CIRM-BIA 101, 3- CNRZ 32J, 4- CNRZ 32TL, 5- CNRZ 241, 6- CNRZ 303, 7- CNRZ 414, 8 CIRM-BIA 1877, 9- CIRM-BIA 107, 10- CIRM-BIA 99, 11-CIRM-BIA 104,12-, 13- DPC 4571, 14- CCDM 112, 15- CCDM ,17-1 kb Ladder, 18- CCDM 125, 19-CCDM 136, 20- CCDM 139, 21-L CCDM 140, 22-L CCDM 380, 23-CCDM 466, 24- CCDM 467, 25- CCDM 468, 26- CCDM 499, 27- CCDM BAII, 28- ICT CH1, 29- ICT BROI, 30-1kb Ladder 270

271 RT-PCR U vybraných 12ti kmenů L. helveticus byla potvrzeno, že všechny PGH geny jsou přepsány do mrna po 12ti hodinách růstu v MRS. U třech z těchto kmenů, které se lišili růstovou rychlostí, bylo potvrzeno, že se transkripce v průběhu růstu mění, ale vždy je positivní po 12ti hodinách růstu (Obr. 3). Kmeny se neliší v autolýze na základě transkripce genů kódujících PGH. Obr. 4: Sledování transkripce pomocí RT-PCR genu Lhv_190 u tří kmenů L. helveticus (DPC 4571, CIRM-BIA 107, CCDM BROI) během růstu v MRS bujónu při 43 C. Vzorky pro extrakci m RNA odebrány v časech 4, 8, 12, 16, 24 a 48 hodin. Závěr: Všech devět genů bylo systematicky přítomných a přepsaných do m RNA u všech studovaných kmenů. Rozdíl v autolýze tedy není zapříčiněn ani odchylkou v počtu přítomných genů v genomech ani nefunkčností transkripce v buňkách jednotlivých kmenů L. helveticus. Nelze provádět výběr vysoko-autolytických kmenů L. helveticus na základě detekce genů kódujících peptidoglykan hydrolasy. Tyto výsledky naznačují, že rozdíly v autolýze mohou být na dalších úrovních exprese genů např. translace nebo post-translačních modifikacích nebo také v rozdílu složení buněčné stěny. Poděkování: Tato práce byla podpořena grantem MŠMT Použitá literatura: 1. Callanan, M., Kaleta, P., O Callaghan, J., O Sullivan, O., Jordan, K., McAuliffe, O., Sangrador-Vegas, A., Slattery, L., Fitzgerald, G.F., Beresford, T., and R.P.Ross Genome sequence of Lactobacillus helveticus, an organism distinguished by selective gene loss and insertion sequence element expansion. J. of Bacteriol. 190: Crow, V.L., Coolbear, T., Gopal, P.K., Martley, F.G., McKay, L.L., and H. Riepe The role of autolysis of lactic acid bacteria in ripening of cheese. Int dairy J. 5: Drake, M.A., Boylston, T.D., Spence, K.D., and B.G. Swanson Chemical and sensory effects of a Lactobacillus adjunct in Cheddar cheese. Food Res. Int. 29: Hannon, J.A., Kilcawley, K.N., Wilkinson, M.G., Delahunty, C.M., and T.P. Beresford Flavour developement in Cheddar cheese due to lactococcal starters and the presence and lysis of Lactobacillus helveticus. Int. Dairy J. 17: Kenny, O., FitzGerald, R.J., O Cuinn, G., Beresford, T.P., and K. Jordan Comparative analysis of the autolytic potential of Lactobacillus helveticus strains during Cheddar cheese ripening. Int. J. of Dairy Tech 58: Kenny, O., FitzGerald, R.J., O Cuinn, G., Beresford, T.P., and K. Jordan Autolysis of selected Lactobacillus helveticus adjunct strains during Cheddar cheese ripening. Int. Dairy J. 58: Lortal, S., Lemée, R., and F. Valence. 1997a. Autolysis of termophilic lactobacilli and dairy propionibacteria: a rewiew. Lait 77:

272 8. Lortal, S., Rouault, A., Guezenec, S., and M. Gautier. 1997b. Lactobacillus helveticus: Strain Typing and Genome Size Estimation by Pulsed Field Gel Electrophoresis. Curr. Microbiol. 34: Lortal, S., and M.P. Chapot-Chartier Role, mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese. Int. Dairy J. 15: Valence, F., Deutsch, S.-M., Richoux, R., Gagnaire, V., and S. Lortal Autolysis and related proteolysis in Swiss cheese for two Lactobacillus helveticus strains. J. Dairy Res. 67: Kontaktní adresa: Ing. Iva Ondráčková, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6, Česká republika tel:

273 VLIV LAKTOKOKŮ NA PERZISTENTNÍ KMENY LISTERIÍ Složilová Ivana, Šviráková Eva, Tichovský Petr, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT v Praze Effect of lactococci on persistent listerial strains Summary: This work was aimed at the detection of antilisterial activity of cultured lactococcal Lactococcus lactis subsp. lactis (LCC 416 and NIZO R5) nisin-producing (Nis + ) strains and commercial cheese mesophilic mixed DELVO-ADD 100-X DSF nisin-non-producing (Nis - ) culture against collection of the pathogenic listerial Listeria monocytogenes CCM 5576 strain and five persistent L. monocytogenes (L-2296, L-2297, L-2299, L-2300 and Lm-31) strains. Lc. lactis subsp. lactis (LCC 416 a NIZO R5) (Nis + ) strains and their supernatants showed positive antilisterial activity only against L. monocytogenes CCM 5576 strain. Cheese DELVO-ADD 100X DSF (Nis - ) culture showed positive antilisterial activity against five persistent L. monocytogenes (L-2296, L-2297, L-2299, L-2300 and Lm-31) strains, which are able to create biofilms. It was confirmed that lactic acid bacteria (LAB) dispose of strong biochemical potential, mainly lactic acid and nisin productions. LAB have antilisterial effect against persistent listerial strains isolated from dairy industry surrounding, where can create biofilms. Obtained results should be applicable in dairy industry provided the HACCP, the GHP and the GMP systems should be observed. Úvod: Bakterie rodu Listeria jsou v současné době na trhu České republiky (ČR) a Evropské unie (EU) středem pozornosti z důvodu zdravotní bezpečnosti finálních potravinářských výrobků, včetně mlékárenských, a to především sekundárně zrajících sýrů. Většina druhů listerií je neškodná. Druh L. monocytogenes je pro člověka patogenní. V mlékárenském průmyslu může být potenciálním zdrojem listeriální kontaminace syrové mléko, zejména v případě nedodržení principů správné hygienické praxe při dojení mléka. Na mlékárnách je syrové mléko tepelně ošetřeno, což zaručuje inaktivaci L. monocytogenes. Následně však může dojít k sekundární kontaminaci mléka a mlékárenských výrobků listeriemi 3. V mlékárenských provozech představují nebezpečí především perzistentní listerie tvořící biofilmy, a to na nedostatečně vyčištěných a vydensifikovaných površích výrobních zařízení. Tyto biofilmy jsou zdroji listeriální kontaminace a vykazují vyšší rezistenci k antimikrobiálně působícím látkám než je tomu u planktonických forem listerií. Tyto biofilmy se vyskytují se v místech, kde je dostatek vody a proces sanitace není dokonalý. Jednovrstevný biofilm listerií se při výrobě z povrchu výrobního zařízení snadno uvolní, čímž vznikne mikrobiální riziko suroviny/finálních výrobků. Listerie mají schopnost rozmnožovat se při nízkých chladírenských teplotách a vzhledem k dlouhé inkubační době listeriózy nelze často prokázat, zda byl výrobek kontaminován u výrobce či až u spotřebitele. Jednou z možných cest eliminace růstu listerií mohou představovat bakterie mléčného kvašení (BMK), které se díky svým biochemickým činnostem podílejí na redukci počtu nebo inhibici růstu listerií. Na trhu ČR a EU se objevují různé komerční preparáty s antilisteriálními účinky 1. Cílem této práce bylo prověření antilisteriální aktivity sbírkových laktokokových kmenů Lc. lactis subsp. lactis (LCC 416 a NIZO R5) produkujících nisin (Nis + ) a komerční sýrařské směsné mezofilní kultury DELVO-ADD 100-X DSF neprodukující nisin (Nis - ) na růst patogenních, především perzistentních kmenů Listeria sp. Materiál a metody: Použité kmeny Pro práci byly použity dva sbírkové laktokokové kmeny Lc. lactis subsp. lactis (LCC 416 a NIZO R5) (Nis + ), jedna komerční sýrařská kultura DELVO-ADD 100-X DSF (Nis - ), jeden sbírkový listeriální kmen L. monocytogenes CCM 5576 a pět perzistentních listeriálních kmenů L. monocytogenes (L-2296, L-2297, L-2299, L-2300 a Lm-31), izolovaných z mléka či z povrchů 273

