diagnostika in vitro Vysokovýkonné sálové centrifugy Avanti JXN Nový přístroj HIAC pro měření kvality viskózních kapalin

Transkript

1 in vitro diagnostika Vysokovýkonné sálové centrifugy Avanti JXN Nový přístroj HIAC pro měření kvality viskózních kapalin Nová souprava Duraclone B27 pro analýzu na průtokovém cytometru Hematurie v klinickém kontextu Prvé skúsenosti s analyzátorom iricell 2000 Měření hladin vitamínu D mezi zaměstnanci společností Immunotech a Beckman Coulter Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

2 Na tý louce zelený najdete zajíce a moderní nemocnici Editorial tohoto čísla jsme věnovali malé nemocnici, která se před necelými 10 lety objevila na okraji Domažlic v místě, jež do té doby obývalo maximálně pár zajíců a bažantů (ty lze mimochodem v nemocničním parku občas potkat dodnes). Předsedkyní představenstva nemocnice je po celou dobu Ing. Alena Vyrutová, její současná a zároveň dlouhodobá ředitelka. Jí jsme se zeptali nejen na to, jak se nemocnice mezi zajíce dostala V lednu 2006 byl otevřen nový areál Domažlické nemocnice, která tak dnes patří mezi jedno z nejnovějších zdravotnických zařízení v České republice. Pomohl tento atraktivní vzhled Vašich prostor spolu s pohodlím, jež Vaše nemocnice nabízí, k získání většího množství pacientů? Domažlice se rovněž nachází v blízkosti německých hranic. Zaznamenali jste tak např. větší příliv německých klientů? Stará nemocnice byla z hlediska hygienických předpisů zcela nevyhovující. Stáli jsme tedy před rozhodnutím: buď s ní něco udělat, nebo ji zcela opustit. Původní projekt rekonstrukce zastaralého objektu se ukázal jako ne zcela vhodný, takže nám v té době jako asi jediným schválili stavbu nového zařízení na zelené louce. Samotné stavbě předcházela dlouhá příprava. Náklady byly financovány z dotací ministerstva financí a ministerstva zdravotnictví. Základní kámen byl položen v roce Vlastní výstavba pak probíhala v letech I přes výrazný nárůst DPH v průběhu realizace se nám podařilo zachovat rozpočet. S novými prostory došlo přibližně ke 30% navýšení počtu výkonů. Velmi populární je naše porodnice. V době otevření nemocnice byla díky populační explozi druhou v kraji po FN Plzeň, co se počtu narozených dětí týče. Nyní zde přijde ročně na svět 500 až 600 novorozenců. Při porodu se rodičkám a jejich přáním snažíme vycházet maximálně vstříc. Pokud jde o zahraniční pacienty, poskytuje nemocnice především akutní péči, tzn. většinu klientely z ciziny tvoří turisté v regionu. Německé pacienty, kteří nepotřebují neodkladnou péči, vozí sanitka do Německa. Po otevření nového objektu byly pronajímány operační sály plastickým chirurgům, jimž německá agentura zprostředkovávala zahraniční klientelu. Ale v tomto případě se jednalo o čistě soukromou aktivitu, kde byla nemocnice pouze smluvním partnerem, resp. pronajímatelem. Jaké klady vidíte na zahájení provozu nové, moderní budovy? A přineslo to s sebou i nějaká negativa? Klady jsou patrné na první pohled. Je zde především nesrovnatelně lepší zázemí a komfort pro pacienty, neboli, jak se dnes říká, vyšší úroveň hotelových služeb. OBSAH Editorial: Na tý louce zelený najdete zajíce a moderní nemocnici A. Vyrutová, T. Tietze, M. Chmátalová Vysokovýkonné sálové centrifugy Avanti JXN M. Máša Nový přístroj HIAC pro měření kvality viskózních kapalin M. Polčík Buněčné kultury, sledování cytopatického efektu a možnost jeho ovlivnění J. Šebek AQUIOS CL první zcela automatizovaný průtokový cytometr na trhu R. Vlček Nová souprava Duraclone B27 pro analýzu na průtokovém cytometru R. Vlček Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii CYTO 2014 ve Fort Lauderdale Sestavte si svůj desetibarevný panel z CE IVD reagencií P. Kružík Nová souprava na stanovení hcg T. Tietze, I. Mičíková Hematurie v klinickém kontextu J. Granátová Prvé skúsenosti s analyzátorom iricell 2000 J. Uhrová Měření hladin vitamínu D mezi zaměstnanci společností Immunotech a Beckman Coulter H. Krátká Setkání uživatelů systémů Beckman Coulter března 2014, Praha-Čestlice I. Mičíková Setkání uživatelů průtokových cytometrů Beckman Coulter května 2014, Mikulov F. Vičar 20. setkání distributorů manuálních imunoanalytických souprav května 2014, Praha H. Krátká Užívateľské stretnutie Beckman Coulter Slovenská republika júna 2014, Vyhne H. Bazovská DNA analýza XI, 10. června 2014, Praha E. Králová Vizitka: Nech brouka žít B. Bubeník, F. Vičar Křížovka Kde se můžeme setkat in vitro diagnostika Časopis vydává a distribuuje Beckman Coulter Česká republika s.r.o., Radiová 1, Praha 10, Časopis připravují Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová Ing. Hana Krátká Mgr. Pavel Kružík Ing. Kateřina Sikorová, Ph.D. Ing. Petr Suchan Mgr. Patrik Šaf RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli Ing. Alena Vyrutová Domažlická nemocnice Mgr. Ing. Tereza Tietze Ing. Marcela Chmátalová RNDr. Martin Máša, Ph.D. RNDr. Martin Polčík, CSc. Mgr. Jaroslav P. Šebek, DiS. Ing. Roman Vlček Mgr. Pavel Kružík Ing. Mgr. Ivana Mičíková MUDr. Jana Granátová Thomayerova nemocnice Mgr. Jana Uhrová FN Trenčín Ing. Hana Krátká Mgr. František Vičar Mgr. Helena Bazovská Ing. Eva Králová MUDr. Boris Bubeník Krevní centrum Ing. Kateřina Kožaná Ivan Šarkan - autor křížovky Ing. Stanislav Čermák - autor tajenky Grafik Jiří Adámek Náklad čísla 2000 výtisků 2 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

3 Na tý louce zelený najdete zajíce a moderní nemocnici Jistou nevýhodu vidím ve větší vzdálenosti od centra města, která někdy trochu komplikuje situaci jak pacientům, tak našim zaměstnancům. Domažlická nemocnice je součástí Zdravotnického holdingu Plzeňského kraje. Jaké výhody toto spojení přináší pro pacienty? Holding je především servisní organizací, nemocnice jinak zůstávají autonomní. Pacienti by tak neměli zaznamenat žádné výrazné změny. Pozitivem by pro naše klienty mělo být jakési administrativní sjednocení zařízení, jež jsou součástí holdingu. V současnosti probíhá například nastavení jednotného objednávacího systému přes internet a všechny nemocnice skupiny včetně naší se připravují na akreditaci. V loňském roce byl ve Vaší nemocnici nainstalován v pořadí již 59. babybox v republice. Dostala se tato informace také na druhou stranu naší hranice, resp. ví německé ženy o této možnosti? A mohou ji vlastně využít? Spolupracujete případně s některými zdravotnickými zařízeními v Německu? Babybox je novinka. Zatím jediné miminko, které se v něm ocitlo, byla při slavnostním otevření panenka pana Ludvíka Hesse, zakladatele a člena občanského sdružení Babybox. Pokud zůstane jediným i nadále, budeme jen rádi. Zda o babyboxu vědí v Německu, netušíme, a ani nevíme, jaká je v tomto smyslu německá legislativa. Náš babybox je primárně určen pro ženy v tísni z našeho kraje. Koneckonců se na jeho zřízení finančně podílela řada obcí či měst z regionu. Pokud jde o provoz nemocnice, máte nějaké zajímavé plány do budoucna? Naší hlavní snahou je udržet základní akutní péči na stejné úrovni a ve stejném rozsahu jako doposud. Ve spolupráci s MUDr. Rostislavem Holečkem, který má v areálu nemocnice urologickou praxi, pak plánujeme rozšíření spektra operací prováděných v nemocnici o některé urologické výkony. S tím už v současné době začínáme Na co jste v rámci své profese ředitelky Domažlické nemocnice osobně nejvíce pyšná? I po letech především na to, že se nám uvedení nové budovy do provozu ze dne na den povedlo bez větší újmy a současně se nám v posledních těžkých letech podařilo nemocnici nezadlužit. Umožňuje Vám Vaše pracovní nasazení pěstovat nějaké koníčky? Jak vlastně ve svém volném čase relaxujete? Pokud zbude trochu volna, potom čtení, sudoku, křížovky a v poslední době také vnouče (i když v tomto případě je pojem relaxace samozřejmě relativní). Nastala doba dovolených. Máte nějaké zajímavé tipy z místního okolí? Samy Domažlice jsou krásné historické město s řadou památek. A okolí města zase nabízí hezkou přírodu. Jsme tu na rozhraní Šumavy a Českého lesa. Za návštěvu stojí třeba Čerchov, vrch s rozhlednou s úžasným výhledem především na německou stranu. Při dobrém počasí lze vidět až Alpy. Směrem k hranicím je obec Babylon s oblíbeným koupalištěm. Rekreuje se tam i řada známých osobností. Další obec Česká Kubice bývaly za první republiky vzdušné lázně. Zajímavé svoji architekturou, historií a folklorem jsou chodské obce, například Klenčí pod Čerchovem, Postřekov, Újezd, Trhanov a další. S místním krajem je neodmyslitelně spjat Jindřich Šimon Baar, pochází odtud Josef Thomayer a Chodsko proslavil Jan Sladký Kozina. Řada turistů sem míří právě za originálním chodským folklórem. Mrákovská hejta, postřekovský masopust, Domažlické slavnosti a další svým věhlasem daleko přesahují hranice regionu. Děkujeme za rozhovor a přejeme, ať si letošní léto těchto místních krás (a samozřejmě i té relaxace) užijete co nejvíce. A ať nemocnici zůstanou věrní nejen zajíci, ale zejména vaši pacienti. ING. ALENA VYRUTOVÁ DOMAŽLICKÁ NEMOCNICE, A.S., KOZINOVA 292, DOMAŽLICE alena.vyrutova@donem.cz TEREZA TIETZE ttietze@beckman.com MARCELA CHMÁTALOVÁ mchmatalova@beckman.com 4 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