274 mlékárenských výrobních zařízení. Použité kmeny jsou uchovány na Ústavu technologie mléka a tuků, VŠCHT v Praze, Praha, ČR). Kultivační podmínky použitých kmenů Laktokoky a sýrařská kultura byly kultivovány v bujónu M17 s laktosou (0,5 % hm.) (bujón LM17) při teplotě 30 C po dobu 18 h za aerobních podmínek (AP). Listerie byly kultivovány v bujónu BHI při teplotě 37 C po dobu 18 h za AP. Pro přeočkování bylo použito 1% (obj.) inokulum. Stanovení antilisteriální aktivity laktokoků agarovou vpichovou metodou Rozehřátý soft agar BHI (10 ml) byl zaočkován čerstvě narostlým listeriálním kmenem (inokulum 1 % obj.) a nalit na Petriho misku. Po jeho zatuhnutí a předsušení bylo do agaru nadávkováno vpichem vždy 10 μl čestvého laktokokového kmene, čerstvě připraveného supernatantu nebo upraveného supernatantu (příprava upraveného supernatantu viz níže). Následovala inkubace při teplotě 30 C po dobu 18 h. Poté byl sledován vznik inhibičních zón, který indikoval antilisteriální aktivitu laktokoků 4. Příprava upraveného supernatantu Čerstvě narostlý kmen laktokoků byl odstředěn (3680 g, 4 C, 15 min). U supernatantu bylo upraveno ph na hodnotu 6,5 pomocí NaOH (1 a 10% hm. roztok). Supernatant byl následně ošetřen záhřevem na vodní lázni (90 C, 5 min) z důvodu inaktivace aktivit zbylých buněk a enzymů. Pro experimenty byl použit vždy čerstvý, takto připravený supernatant 2. Výsledky a diskuse: V laboratorních podmínkách byla prověřována antilisteriální aktivita vybraných laktokoků (Nis + ) a sýrařské kultury (Nis - ). V práci byly testovány jednak čerstvé kmeny laktokoků a sýrařské kultury, také jejich supernatanty s ph upraveným na hodnotu 6,5 a rovněž supernatanty s ph upraveným na hodnotu 6,5 nasledně tepelně ošetřené (90 C, 5 min). Kvalitativní výsledky antilisteriální aktivity laktokoků jsou uvedeny v tabulkách I až III a představují průměr ze tří uskutečněných stanovení. Tabulka I Antilisteriální aktivita buněk laktokoků vůči buňkám listerií (experiment A); kultivace probíhaly v agaru BHI při teplotě 30 ºC po dobu 18 h Antilisteriální aktivita buněk laktokoků vůči buňkám listerií (Experiment A) Kmeny laktokoků Lc. lactis subsp. lactis Lc. lactis subsp. lactis Kmeny listerií LCC 416 NIZO R5 DELVO-ADD 100X DSF L. monocytogenes CCM L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes Lm pozitivní inhibice; -... negativní inhibice 274

275 Tabulka II Antilisteriální aktivita supernatantů z laktokoků vůči buňkám listerií (experiment B); kultivace probíhaly v agaru BHI při teplotě 30 ºC po dobu 18 h Antilisteriální aktivita supernatantů z laktokoků vůči buňkám listerií (Experiment B) Kmeny laktokoků Lc. lactis subsp. lactis Lc. lactis subsp. lactis Kmeny listerií LCC 416 NIZO R5 DELVO-ADD 100X DSF L. monocytogenes CCM L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes Lm pozitivní inhibice; -... negativní inhibice Tabulka III Antilisteriální aktivita upravených supernatantů laktokoků vůči buňkám listerií (experiment C); kultivace probíhaly v agaru BHI při teplotě 30 ºC po dobu 18 h Antilisteriální aktivita upravených supernatantů z laktokoků vůči buňkám listerií (Experiment C) Kmeny laktokoků Lc. lactis subsp. lactis Lc. lactis subsp. lactis Kmeny listerií LCC 416 NIZO R5 DELVO-ADD 100X DSF L. monocytogenes CCM L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes L L. monocytogenes Lm pozitivní inhibice; -... negativní inhibice Laktokokové kmeny Lc. lactis subsp. lactis (LCC 416 a NIZO R5) (Nis + ) i jejich supernatanty vykazovaly pozitivní antilisteriální aktivitu pouze vůči kmeni L. monocytogenes CCM 5576 (viz tabulka I až II). Supernatanty laktokoků upravené pro experiment C neměly na inhibici růstu listeriálního kmene CCM 5576 žádný vliv (viz tabulka III). To se dá vysvětlit sníženým množstvím produkovaných a přítomných organických kyselin díky úpravě ph supernatantů na hodnotu 6,5. Úprava ph měla rovněž vliv na aktivitu nisinu, který je účinný pouze v rozmezí ph 3 až 6. Rovněž tepelná inaktivace supernatantů přispěla k tomu, že takto upravené supernatanty neměly na růst kmene L. monocytogenes CCM 5576 žadný vliv a antilisteriální aktivita u nich tedy nebyla prokázána. 275

276 Sýrařská kultura DELVO-ADD 100X DSF (Nis - ), stejně jako její supernatanty i upravené supernatanty, vykazovala pozitivní antilisteriální aktivitu vůči všem pěti testovaným persistentním kmenům L. monocytogenes (L-2296, L-2297, L-2299, L-2300 a Lm-31) (schopných tvořit biofilm), jak je patrné ze všech tří experimentů uvedených v tabulkách I až III. Z výsledků je patrné, že úprava ph ani tepelná inaktivace supernatantů sýrařské kultury (Nis - ) nesnížily účinek antilisteriální aktivity laktokoků. Z výsledků experimentů A až C je zřejmé, že nisin produkovaný laktokoky (Nis + ) neměl na tyto persistentní kmeny listerií žádný vliv. Na antilisteriální aktivitě sýrařské kultury se podílí zřejmě celá řada produktů metabolismu přítomných laktokoků a leukonostoků a různých organických kyselin, především kyselina mléčná. Závěr: Patogenní druhy L. monocytogenes, a to zejména perzistentní kmeny schopné tvorby biofilmů, představují v mlékárenském průmyslu mikrobiální riziko, které si zaslouží trvalou pozornost výrobců. V práci bylo potvrzeno, že BMK - konkr. laktokoky a leukonostoky - disponují silným biochemickým potenciálem, především produkcí kyseliny mléčné a bakteriocinu nisinu, a že vykazují průkazné antilisteriální účinky vůči perzistentním listeriálním kmenům, pocházejícím z mlékárenských provozoven, kde mohou tvořit biofilmy. V mlékárenské praxi mohou být zjištěné poznatky účinné pouze za předpokladu dodržování systému HACCP a principů SHP a SVP. Poděkování: Tato práce byla podpořena Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy (projekty MSM 2B08050 a MSM ). Literatura: 1. CARLTON R.M., NOORDAM W.H., BISWAS B., DE MEESTER E.D., LOESSNER M.J.: Bacteriophage P100 for control of Listeria monocytogenes in foods: Genome sequence, bioinformatic analyse, oral toxicity study and application. Regul. Toxicol. Pharmacol. 43, (2005). 2. FRANTZ C.M.A.P., SCHILLINGER U., HOLZAPFEL W.H.: Production and characterization of enterocin 900, a bacteriocin produced by Enterococcus faecium BFE 900 from blafl olives. Int. J. Food Microbiol. 29, (1996). 3. MACELA A. a kol. Infekční choroby a intracelulární parazitismus bakterií. Praha: Grada Publishing, pp. 216, SCHILLINGER U., STILES M.E., HOLZAPFEL W.H. Bacteriocin production by Carnobacterium pisciola LV 61. Int. J. Food Microbiol. 20, (1993). Kontaktní adresa: Ing. Ivana Složilová, Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6, , ČR ivana.slozilova@vscht.cz 276

277 VLIV BIOCHEMICKÉHO POTENCIÁLU LAKTOKOKŮ PŘI REDUKCI RŮSTU LISTERIÍ Šviráková Eva, Složilová Ivana, Tichovský Petr, Solichová Kateřina, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT v Praze Effect of lactococci biochemical potential on the reduction of listerias growth. Summary: There are found natural paths of elimination of listerias occurrence and listerias growth for the reason of providing microbiological safety of dairy products. For example lactic acid bacteria, including lactococci, present one the path due to their rich biochemical activities, primarily thanks to production of lactic acid and different bacteriocins including nisin. Used lactococci were able to reduce listerias depending on two different ways of milk contamination by listerias. The milk was contaminated by listerias before common cultivation with lactococci during experiments of the first type. The milk was firstly fermented by lactococci and subsequently contaminated by listerias during experiments of the second type. Observed results can be applicable in dairy practice, however they can be effective only if compliance of HACCP, GMP and GHP rules. Úvod: Z důvodu zajišťování mikrobiologické bezpečnosti mlékárenských výrobků, především sekundárně zrajících sýrů, jsou hledány přirozené cesty eliminace výskytu a růstu listerií. Jednu z možností představují například bakterie mléčného kvašení, které se svými bohatými biochemickými činnostmi podílejí na redukci počtu nebo inhibici růstu listerií, především díky produkci kyseliny mléčné a různých bakteriocinů, včetně nisinu. Cílem práce bylo prověřit biochemický potenciál sbírkových laktokokových kmenů Lactococcus lactis ssp. lactis a komerčních sýrařských mezofilních směsných kultur DELVO během společných kultivací se sbírkovými listeriálními kmeny Listeria sp. (druhy innocua a monocytogenes) při redukci růstu listerií v laboratorních podmínkách. Materiál a metody: Použité kmeny. Pro práci byly použity čtyři sbírkové laktokokové kmeny Lc. lactis ssp. lactis (LCC 416, NIZO R5, 303 a CHCC 2281), tři komerční směsné mezofilní sýrařské kultury (DELVO-TEC LL 50A-Z DSF, DELVO-ADD 100-X DSF a DELVO UX-11B DSF) a čtyři sbírkové listeriální kmeny L. innocua (CCM 5884, Ln-03 a Ln-10) a L. monocytogenes CCM 5576, které byly uchovány ve Sbírce bakterií, plísní a kvasinek (Ústav technologie mléka tuků, VŠCHT v Praze, Praha, ČR). Kultivační podmínky použitých kmenů. Laktokoky a sýrařské kultury byly kultivovány v bujónu M17 s laktosou (0,5 % hm.) (bujón LM17) při teplotě 30 C po dobu 18 h za aerobních podmínek (AP). Listerie byly kultivovány v bujónu BHI při teplotě 30 C po dobu 18 h za AP. Kmeny byly také kultivovány v mléce UHT (0,5 % hm. mléčného tuku) s/ nebo bez přídavku kvasničného extraktu (KE) (0,5 % hm.) při teplotě 30 C po dobu 18 h za AP. Pro přeočkování byla použita 1% (obj.) inokula. Stanovení počtu laktokoků a listerií. Počet laktokoků byl stanoven plotnovou metodou 1, technikou přelivu; kultivace probíhala v agaru LM17 při teplotě 30 C po dobu 48 h za AP. Počet listerií byl stanoven plotnovou metodou, technikou přelivu; kultivace probíhala v agaru BHI při teplotě 30 C po dobu 48 h za AP. 277

278 Stanovení počtu listerií na agaru PALCAM. Počet listerií byl stanoven plotnovou metodou, technikou roztěru; kultivace probíhala na selektivním agaru PALCAM při teplotě 30 C po dobu 24 h (48 h) za AP 2. Stanovení citlivosti použitých kmenů k nisinu. Citlivost kmenů k nisinu byla zjišťována stanovením jejich minimální inhibiční koncentrace nisinu (MIC nisinu ). Použité koncentrační rozmezí nisinu (Nisaplin, Danisco, Brabrand, DK) bylo 0 až IU nisinu ml -1 (tj. 0 až 1250 mg nisinu l -1 ). Stanovení antilisteriální aktivity laktokoků agarovou vpichovou metodou. Stanovení antilisteriální aktivity laktokoků bylo uskutečněno podle Schillingera 3 a supernatanty upraveny podle Franze 4. Společné kultivace laktokoků a listerií v modelovém systému mléka. Společné kultivace kmenů Lc. lactis ssp. lactis (LCC 416 produkující nisin, Nis +, nebo CHCC 2281 neprodukující nisin, Nis - ) nebo sýrařské kultury DELVO-ADD 100-X DSF (neprodukující nisin, Nis - ) s kmeny L. innocua (CCM 5884 nebo Ln-03) probíhaly v mléce UHT (0,5 % hm. mléčného tuku) při teplotě 30 C po dobu 18 h za AP. První modelový systém: lakotokoky o denzitě 10 8 KTJ ml -1 a listerie o denzitě 10 3 KTJ ml -1 byly inokulovány do mléka společně. Druhý modelový systém: mléko bylo fermentováno pouze laktokoky o denzitě 10 8 KTJ ml -1 a následně, až po fermentaci, kontaminováno listeriemi o denzitě 10 3 KTJ ml -1. Výsledky a diskuse: Citlivost laktokoků, sýrařských kultur a listerií k nisinu. Produkce nisinu u laktokoků. U testovaných laktokoků, sýrařských kultur a listerií byla zjišťována minimální inhibiční koncentrace nisinu (MIC nisinu ) a u laktokoků též produkce nisinu. Kvantitativní výsledky uskutečněných experimentů jsou presentovány v tabulce I a představují průměr ze tří uskutečněných měření. Tabulka I Minimální inhibiční koncentrace nisinu (MIC nisinu ) u laktokoků, sýrařských kultur a listerií a u laktokoků produkce nisinu; kultivace laktokoků v agaru LM17 1 a listerií v agaru BHI 2 při teplotě 30 C za 18 h Produkce nisinu [IU ml -1 ] Produkce nisinu [mg l -1 ] MIC nisinu MIC nisinu Kmen [IU ml -1 ] [mg l -1 ] Lc. lactis ssp. lactis LCC ,0 5,8 1000,0 25,0 Lc. lactis ssp. lactis NIZO R ,0 9,0 500,0 12,5 Lc. lactis ssp. lactis ,0 6,3 Lc. lactis ssp. lactis CHCC ,0 2,5 DELVO-TEC LL 50A Z DSF 1 250,0 6,3 DELVO-ADD 100-X DSF 1 3,0 0,1 DELVO UX-11B DSF 1 10,0 0,3 L. innocua CCM ,0 6,3 L. innocua Ln ,0 2,5 L. innocua Ln ,0 6,3 L. monocytogenes CCM ,0 6,3 278