4 Vysokovýkonné sálové centrifugy Avanti JXN Včervnu tohoto roku představila společnost Beckman Coulter novou řadu vysokokapacitních a vysokovýkonných sálových centrifug řady Avanti JXN. Na trh byly uvedeny prozatím pouze stěžejní modely Avanti JXN 26 a 30, které navazují na nejoblíbenější typy Avanti J-26 XPI a J-30I. Z těch si zachovávají časem prověřené technologie a přidávají vymoženosti současnosti v podobě grafického softwaru ovládaného přes dotykovou obrazovku a ethernetové připojení. Vysokokapacitní a vysokovýkonné sálové centrifugy bývají standardem v přístrojovém vybavení biochemických a biotechnologických laboratoří. Díky všestrannosti svého použití dokáží pokrýt separační kroky od izolace buněčných organel, virových částic, proteinů, nukleových kyselin z biologických materiálů a expresních systémů až po jejich purifikaci v zonálních gradientech. Tyto sálové centrifugy tak dokáží v mnohém nahradit i výkonné stolní centrifugy, nebo, v případě Avanti J-30I, resp. JXN 30, také sálové ultracentrifugy. Zkumavky V sálových centrifugách Avanti lze pracovat v širokém spektru zkumavek od oblíbených 1,5 ml typu eppendorf přes falkony, odběrové zkumavky až po lahve o objemu 50 ml až 1 litr, kromě toho se dají stáčet rovněž mikrotitrační destičky. Většinu zkumavek a lahví vyvíjí a vyrábí přímo naše společnost, čímž zajišťuje vysokou spolehlivost a bezpečnost při extrémních přetíženích, jaká se v rotorech Ovládání centrifugy z mobilního zařízení dosahují. Známkou značné výdrže materiálu je také to, že se mnohé zkumavky a lahve dají plnit v rozsahu % objemu. To také umožňuje uživateli pracovat s různými objemy vzorků v jednom typu lahví a rotoru bez omezení výkonu. Rotory Beckman Coulter již desítky let vyrábí kovové rotory. Pro řadu Avanti jsou převážně z hliníku ošetřeného antikorozní vrstvou. Vysokovýkonné rotory jsou pak zhotoveny z titanu, jenž se používá výhradně u ultracentrifug. Důvodem, proč naše společnost stále neupustila od produkce kovových rotorů a nepodlehla trendům plastových rotorů potažených vlákny karbonu, je tepelná vodivost kovu a jeho mechanické vlastnosti. Kovové rotory se rychle vychladí a při točení snadno přenášejí tepelnou energii mezi vzorkem a chlazením centrifugy. Teplota vzorku je tak lépe kontrolována nežli v případě použití tepelného izolantu, jakým je plast. Z důvodů mechanických vlastností nejsou tzv. karbonové rotory vhodné pro použití ve vysokootáčkových centrifugách a ultracentrifugách a i ostatní výrobci v těchto kategoriích nabízí výhradně kovové rotory. Ojedinělou službou, kterou Beckman Coulter bezplatně poskytuje, je pravidelná kontrola rotorů našich zákazníků známá pod zkratkou FRIP. Ze statistik těchto kontrol vyplývá, že životnost rotorů našich uživatelů v České republice běžně přesahuje 20 let. Technologie centrifug Avanti Vysokokapacitní sálové centrifugy Beckman se vyrábí déle než 40 let. První modely nesly označení J a J2. Už u těchto typů ze 70. let zavedla naše společnost nadčasová technická řešení, jako je integrace vakuové pumpy pro snížení tlaku vzduchu v rotorovém prostoru. Toto řešení bylo již dříve známo z ultracentrifug Beckman, které za sebou mají mnohem Grafické zobrazení záznamu otáček a teploty delší historii vývoje. Nicméně použitím jejich technologie byly z vysokoobjemových centrifug vytvořeny centrifugy vysokorychlostní. Vakuový systém u řady Avanti, označovaný jako FRS (Friction Reduction System), dovoluje točit rotory na vysoké otáčky při zachování teplotní stability, a to snížením zahřívání při tření molekul vzduchu o povrch rotoru. Chladicí systém tak není namáhán a dokáže snadněji udržovat nastavenou teplotu s výrazně menšími teplotními výkyvy. Snížený tlak v rotorovém prostoru také urychluje akceleraci rotoru. Proto se vakuová pumpa zapíná při roztáčení ve vyšších otáčkách, při udržování nastavených otáček se spouští jen minimálně. Systémy chlazení, vakua a pohonu centrifugy vzájemně spolupracují a jsou v činnosti pouze tehdy, když je to potřeba. Uvedená systémová součinnost vede ke snížení hlučnosti a odběru elektrické energie, ale také tepelného výdeje do okolních prostor. Toto snížení je v obou případech výrazně nižší než u přístrojů jiných výrobců. Výhodou FRS sytému, kterou využije i sám uživatel u modelů řady Avanti, je ta, že lze se všemi rotory točit na maximální možné otáčky, a to při zachování teploty 4 C, což sálové centrifugy ostatních výrobců neumožňují. Technologickým zlomem u modelů Avanti z 90. let bylo nahrazení uhlíkových motorů bezúdržbovými indukčními motory SR (Switched Reluctance). Ty umožnily překročit otáček/min a výrazně zvýšit točivý moment, a zkrátit tak dobu akcelerace a brždění, tudíž i délku celé separace. Modely Avanti obsahovaly na tehdejší dobu řadu technologických inovací jako automatické rozpoznávání rotorů pomocí magnetických bodů a jejich dodatečnou identifikaci zjišťováním momentu setrvačnosti. Dalšími novinkami bylo zavedení HEPA filtrů při práci s biologicky nebezpečným materiálem nebo beztlačítkové otevírání víka centrifugy pomocí pedálu. Nová řada Avanti JXN Série Avanti JXN si z předchozích generací uchovává ta nejlepší léty prověřená řešení. Samozřejmostí je také zachování kompatibility rotorů používaných u předchozích generací. Naši zákazníci tak nemusí s obnovou centrifugy z řady J2, J6 a Avanti J dokupovat kompletní sadu rotorů, ale mohou nadále používat své stávající rotory v nových centrifugách. Centrifugy Avanti JXN skrývají také řadu technických vylepšení v podobě řídicího systému a elektroniky, které nejsou viditelné tak jako velká dotyková obrazovka určená pro zobrazení i nastavení veškerých parametrů přístroje. Software centrifugy Ovládání centrifugy lze zvládnout během chvilky bez nutnosti použití manuálu. Vše potřebné k nastavení separace je umístěno na hlavní obrazovce ve formě číselných polí (rychlost, čas, teplota a rotor) nebo ikonek (uložené programy, historie používání, grafické zobrazení průběhu, start a stop). Aktuální údaje (v číselných hodnotách) o rychlosti, času Avanti JXN 26 Avanti JXN 30 Max. otáčky rpm rpm Max. výkon x g x g Max. kapacita 6 litrů 4 litry Nastavení teploty -10 až +40 C -20 až +40 C Hlavní obrazovka Avanti JXN v průběhu točení a teplotě jsou viditelné také z velké vzdálenosti. Unikátní novinkou je však jejich zobrazení v grafu, a to i zpětně, pro právě probíhající točení nebo jakýkoli záznam z historie. Pro používání přístroje můžete zadat až 50 uživatelských účtů chráněných heslem se 3 úrovněmi přístupů. Tímto způsobem lze omezit ovládání přístroje na vybrané přednastavené programy pro určité uživatele nebo zamezit pokročilému nastavení jinými osobami než administrátorem. Software centrifugy zaznamenává veškerou historii používání, změn nastavení nebo chybových hlášení. Z historie je možné vyčíst, kdy a kým byl přístroj spuštěn, s jakým rotorem a jak vypadal průběh točení. Pro jednotlivé rotory se rovněž ukládají informace o počtu jejich použití. Záznamy historie mohou pojmout až položek a dají se kompletně exportovat přes UBS na paměťové médium. Vzdálené ovládání Centrifugy řady Avanti JXN, ale i ultracentrifugy Optima XPN, lze zapojit do ethernetové sítě a ovládat je vzdáleně z osobního počítače nebo mobilního zařízení s operačním systémem ios či Android. Z jednoho zařízení můžete ovládat nebo monitorovat i několik centrifug současně. Pro běžné počítače probíhá vzdálená správa přes software VNC, chytré telefony a tablety pak používají aplikaci Mobile Fuge. Oba programy jsou volně k dispozici na internetu. Toto vzdálené monitorování a ovládání je užitečné zejména v institucích, kde sdílí více laboratoří jeden přístroj, který je s největší pravděpodobností umístěn na jiném patře, než se nachází laboratoř uživatele. Vzdálené připojení lze použít také k softwarové diagnostice centrifugy servisním technikem, a někdy tak vyřešit určité problémy bez jeho příjezdu. MARTIN MÁŠA mmasa@beckman.com 6 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

5 Nový přístroj HIAC pro měření kvality viskózních kapalin Důležitým parametrem charakterizujícím kvalitu olejů je koncentrace mikročástic. Její zvýšení např. v hydraulickém systému může signalizovat opotřebení přístroje, nebo dokonce jeho poruchu. Proto se v řadě průmyslových odvětví, jako je letecký průmysl či energetika, kvalita těchto kapalin testuje podle příslušných norem. Jednou z novinek v této oblasti, kterou společnost Beckman Coulter dodává od letošního roku, je přístroj HIAC Ten je určen k měření počtu částic ve viskózních kapalinách a odpovídá standardům ISO, NAS, SAE, GOST, DOD a ASTM. Jádrem přístroje je senzor pracující na principu blokování paprsku světla. Zákazník si může zvolit detektor na základě několika parametrů, jimiž jsou rozsah velikosti částic, jejich maximální koncentrace a průtok kapaliny detektorem. Maximální rozsah velikostí (průměrů) činí 0,5 600 µm. Předností nového HIAC 800+ jsou chytré (smart) senzory, jež si pamatují kalibrační křivku a také číslo detektoru a datum kalibrace. Fluidický systém je kompatibilní s kapalinami, jako jsou tryskové palivo JP4, JP5, Obrázek č. 2: Ovládací panel 8 Obrázek č. 1: Přístroj HIAC minerální oleje, éter, alkoholy, ketony, voda a řada dalších. Dovoluje odplynění kapaliny před započetím analýzy, a to pomocí vakua (jde o funkci volitelnou z řídícího software). Použitím přetlaku se tak během měření potlačí vliv bublinek. Přesnost měření je zajištěna automatickým řízením průtoku. Přístroj hodnotí kapaliny v širokém rozsahu viskozity mm 2 /s. Součástí řídícího software je funkce čištění, která proplachuje fluidický systém buď zvoleným objemem kapaliny, nebo tak dlouho, až měřené pozadí klesne ke zvolené hodnotě. Uživatel má rovněž možnost odblokovat fluidický systém přímo z řídícího software. Veškeré ovládání probíhá z konzoly, která je vytvořena s ohledem na reálné podmínky v provozech. Software dovoluje vytvářet také uživatelské protokoly, jež jsou užitečné hlavně při testování. Výstupní hodnoty lze odečíst na displeji. Celý report je rovněž možné exportovat jako soubory ve formátu pdf nebo MS Excel pomocí vstupu USB nebo přes internet, na nějž může být přístroj připojen. Přímo v paměti lze uchovat až reportů. Servis a kalibrace se provádí u zákazníka. Další informace o tomto přístroji a také o dalších zařízeních k měření počtu částic v kapalinách naleznete na stránkách MARTIN POLČÍK mpolcik@beckman.com Buněčné kultury, sledování cytopatického efektu a možnost jeho ovlivnění Úvod V současné době umožňují kultivační techniky pracovat s eukaryotickými buňkami rostlinného i živočišného typu. Nicméně výsadní postavení náleží kulturám živočišným, poněvadž umožňují objasnit nespočet fyziologických, potažmo patofyziologických mechanismů, které měly a stále mají zásadní dopady na lékařské vědy, a to v nejširším slova smyslu. Začátky nebyly jednoduché. Ve 2. polovině 19. století, kdy se pozvolna rozvíjely postupy kultivace mikroorganismů prokaryotického typu, byla možnost pomnožení eukaryotických buněk mimo organismus stále v nedohlednu. Jeden z prvních úspěchů byl zaznamenán začátkem 20. století. Přírodovědec americké národnosti Ross Harrison prokázal, že buňky v optimálním prostředí neztrácely svoje přirozené chování a po nějakou dobu zůstávaly vitální, ač bez možnosti proliferace. V roce 1912 francouzský lékař Alexis Carrel daný problém překonal, čímž prokázal možnost, že buňky lze pěstovat in vitro. Do vhodného roztoku umístil embryonální tkáň zvířete, přičemž hlavní složkou tekutiny byla lymfa pocházející od identického zvířecího druhu doplněná o některé nutriční faktory. Okolnosti obou experimentů tedy upozorňovaly na zásadní význam kultivačního média jako takového. Potřebná koncentrace jednotlivých složek byla zjišťována empiricky a postupem doby se pozvolna zvyšovala kvalita jejich přípravy. Obecně můžeme říci, že nejzákladnějším úkolem média je vůči buňkám udržet stálost vnitřního prostředí, kterou můžeme vyjádřit jako izoionii, izohydrii, izoosmii. Výčet můžeme rozšířit i o izotermii, ač teplota není parametrem, který by se složením tekutiny přímo souvisel. Typy kultur Kultury můžeme členit hned podle několika kritérií. První a snad nejdůležitější z nich zohledňuje způsob růstu, poněvadž buňky mají rozličné nároky na vazbu k pevnému podkladu. U adherentní kultury, u níž se občas můžeme setkat s označením stacionární, jsou buňky přichyceny k pevnému povrchu. Je-li nosičem dno polystyrénové kultivační nádoby s hydrofilní úpravou, vytvářejí buňky souvislou vrstvu, neboli tzv. monolayer. Ten roste i v případech, když dno potáhneme vrstvou kolagenu či fibrinu. V mnohem sofistikovanějších případech mohou buňky adherovat k architektonicky složitějším prostorově uspořádaným povrchům, jimž říkáme scafoldy. Zcela opačným případem je suspenzní kultura. Pro suspenzi je typický volný růst buněk, kdy adhezi zabraňuje kontinuální pohyb média v nádobě. Jiné kritérium klasifikuje kultury podle populační charakteristiky buněk. Na straně jedné totiž rozlišuje kultury buněčné od tkáňových, což jsou termíny bohužel často zaměňované, a na straně druhé kultury primární, sekundární a tzv. stabilizované buněčné linie. Teprve stabilizované linie se standardizovanými vlastnostmi používáme ve většině laboratorních aplikací výzkumného či klinického zaměření. Primární kultura, taktéž primokultura, obsahuje buňky, které mají zvířecí, eventuálně lidský původ a poprvé byly vystaveny podmínkám in vitro mimo prostředí organismu za účelem pomnožení. Pokud migrují z určitého množství celistvé tkáně, považujeme primokulturu současně za kulturu tkáňovou. Několik typů buněk začne nahodile excentricky proliferovat do média, kde pochopitelně vytváří heterogenní populaci. Takovou kulturu můžeme označit za explantační. Pro snadnější založení takové primokultury, obvykle mimo mechanického rozvolnění tkáně, používáme enzymy ve smyslu kolagenázy, trypsinu nebo jiných proteolytických látek, jež během perfuze buňky uvolňují z extracelulárního matrixu. Nepříjemným a nevyhnutelným důsledkem bývá nízké procentuální zastoupení viabilních buněk v takto vyizolované suspenzi, což koresponduje s faktem, že na založení primokultury participuje pouze 5 35 % z jejich původního počtu. Aby se úspěšnost pohybovala ve vyšších číslech, je vhodné použít jako výchozí materiál nádorově transformovanou nebo embryonální tkáň. Mitotická aktivita vede k růstu nových buněk, u nichž ale není nijak pozměněn genotyp. Z primokultury založíme pasážováním sekundární kulturu, pro kterou se občas používá termín diploidní linie, eventuálně buněčný kmen. Nicméně přenos celulárních částic do nového média má svoje specifika. Především u adherentních kultur vytvářející monolayer potřebujeme dosáhnout disociace buněk od pevného podkladu, abychom je mohli přenést do nového prostředí bez zbytečně působícího stresu. K tomu se používá dlouhodobě zavedená technika, při níž chelatační látky ve smyslu EDTA, eventuálně citrátu, vychytávají dvojmocné ionty kalcia i magnézia, které nenahraditelným způsobem přemosťují membránové glykoproteiny s hydrofilním povrchem nádoby za současného spolupůsobení proteolytických enzymů, například trypsinu nebo kolagenázy o nízké koncentraci s přídavkem pufru. Prakticky základním účelem sekundární kultury je z heterogenní buněčné populace obsažené v kultuře primární vyselektovat požadovaný typ a zachovat jej pro nezbytně dlouhou dobu ve viabilním stavu. Nicméně udržovat při životě diploidní linie bývá v laboratorních podmínkách značně limitováno. Valnou většinu kultur vytvářejících monolayer totiž ovlivňuje konfluentní způsob růstu, kdy vzájemné mezibuněčné kontakty navozují depresi mitózy. Pro jev se vžil termín kontaktní inhibice. Neměli bychom opomenout, že stupeň konfluence závisí na typu linie a vzájemně se mezi sebou značně liší. Nicméně hlavní úskalí, které limituje práci se sekundárními kulturami, tkví v tom, že zcela fyziologické autoregulační procesy omezují počet mitóz potažmo pasáží a tím také životnost kultury. Buňky tedy podléhají přirozenému průběhu senescence, taktéž replikativnímu stárnutí, kdy pozvolna nastupuje útlum proliferace. Pochopitelně na počtu dosažitelných pasáží participuje živočišný druh i jeho stáří, z něhož byla odvozena primární kultura. Obecně můžeme říci, že materiál od dlouhověkých zvířat odebraný v raném ontogenetickém období umožňuje nejvíce pasáží. Jejich maximální dosažitelný počet, respektive maximální dosažitelný počet mitóz, je obecně znám jako Hayflickův limit. Z uvedených důvodů vyplývá nutnost založit ze sekundární kultury tzv. stabilizovanou buněčnou linii, u které bylo dosaženo imortalizace. Takovým buňkám náleží plný proliferativní potenciál, a to takřka po neomezenou dobu. Vymaní se tedy z Hayflickova limitu. Stabilizované linie umožňují rozmanité využití ve vědeckých aplikacích nebo diagnostických postupech ve smyslu kultivace virů, určování cytotoxicity rozličných xenobiotik, preklinického testování potencionálních léčiv apod. Počet doposud vytvořených stabilizovaných linií můžeme vyčíslit na několik set. Právě již zmiňovaná skutečnost, že viry pomnožujeme na buněčných modelech, bude předmětem našeho dalšího zájmu. Cytopatický efekt V současné době se v klinické diagnostice vážnějších virových infekcí bohatě využívá molekulárně genetických metod, přesněji řečeno PCR. Používání buněčných kultur k takovému účelu proto pomalu ztrácí na významu. To ovšem neplatí za okolností, kdy nechceme pouze diagnostikovat infekční agens, určit virovou nálož nebo farmakorezistenci vůči virostatickým léčivům, ale sledujeme rozvoj onemocnění na buněčné nebo molekulární úrovni, případně chceme zmapovat jiné doprovodné parametry. Měli bychom si uvědomit, že ne každá infekce umožňuje kompletní průběh replikačního cyklu viru. Z tohoto důvodu nenavozují takové druhy infekcí výraznější změny cytologické struktury. Teprve buňky s přirozenou permisivitou, eventuálně dodatečně navozenou vnímavostí, umožňují průběh reprodukčního cyklu v celém rozsahu, což koresponduje s nástupem cyto- Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