279 Z testovaných kmenů a kultur byly k nisinu nejcitlivější následující: z laktokoků: Lc. lactis ssp. lactis CHCC 2281 (MIC nisinu 100 IU ml -1, resp. 2,5 mg l -1 ); ze sýrařských kultur: DELVO- ADD 100-X DSF (MIC nisinu 3 IU ml -1, resp. 0,1 mg l -1 ); z listerií: L. innocua Ln-03 (MIC nisinu 100 IU ml -1, resp. 2,5 mg l -1 ). Z literatury 5 je známo, že je u laktokoků za produkci nisinu zodpovědný soubor genů rozdělený do skupin nisabtcip, nisrk a nisfeg. Laktokoky produkující nisin mají k nisinu vytvořenou imunitu 6. Antilisteriální aktivita laktokoků v bujónu BHI U testovaných laktokoků a sýrařských kultur byla dále zjišťována jejich antilisteriální aktivita. Byly testovány jednak čerstvé kmeny laktokoků a sýrařských kultur (experiment A), také jejich supernatanty s upraveným ph na hodnotu 6,5 (experiment B), a také jejich supernatanty s upraveným ph na hodnotu 6,5 následně podrobené tepelné inaktivaci při 90 C po dobu 5 min (experiment C). Pozitivní antilisteriální aktivitu vykazovaly jednak kmeny Lc. lactis ssp. lactis (LCC 416 a NIZO R5, oba Nis + ) jednak kmeny Lc. lactis ssp. lactis (303 a CHCC 2281, oba Nis - ). Sýrařské kultury (všechny Nis - ) nevykazovaly vůči listeriím žádnou inhibici. Nejčastěji inhibovanými listeriálními kmeny byly L. innocua (CCM 5884 a Ln-10). Experimenty přinesly zjištění, že úprava ph supernatantů měla vliv na aktivitu nisinu. Z literatury 7 je známo, že ph pro standardní působení nisinu se pohybuje v rozmezí 3 až 6, a že nejvyšší aktivity nisinu je dosahováno v prostředí o ph 2 až 3. Supernatanty s upraveným ph na 6,5 vykazovaly při experimentech sníženou aktivitu nisinu. Uvádí se 7, že je nisin je při ph 6,5 a vyšším již ireverzibilně neaktivní. Společné kultivace laktokoků a listerií v modelovém systému mléka Pro společné kultivace bakterií v modelovém systému mléka byly na základě výše zjištěných výsledků vybrány tři laktokokové a dva listeriální kmeny. Z laktokokových kmenů byl vybrán jeden kmen produkující nisin a jeden kmen neprodukující nisin. Třetím kmenem byla směsná sýrařská kultura, která se používá pro komerční výrobu fermentovaných mléčných výrobků. Přestože kmen Lc. lactis ssp. lactis LCC 416 produkoval nižší množství nisinu (230 IU ml -1 ), než kmen Lc. lactis ssp. lactis NIZO R5 (360 IU ml -1 ), byl pro společné kultivace vybrán z důvodu vyššího antilisteriálního účinku prokázaného při stanovení vzájemné snášenlivosti laktokoků a listerií. Z kmenů, které neprodukovaly nisin byl vybrán kmen Lc. lactis ssp. lactis CHCC 2281, jelikož působil inhibičně při stanovení vzájemné snášenlivosti laktokoků a listerií. Ze sýrařských kultur byla vybrána kultura DELVO-ADD 100-X DSF z důvodu jejího praktického využití při výrobě fermentovaných mléčných výrobků, i když u něho nebyla prokázána antilisteriální aktivita při stanovení vzájemné snášenlivosti laktokoků a listerií. Z listeriálních kmenů byly vybrány dva kmeny L. innocua (5884 a Ln-03). Tyto kmeny byly dostatečně citlivé k nisinu (250 IU ml -1, resp. 100 IU ml -1 ) a byly laktokoky inhibovány při stanovení vzájemné snášenlivosti laktokoků a listerií (kap. 4.9). Výsledky dvou typů experimentů (experiment I a II) společných kultivací laktokoků a listerií v modelovém systému mléka jsou presentovány v tabulkách II a III a představují průměr ze dvou uskutečněných paralelních stanovení. 279

280 Tabulka II Společná kultivace laktokoků a listerií v modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mléčného tuku) při teplotě 30 C za 18 h; inokulace laktokoků a listerií v identickém čase (experiment I). Kmeny Kultivace Počet laktokoků [KTJ ml -1 ] Lc. lactis ssp. lactis LCC 416 Počet listerií [KTJ ml -1 ] Před kultivací 8, , ,5 + L. innocua 5884 Po kultivaci 1, , ,5 Lc. lactis ssp. lactis LCC 416 Před kultivací 8, , ,5 + L. innocua Ln-03 Po kultivaci 1, , ,5 Lc. lactis ssp. lactis CHCC 2281 Před kultivací 2, , ,5 + L. innocua 5884 Po kultivaci 3, , ,1 Lc. lactis ssp. lactis CHCC 2281 Před kultivací 3, , ,5 + L. innocua Ln-03 Po kultivaci 3, , ,1 DELVO-ADD 100-X DSF Před kultivací 7, , ,5 + L. innocua 5884 Po kultivaci 8, , ,6 DELVO-ADD 100-X DSF Před kultivací 4, , ,5 + L. innocua Ln-03 Po kultivaci 9, , ,6 Tabulka III Společná kultivace laktokoků a listerií v modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mléčného tuku) při teplotě 30 C po dobu 18 h; listerie inokulovány do mléka až po fermentaci mléka laktokoky (experiment II). Kultivační systém Kultivace Počet laktokoků [KTJ ml -1 ] Lc. lactis ssp. lactis LCC 416 Počet listerií [KTJ ml -1 ] Před kultivací 1, , ,9 + L. innocua 5884 Po kultivaci 8, , ,3 Lc. lactis ssp. lactis LCC 416 Před kultivací 1, , ,9 + L. innocua Ln-03 Po kultivaci 6, , ,3 Lc. lactis ssp. lactis CHCC 2281 Před kultivací 2, , ,1 + L. innocua 5884 Po kultivaci 2, , ,1 Lc. lactis ssp. lactis CHCC 2281 Před kultivací 2, , ,1 + L. innocua Ln-03 Po kultivaci 2, , ,1 DELVO-ADD 100-X DSF Před kultivací 4, , ,8 + L. innocua 5884 Po kultivaci 8, , ,4 DELVO-ADD 100-X DSF Před kultivací 5, , ,8 + L. innocua Ln-03 Po kultivaci 5, , ,4 ph ph Při společných kultivacích kmene Lc. lactis ssp. lactis LCC 416 (Nis + ) s kmeny L. innocua (CCM 5884 nebo Ln-03) v mléce došlo ke snížení denzit obou listeriálních kmenů o dva řády, a to z denzity 10 3 KTJ ml -1 na denzitu 10 1 KTJ ml -1. Při společných kultivacích kmene Lc. lactis ssp. lactis CHCC 2281 (Nis - ) nebo sýrařské kultury DELVO-ADD 100-X DSF (Nis - ) s kmeny L. innocua (CCM 5884 nebo Ln-03) došlo v mléce k zastavení růstu obou listeriálních kmenů a denzita listerií zůstávala v řádu 10 3 KTJ ml -1. Při kultivacích kmenů Lc. lactis ssp. lactis (LCC 416 nebo CHCC 2281 nebo kultury DELVO-ADD 100-X DSF), které již fermentovaly mléko, s kmeny L. innocua (CCM 5884 nebo Ln-03) došlo u obou listeriálních kmenů ke snížení denzit listerií o tři řády, a to z denzity 10 3 KTJ ml -1 na denzitu 10 0 KTJ ml

281 Závěr: Laktokoky používané pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků ve formě komerčních mezofilních zákysových kultur lze využít pro účinnou kontrolu výskytu a růstu listerií díky jejich bohatým biochemickým činnostem, především díky produkci kyseliny mléčné a různých bakteriocinů, vč. nisinu. Výsledky modelového systému mléka potvrdily, že pokud dojde ke kontaminaci mléka listeriemi ještě před jeho fermentací pomocí laktokoků, dojde k adaptaci přítomných listerií na kyselé ph (ph 4,0 až 4,5) a denzita listerií se nezvýší ani nesníží. Pokud listerie kontaminují již fermentované mléko, mimo jiné, skoková změna ph způsobí redukci počtu listerií. V mlékárenské praxi mohou být zjištěné poznatky účinné pouze za předpokladu dodržování systému analýzy nebezpečí a kritických kontrolních bodů a pravidel správné hygienické a výrobní praxe. Poděkování: Tato práce byla podpořena Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy (projekty MSM 2B08050 a MSM ). Použitá literatura: 1. ČSN EN ISO 7218 (560103): Mikrobiologie potravin a krmiv Všeobecné požadavky a doporučení pro mikrobiologické zkoušení. ČNI, Praha ČSN EN ISO (560093): Mikrobiologie potravin a krmiv Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes. ČNI, Praha SCHILLINGER U., STILES M.E., HOLZAPFEL W.H. Bacteriocin production by Carnobacterium pisciola LV 61. Int. J. Food Microbiol. 20, (1993). 4. FRANTZ C.M.A.P., SCHILLINGER U., HOLZAPFEL W.H.: Production and characterization of enterocin 900, a bacteriocin produced by Enterococcus faecium BFE 900 from black olives. Int. J. Food Microbiol. 29, (1996). 5. MCAULIFFE O., ROSS R. P., HILL C.: Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action. FEMS Mirobiol. Rev. 25, (2001). 6. MILLS S., MCAULIFFE O.E., COFFEY A., FITZGERALD G.F., ROSS R.P.: Plasmids of lactococcigenetic accessories or genetic necessities? FEMS Microbiol. Rev. 30, (2006). 7. HURST A.: Nisin. Adv. Appl. Microbiol. 27, (1981). Kontaktní adresa: Ing. Eva Šviráková, Ph.D., Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6, , ČR, eva.svirakova@vscht.cz 281

282 NEŽIADUCE MIKROORGANIZMY V SYROCH HOLADSKÉHO TYPU S OBSAHOM PROBIOTICKÝCH KULTÚR POČAS ZRETIA Poľáková Lucia, Dudriková Eva, Lovayová Viera Ústav hygieny a technológie mlieka, UVL Košice Undesirabrable micro organisms in Dutch-type semi-hard chesses with probiotic culture during ripening. Summary The aim of work was to study undesirable micro organisms (S. aureus, coliform bacteria, psychrotrophic bacteria, Listeria monocytogenes) in Dutch-type semi-hard chesses made from cow s milk during laboratory conditions, contenting probiotic culture (Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum 96). Samples were taken one per month during period from January 2009 to June Microbiological analysis showed that used probiotic strains, chosen technological process as well as conditions of ripening during six month of experiment have had consequence that in any case were not isolated and identified selected type of micro-organisms. Index of milk pasteurization was between from 99.2 to 99.8 %. In conclusion we can say that chosen technological process of cheese manufacturing and used strains of probiotic micro-organisms as well as time and conditions of cheeses ripening (six month, 4-6 C in fridge) were correct and could be use in the practice for small producers. The cheeses made during the experiment are safety and can be recommended for the small producers for the production of cheeses with probiotic cultures. Úvod Mlieko a syry sú dôležitým zdrojom biologicky aktívnych látok nevyhnutných pre zdravý vývoj každého človeka. Syry obsahujú podľa druhov až 30 % bielkovín, do 30 % tuku stopové množstvo mliečneho cukru a minerálne látky a celú radu biologicky dôležitých látok, ako sú napr. esenciálne aminokyseliny (2). V súčasnosti sa do popredia záujmu dostávajú funkčné potraviny, kde patria aj potraviny obsahujúce probiotiká. Probiotiká sú považované za výživové suplementy, ktoré sa vyznačujú preukázateľným vplyvom na stav črevnej mikroflóry a svojim účinkom priaznivo pôsobia na zdravotný stav človeka (5, 7, 8). Probiotiká pridávané do potravín by mali vydržať technologický proces výroby bez zníženia ich životaschopnosti alebo negatívneho efektu na senzorické vlastnosti potravinárskych produktov (3, 6). Mikroflóra každého syra je jedinečná bez ohľadu na štartovaciu kultúru alebo cielene pridaných sekundárnych mikroorganizmov (napr. plesne a kvasinky). V syroch sa vyskytujú nielen žiadúce mikroorganizmy pozitívne ovlyvňujúce vlastnosti syra, ale i nežiaduce mikroorganizmy, ktoré môžu negatívne ovplyvniť jeho senzorické a mikrobiologické vlastnosti (1). Najčastejšími nežiaducimi mikroorganizmami v syroch sú koliformné baktérie, sporulujúce baktérie zvlášť Clostridium spp., niektoré kvasinky, plesne a neštartovacie baktérie mliečneho kvasenia (9). Výskyt nežiaducich mikroorganizmov je výsledkom kontaminácie mlieka a syrov. Ku ktorému môže dôjsť v priebehu technologického procesu, skladovania syrov, ako aj jeho distribúcie do obchodnej siete a počas predaja (4). Cieľom práce bolo sledovať nežiaduce mikroorganizmy (S. aureus, koliformné baktérie, psychotrofné baktérie, L. monocytogenes) v polotvrdých syroch s nízkodohrievanou syreninou holandského typu s obsahom probiotických kultúr vyrobených v laboratórnych podmienkach. Materiál a metodika Polotvrdé syry holandského typu s nízkodohrievanou syreninou z pasterizovaného mlieka boli vyrobené v laboratórnych podmienkach na Ústave mikrobiológie a gnotobiológie UVL v Košiciach za použitia inokula zloženého z klasickej štartovacej kultúry v kombinácii s troma druhmi probiotickej kultúry (Tab.1). Množstvo probiotika v pripravenom inokule bolo 10 8 /100 l mlieka. Spolu bolo vyrobených 12 bochníkov syra holandského typu, t.j tri skupiny syra s danou probiotickou kultúrou, pričom v každej skupine boli 3 bochníky o priemernej hmotnosti 3273 g 282

283 a jedna skupina s počtom troch bochníkov syra bez použitia probiotickej kultúry. Po vytvorení kôrky sa syry nalakovali, zavoskovali a zreli pri teplote 10 C po dobu 6 mesiacov (január 2009 až jún 2009). Vzorky na mikrobiologické vyšetrenie boli odoberané 1 x mesačne v priebehu obdobia zretia syrov, a to z dvoch miest každej vyšetrovanej vzorky bochníka syra, t.j. stred a kraj. Vzorky sa spracovali štandardnými mikrobiologickými metódami a sledované nežiaduce mikroorganizmy (S. aureus, koliformné baktérie, psychotrofné baktérie a L. monocytogenes) boli izolované a diagnostikované štandardnými mikrobiologickými metódami podľa príslušných STN ISO noriem. Tabuľka 1 Prehľad použitých probiotických kultúr pri výrobe polotvrdých syroch holandského typu s nízkodohrievanou syreninou Označenie syra Štartovacia kultúra Druh použitého probiotika S1 S2 S3 SK FD-DVS-DCC-260 (Christians Hansen) FD-DVS-DCC-260 (Christians Hansen) FD-DVS-DCC-260 (Christians Hansen) FD-DVS-DCC-260 (Christians Hansen) Lactobacillus acidofilus Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum 96 bez probiotika Výsledky a diskusia Pasterizačný efekt pre mlieko sa pohyboval od 99,2 do 99,8 %. V polotvrdých syroch holandského typu v období január 2009 až jún 2009 neboli vyizolované a identifikované žiadne nami sledované nežiaduce mikroorganizmy (S. aureus, koliformné baktérie, psychotrofné baktérie, L. monocytogenes). Na základe nami zistených výsledkov možno konštatovať, že zvolená teplota pasterizácie mlieka (72 0 C/15 sek.), ako aj technologický postup výroby tohto typu syrov, zvolené kmene probiotických mikroorganizmov, ako aj použitá doba a podmienky zretia syrov (6 mesiacov, 4-6 C v chladničke) boli správne a môžu byť využívané v praxi u drobných spracovateľov mlieka. Možno konštatovať, že takto vyrobené syry sú nielen zdravotne bezpečné, ale svojim zložením môžu rozšíriť sortiment zdraviu prospešných mliečnych výrobkov na báze probiotickej mikroflóry. Záver Nežiaduce mikroorganizmy, ktoré môžu tvoriť mikroflóru finálnych výrobkov možno rozdeliť na technologicky nežiaduce (koliformné baktérie, psychrotrofné baktérie), ktoré sa podieľajú na vzniku nežiaducich chýb finálnych výrobkov a patogénne a toxinogénne mikroorganizmy (S. aureus, L. monocytogenes), ktoré môžu ohroziť zdravie konzumentov. Z výsledkov našej práce vyplýva, že v podmienkach laboratórnej výroby syrov, pri ktorých boli dodržané všetky technologické a hygienické aspekty výroby a skladovania, resp. zretia syrov sme ani v jednej vzorke nami vyšetrených druhov syrov neizolovali uvedené skupiny mikroorganizmov. Z toho vyplýva, že dodržanie základných uvedených podmienok aj v podmienkach výroby syrov v malých a stredných prevádzkach môže byť výroba polotvrdých syrov s nízkodohrievanou syreninou holandského typu s obsahom probiotických kultúr jednou z možností rozšírenia sortimentu v obchodnej sieti a nie je potrebné sa obávať mikrobiologického nebezpečenstva. Poďakovanie: Práca bola finančne podporená grantom VEGA SR č. 1/0638/