6 patického efektu (CPE). Nákazy perzistentní nebo latentní, které se vyznačují protrahovaným průběhem, doprovází mírný cytopatický efekt. Úplný rozvoj cytopatického efektu nastane až jako následek klasické produktivní infekce. Často bývá pro určité viry infikující určité buňky typický, a efekt tak lze na buněčných modelech využít k diagnostice infekčního agens. Záhy po nákaze zpracovává permisivní buňka mimo vlastní DNA také nukleovou kyselinu viru, což je ve své podstatě počátek patogeneze cytopatického efektu jako takového. Nejprve organely sekreční dráhy syntetizují virové proteiny. Ze začátku jsou nestrukturální s regulační funkcí, posléze indukují přesmyk buněčného metabolismu ve prospěch replikace viru s následnou produkcí proteinů strukturálních. Vazbou napřímo modifikují fyziologické bílkoviny, glykoproteiny, fosfolipidy lokalizované především v cytoplazmatickém kompartmentu, popřípadě sami o sobě podléhají fosforylaci. Změny přednostně postihují podjednotky mikrotubulů, fosfolipidové membrány, iontové kanály, enzymatické komplexy a mnoho dalších molekul. Buňky ztrácejí schopnost reagovat nejen na vnější regulační podněty, ale i na stimuly nitrobuněčné. Nestrukturální proteiny, včetně později produkovaných strukturálních, participují na vzniku inkluzí lokalizovaných jak v cytoplazmě, tak v jádře hostitelské buňky. Vlivem degradace enzymů zpracovávající ATP selhávají iontové pumpy, přičemž v intracelulární tekutině vzniknou posuny v koncentraci minerálů, resp. natria, kalia včetně vodíkových iontů. Buňky pak vlivem nechtěné redistribuce vody postihuje edém související se ztrátou jejich typického tvaru. Pokračující maturace virových částic dále prohlubuje cytopatický efekt, poněvadž fosfolipidové membrány průchodem nově vzniklých virionů fenestrují. Nejvýraznější deformace souvisejí s lysozomálními enzymy. Přesněji řečeno proteolytické enzymy se aktivují v cytoplazmatickém kompartmentu a vlivem postupné ztráty integrity buněčné membrány vznikají cytoplazmatické výběžky, potažmo mnohobuněčné syncytiální útvary. U jádra vedou degenerativní změny k tzv. pyknóze, kdy karyoplazma ztrácí vodu, svrašťuje se a rozpadá na menší útvary. Neodvratnou terminální fází je pak cytolýza. Pozorování cytopatického efektu My se v praktické části zaměříme na cytomorfologii buněčné linie odvozené z lidských embryonálních plic. Po naočkování herpetickými viry HSV-1 a HSV-2 nastupuje rozvoj cytopatického efektu, podle jehož mikroskopického vzhledu můžeme vzájemně odlišit infekci typem 1 a 2. První morfologické změny můžeme pozorovat již po jednom dni, plně se rozvinou přibližně po dvou dnech. Jak již víme, morfogeneze CPE nejvíce koresponduje s poškozením cytoskeletu i buněčných membrán, včetně těch intracelulárních. Při hlubší úvaze se může nabídnout otázka, zda a případně do jaké míry můžeme samotný cytopatický efekt modifikovat, aniž bychom kauzálně zasahovali do replikace viru. K zodpovězení nám mohou napomoci znalosti o léčivech schopných stabilizovat buněčné membrány. Taková vlastnost přísluší esenciálním fosfolipidům, pro něž je typická přítomnost nenasycených mastných kyselin. Inkorporují se do buněčných membrán, kde jim náleží oporná funkce. Následně podněcují k činnosti celou řadu proteinových komplexů asociovaných s fosfolipidovou dvojvrstvou. Především u buněk jaterního parenchymu bylo na buněčných a zároveň biologických modelech prokázáno, že usnadňují regeneraci, urychlují látkovou výměnu molekul, včetně eliminace škodlivých xenobiotik, a proto ve farmakoterapii našly uplatnění jakožto hepatoprotektiva. Pracoval jsem s osmi buněčnými kulturami se základním označením A, B, C, D v takovém uspořádání, aby bylo možné sledovat cytopatický efekt. Bližší specifikaci kultur uvádí tabulka číslo 1. Jsou z ní patrné vzájemné rozdíly z hlediska složení média, typem naočkovaného viru i doby měření cytopatického efektu, které taky budou předmětem vyhodnocení. Pro kultivaci jsem zvolil standardní postup za použití udržovacího média GaP-MEM čili modifikovaného minimálního esenciálního média dle Eaglea. Výrazem udržovací rozumíme takové médium, u něhož bývá glukóza nahrazena galaktózou, popřípadě snížená koncentrace glutaminu. Tím pádem není zcela pokryta energetická spotřeba buněk a mitotická aktivita stagnuje. Naproti tomu bazální metabolismus zůstává plně zachován, což umožňuje nerušený průběh cytopatického procesu. U druhé skupiny buněk jsem použil stejné kultivační médium, ale s přídavkem esenciálních fosfolipidů, které jsou k dostání ve formě komerčně vyráběného doplňku. Součástí roztoku je rovněž cyclodextrin, aby fosfolipidům upravil solubilní vlastnosti. Pro laboratorní práci bylo praktické použít zvláštní kultivační nádoby. Po ukončení kultivace a po kontrole pod inverzním mikroskopem jsem z nich jednoduchou úpravou vytvořil podložní sklíčka vhodné k fixaci a panoptickému barvení (obr. č. 1). Výsledky pozorování a závěr Pro odečet výsledků, tj. cytopatického efektu, kdy je žádoucí eliminovat subjektivní faktory, jsem zvolil software určený ke zpracování digitálních mikrofotografií. Ten dokáže, mimo mnoha jiných funkcí, dle navolených parametrů vybrat stejnorodé plochy a procentuálně je vyčíslit. Může se zdát, že spočítání buněčné plochy bude nejvíce směrodatné. Buněčný povrch však bývá nesourodý, tudíž jej program vyčíslil značně zkresleně. Daleko lepší situace nastala, když byl změřen bezbuněčný povrch. Měl mnohem transparentnější vlastnosti, což umožnilo lepší procentuální vyčíslení, jak je i patrno ze sady ilustrací. Podíváme-li se blíže na hodnoty z tabulky číslo 2, zjistíme, že přídavek esenciálních fosfolipidů vesměs jednoznačný účinek neměl. U buněk naočkovaných HSV-1 byla progrese cytopatického efektu vůči kontrolní kultuře takřka stejná. Důvodem by mohl být fakt, že CPE v tomto případě více koresponduje s tvorbou inkluzí a cytoplazmatických výběžků s nevalným vznikem syncytií. Tudíž stabilizace cytoplazmatické membrány postrádala na významu. Odlišnou situaci, kdy rozdílnost výsledků můžeme označit za signifikantní, můžeme pozorovat u kultury infikované HSV-2, u níž byl rozvoj cytopatického efektu v podobě syncytií značně zpomalen. Druhý typ viru totiž indukuje cytopatický efekt, u kterého přirozeně dominuje tvorba syncitií a na tvorbě takových mnohobuněčných útvarů participuje dezintegrace cytoplazmatické membrány. Zde se můžeme domnívat, že fosfolipidům náležel protektivní efekt, poněvadž částečnou stabilizací se nástup morfologických změn oddálil. Pro uvedenou hypotézu svědčí i následující fakt. Morfologické změny u kultur s HSV-1, kde působily esenciální fosfolipidy, pozbyly typického vzhledu a struktura se začala více podobat cytopatickému efektu navozeného HSV-1. Praktické využití zjištěného účinku esenciálních fosfolipidů, pomineme-li hepatologii, by mohlo nastat u respiračních virových infekcí, pro něž je vznik syncytiálních útvarů vesměs typický. Aplikace ve formě aerosolu přímo do respiračního traktu by tak mohla zmírnit klinické projevy onemocnění. Je ovšem otázkou do jaké míry. Literatura 1. ABBOTT LABORATORIES. Hepatitis: Learning Guide. USA: Abbott Diagnostics,[2011], 66 s. ISBN neuvedeno. 2. BEDNÁŘ, Marek et al. Lékařská mikrobiologie: Bakteriologie, virologie, parazitologie. 1. dotisk. Praha 2: Marvil, 1996, 558 s. ISBN CAMBREX CORPORATION-BIOSCIENCE. Research Products catalog 2007: Cell biology, Bioassays, Cell culture, Molecular Biology, Endotoxin detection. Great Britain: Ambrex Corporation, 2007, 354 s. ISBN neuvedeno. 4. ERBA LACHEMA. Leukodif 200: Souprava k rychlému barvení krevních nátěrů. Brno: Erba Lachema, 2011, 1 s. ISBN neuvedeno. 5. GREENWOOD, David, SLACK, Richard C. B. a PE- UTHERER, John F. Lékařská mikrobiologie: přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita, laboratorní diagnostika a epidemiologie. 1. české. Jiří Schindler. Praha 7: Grada Publishing, 1999, 686 s. ISBN HUSA, Petr. Virové hepatitidy. 1. vyd. Praha: Galén, 2005, 247 s. ISBN MELTER, Oto a MALMGREN, Annika. Principy a praktika lékařské mikrobiologie. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2014, 139 s. ISBN RAJČÁNI, Július a ČIAMPOR, Fedor. Lekárska virológia. 1. vyd. Bratislava: VEDA, vydavatelstvo Slovenskej akadémie vied, 2006, 573 s. ISBN SIGMA-ALDRICH. Cell culture: Manual St. Louis: GJN, 2011, 400 s. Sigma life science. ISBN B. MGR. JAROSLAV P. ŠEBEK, DIS. AESKULAB K.S., NEPOMUCKÁ 159A, PLZEŇ jarda.sebku@seznam.cz Obr: 1a (sestava vhodná pro kultivaci) Obr: 1b (sestava s vyminutým krytem) Obr: 1c (podložní sklíčko po odstranění všech dílů) Označení kultury Kontrola CPE (hod) cytoplazmatické výběžky Virus Udržovací médium syncytium Esenciální fosfolipidy A1 24 A2 48 HSV-1 GaP-MEM ne B1 24 B2 48 HSV-1 GaP-MEM ano C1 24 C2 48 HSV-2 GaP-MEM ne D1 24 D2 48 HSV-2 GaP-MEM ano Tabulka č. 1: Specifikace jednotlivých buněčných kultur Označení Bezbuněčná plocha (%) kultury 24 h 48 h A1 42,01 A2 54,20 B1 39,62 B2 53,38 C1 60,64 C2 75,15 D1 43,15 D2 62,41 Buňky před zahájením kultivace 2,54 Tabulka č. 2: Naměřené hodnoty Obr: 1d (detail cytopatického efektu) Virus HSV-1 HSV-1 HSV-2 HSV-2 Esenciální fosfolipidy ne ano ne ano pyknotické jádro 10 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

7 Buněčná kultura před kultivací Buněčná kultura před kultivací s výpočtem plochy Vzorek A1 První zcela automatizovaný průtokový cytometr na trhu Vzorek A1 s výpočtem plochy Vzorek A2 Vzorek A2 s výpočtem plochy Vzorek B1 Vzorek B1 s výpočtem plochy Vzorek B2 Jak jsme vás již informovali dříve, zabývala se naše společnost vývojem prvního zcela automatizovaného a bez nadsázky revolučního typu průtokového LOAD & GO cytometru AQUIOS CL. Ten je určen pro klinické použití bez nutnosti obsluhy specializovaně vyškoleným personálem v technických aspektech průtokové cytometrie. V současné době je tento systém uvolněn na trh jako CE IVD a je dostupný rovněž v České republice a na Slovensku. AQUIOS CL zcela automaticky, bez nutnosti jakýchkoliv manuálních intervencí, zpracovává vzorek od vložení zkumavky až po vydání výsledků. Pracuje přímo s primárními zkumavkami v kazetách (stojáncích), čte čárový kód zkumavky a následně pak propíchnutím septa aspiruje krev. Zkumavky lze v kazetách vkládat kontinuálně, tj. kdykoliv během již probíhajícího zpracování předcházejících vzorků. Systém poté zcela automaticky přidá protilátky, inkubuje, napipetuje lyzační roztok a změří vzorek. Výsledky jsou uloženy v software přístroje a jsou automaticky, nebo po jejich validaci obsluhou odesílány do LIS. AQUIOS CL umožňuje obousměrnou komunikaci s LIS, čímž usnadňuje zadávání vzorků/zkumavek. Je rovněž vybaven manuálním portem pro aspiraci z jedné otevřené zkumavky, nebo pro případ statimového požadavku na vzorek. Jedná se tak o první průtokový cytometr na trhu, který je určen pro zpracování rutinních vzroků pro imunofenotypizaci lymfocytů 24 hodin denně 7 dní v týdnu. Díky tomu je možné jej použit v core laboratořích. Zároveň umožňuje laboratornímu personálu věnovat se jiným specializovaným analýzám. V současné době jsou k dispozici soupravy Tetra 1 a Tetra 2+, které budou brzy doplněny o další znaky lymfocytů (zejména HLA-DR, CD34 a další). Tetra 1 a Tetra 2+ jsou určeny pro stanovení subpopulací lymfocytů v periferní krvi. Zahrnují tyto znaky: CD45/CD4/CD8/CD3 a CD45/ CD16+56/CD19/CD3, a to včetně stanovení absolutních počtů subpopulací lymfocytů bez nutnosti přidání kalibračních partikulí. Pro bližší informace o prvním LOAD & GO cytometru AQUIOS CL na trhu nás, prosím, kontaktujte, nebo navštivte stránky ROMAN VLČEK rvlcek@beckman.com Vzorek B2 s výpočtem plochy Vzorek C1 Vzorek C1 s výpočtem plochy Vzorek C2 Vzorek C2 s výpočtem plochy Vzorek D1 Vzorek D1 s výpočtem plochy Vzorek D2 Vzorek D2 s výpočtem plochy 12 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

8 Nová souprava Duraclone B27 pro analýzu na průtokovém cytometru Vminulém čísle tohoto časopisu jsme vás seznámili s unikátními vlastnostmi reagencií Duraclone, kdy je na dno cytometrické zkumavky nakoutována vysušená protilátka(y) včetně fluorochromů, a to bez jakékoliv ztráty funkčnosti. Použití soupravy Duraclone je pro obsluhu nesmírně snadné, neboť nemusí dělat nic jiného než přidat vzorek (krev), ten zinkubovat, následně zlyzovat a změřit. Odpadá tak jakékoliv skladování a pipetování protilátek. Nové monoklonální protilátky jsou určeny jak pro základní cytometry se 488nm laserem, tak pro systémy vybavené červeným nm, žlutým 561nm a fialovým 405nm laserem. Objednávkové číslo Společnost Beckman Coulter se coby zlatý sponzor zúčastnila konference CYTO Ta se konala ve dnech května 2014 ve Fort Lauderdale. Na své expozici představila průtokový cytometr Gallios s akvizičním software Kaluza G, nejnovější verzi sorteru Astrios EQ a klinický cytometr Aquios CL. Současně byl prezentován nový cytometr pro základní výzkum s názvem CytoFlex. Souprava Duraclone B27 slouží k diagnostice in vitro (CE IVD). Kromě výše zmíněné jednoduchosti použití vyniká zejména extrémně vysokou specificitou stanovení dosahující 95,5 %. Je možné ji využít až pro 50 testů. Každá zkumavka na svém dně obsahuje vysušenou protilátku anti-cd3, anti-hlab27 (klon ABCm3) a navíc také klon (FD705), protilátku anti-hlab7 (není značena žádným fluorochromem) a zároveň vnitřní standard v podobě kalibračních kuliček. Standardní protokol vyžaduje přidání 25 ul krve, inkubaci a lýzu lyzačním činidlem, které je součástí soupravy. Výsledkem stanovení je jednoznačné určení pozitivity, respektive negativity porovnáním meanu signálu B27 a jeho komparací s referenční hodnotou soupravy. Tato souprava je tak vhodná zejména jako konfirmační stanovení v případě nejasného výsledku po změření konvenčními soupravami, nebo jako rutinní test v cytometrické laboratoři. Je určena pro průtokové cytometry Cytomics FC 500, Navios (Beckman Coulter) a FACSCalibur a FACScan (BD). Nevyžaduje chlazení, je skladována při laboratorní teplotě. Souprava Duraclone B27 (PN B36862) je od června 2014 standardně dostupná na našich skladech. CD3 HLA B27 HLA B27 HLA B7 klon UCHT1 ABCm3 FD705 BB7.1 fluorochrom PE-Dyomix649 PE PE - emisní vlnová délka (nm) detektor FC500/Navios FL4 FL2 FL2 - detektor FACScan a BD FACSCalibur FL3 FL2 FL2 - BD FACScan a BD FACSCalibur jsou ochranné známky společnosti Becton Dickinson and Company. Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii Fluorochrom Klon Izotyp Objem B46023 CD2 ECD 39C1.5 IgG2a Rat 0,5 ml B46024 CD56 APC-Alexa Fluor 750 N901 IgG1 Mouse 0,5 ml B46025 CD197 PC7 G043H7 IgG2a Mouse 0,5 ml B43299 CD200 PC7 OX-104 IgG1 Mouse 0,5 ml B43301 CD200 APC-Alexa Fluor 750 OX-104 IgG1 Mouse 0,5 ml B42021 HLA-DR APC-Alexa Fluor 750 Immu-357 IgG1 Mouse 0,5 ml B46034 IFN-gamma Pacific Blue IgG1 Mouse 0,5 ml CYTO 2014 ve Fort Lauderdale Tento přístroj je výsledkem akvizice čínské firmy Xitogen. Tato společnost vyvinula nový typ průtokového cytometru s rozlišením částic až do 100 nanometrů virů, bakterií, mikropartikulí a buněčných organel. Jedná se o modulární systém, který může být ze základní verze s jedním laserem a 4 detektory rozšířen až do konfigurace se 3 lasery a 16 detektory. Pro více informací navštivte stránky nebo nás, prosím, kontaktujte. ROMAN VLČEK rvlcek@beckman.com Sestavte si svůj desetibarevný panel z CE IVD reagencií V naší nabídce naleznetevíce než 200 reagencií ve formátu CE IVD, převážně monoklonálních protilátek konjugovaných různými fluorochromy. Z těch je možné skládat podle potřeby různé,až desetibarevné panely. Tyto monoklonální protilátky jsou ve formátu CE IVD dostupné nejenom se základními fluorochromy pro modrý laser (FITC, PE, ECD, PC5, PC.5, PC7), ale také s flurochromy APC, APC-Alexa Fluor 700, APC-Alexa Fluor 750, Pacific BlueTM a Krome Orange. Laser Obj.číslo Fluorochrom počet testů Klon fialový B36294 CD45 Krome Orange CE IVD 100 J.33 fialový A74764 IgG1 Pacific Blue CE IVD Mc7 fialový B36296 CD11b Pacific Blue CE IVD 50 Bear1 fialový B36292 CD16 Pacific Blue CE IVD 50 3G8 fialový A74763 CD45 Pacific Blue CE IVD 100 J.33 fialový B36286 HLA-DR Pacific Blue CE IVD 50 Immu-357 červený A79393 IgG1 APC-Alexa Fluor 750 CE IVD Mc7 červený A94680 CD3 APC-Alexa Fluor 750 CE IVD 50 UCHT1 červený A94682 CD4 APC-Alexa Fluor 750 CE IVD 50 13B8.2 červený A94683 CD8 APC-Alexa Fluor 750 CE IVD 50 B9.11 červený B36295 CD11b APC-Alexa Fluor 750 CE IVD 50 Bear1 červený A94681 CD19 APC-Alexa Fluor 750 CE IVD 50 J3-119 červený A79392 CD45 APC-Alexa Fluor 750 CE IVD 100 J.33 červený A79391 IgG1 APC-Alexa Fluor 700 CE IVD Mc7 červený B36290 CD7 APC-Alexa Fluor 700 CE IVD 50 8H8.1 červený B36293 CD22 APC-Alexa Fluor 700 CE IVD 50 SJ10.1H11 červený A79390 CD45 APC-Alexa Fluor 700 CE IVD 100 J.33 červený IM2475 IgG1 APC CE IVD Mc7 červený A12693 IgG2a APC CE IVD 100 7T4-1F5 červený IM2467 CD3 APC CE IVD 100 UCHT1 červený IM2468 CD4 APC CE IVD B8.2 červený IM2469 CD8 APC CE IVD 100 B9.11 červený IM2580 CD14 APC CE IVD 100 RMO52 červený IM2470 CD19 APC CE IVD 100 J3-119 červený A21693 CD20 APC CE IVD 100 B9E9 červený IM2471 CD33 APC CE IVD 100 D3HL červený IM2472 CD34 APC CE IVD červený IM2473 CD45 APC CE IVD 100 J.33 červený IM2474 CD56 APC CE IVD 100 N901 (NKH-1) červený B36287 CD79a APC CE IVD 100 HM47 červený B36300 CD117 APC CE IVD D2D1 Rozplňování velkého množství monoklonálních protilátek do cytometrických zkumavek lze automatizovat pomocí pipetovacího automatu Biomek 4000 ACP. Software umožňuje uživateli předdefinovat panely protilátek podle své potřeby, včetně pipetovaných objemů, a poté je velmi rychle volit pro použití. Další možností výroby těchto koktejlů je formát DuraClone v rámci programu Custom Design Service. PAVEL KRUŽÍK pkruzik@beckman.com 14 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

9 Nová souprava na stanovení hcg Hematurie v klinickém kontextu Vpolovině letošního roku uvádí společnost Beckman Coulter na trh novou soupravu na stanovení celkové beta podjednotky hcg (Total beta hcg). Tato souprava je jako první na trhu navázaná na 5. mezinárodní normu (IS) WHO pro choriogonadotropin NIBSC kód 07/364. Jejím dalším přínosem je minimalizace interakcí v nízkých hodnotách pomocí blokačního pufru. To ocení především laboratoře využívající stanovení jako statimovou detekci těhotenství, případně ke sledování onkologických pacientů. Jsme si vědomi závazku plynoucího z našeho postavení coby jedničky na trhu prenatálního Parametry soupravy: Formát Podklady pro objednání: PN A85264 B krokový sandwich Standardizace 5. IS WHO NIBSC 07/364 Množství vzorku 25 µl Rozsah stanovení bez ředění Rozsah stanovení s automatickým ředěním Doba stanovení Hook effect Stabilita kalibrace Stabilita reagencie v přístroji screeningu vývojových vad ve 2. trimetru, proto poskytujeme zájemcům hodnoty pro stanovení v těhotenství. Mediány byly získány multicentrickým stanovením ve 2 velkých screeningových centrech. TEREZA TIETZE ttietze@beckman.com IVANA MIČÍKOVÁ imicikova@beckman.com 0, IU/L IU/L Název 18 min není do IU/L 28 dní 28 dní ACCESS Total b-hcg 5IS, 2x50 tests ACCESS Total b-hcg 5IS Calibrator set Hematurie (HU), neboli přítomnost krve v moči, může být zdrojem obav pacienta, u dětí také jejich rodiny a ošetřujícího lékaře. Je třeba správně zhodnotit příčinu a závažnost nálezu. Základní otázkou je, zda je hematurie příznakem klinicky významného onemocnění ledvin. K tomu může být přínosná znalost klinického kontextu jaká onemocnění přicházejí diferenciálně diagnosticky v úvahu, s jakou pravděpodobností, s jakými riziky, co je nutné vyšetřit a co dále sledovat. Je nutné zhodnotit, v jakém věku se hematurie objevila, zda se jedná o formu jednorázovou/přechodnou (tranzientní)/přetrvávající (perzistentní), mikroskopickou/makroskopickou, asymptomatickou/symptomatickou, izolovanou/s proteinurií či zda je glomerulárního/neglomerulárního typu. Příčinou hematurie mohou být onemocnění ledvin (glomerulů i tubulointersticia), vývodných močových cest, nebo extrarenální důvody: 1) renální hematurie a) glomerulární onemocnění: (proliferující) glomerulonefritis (nejčastěji IgA nefropatie, ale také jiné glomerulonefritidy), systémová onemocnění a vaskulitidy, hereditární (syndrom tenkých membrán, Alportův syndrom) b) tubulointersticiální onemocnění: akutní nefritidy, akutní obstrukce, hydronefróza, akutní tubulární nekróza c) vaskulární příčiny: maligní hypertenze, trombóza nebo embolie renální cévy d) jiné: tumory (Grawitzův, Wilmsův), cysty, nekróza papily, trauma, konkrement 2) postrenální hematurie e) onemocnění vývodných močových cest: urolitiáza, onemocnění prostaty (benigní hyperplazie, prostatitis, karcinom), uroteliální karcinom, infekce močových cest (nejčastěji cystitis), trauma, tbc, malformace, postradiační zánět, píštěle f) arteficiální iatrogenní: po biopsii prostaty, při zavedeném permanentním močovém katetru g) metabolické příčiny: hyperkalciurie, hyperurikosurie 3) extrarenální hematurie h) polékové: předávkování warfarinem nebo kyselinou acetylosalicylovou; samotná terapie warfarinem nebývá příčinou hematurie, až 80 % hematurií u pacientů s terapií warfarinem je způsobeno současnou infekcí močových cest (1) i) hematologická onemocnění (polycytémie, leukémie), krvácivé stavy j) jiné: po namáhavém cvičení, při horečce Obrázek č. 1: Nejčastější etiologie hematurie podle věku a trvání Modře jsou znázorněny nejčastější příčiny. BHP = benigní hyperplazie prostaty. Zdroj: Hematurie sama o sobě nepředstavuje pro pacienta bezprostřední ohrožení, nejedná-li se o masivní extrarenální krvácení, kdy případná koagula ve vývodných močových cestách mohou zablokovat odtok moče. Hematurie se vyskytuje poměrně hojně. Zejména u dětí a mladších jedinců do 35 let bývá často přechodným a klinicky nevýznamným nálezem. Avšak u pacientů nad 35 let může být i přechodná HU příznakem malignity. Panel vyšetřovacích metod zahrnuje kromě standardního chemického a morfologického vyšetření moče ještě její vyšetření mikrobiologické, aby se tak vyloučila infekce močového ústrojí. Dále jde o vyšetření erytrocytů ve fázovém kontrastu k posouzení dysmorfních erytrocytů, eventuálně přítomnosti akantocytů, stanovení kreatininu a albuminu v séru/plazmě, C3 složky komplementu, ANA, ASLO, KO + diff., proteinurii (PCR), exkreci kalcia močí (U-Ca/U-kreat.), albuminový index v moči (U-albumin/u-celková proteinurie), proteinové močové indexy (8), zobrazovací metody (ultrasonografii, CT, cystoskopii, cytologické vyšetření, v indikovaných případech renální biopsii). Je-li přítomna močová infekce, je doporučeno zopakovat vyšetření po 6 týdnech. U negativního nálezu není třeba dalšího sledování. Jako mikroskopickou HU označujeme pouze pozitivní reakci na krev močovým reagenčním proužkem s přítomností 5 10 a více erytrocytů/µl moče. Reagují nejen erytrocyty, ale rovněž volný hemoglobin (z rozpadlých erytrocytů nebo při intravaskulární hemolýze) a myoglobin (při kontuzi svalů nebo rhabdomyolýze). Falešně pozitivní odezva na krev může být pozorována při kontaminaci ejakulátem nebo oxidujícími dezinficiens, při alkalickém ph vyšším než 8, nebo může být krev gynekologického původu (např. v období kolem menses, u onemocnění děložního čípku, vaginitis, endometriózy), či se může objevit po namáhavém cvičení, při horečce, viróze, ale také arteficiálně při simulaci. Při makroskopické HU je moč zbarvena viditelně růžově, červenohnědě až do barvy Coca-coly. Odstín moče nemusí odrážet množství krve barevná změna je viditelná při příměsi 1 ml krve/l moče. Zbarvení moče může být způsobeno také léky (doxorubicin, ibuprofen, nitrofurantoin, rifampicin, fenolftalein, chloroquin, fenazopyridin), barvivy z po- 16 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