284 Použitá literatura: 1. Beresford T.P., Fitzimons N.A., N. L. Brennan., Cogan T.M.: Recent advances in cheese Microbiol. Int. Dairy J., 2001, 11, Keresteš, J.: Syry výživa a zdravie. Otamva, Považská Bystrica, 2007, 175s. 3. Lee, Y.-K., Salminen, S.: The coming age of probiotics. Trends Food Sci. Technol., : Marth, E.H., Steele, J.L: Applied dairy microbiology. Marcel Dekker, Inc., New York, 2001, 759 s. 5. McFarland, L.: Areviewof evidences of health claims for biotherapeutic agents. Microb. Ecol. Health Dis., 2000, 12: Saarela, M., Morgensen, G., Fonde n, R., Matto, J., Mattila-SandholmT.: Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties. J. Biotechnol., 2000, 84: Salminen, S.: Human studies on probiotics: Aspects of scientific documentation. Scand. J. Nutr., 2001, 45: Rimárová, K., Petriľáková, T.: Karcinogénne látky v životnom prostredí. Enviromentálne problémy miest: zborník príspevkov z 3. celoštátnej konferencie s medzinárodnou účasťou-proceedigs, Košice, 1999, s van den Berg: Dutch type cheese. In: Encyclopedia of Dairy Science (Roginsky H., ed.) Academic Press, London 2003, s. Kontaktná adresa: Lucia Poľáková, Ústav hygieny a technológie mlieka, Komenského 73, Košice, polakova@uvm.sk 284

285 ANTIBAKTERIÁLNÍ A ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITA ESTERŮ FENOLICKÝCH KYSELIN Merkl Roman, Hrádková Iveta, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír Ústav technologie mléka a tuků, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Antibacterial and antioxidant activity of phenolic acids esters. Summary: The aim of the study was to test the antioxidant and antibacterial activity of selected phenolic compounds. Antibacterial activity was demonstrated at concentrations of to 10 mmol / l. The selected agent of G- bacteria strain Escherichia coli 7503 DMF showed high efficiency of prepared esters of phenolic acids, while the chosen agent of G+ bacterial strain Bacillus cereus DMF 2001 showed a higher efficiency of phenolic acids. The highest tested concentration of 10 mmol / l the most substances essentially stopped the growth of both strains of bacteria after 50 hours of cultivation. Their antioxidant activity was carried out Rancimat method. The most effective substance of the group of phenolic acids and their derivatives was gentisic acid and caffeic esters. Úvod: Fenolické látky jsou známé širokým spektrem biologických aktivit, zahrnujícím protizánětlivé, antivirové, antibakteriální, antiaterogenní a antikancerogenní účinky 1. Užívání fenolických přírodních látek, hlavně kvůli jejich antioxidačním účinkům, je známé již velmi dlouho. Přírodní fenolické látky jsou obsaženy téměř ve všech rostlinách, mikroorganismech a houbách 4. Doposud byly tyto látky charakterizovány především ve směsích jako extrakty z jednotlivých rostlin. V této práci vystupují vybrané fenolické látky jako chemická individua. Pro další možné využití těchto látek k ochraně lipidů proti oxidaci byl srovnáván antioxidační a antimikrobiální účinek kyselin s jejich estery. Účinnost je ovlivněna celou řadou faktorů, jak ze strany činidla (rozpustnost, polarita látky, ph prostředí, atd.), tak ze strany mikroorganismu v případě antimikrobiální aktivity, kde hlavní roli hrají především rozdíly ve složení buněčné stěny G + a G - bakterií. Při sledování antioxidační aktivity látek strukturně podobných byly v předešlých pracích vyvozeny tyto závěry: Monofenoly jsou méně účinné než polyfenoly. Zavedením druhé hydroxylové skupiny do ortho nebo para polohy vzroste antioxidační aktivita. Inhibiční efekt monofenolů významně vzrostl s jedním nebo dvěmi metoxylovýmy substituenty 2. Experimentální část: Pro testování byla vybrána pětice kyselin (Fluka, Sigma-Aldrich) a z nich připravené estery. HO HO COOH HO COOH COOH HO kyselina 4-hydroxy benzoová kyselina 3,4-dihydroxy benzoová kyselina 2,5-dihydroxy benzoová OH HO O kyselina vanilová COOH HO HO kyselina kávová COOH 285

286 Příprava esterů z alkoholů s nižšími body varu (C 1-6) Estery alkoholů s nižšími body varu (C 1-6) byly připraveny kysele katalyzovanou esterifikací (Obr. 1). Jako katalyzátor byla použita p-toluensulfonová kyselina (p-ts-oh). Rozpouštědlem byl vždy daný alkohol, který byl v reakci v několikanásobném molárním přebytku. Reakce probíhala při bodu varu alkoholu, u alkoholů vroucích za laboratorní teploty nad 100 C, probíhala reakce při teplotě C. Reakce trvala několik hodiny v závislosti na stupni konverze. Průběh reakce byl sledován pomocí tenkovrstvé chromatografie (TLC). HO HO COOH OH p-ts-oh HO HO Obr. 1. Příprava ethylesteru kyseliny 3,4-dihydroxybenzoové. Příprava esterů z alkoholů s vyššími body varu (C 8-12) Estery alkoholů s vyššími body varu (C 8-12) byly připraveny dvoukrokovou reakcí. V prvním kroku proběhla chlorace kyseliny a poté následovala substituce za alkohol (Obr. 2). Reakce probíhala ve 100 ml kulaté baňce se zpětným chladičem na magnetickém míchadle. Do baňky bylo nalito 50 ml dioxanu, poté byla nasypána kyselina a po rozpuštění byl do homogenní směsi přilit thionylchlorid. Směs byla zahřána na teplotu 96 C a míchána tři hodiny. Poté byl opatrně přikapán alkohol a směs byla míchána při teplotě 96 C dalších šest hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC. Látky byly v molárním poměru kyselina : thionylchlorid : alkohol = 1 : 3 : 1,2. O O O OH 1. SOCl 2 dioxan 3 h, 96 C O O HO OH 2. 6 h, 96 C 1-oktanol HO OH Obr. 2. Příprava oktylesteru kyseliny 3,4-dihydroxybenzoové. Po odpaření rozpouštědla byly získané krystaly přečištěny pomocí Flash chromatografie nebo rekrystalizací. Látky byly rekrystalizovány především z benzenu, u méně rozpustných esterů bylo při zahřívání přidáno po kapkách malé množství výchozího alkoholu. Takto byly připraveny látky o čistotě vyšší než 98 % hm. (TLC- FID). Testování antioxidační účinnosti K měření antioxidační aktivity byla použita automatizovaná mezinárodně uznávaná metoda Rancimat. Principem metody je kontinuální měření změny elektrické vodivosti demineralizované vody, do které jsou absorbovány sekundární oxidační produkty uvolněné z testovaného vzorku. Tyto látky především kyselina mravenčí jsou unášené proudem vzduchu, kterým je vzorek probubláván o průtoku 20 L h -1 a oxidován. Zkumavka ze vzorkem je umístěná ve vyhřívaném lůžku, v našem případě při teplotě 120 ± 1,6 C. Výsledkem je oxidační křivka, jejíž inflexní bod se nazývá indukční perioda. Pro samotné měření je důležité dodržet několik zásad. Počáteční elektrická vodivost demineralizované vody měrné nádobce by měla být nižší než 1 µs. Dále je nutné, aby se navážky oleje co nejméně lišily. V našem případě byla používána navážka 2,5 ± 0,013 g. 286