10 Obrázek č. 2: Glomerulární HU s dysmorfními erytrocyty a akantocyty ve fázovém kontrastu a v elektronovém mikroskopu Zdroj: (1, 3) travy (červená řepa, ostružiny, potravinářská barviva) a metabolity (žlučovými pigmenty, methemoglobinem, porfyriny, uráty ve vysoké koncentraci, kyselinou homogentisovou nebo tyrozinem). Falešně negativní reakce byly pozorovány při velmi vysoké koncentraci kyseliny askorbové v moči. Glomerulární HU je způsobena prostupem erytrocytů skrz glomerulární bazální membránu poškozenou imunitně zprostředkovanou reakcí (glomerulonefritidy), nebo morfologickými změnami (syndrom tenkých membrán, Alportův syndrom). Glomerulární typ HU je pravděpodobný, je-li přítomna rovněž proteinurie, aktivní močový sediment (erytrocytární válce, dysmorfní erytrocyty, eventuálně akantocyty, granulované, hyalinní a buněčné válce viz obrázek č. 2) a renální insuficience. Jejich absence však nevylučuje glomerulární onemocnění. Jsou-li u glomerulárního onemocnění přítomny hematurie i proteinurie, objevují se v časově srovnatelnou dobu. Pokud se u pacienta s proteinurií objeví hematurie výrazně později, neměla by být vysvětlována již diagnostikovaným glomerulárním onemocněním a je třeba pátrat po urologické příčině, nebo po jiném onemocnění. Samotná hematurie nevede k významnému zvýšení exkrece bílkovin močí, při vyšetření moče chemicky nebývá reakce na přítomnost bílkoviny vyšší než 1. Hematurie u dětí Hematurie je u dětí poměrně častým nálezem. Uvádí se, že 3 4 % dětí ve věku 6 15 let mělo někdy pozitivní reakci na krev při vyšetření moče chemicky, pouze 1 % z nich však opakovaně a jen u 1/3 z těchto opakovaných nálezů se jednalo o perzistentní mikroskopickou HU (opakovaně pozitivní po 6 měsících). Kombinace hematurie a proteinurie u neselektované školní populace byla výrazně nižší (0,7 %) (3). MikroHU u dětí může mít benigní i závažné příčiny (7). Mikroskopická hematurie u dětí Nejčastějším nálezem je asymptomatická izolovaná mikrohu, jejíž příčinu se až u 1/3 dětí nepodaří objasnit. Tranzientní HU bývá nejčastěji způsobena infekcí, horečkou, traumatem nebo po cvičení. Pokud přetrvává, je třeba doplnit o mikrobiologické vyšetření, exkreci kalcia močí a vyšetření hematurie u přímých příbuzných. Nejčastějšími příčinami perzistentní HU trvající více než 6 měsíců jsou glomerulopatie, zejména IgA nefropatie a syndrom tenkých membrán (TBM), méně hereditární nefropatie (nejčastěji Alportův syndrom), infekce močových cest, hyperkalciurie, poststreptokoková glomerulonefritida a malformace. Hematurie přetrvává různě dlouhou dobu. Renální biopsie se standardně u izolované mikrohu neprovádí (ani v případě, je-li perzistentní) vzhledem k tomu, že má většina onemocnění benigní průběh. Je indikována při vzestupu kreatininu, proteinurii, nevysvětlitelném vzestupu krevního tlaku (i v rámci normálních hodnot) a při obavách rodičů. Je zvažována u mikrohu s rodinnou historií selhání ledvin v časné dospělosti u příbuzných 1. linie. V histologických nálezech u izolované mikrohu bývá téměř u poloviny vyšetřených dětí normální nález, u třetiny TBM nebo IgA nefropatie. I když je diagnostikována IgA nefropatie, má v dětském věku minimální riziko progrese. Proteinurie se vůbec neobjeví, nebo až po letech.iga nefropatie se často projeví epizodami makrohu po infekci dýchacích cest nebo po gastrointestinálním onemocnění, mívá negativní rodinnou anamnézu. V dalším průběhu se může vyskytovat mikrohu. V histologickém nálezu dominují typická globulární depozita IgA v mesangiu, ne v glomerulární bazální membráně (viz obrázek č. 3). Hyperkalciurie a hyperurikosurie u jedinců s hematurií jsou častým nálezem. Hyperkalciurie byla prokázána v různých studiích u 30 % školních dětí, hyperurikosurie pak až u 20 %. Tyto metabolické dysbalance jsou rizikovým faktorem vzniku urolitiázy % dětí s hyperkalciurií a/nebo hyperurikosurií mělo v rodinné anamnéze urolitiázu. Dietní opatření, případně terapie thiazidy nebo allopurinolem snižují riziko urolitiázy (3). Podrobnější vyšetření je třeba, pokud se objeví hypertenze, makrohu, celkové příznaky nebo proteinurie. Dětští pacienti s asymptomatickou mikrohu a s proteinurií vyšší než 4 g/m 2 /h by měli být vyšetřeni dětským nefrologem vzhledem k vysoké pravděpodobnosti významného onemocnění ledvin. Při nižší proteinurii je doporučeno opakovat vyšetření za 2 3 týdny. Děti s glomerulární mikrohu kromě dysmorfních erytrocytů a erytrocytárních válců mývají často proteinurii vyšší než 100 mg/m 2 /h (je-li vyloučena ortostatická proteinurie). Symptomatickou mikrohu může provázet horečka, slabost, úbytek hmotnosti, otoky, vyrážka, atritis, dysurie, oligurie. Příčinou mohou být lupusová nefritis nebo Henoch- Schönleinova purpura (IgA vaskulitida), poststreptokoková glomerulonefritida, intersticiální nefritis, nefrolitiáza, tumory, vaskulární onemocnění, infekce. Je doporučeno vyšetřit sérový kreatinin, C3 složku komplementu, KO + diff., ASLO, ANA a proteinurii. Makroskopická hematurie u dětí V tomto případě je potřeba vyloučit jiné příčiny zbarvení (léky, potraviny, volný hemoglobin a myoglobin). Převažuje mírně neglomerulární HU nad glomerulární (37 % versus 29 %). Nejčastějšími příčinami neglomerulární HU byly infekce vývodných močových cest, iritace perinea, trauma (celkem 45 %), kongenitální anomálie včetně vezikoureterálního refluxu, urolitiáza. Při glomerulární HU se nejčastěji jednalo o IgA nefropatii a Alportův syndrom. U 35 % dětí s makrohu se příčinu nepodařilo zjistit (2). Familiární mikrohematurie představuje jak klinicky, tak geneticky velmi heterogenní skupinu. Může být asymptomatická, izolovaná nebo s proteinurií, s normální či různě sníženou renální funkcí. Obvykle bývá multifaktoriální a v její etiopatogenezi se uplatňují rovněž genové modifikátory a faktory prostředí. Příčinou může být až v 80 % případů TBM, u 15 % Alportův syndrom (X-vázaný i autozomálně dominantní), u necelých 5 % hyperkalciurie nebo hyperurikosurie, vzácně C3 glomerulopatie nebo glomerulopatie s fibronektinovými depozity. Alportův syndrom jako X-vázané hereditární onemocnění se projevuje u mužů progredující ztrátou sluchu (zpočátku ve vysokých frekvencích), renální insuficiencí s mikrohu a očními abnormitami. Renální insuficience se objevuje kolem 20. roku věku a progreduje rychle do selhání ledvin ve 4. deceniu. Heterozygotní ženy přenašečky mají mikrohu bez renální insuficience, mohou mít mírné poruchy sluchu. Existuje však také autozomálně dominantní forma onemocnění, která postihuje obě skupiny. Genetickými abnormitami jsou u X-vázané formy mutace v genu pro alfa-5-řetězec kolagenu IV (COL4A5, chromozom Xq22.3), mohou se však vyskytovat autozomální formy, které mají mutace v genech pro COL4A a COL4A3 (chromozom 2q36.3) (5). Mutace způsobí tvorbu defektních řetězců, jež jsou následně degradovány, tj. nedojde k vytvoření komplexu α3,4,5 molekul kolagenu IV v bazální membráně. Díky tomu je bazální membrána více náchylná k proteolýze, což se morfologicky projeví v histologickém nálezu typickým ztenčením, fragmentací a laminací glomerulární bazální membrány. Syndrom tenkých membrán (TBM) se projevuje pouze u mikrohu, bez očních změn, hluchoty a bez renální insuficience. Dříve se uvádělo, že se jedná o zcela benigní onemocnění. Dnes je známo, že onemocnění zcela benigní není. Jedinci s TBM sice měli v dlouhodobém sledování do let věku pouze mikro- HU, avšak do 40 let věku se až u 70 % z nich objevila proteinurie, u % pak progredovalo onemocnění do selhání ledvin (5). TBM vykazuje v elektronovém mikroskopu charakteristické ztenčení strukturně normální glomerulární bazální membrány (viz obrázek č. 5). Uvádí se, že TBM může být až v 50 % případů heterozygotní formou autozomálně recesivního Alportova syndromu s mutacemi v genech COL4A3 a COL4A4. Poznatky z posledních let ukazují, že tzv. benigní familiární hematurie není benigní, protože v dlouhodobém sledování u více než poloviny jedinců progreduje do renální insuficience různého stupně (5, 6). Je-li však spojena s proteinurií nižší než 0,5 g/d, prognóza bývá velmi dobrá. Obrázek č. 3: IgA nefropatie A: V elektronovém mikroskopu jsou patrná elektron-denzní depozita (D) v mesangiu, glomerulární bazální membrána (GBM) je normální, nejsou zjevná depozita v cévní stěně. Endo = jádro endoteliální buňky. B: Imunofluorescenční vyšetření. Zdroj: (1, 3) 18 Obrázek č. 4: Alportův syndrom, hereditární nefritis V elektronovém mikroskopu vlevo můžete pozorovat normální glomerulární bazální membránu, vpravo jsou patrné fragmentace se ztenčenou glomerulární bazální membránou a její laminace. GBM = glomerulární bazální membrána, endo = endotelová buňka. Zdroj: (3) Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

11 Obrázek č. 5: Syndrom tenkých membrán V elektronovém mikroskopu vlevo normální bazální membrána, vpravo ztenčená při TBM. Zdroj: (3) Hematurie u dospělých Hematurie, u níž není nalezena jednoznačná příčina, je u mnoha dospělých, zejména mladšího věku, poměrně častá, přechodná a bez následků. V populační studii zahrnující 2,5 miliónu jedinců různého věku bylo zjištěno, že u 40 % z nich se vyskytla v průběhu života asymptomatická hematurie, u 2/3 opakovaně, u 1/3 jako tranzientní (1). V jiné populační studii s 56 tisíci dospělých jedinců různého věku byla pozorována mikrohu u 0,7 % případů. Po 6 letech sledování u 44 % z nich HU vymizela, u 44 % přetrvávala dále bez proteinurie, pouze u 12 % se objevila proteinurie. U nikoho nedošlo k vývoji renální insuficience. Nicméně u jedinců s hematurií a proteinurií vymizela HU pouze u 16 % a renální insuficience se objevila u 15 % (1). U pacientů s glomerulární mikrohu je renální biopsie indikována pouze v přítomnosti rizikových faktorů progrese onemocnění (zvýšení sérového kreatininu, proteinurie, nová hypertenze). Není nutná u izolované mikrohu, neboť nález u většiny pacientů neovlivní celkový přístup k onemocnění. Většina nemocných je pouze dlouhodobě sledována. V histologickém obrazu bývá normální nález, TBM (až 40 %), IgA nefropatie (20 30 %), mírné abnormity nebo vzácněji Alportův syndrom. Častou příčinou asymptomatické mikrohu u dospělých, stejně jako u dětí, bývá hyperkalciurie a hyperurikosurie. Je-li přítomna neglomerulární makroskopická HU nebo mikroskopická HU nevysvětlitelného původu, jsou doporučeny zobrazovací metody. Cystoskopii by měli podstoupit všichni pacienti s makroskopickou HU, dále všichni s mikroskopickou HU nad 35 let, i tranzientní po vyloučení benigních příčin (menstruace, infekce, léky, cvičení, viróza, trauma, nedávné urologické vyšetření), a dále osoby s mikroskopickou HU a rizikovými faktory pro vznik uroteliálního karcinomu bez ohledu na věk. Rizikovými faktory jsou věk nad 35 let, kouření (a jeho délka), expozice benzenem, aromatickými aminy (tiskaři, malíři, pracující s herbicidy), makrohu v anamnéze, chronická cystitis, radiace malé pánve, anamnéza cizího tělesa v močovém měchýři, terapie cyklofosfamidem, abúzus analgetik (analgetika jsou rizikovým faktorem i pro karcinom ledviny), mužské pohlaví. Uroteliální karcinom z přechodného epitelu se může vyskytovat současně na více místech močového ústrojí. Je-li diagnostikován primárně při cystoskopii karcinom močového měchýře, je nutné vyloučit karcinom horního typu (ledvinné pánvičky a ureteru) a obráceně. U 37 % nemocných byl při cystoskopii diagnostikován primární karcinom močového měchýře a sekundární karcinom horního typu. U 51 % pacientů s karcinomem horního typu byla stanovena sekundární malignita močového měchýře (1). Cytologické vyšetření má vysokou senzitivitu (90 %) pro uroteliální karcinom močového měchýře, avšak nízkou (maximálně 65 %) pro karcinomy ureteru a pánvičky, vzhledem k tomu, že se často jedná o low-grade tumory. Jak tedy postupovat u dospělých jedinců s hematurií? U osob s asymptomatickou mikrohu je doporučeno zopakovat vyšetření po 3 měsících. Je-li přítomna infekce močových cest, pak po jejím zaléčení. Nepodaří-li se identifikovat příčinu a jedná-li se o perzistentní HU, nebo jedince s rizikovými faktory, je potřeba vyloučit malignitu a metabolickou dysbalanci (hyperkalciurii, hyperurikosurii). Perzistuje-li HU, je nutné 1x ročně vyšetřit moč chemicky a morfologicky a po 3 5 letech zopakovat komplexní vyšetření. Je-li přítomna i proteinurie, je zapotřebí doplnit vyšetření o kreatinin a kvantitativní proteinurii, eventuálně zopakovat vyšetření po 2 3 týdnech a podle výsledku zvážit nefrologické vyšetření. U makrohu je třeba vyloučit zejména malignitu, trauma, infekci, litiázu a pravděpodobnost glomerulárního onemocnění (mikrobiologické vyšetření, exkrece kalcia a kyseliny močové, rodinná anamnéza, zobrazovací metody), u podezření na glomerulární onemocnění konzultovat stav s nefrologem. Literatura: 1. Feldman A.S., Hsu Chi-yuan, Kurz M., Cho K.C.: Etilogy and evaluation of hematuria in adults, Febr. 2. Gagnadoux M.F.: Evaluation of gross hematuria in children. 3. Gagnadoux M.F.: Evaluation of microscopic hematuria in children. 4. Amore A.S.: Early detection of microscopic hematuria in adolescent and young adults, 50th ERA-EDTA Congress, Istanbul, Deltas C.: The role of molecular genetics in diagnosing familial hematuria, 50th ERA- EDTA Congress, Istanbul, Praga M.: Diagnosis of renal disease in adults before too late referral, 50th ERA- EDTA Congress, Istanbul, Quigley R.: Evaluation of hematuria and proteinurie: how should a pediatrician proceed? Current Oppinion in Pediatrics 2008, 20: Granátová J.: Indikátorové proteiny v moči (3) vyšetřování hematurie, In vitro diagnostika 2009, 10: 31 37, Beckman Coulter. MUDR. JANA GRANÁTOVÁ ODDĚLENÍ KLINICKÉ BIOCHEMIE, THOMAYEROVA NEMOCNICE, VÍDEŇSKÁ 800, PRAHA 4 jana.granatova@ftn.cz Prvé skúsenosti s analyzátorom iricell 2000 Vo februári 2014 bol na našom Oddelení klinickej biochémie, hematológie a mikrobiológie Fakultnej nemocnice Trenčín inštalovaný močový analyzátor iricell 2000 od spoločnosti Beckmann Coulter. Zástupcami firmy som bola požiadaná o tento malý príspevok, cieľom ktorého nie je popisovať technické parametre analyzátora, ale zamerať sa na vlastné skúsenosti z jeho prevádzky. O čom hovoríme Močový analyzátor iricell 2000 je kombináciou modulu ichem Velocity, ktorý meria fyzikálne vlastnosti a analyzuje chemické zložky moču použitím testovacích prúžkov, a modulu iq200series pre automatické spracovanie a identifikáciu častíc moču s výkonom 70 stanovení/hod. Ako to prebiehalo V spolupráci s aplikačnými špecialistami sme za 2 dni zabezpečili nastavenie analyzátora a plynulý prechod od manuálneho mikroskopického hodnotenia morfologických súčastí moču k automatickému spracovaniu. Pripojenie na LIS prebehlo bez komplikácií. Potom sme začali zaškol óvať obsluhujúci personál, čo považujem za najdôležitejší faktor pri zavádzaní nových vecí do prevádzky. Ako to funguje Užívateĺský softvér je jednoduchý ako na základnej úrovni obsluhy, tak aj na vyššej, ktorá umožňuje široké možnosti zadefinovania vlastných pravidiel prevádzky a hodnotenia nálezov. Na analyzátore iricell 2000 vyšetrujeme jednorazový nescentrifugovaný moč označený čiarovým kódom. Vzorky, ktoré sú viskózne, zakalené alebo s viditeĺnou hematúriou, sa spracúvajú na základe doporučení manuálnym postupom. Hodnoty meraní (počet elementov/µl) prechádzajú do LIS systému online po kontrole pracovníkom. Práve hodnotenie a preraďovanie častíc predstavovalo najväčší problém v zmene prevádzky úseku, na ktorý si však všetci pracovníci nakoniec, aj na vlastné prekvapenie, veĺmi rýchlo zvykli. Napríklad obrazy valcov, pri ktorých sme sa obávali potreby ďalšej diferenciácie pomocou manuálnej mikroskopie, sú dostatočne jasné a zretelńé. Problém skôr predstavujú niektoré obrazy kryštálov alebo kvasiniek a ich nesprávne zaradenie automatickým systémom. Po mesiaci práce s analyzátorom a zhodnotením dostatočného množstva nálezov súčasne aj manuálnym spracovaním sme zistili vysokú spoláhlivosť automatickej klasifikácie. Preto sme sa rozhodli pre prechod na Auto- Release s nastavením vlastných pravidiel pre každú časticu: vzorky bez patologického nálezu automatická validácia prístrojom s prenosom do LISu bez zásahu pracovníka (Auto-Release) vzorky s akýmkoĺvek nálezom nad cut-off validácia pracovníkom, pričom v ponuke kontroly sú len častice mimo určených hraníc akýkoĺvek nález valcov kontrola pracovníkom vždy je treba posudzovať súčasne chemické výsledky moču a morfologický nález častíc moču!!! Pri hodnotení je veĺkou pomôckou aj grafický vzhĺad nálezov (farebné odlíšenie), ďalej funkcia REDO (návrat na pôvodné rozdelenie častíc analyzátorom) a Un-Delete, vďaka čomu sa nestratí žiadny výsledok. Novinkou, ktorú sme pri manuálnom spracovaní a hodnotení nepoznali, je archivácia nálezov a možnosť štatistiky. Čo sme získali Okrem nových skúseností priniesla automatizácia močového úseku rýchlejšiu dostupnosť výsledkov, menšiu zrakovú záťaž pracovníkov, čistejšiu prácu a spoĺahlivé výsledky. Musím však zdôrazniť, že ĺudský faktor je stále dôležitý a nezastupiteĺný pri kontrole hodnotenia. Bez validácie pracovníkom žiadny patologický výsledok nie je odoslaný do LISu. Na záver Každý, kto pozná problémy spojené so zavádzaním nového prístroja do praxe, bude súhlasiť, že je rád, keď poznámky typu Toto je čo? Ja si to rýchlejšie urobím pod mikroskopom. po týždni vystriedajú Celkom sa mi to páči a je to rýchlejšie. A vieš, že to sedí? MGR. JANA UHROVÁ ODDELENIE KLINICKEJ BIOCHÉMIE, HEMATOLÓGIE A MIKROBIOLÓGIE, FN TRENČÍN, LEGIONÁRSKA 28, TRENČÍN jana.uhrova@fntn.sk 20 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

12 Originál je pouze jeden Iris je součástí Beckman Coulter Měření hladin vitamínu D mezi zaměstnanci společností Immunotech a Beckman Coulter Při příležitosti uvedení nových souprav 25-OH Vitamin D Total RIA a ELISA na trh jsme letos v květnu uspořádali mezi zaměstnanci společností Beckman Coulter a Immunotech akci zaměřenou na zjišťování hladiny vitamínu D v krvi. Využili jsme k tomu pravidelnou roční preventivní prohlídku, kdy 74 našich kolegů dobrovolně obětovalo za výše zmíněným účelem jednu zkumavku životadárné tekutiny navíc. Protože odběry probíhaly v několika termínech, byly vzorky rozalikvotovány, zamraženy a poté najednou stanoveny pomocí RIA soupravy. Až na pár výjimek se většina dobrovolníků těší dobrému zdraví. Základní informace o vitamínu D říkají, že je jeho hladina závislá na: zeměpisné šířce ročním období (u nás jsou nejvyšší po létě, tj. v září a říjnu) úhlu dopadu slunečních paprsků denní době pigmentaci kůže obsahu 7 dehydrocholesterolu (7-DHC) v kůži, tedy na věku používání opalovacích krémů povrchu těla krytého oblečením kázáno, hraje rovněž pozitivní roli v případě rakovinných onemocnění. Vzhledem k výše uvedeným faktům o značné fluktuaci hodnot vitamínu D i u zdravých jedinců a negativnímu vlivu našeho životního stylu je jasné, že stanovení normálních hodnot na základě jejich měření a hodnocení na zdravé populaci není možné. Proto byly jeho hladiny stanoveny víceméně arbitrárně za pomoci studií, zejména těch o rizikovosti jeho nedostatku. Rozmezí hodnot pro soupravu 25-OH Vitamin D Total RIA, kat. č. B46327 je stanoveno následovně: Nedostatek <10 ng/ml Mírný nedostatek ng/ml Dostatek ng/ml Potenciální toxicita >100 ng/ml Ačkoliv je známo, že v našich zeměpisných šířkách není množství vitamínu D v krvi optimální, navíc odběry probíhaly v květnu, tedy na jaře, což má také negativní vliv na jeho hladinu, výsledky měření nás dosti překvapily. Ze 74 zúčastněných bylo 42 žen a 32 mužů ve věkovém rozptylu let. Pouze jediný účastník měl hladinu vitamínu D vyšší než 30 ng/ml, což je spodní limit doporučeného rozmezí (viz obrázek č. 1). Celkový medián činil 13,4 ng/ml, přičemž u žen byl poněkud vyšší než u mužů: 14,1 ng/ml versus 12,8 ng/ml. Co říct závěrem? Několik kolegů na základě naměřených hodnot zařadilo do svého jídelníčku ryby. Dále je tu ještě možnost suplementace. Naštěstí je léto před námi, tedy velká šance ke zlepšení. Samozřejmě i zde platí všeho s mírou, aby pak člověk nemusel řešit problémy jiného rázu! Nabízené soupravy: 25-OH Vitamin D Total RIA, kat. č. B OH Vitamin D Total ELISA, kat. č. B46328 Rádi vám zdarma poskytneme soupravu k vyzkoušení! HANA KRÁTKÁ hkratka@beckman.com Vitamín D lze přijímat potravou ve formě ergosterolu, který je rostlinného původu a jehož zdrojem jsou ryby. Vysoká hladina vitamínu D v tukové tkáni a játrech ryb je vysvětlitelná právě díky bohatému příjmu tohoto vitamínu z potravních zdrojů, jako je fytoplankton. Další formou je cholekalciferol. Ten se tvoří v kůži z výše zmíněného 7-DHC působením UVB záření. Význam a funkce vitamínu D již dávno nejsou spojovány pouze s křivicí, kdy vitamín D podporuje vstřebávání vápníku ve střevech, čímž napomáhá udržovat odpovídající hladiny vápníku a fosforu v našem těle. Je celkově důležitou součástí kostního metabolizmu. Jeho působení je však mnohem komplexnější. Má např. vliv na naši imunitu a, jak již bylo pro- Obrázek č. 1: Hladiny vitamínu D mezi zaměstnanci společností Immunotech a Beckman Coulter Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