287 Tabulka I Charakteristika použitého oleje. ČK [mg KOH/g] PČ [mekv. akt. O/kg] ČJ [g I2/100g] složení mastných kyselin [% hm.] C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C24:0 0,16 3,28 122,06 0,01 0,07 6,12 4,05 26,62 61,71 0,04 0,30 0,02 0,82 0,25 Testování antimikrobiální účinnosti Bylo použito pět koncentrací každé z testovaných látek v intervalu 0, mmol/l. Jako rozpouštědla testovaných látek byly použity ethanol a dimethyl sulfoxid. Jejich výsledná koncentrace v médiu byla nižší než 2 % hm., což nemělo vliv na růst bakterií (ověřeno kontrolním pokusem). Testované kmeny byly Escherichia coli DMF 7503 a Bacillus cereus DMF 2001, absorbance inokula byla upravena na hodnotu 0,1. Jak pro zástupce G + tak i G - bakterií bylo použito jako živné médium nutrient bujón. Kultivace probíhala při 37 C pro kmen Escherichia, respektive při 30 C pro kmen Bacillus. Měření a zároveň i kultivace probíhaly v přístroji PowreWave XS na mikrotitračních destičkách. V jednotlivých jamkách destiček bylo růstové médium, odpovídající koncentrace testované látky a inokulum. Kontrolní vzorek bez indikátorové bakterie obsahoval pouze bujón a testovanou látku. Absorbance byla měřena při 650 nm. Po transportu dat do programu Excel byly výsledky zpracovány do růstových křivek (závislost absorbance média na době kultivace). Pro přehlednost byla inhibiční aktivita každé látky vyjádřena jako plocha pod růstovou křivkou, která byla vztažena na stoprocentní nárůst. Výsledky: Na obr. 3 jsou uvedené hodnoty protekčních faktorů (PF), které byly získány výpočtem z indukčních period naměřených přístrojem Rancimat. Ke vzorkům slunečnicového oleje bylo přidáno 0,05 % hm. vybraných derivátů fenolových kyselin a ty byly proměřeny metodou Rancimat. Naměřená absorbance média je úměrná nárůstu bakterií. Na mikrotitračních destičkách byly bakterie kultivovány a součastně se měřila absorbance po dobu 50 hodin. Z průběhu křivek na obr. 4 je patrné, že od koncentrace methylesteru kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové 2,5 mmol/l byl růst bakterie prakticky potlačen. 287

288 200 PF (%) k. 3,4- dihydroxybenzoové k. 2,5- dihydroxybenzoové k. ferulové k. kávové k. vanilové k. 4- hydroxybenzoové methyl ester ethyl ester propyl ester butyl ester hexyl ester kyselina Obr. 3. Antioxidační vlastnosti derivátů vybraných fenolických kyselin Obr. 4. Růstové křivky Escherichia coli s různými koncentracemi esteru kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové. Výsledky byly zpracovány do přehledné map. Z obsahů ploch pod křivkami byly vypočteny procenta inhibice. Úroveň inhibice odpovídá intenzitě zabarvení pole pro určitou koncentraci inhibiční látky. Čím je v poli tmavší odstín, tím bylo dosaženo vyššího procenta inhibice (obr. 5). 288

289 Escherichia coli DMF 7503 Bacillus cereus DMF 2001 Látka c (mmol / l) c (mmol / l) 0,625 1,25 2, ,625 1,25 2, kyselina 4-hydroxybenzoová methyl ester ethyl ester kyselina 3,4-dihydroxybenzoová methyl ester ethyl ester kyselina 2,5-dihydroxybenzoová methyl ester ethyl ester kyselina kávová methyl ester ethyl ester kyselina vanilová methyl ester ethyl ester +... stupeň inhibice nebylo možné změřit kvůli změně barvy bujónu vyšší nárůst (%) inhibice (%) Obr. 5. Inhibiční aktivita jednotlivých koncentrací testovaných látek na vybrané zástupce G + a G - bakterií. V některých případech nižších koncentrací kyselin došlo po počátečním částečném potlačení růstu bakterií k pozdějšímu zvýšení nárůstu bakterií nad hodnoty stoprocentního nárůstu. Při měření hodnot absorbance v případě kyseliny kávové nebylo možné kvantifikovat nárůst bakterií. Během kultivace došlo ke změně barvy bujónu s typicky nažloutlé na sytě zelenou. Intenzita zabarvení bujónu odpovídala koncentraci testované látky a ve vyšších koncentracích došlo až k vyvločkování média. Přesto lze tvrdit, že při vizuální kontrole daných jamek na mikrotitrační destičce nebyl pozorován zákal charakteristický pro nárůst bakterie. Diskuse a závěry: Z obrázku 3 je názorné, že deriváty kyseliny kávové významně prodloužily indukční periodu testovaného oleje, v některých případech téměř na dvojnásobek. O derivátech kyseliny vanilové lze tvrdit, že mají prooxidační vlastnosti. Převedením k. 2,5-dihydroxybenzoové na její estery, jsme zabránily její snadnému přechodu oxidací na chinonovou formu a tím došlo ke ztrátě jejich antioxidačních vlastností. Látky, které mají přítomnu v molekule jednu hydroxy skupinu nebo methoxy skupiny, antioxidační účinek nevykazují. Fenolové kyseliny a jejich estery s dvěma a více hydroxy skupinami v molekule vykazují významný antioxidační účinek kyselina pyrogallolkarboxylová (2,3,4-trihydroxybenzoová), gentisová (2,5-dihydroxybenzoová) a kávová (3,4-dihydroxyskořicová). Testované kyseliny vykazovaly nižší antimikrobiální účinnost na kmen Escherichia ve srovnání s kmenem Bacillus (obr. 5). To je pravděpodobně způsobeno především rozdílným složením buněčné stěny, která se u G - bakterií skládá z tenké vnitřní vrstvy peptidoglykanů a z vnější membrány složené z molekul fosfolipidů, liposacharidů, lipoproteinů a povrchových proteinů. Ty naopak podporují vyšší antibakteriální aktivitu hydrofóbnějším esterům. Vyšší účinnost ethylesterů daných kyselin na zástupce G - je také pravděpodobně dána jejich vyšší lipofilitou. Na druhou stranu je podobný efekt pozorován v menší míře i na zástupce G

290 Dále lze tvrdit, že s přítomností další hydroxylové skupiny v molekule, se zvyšuje inhibiční účinek. Výhodnější je zavedení druhé hydroxylové skupiny do polohy para, než-li do polohy ortho. Změna antimikrobiální aktivity po zavedení methoxyskupiny do molekuly v poloze ortho není podle dosažených výsledků významná. V práci byly potvrzeny předpoklady o souvislosti struktury látky s antimikrobiální aktivitou 2. Struktura molekuly má podobný vliv i na antimikrobiální aktivitu. Literatura: 1. Cos P., Calomme M., Pieters M., Vietinck A. J., Vanden Berghe D. (2000). Studies in Natural Products Chemistry, Atta-Ur-Rahman, Elsevier Science, Amsterdam, 22, Cuvelier M-E, Richard H., Berst C. (1992). Comparison of the antioxidative activity of some acidphenols: structure activity relationship, Biosci Biotech Biochem, Nagaoka T., Banskota H. A., Tezuka Y., Saiki I., Shigetoshi K. (2002). Selcetive Antiproliferative Activity of Caffeic Acid Phenethyl Ester Analogues on Highly Liver-Metastatic Murine Colon 25-L6 Carcinoma Cell Line, Bioorg. Med. Chem., 10, Pokorny J. (1999). Antioxidants in food preservation, Handbook of Food Preservation, Shafiur Rahman M, New York, Marcel Dekker,, Poděkování: Tato práce byla finančně podpořena z projektu MŠMT ČR (MSM /2005). Kontaktní adresa: Ing. Roman Merkl Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT, Technická 5, Praha 6 roman.merkl@vscht.cz 290