13 Setkání uživatelů systémů Beckman Coulter března 2014, Praha-Čestlice Setkání uživatelů průtokových cytometrů Beckman Coulter května 2014, Mikulov Milé čtenářky, milí čtenáři, jak se již stalo zvykem, v prázdninovém čísle našeho časopisu hodnotíme proběhlá uživatelská setkání. V březnu tohoto roku se konal biochemický (resp. z oblasti biochemie, imunochemie, nefelometrie, automatizace laboratorního provozu a močové analýzy) uživatelský meeting já si ho pracovně nazvala BUM! Přípravy vypukly již v lednu, kdy jsme se s kolegyní Terezou Tietze dobrovolně a proaktivně nahlásily jako garantky akce, a spolu s Klárou Lincovou, naší zkušenou pravou i levou rukou, se daly do práce. Na začátku všeho byla otázka dostupnosti a dostatečné velikosti hotelu. Poptaly jsme několik ubytovacích a zároveň konferenčních zařízení. Z interního výběrového řízení naše 3členná komise jednohlasně zvolila Hotel Aquapalace Praha. Následovala úvaha nad sděleními, která by vás mohla zajímat. Po bouřlivém brainstormingu se vyprofilovalo 5 bloků horkých témat: močová analýza zakončená přednáškou anémie, vitamín D, ProPSA, akutní stavy a blok různé. A tak se zrodil tento program: 1. blok: Močová analýza Moderné možnosti analýzy moču a močového sedimentu; Ing. Doc. Blažíček, Ph.D. Hematurie možnosti vyšetřování, kazuistiky; MUDr. Jana Granátová Močové analyzátory IRIS; Ing. Petr Suchan Anémie poruchy metabolizmu železa a erytropoézy; Doc. Mudr. Tomáš Lipšic, Ph.D. 2. blok: Vitamín D Slunce, nebo lékař; prim. MUDr. Jana Čepová, Ph.D. MBA Vitamín D zkušenosti z laboratoře; MUDr. Radka Fuchsová, RNDr. Jindra Windrichová, Ph.D. Vitamín D novinka v našem portfoliu; Mgr. Ing. Tereza Tietze 3. blok: propsa Movember rakovina prostaty věcí veřejnou; Mgr. Ing. Ivana Mičíková, Ing. Petr Matějka, MUDr. Radka Fuchsová 4. blok: Akutní stavy Interleukin 6 na UniCel DxC 880i a jeho využití u novorozeneckých infekcí; RNDr. Zdeněk Veškrna Vše, co potřebujete vědět o vysoce senzitivním Troponinu; Prof. Paul Collinson Hereditární angioedema; MUDr. Radana Zachová 5. blok: Různé K čemu je standardizace,jak se vyvíjí její proces, jak se v ní orientovat; RNDr. Bedřich Friedecký, Ph.D. Informační podpora jako stavební kámen úspěšné laboratoře; Bc. Pavel Jezdinský Když se řekne "CAS"; Ing. Renata Řehořová Čulíková Posoudit, jak moc byla na letošním BUMu témata horká, můžete i vy sami! Máme totiž pro vás k dispozici přednášky v elektronické podobě. Můžete si je vyžádat u zástupců naší firmy. S pozdravem a přáním prvotřídního odpočinku na dovolené IVANA MIČÍKOVÁ imicikova@beckman.com Mezi akce, které naše společnost pravidelně pořádá, patří už tradičně také setkání uživatelů našich průtokových cytometrů. Letos se uskutečnilo ve dnech května v prostorách hotelu Galant v Mikulově. Zúčastnilo se ho 50 uživatelů z celé České republiky i Slovenska. V odborném programu zazněly přednášky z oblasti klinické imunologie a hematologie. Zaměřili jsme se na témata jak ryze praktická, tj. z každodenního laboratorního života, tak edukační. Mezi návštěvníky našeho meetingu bylo mnoho mladých odborníků, což vypovídá o perspektivách tohoto oboru. Velmi dobře se zde snoubilo nadšení ostřílených pracovníků s entuziasmem nastupující generace. Projevilo se to jak při odborném programu, tak při debatách mimo přednášky, které byly, dle vyjádření samotných účastníků, velmi zajímavé a přínosné, zejména díky zkušeným bardům, jako je prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc., Mgr. Marcela Vlková, Ph.D., RNDr. Marián Bobovčák a další. Po skončení našich setkání vždy vyhodnocujeme jejich úspěšnost prostřednictvím dotazníku spokojenosti. Ten nám pomáhá lépe plánovat další akce, zejména jejich odborné zaměření. Také vyhodnocení meetingu v Mikulově nám přineslo mnoho spokojených odpovědí, občas samozřejmě nějakou připomínku, ale hlavně spoustu podnětů a nápadů, jak bychom mohli příští akci zorganizovat ještě lépe. Za to patří všem účastníkům velký dík. Na našich stránkách si můžete stáhnout některé zajímavé prezentace. Těšíme se na viděnou zase za rok při našem dalším setkání. FRANTIŠEK VIČAR fvicar@beckman.com 24 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

14 20. setkání distributorů manuálních imunoanalytických souprav května 2014, Praha Pro klasika představuje máj lásky čas, pro nás členy oddělení MIB (Manual Immunoassay Bussines), zodpovědné za obchodní a produktovou podporu manuálních souprav vyráběných v Immunotechu je tento měsíc tradičně zasvěcen přípravám a realizaci setkání s distributory našich RIA/EIA souprav. Každoročně se k nám sjíždějí partneři z různých koutů světa od Argentiny až po Koreu. Kromě zmíněných zemí jsme v letošním jubilejním 20. ročníku přivítali zástupce z Brazílie, Portugalska, Itálie, Německa, Turecka, Maďarska, Tchaj-wanu, Indie, Rakouska, Izraele, Jordánska, Ukrajiny, Polska a Řecka. Přestože, nebo právě proto, že se v průběhu akce potkávají lidé z různých končin naší zeměkoule a tím různých mentalit, snažíme se o vytvoření otevřeného přátelského prostředí. Díky našim hostům to však není nikdy těžká věc. Během setkání probíhají paralelně dvoustranná jednání se zástupci naší firmy a produktové školení, jež bylo letos zaměřeno na diabetes mellitus a parametry používané při diagnostice a sledování tohoto onemocnění. Letos jsme pro účastníky uspořádali také exkurzi přímo u výrobce manuálních souprav v Immunotechu, který se stane od podzimu 2014 exkluzivním výrobcem RIA souprav v rámci koncernu Beckman Coulter. Právě letos v září bude završeno zhruba dvouleté úsilí, kdy bude výroba RIA souprav z Immunotech France přesunuta a centralizována do Prahy. Zahraniční obchodní partneři byli upřímně potěšeni z celkového dojmu a přátelské atmosféry, která v Immunotechu panuje. Aby si naši hosté odpočinuli od beckmanních tváří, připravila si pro nás jednu z přednášek RNDr. Jindra Windrichová z FN Plzeň. Protože od letošního léta nově nabízíme RIA a ELISA soupravy na stanovení vitamínu D, byla její prezentace zasvěcena právě tomuto parametru. V souvislosti s uvedením nových souprav bylo mezi zaměstnanci Immunotechu a Beckman Coulter ČR provedeno měření hladin vitamínu D. Ale o tom více na jiném místě tohoto čísla. Ve volném čase jsme účastníkům našeho setkání představili v Muzeu Českého ráje v Turnově kus českého nerostného bohatství. Společně jsme obdivovali šikovnost a trpělivost českých řemeslníků, která je nezbytná pro výrobu šperků z českých granátů. Cestou zpět jsme poobědvali na farmě Ptýrov, kde jsme měli příležitost za krásného počasí shlédnout závod parkurových koní. Jak již bylo zmíněno výše, letošní ročník byl dvacátý v pořadí. A protože kulatiny by se měly patřičně oslavit, dort ani svíčky nemohly chybět! HANA KRÁTKÁ hkratka@beckman.com Užívateľské stretnutie Beckman Coulter Slovenská republika júna 2014, Vyhne Začiatkom júna sme mali príležitosť stráviť spoločne s našimi zákazníkmi dva príjemné dni na stretnutí užívateľov spoločnosti Beckman Coulter. Akcia sa uskutočnila v hoteli Sitno v obci Vyhne - oblasti stredného Slovenska v južnej časti chránenej krajinnej oblasti Štiavnické vrchy. V skratke pár viet o tejto malebnej lokalite pre tých, ktorí počas pobytu nemali čas zaoberať sa jej históriou a súčasnosťou. V minulosti predstavovali Vyhne vyhl adávané kúpele s termálnou železitou vodou, ktoré sa spomínajú už v dokumentoch z 13. storočia. Ich majitel om bolo mesto Banská Štiavnica. To do nich vložilo významné investície, hlavne v 18. storočí. Vyhne sa tak stali jedny z najvýznamnejších stredoeurópskych kúpel ov. Neskôr sa mesto dostalo do finančných ťažkostí, preto kúpele prešli do rúk súkromných osôb. V roku 1945 potom boli vo vel kej miere zničené požiarom pri prechode frontu. Od tejto tragickej udalosti sa ich už nepodarilo obnoviť. Okrem kúpeĺov sú Vyhne známe aj baníctvom, pivovarníctvom (nachádza sa tu najstarší slovenský pivovar Steiger), železiarstvom a strojárstvom. Toĺko z histórie. Všetci sme väčšinu času strávili v priestoroch hotela, kde sme sa venovali ďalšiemu vzdelávaniu a získavaniu nových informácií a poznatkov počas užívateĺských a firemných prednášok. Účastníci mali možnosť oboznámiť sa bližšie s našou spoločnosťou a tak isto aj príležitosť osobne sa stretnúť a porozprávať s našimi kolegami a novými zamestnancami. Sympatické boli tiež vzájomné osobné stretnutia kolegov z laboratórií. Akciu otvoril a všetkých privítal Václav Mádr, generálny riaditel spoločnosti Beckman Coulter. Predstavení boli naši kolegovia z oddelenia zákazníckej podpory, teda tí, ktorí plnia vaše priania a ktorých počujete pri telefonických rozhovoroch. Viac informácií o nežiaducich príhodách a nápravných opatreniach sme mohli získať aj z oblasti manažmentu kvality. Problematike DRG sa venoval Ing. Vladimír Heriban. Nasledujúci deň sme mali možnosť vybrať si z dvoch blokov prednášok. Jeden bol zameraný na hematológiu, koaguláciu a prietokovú cytometriu, v druhom bloku boli prezentované prednášky z oblasti biochémie, imunochémie a močovej analýzy. Pre záujemcov o automatizovanú močovú analýzu bol k dispozícii vystavený močový analyzátor iricell 2000 plus. Odbornú konzultáciu poskytla naša produktová špecialistka Jozefína Bernátová. Všetky prednášky, ktoré odzneli na stretnutí, sme starostlivo zaznamenali a budú zaslané všetkým účastníkom na CD nosiči. Veríme, že takto organizované podujatie je pre vás inšpirujúce a že ste s nami prežili užitočné a príjemné chvíle. Vaše pripomienky a postrehy budú pre nás povzbudením pri organizácii ďalšieho ročníka. Tešíme sa na vás a na opätovné stretnutie s vami. HELENA BAZOVSKÁ hbazovska@beckman.com 26 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

15 DNA analýza XI, 10. června 2014, Praha Nech brouka žít Letošní již jedenáctý ročník DNA analýzy, který se konal dne 10. června, byl v několika ohledech poněkud jiný než ty předchozí. Po několika letech jsme se z centra Prahy z blízkosti 1. lékařské fakulty UK přesunuli do moderních konferenčních prostor v areálu výzkumných ústavů Akademie věd v Krči. Posluchárna Milana Haška v konferenčním centru Ústavu molekulární genetiky se ukázala jako stvořená pro pořádání našeho pravidelného setkání. A protože jsme se letos snažili témata z molekulární a buněčné biologie a průtokové cytometrie skloubit s oblastí translační medicíny, celé prostředí tak ještě více podtrhlo úsilí propojit koncepci základního biomedicínského výzkumu s klinickou praxí. Dopolední blok zahájila svou přednáškou Mgr. Iva Polakovičová z týmu RNDr. Petra Drábera, DrSc., který se stal garantem celé akce. Prezentace se věnovala žírným buňkám, jejich funkci, aktivaci, roli v alergickém zánětu a využití v nových metodách terapie. Mgr. Martina Vášková, Ph.D. z laboratoří CLIP Kliniky dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol nás přišla seznámit s aplikací průtokové cytometrie v diagnostice dětské leukémie. Zaměřila se především na proteinové znaky tohoto onemocnění identifikované pomocí genových expresních profilů. Druhý blok byl otevřen přednáškou doc. MUDr. Lucie Bačáková, CSc. z Fyziologického ústavu AV ČR. Ta velice poutavým a didaktickým způsobem představila tkáňové inženýrství jako interdisciplinární obor využívající principy technických a biologických vědních disciplín pro vývoj biologické náhrady, jež obnoví, zachová nebo zlepší funkci tkáně či celého orgánu. Posledního bloku přednášek se ujali kolegové Martin Máša a Martin Polčík, kteří se soustředili na momentálně velice aktuální téma přípravy vzorků pro sekvenátory druhé generace a automatizace pomocí pipetovacích robotů Biomek. Prezentace autorů, od nichž jsme získali souhlas s uveřejněním, společně s fotografiemi z letošního ročníku DNA analýzy jsou k dispozici ke stažení v pdf formátu na našich webových stránkách na adrese: -dna-analyza-xi-2014 Všem přednášejícím a účastníkům ještě jednou touto cestou děkujeme a těšíme se na naše další setkání. EVA KRÁLOVÁ ekralova@beckman.com Před pár lety jsem se seznámil s MUDr. Borisem Bubeníkem, ředitelem společnosti Krevní centrum s.r.o. ve Frýdku Místku. Až po několika návštěvách jeho kanceláře jsem začal chápat, co je jeho velkým koníčkem entomologie. O této jeho zálibě jsem si s ním nedávno popovídal. Kdy Vás začali motýli a brouci zajímat? První dokladový materiál pochází z roku 1963, tzn. z doby před 51 lety, kdy jsem začal hmyz sbírat. A sbírám ho a lovím dodnes. Zajímavé bylo, že jsem neměl ve své blízkosti žádný vzor, který by mě k tomuto oboru přivedl. Prostě mě začalo bavit sbírat všelijaké drobné živočichy, až se to vyprofilovalo vesběr denních a nočních motýlů a brouků. Za tu dobu musíte mít jistě velkou sbírku. Můžete nám ji trochu představit? Dá se říci, že ve svých 60 letech mám nashromážděnou kompletní sbírku denních a nočních motýlů střední Evropy a zhruba 200 sbírkových krabic, které čítají martináče a denní motýly, především z Jižní Ameriky a spoustu druhů z Asie. Má sbírka obsahuje asi 70 % všech saturnidů čili martináčovitých Jižní Ameriky.Z brouků se mi podařilo zkompletovat rod tesaříků střední Evropy. Dále je pak rozsáhlá moje sbírka nosorožíků, zlatohlávků a krasců. Z denních motýlů mám široké spektrum především čeledě otakárkovitých, ohniváčků, modrásků, žluťásků, respektive všech čeledí denních motýlů střední Evropy. Z nočních motýlů pak kromě martináčovitých tvoří sbírku především lišaji, bourovci, přástevníci a stužkonosky. Vedle lovu jsem spoustu exemplářů dokázal napěstovat z vajíček, které jsem si přivezl ze svých cest. A co jiné lokality? Například v Rusku, je tam jiný hmyz? Ano, je. V Rusku se nachází spousta krásných a zajímavých druhů. Především do republik bývalého Sovětského svazu se jezdí na parmacidy, to jsou jasoňovití. Je zde spousta druhů jasoňů, kteří žijí přes Pamír, Altaj, tedy bývalé ruské velehory. Dneska najdete velice zajímavé druhy také v Kyrgyzstánu, v Tádžikistánu a dalších podobných státech. Ale bezpečnost cestování v těchto zemích lze bohužel v současné době přirovnat k nejdivočejším krajinám. Za komunismu to ještě šlo, dnes jsou lidé schopni tě zastřelit kvůli špinavým smradlavým ponožkám. Ty země Jižní Ameriky, které jste jmenoval taky, myslím, nepatří k nejbezpečnějším na světě. Ano, řádí tam narkomafie. Kradou zbraně, obsahy aut, kdeco všechno. Takže skutečně každý v pohraničí chodí ozbrojen. Všichni civilisti mají v autě zbraň, protože se obávají případného přepadení. Naštěstí jsem nemusel při svých cestách žádnému útoku čelit, ale důkazy ve formě prostřílených a ohořelých aut jsou tam běžným jevem. Chystáte se ještě na nějaké další cesty? Víceméně mě láká ještě Fidži, kde mám za- interesované 3 rodiny lidožroutů, které jsou pověřeny sběrem hmyzu. Proto bych to chtěl po 3 letech objet a podívat se, co bylo nashromážděno, probrat to, protřídit a dovézt. Navíc přibývá roků, ubývá energie, takže ono už spát někde v džungli v síti, v dešti, v nepohodě není pro mě. Hmyzu je tam právě nejvíc v období dešťů. A když je tam krásně, člověk spí pod plachtou, mokrý, takže prostě během pobytu v Jižní Americe nikdy nevyschne. Ono už i komárů a muchniček bylo dost. Po 60ce už se tedy budu jenom kochat tím, co jsem nasbíral. A cesty do skutečné divočiny už bych chtěl omezit. Jak je to s legislativou? Můžete vozit exempláře legálně? V některých zemích je to zakázáno, někde je vývoz potřeba doložit povolením ministerstva. Bolívie zavedla rovněž vývoz pouze na certifikát, tzn. když si na místě něco odlovíš, měl bys na letišti deklarovat, že je to povoleno jejich ministerstvem zemědělství. Ostatní státy Jižní Ameriky mají zatím zcela volný vývoz hmyzu, takže je to bez problémů. Můžete se pochlubit nějakou opravdovou raritou? To se nedá vůbec vybrat. Mám mnoho zajímavých druhů, kterých si velice vážím, ale kdybych měl zvolit jen jednoho, bude to asi ve Do kterých míst světa se vlastně za motýly či brouky jezdí? Během svého života jsem prakticky procestoval celou Severní a Jižní Ameriku. Takový druhý domov jsem nalezl především v Jižní Americe, kterou jsem navštěvoval rok co rok. Tradičně státy Peru, Ekvádor a Bolívie, kde mám spoustu známých a přátel. Kromě toho je velice zajímavá také Guatemala, Honduras, Salvador, Kostarika až po Ohňovou zemi. MUDr. Boris Bubeník (na snímku vlevo se zbraní) 28 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

16 KŘÍŽOVKA Francouzské Guayaně odlovený Titanus giganteus o velikosti 16,7 cm. Je nás pouze sedm na světě, kteří máme ve sbírce takto velký exemplář. Jak vlastně probíhá lov? Představuju si Vás se síťkou na motýly Ano, v mnoha případech tomu tak skutečně je. Lov je prostě adrenalin. Většinou jezdíme ve dvou do divočiny, žádné pohodlí. Musíme vybrat lokalitu, tzn. oblast u řeky a tam, kde se těží dřevo. Přes den lovíme síťkou, v noci pomocí agregátu a výbojky, kdy nám na plátno nalétají různé druhy. Vše je nutno ihned napíchnout čpavkem a založit do sáčku. V průměru je to přes den asi 100 a v noci sáčků. Takže v podstatě nespíme. Je to vlastně velká dřina. Na co se v současné době připravujete? Nyní po své 60ce se snažím dělat systematiku. V rámci připravovaného muzea tady na Krevním centru bych chtěl všechny exempláře, které jsem ať už vypěstoval, nalovil, koupil, nebo vyměnil, dát do systematiky, tj. udělat popisky a série, aby to vypadalo líp než v Národním muzeu. Chtěli bychom na Krevním centru třeba jednou za měsíc uspořádat den otevřených dveří, kde by si návštěvníci mohli tyto unikátní sbírky prohlédnout. Je v přírodě více nebo méně brouků a motýlů? Mnohem méně než před pár desítkami let. Souvisí to s paradoxním přístupem k ochraně přírody. Mnoho druhů je prohlášeno za chráněné, nic se nesmí odlovit, ale mnohem zásadnější je to, že se úplně ničí biotop potřebný k životu hmyzu. A to jak u nás, tak v jiných zemích či kontinentech. Na to se snažíme soustavně upozorňovat a rovněž hodláme připravit televizní pořad na toto téma. Ještě by mě zajímalo srovnání s naším okolím. Jaké je to zde ve středoevropských zemích, např. v Polsku, Rakousku, Německu? Znáte se s tamními entomology? Existují mezinárodní entomologické akce, které navštěvuji, přes Francii, Itálii, kde mám spoustu přátel v této branži. Setkáváme se mnoho let. Bohužel ta legislativa Rok co rok přibývá v seznamu lokálně chráněných druhů. To znamená, že je nesmíš ani měnit, ani vystavovat. Maďaři loni zavedli spoustu nových chráněných druhů běláskem počínaje přes milimetrové motýlky, až po klíněnky, takže to je výsměch entomologii. Žije u nás nějaký ceněný druh, za kterým by přijeli entomologové z jiných zemí? Je zde spousta druhů zástupců můrovitých nebo vzácní lokální přástevníci. Takže se může stát, že když na chalupě plácnu nějakou můru že to byla rarita. Děkuji za příjemné povídání a přeju dobrý lov. MUDR. BORIS BUBENÍK KREVNÍ CENTRUM S.R.O., T. G. MASARYKA 495, FRÝDEK-MÍSTEK b.bubenik@krevnicentrum.cz FRANTIŠEK VIČAR fvicar@beckmanc.com Česká křížovka Slovenská krížovka Tak si, Lojzo, představ, vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, že mi u doktora odebrali půl Tak litru si, krve Lojzo, představ, a z ní diagnostikovali vylévá si vzdělaný Pepa tenisový srdce u piva v loket, hospodě Alzheimera, vzdělanému kamarádovi, močové že mi i u žlučové doktora odebrali kameny půl litru a krve hašteřivou a z ní diagnostikovali manželku. tenisový Když loket, Alzheimera, jsem si močové šel i koupit žlučové kameny pušku, a hašteřivou abych manželku. je zastřelil, Když jsem tak si šel jsem koupit se pušku, celý abych zpocený je zastřelil, probudil. tak jsem se celý Zajímavé zpocený probudil. na celé Zajímavé věci na celé je, věci (tajenka)! je, Tak si, Lojzo, představ, vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, že mi u doktora odebrali půl litru krve a z ní diagnostikovali tenisový loket, Alzheimera, močové i žlučové autor: kameny a hašteřivou manželku. Když jsem si šel koupit pušku, abych je zastřelil, tak jsem se celý zpocený probudil. Zajímavé na celé věci je, (tajenka)! členové Okola, olein, velký nejmenší část klobouk snížení spotřeby, Ivan smůla zamlčovat ojezdil Ludolfovo číslo skanzen Iowa (kód) balení, kryt kamkoliv skautské Plai, Sia tibetský tur chem. prvku u Němcové šetření Šarkan autor: organizace členové Okola, olein, velký nejmenší část klobouk snížení spotřeby, Ivan smůla zamlčovat ojezdil Ludolfovo číslo skanzen Iowa (kód) balení, kryt kamkoliv skautské Plai, Sia tibetský tur chem. prvku u Němcové šetření Šarkan organizace způsob nějak okus (slov.) cestování způsob nějak okus (slov.) cestování útok obyvatel Pyrenejského poloostrova 3 odhadem útok obyvatel Pyrenejskéhopysk poloostrova 3 kamerunské sídlo odhadem vyvýšená plošina pysk oj (slov.) kamerunské st. rumunský sídlo fotbalista vyvýšená učedník plošina oj (slov.) st. rumunský fotbalista učedník baklažán 2 dělat velitele baklažán 2 fáze Měsíce dělat velitele pracoviště literárně tvořit v dole astat (zn.) fáze Měsíce pracoviště 1 literárně bílá barva tvořit v 4dole astat (zn.) pociťovat žal 1 bílá barva Evropská slovenský politik 4 byl zamilovaný komise (zkr.) slavný pociťovat italský žal Evropská lékař ibidem (zkr.) druh slovenský papouška politik byl zamilovaný komise (zkr.) slavný italský lékař součást oleje ibidem (zkr.) souhvězdí Aries druh papouška Taegu (kód (zkr.) starší český zasténání letiště) herec hovor součást (angl.) oleje souhvězdí Aries Taegu (kód feudální (zkr.) sídlo starší český zasténání letiště) herec hovor (angl.) rodový znak hraní feudální sídlo Salvádor (kód) ovoce (něm.) egyptský rodový bůh znak Kanpur hraní Dev. rozumu Authority (zkr.) islandské Salvádor platidlo (kód) ovoce (něm.) egyptský bůh Kanpur Dev. islandské platidlo zakreslení rozumu vázanka Authority (zkr.) a soupis pozemků zakreslení měsíc vázanka Jupitera a soupis pozemků měsíc Jupitera ještěr Verdiho opera souboj ještěr Verdiho opera souboj pozemek s porostem cesta (ang.) popelnice pozemek trav s porostem cesta (ang.) popelnice trav Tak si, si, Lojzo, Lojzo, predstav, predstav, vylieva si vzdelaný vylieva Jožko si srdce vzdelaný pri pive v krčme Jožko vzdelanému srdce kamarátovi, pri pive že v krčme mi u doktora vzdelanému odobrali pol litra kamarátovi, krvi a z nej diagnostikovali že mi u tenisový doktora lakeť, odobrali Alzheimera, močové pol i žlčové kamene a hašterivú manželku. Keď som si išiel kúpiť pušku, aby som ich zastrelil, tak som sa celý spotený zobudil. Zaujímavé na celej veci je, (tajnička)! litra Tak si, krvi Lojzo, a predstav, z nej diagnostikovali vylieva si vzdelaný Jožko tenisový srdce pri pive lakeť, v krčme Alzheimera, vzdelanému kamarátovi, močové že mi i žlčové u doktora kamene odobrali pol a litra hašterivú krvi a z nej manželku. diagnostikovali tenisový Keď som lakeť, si Alzheimera, išiel kúpiť močové pušku, i žlčové autor: kamene aby a som hašterivú ich manželku. zastrelil, Keď som tak si som išiel citoslovce kúpiť sa celý pušku, spotený aby som ich zastrelil, zobudil. tak som Zaujímavé sa celý spotený na zobudil. celej Zaujímavé veci je, na (tajnička)! celej veci je, (tajnička)! prírodná alebo obec na Eira, kulm, oddelenie oddiel spodného múzeum vo kamkoľvek, členovia Ivan patriaci ujovi napodobňujúce vybav Jupiterov mesiac etui, tuba usporenie upravená živica Kysuciach opuka v nemocnici karbónu (geol.) voľnej prírode po česky skautingu Šarkan autor: trúbenie citoslovce prírodná alebo obec na Eira, kulm, oddelenie oddiel spodného múzeum vo kamkoľvek, členovia Ivan patriaci ujovi napodobňujúce vybav Jupiterov mesiac etui, tuba usporenie upravená živica Kysuciach opuka v nemocnici karbónu (geol.) voľnej prírode po česky skautingu Šarkan trúbenie smútok (bás.) nejako skús smútok (bás.) 3 3 časť pušky platený potlesk orgán zraku Írska časť pušky rep. armáda (skr.) orgán zraku Írska rep. armáda (skr.) poľoval 2 beloň poľoval 2 otrok (kniž.) beloň abvolt (zn.) otrok (kniž.) 1 abvolt (zn.) žaketový kabát 1 mäkký ťažký kov mäkký žaketový meno Tita kabát žrď ťažký kov meno Tita fran. muž. meno na priahanie zvierat žrď do voza mastenec fran. muž. (miner.) meno na priahanie zvierat do voza stratený, po anglicky stratený, mastenec (miner.) Korean National Railroad (skr.) Trade Korean Agreement National Railroad Act (skr.) (skr.) po anglicky Trade Agreement Act (skr.) zostatok zostatok sláčikový hudobný nástroj sláčikový hudobný nástroj vápencová hornina vápencová hornina nejako Rudolf (dom.) platený Rudolf potlesk (dom.) sídlo v Portugalsku sídlo v Portugalsku súbor nádob súbor nádob predloha tanková predloha loď tanková loď Európska komisia (skr.) Európska irídium komisia (zn.) (skr.) irídium (zn.) viazanka 2 (rím. viazanka číslo) 2 (rím. číslo) hranie sa kryha, hranie po česky sa kryha, po česky pražský ostrov vrece pražský (zastar.) ostrov vrece (zastar.) popri, vedľa opevnené popri, vedľa sídlo opevnené sídlo skús obyvateľ Pyrenejského polostrova obyvateľ Pyrenejskéhokrík polostrova krík slovenský politik slovenský hádka (zast.) politik hádka (zast.) súboj súboj lakťová kosť (medic.) lakťová kosť (medic.) pracovisko v bani pracovisko v bani TAJENKA Z MINULÉHO ČÍSLA: "TAK JSEM SE CELÝ ZPOCENÝ PROBUDIL" - "TAK SOM SA CELÝ SPOTENÝ ZOBUDIL" 4 4 severovýchod (skr.) severovýchod (skr.) ail ail ston ston starší český herec starší český herec 30 31

17 Kde se můžeme setkat formou stánku (červen - listopad 2014) XXVIII. Olomoucké hematologické dny (Olomouc) Sympozium klinické biochemie FONS 2014 (Pardubice) Celostátní konference zdravotních laborantů ČAS, FN Motol (Praha) XI. Kongres SSKB SLS (Martin) VII. Bratislavské hematologické a transfuziologické dni (Bratislava) XV. Česko-slovenská konference laboratorní hematologie (Hradec Králové)