291 REJSTŘÍK AUTORŮ Abrlová Magdaléna...38 Bavard Alice...38 Běláková Markéta...48 Belej Ľubomír Blahušová Jana...83 Bogovič-Matijašić Bojana Borkovcová Ivana Brežná Barbara...77, 223 Bunešová Věra , 127 Buňka František...43, 104, 187 Buňková Leona...104, 187 Burdová Oľga...117, 249 Burdychová Radka Cicvárek Jiří...83 Cupáková Šárka Čablová Andrea Čanigová Margita Černíková Michaela...43 Čmejlová Kateřina...197,201 Čurda Ladislav...13, 60, 212, 217 Diblíková Lenka...53, 60, 212, 217 Dračková Michaela Drončovský Maroš...88 Ducková Viera Dudriková Eva...117, 282 Dušková Marta Dvořáková Blanka Falta Daniel...145, 149 Ferencová Jana Fiala Jaromír Filip Vladimír Foltys Vladimír...158, 194 Gabrielová Alena Golian Jozef , 168 Greif Gabriel...88, 94, 99 Greifová Mária...88, 94, 99 Guba Peter Haluzíková Tereza Hanuš Oto Hejtmánková Alena Herian Karol Hering Pavel Hladká Kristýna...43, 187 Horáčková Šárka...33 Hrádková Iveta Hrdličková Kateřina Hrnčířová Kristýna Hybenová Eva...71, 232 Chebeňová Viera...77, 223 Chládek Gustav , 149 Chovanec Martin Janštová Bohumíra Jůzl Miroslav Kalhotka Libor Karovičová Jolana Karpíšková Renáta Keresteš Ján Kilcawley Kieran Kirchnerová Katarína , 194 Kolihová Dana Kološta Miroslav Konečná Hana Kontová Marcela... 88, 94 Koreňová Janka , 254 Kouřimská Lenka , 207 Kováčová Renáta Kozelková Monika Kráčmar Stanislav , 187 Krajčová Eva Králíková Marcela Krebs-Artimová Anna Kročko Miroslav Krupková Daniela Kuchta Tomáš... 77, 223 Kunová Gabriela Kvasničková Blanka Legarová Veronika , 207 Liptáková Denisa Lovayová Viera , 249, 282 Lužová Táňa , 228 Mantlová Gabriela Maršík Petr Medveďová Alžbeta... 71, 232 Merkl Roman Miholová Daniela Mihulová Miroslava Necidová Lenka Nemcová Radomíra Němečková Irena... 83, 245 Nevoral Jiří Nováková Lucie Obermajer Tanja Ondráčková Iva , 268 Pachlová Vendula , 187 Pangallo Domenico... 77, 223 Panovská Zdeňka... 27, 197, 201 Pechačová Marta Peroutková Jitka

292 Píšová Zuzana Plocková Milada...33, 38, 48, 83,...264, 268, 273, 277 Pocedičová Klára...212, 217 Poděbradská Jana Poľáková Lucia Pospíšil Jan Přibyla Lubomír Rada Vojtěch , 127 Rimárová Kvetoslava Ročková Šárka...123, 127 Rogelj Irena Rohacká Hana...83 Roubal Petr...83, 245 Rozenská Lenka Řeřichová Jana...197, 201 Sedláček Ivo Sklenář Jan Skýpala Martin...145, 149 Slottová Anna...88 Složilová Ivana...273, 277 Smetanková Jana...94 Sojková Kamila Solichová Kateřina...83, 264, 277 Sopčaková Zuzana...99 Studeničová Adriana...71 Sudzinová Janka Sylvie Lortal Šárka Havlíková Šilhavá Jaroslava Šmidrkal Jan Štětina Jiří... 13, 53, 66 Štoudková Hana Šulcerová Hana Šustová Květoslava , 180, 183, 228 Švec Pavel Šviráková Eva... 38, 273, 277 Tichovský Petr , 277 Tomáška Martin... 88, 99 Tůma Štěpán... 83, 48 Urdová Katarína Váchová Alena , 201 Valence-Bertel Florence Valík Ľubomír... 71, 232 Vejvodová Zuzana Vlková Eva , 127 Vorlová Lenka Weiserová Eva Záhora Jaroslav Zajác Peter , 168 Zeleňáková Lucia , 168 Ženišová Katarína

293 ANAMET, s. r.o. Kováků Praha 5 tel , fax Analytické přístroje ALLIANCE INSTRUMENTS pro potravináře ( především pro mlékárenský průmysl ) OPTIGRAPH - sledování časového vývoje koagulace mléka prostřednictvím měření transmitance NIR signálu současně v deseti vzorcích mléka. Důležité informace pro optimalizaci výrobního procesu sýrů (doba koagulace, vývoj tuhosti ). CINAC - současné sledování až 32 hodnot ( teplota, ph, vodivost, redox) charakterizujících průběh acidifikace při procesech v mlékárenském průmyslu. INFRASCAN - NIR spektrofotometr pro široké použití v potravinářském průmyslu např. měření vlhkosti, obsahu tuků, proteinů atd. LUMiSizer, LUMiFuge, LUMiReader - velikost částic a stabilita disperzí, určování skladovatelnosti emulzí ( shelf life ), sledování koalescence a flokulace, rozpad emulzí.

294

295

296

297 MILCOM a.s. Ke Dvoru 12a, Praha 6 Spolupracujeme na jakosti a efektivnosti vaší produkce na vývoji nových výrobků Školíme laborantky, sýraře, senzorické hodnocení Akreditovaná mikrobiologická a chemická laboratoř mezilaboratorní a kruhové testy s certifikací Dodáváme mlékárenské kultury, živné půdy, mikrobitesty fosfatesty, peroxidázové testy, syřidla, sýr. barviva laboratorní chemikálie (Gerberova a van Gulikova H 2 SO 4, Isoamylalkohol, 0,25N NaOH, fenolftalein) Baličky, termizátory, GO mlékárenských strojů Kontakty Ing. Šalaková Laktoflora M. Pechačová poradenství, pomoc praxi Mgr. Höfer obchodní aktivity tel: milcom@milcom-as.cz

298

299 Laboratorní přístroje ke kontrole kvality surovin, potravin a krmiv FoodScan ke kontrole kvality tvrdých a tavených sýrů, tvarohů a másla. Stanovuje obsah tuku, bílkovin, sušiny, vody, NaCl a ph. první 4 přístroje již v ČR a SR hotové kalibrace plug and play další volitelné kalibrace doba vyšetření vzorku 50 sekund jednoduchá obsluha Kontakty : MVDr. I. Kadlec, Ing. O. Borský kadlec@milcom.cz, borsky@milcom.cz tel: ,145 mob: ,

300

301 NICOLET CZ s. r. o. Specialisté v oboru molekulové spektroskopie FT-NIR analyzátory potravinářských výrobků Stanovení běžných parametrů potravinářských výrobků za několik minut, bez destrukce vzorku a potřeby chemikálií. Zakázkový vývoj metod, včetně automatizace stanovení, bezplatné předvedení přístrojů s možností měření vlastních vzorků. Servisní práce zdarma. Aplikační, servisní a obchodní středisko: Nicolet CZ s.r.o. Nad Trnkovem Praha 10 T/F: , Mobil: , , ThermoScientific FTIR, FTNIR, Raman, Microscopy Kvalita spektrometrů Nicolet ověřena více než 250 uživateli v ČR a SR.

302

303 Květnového vítězství 160/ PRAHA 4 Ing. Pelikánová, Ing. Kubiš, Ph.D. MIKROBIOLOGIE, KONTROLA KVALITY A HYGIENY PŘÍSTROJOVÁ TECHNIKA