Využití mnohobarevné průtokové cytometrie pro vyšetření lymfocytárních subpopulací Jana Nechvátalová

Transkript

1 Využití mnohobarevné průtokové cytometrie pro vyšetření lymfocytárních subpopulací Jana Nechvátalová Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně

2 PRIMÁRNÍ IMUNODEFICIENCE 5% 9% 14% 7% 4% 2% 1% 1% Protilátkové deficity 57% T-buněčné deficity Poruchy fagocytózy Poruchy komplementového systému Další dobře definované PID Syndromy autoimunity a imunodysregulace "Autoinflammatory syndromes" Poruchy vrozené imunity Neklasifikované PIDs

3 HUMORÁLNÍ IMUNODEFICIENCE Selektivní deficit IgA (IgAD) 1: nejčastější asymptomatická ID IgA<0.07g/l, IgG a IgM v normě infekce horních dýchacích cest, alergie, autoimunity Běžný variabilní imunodeficit (CVID) 1: nejčastější symptomatická ID IgG, IgA, variabilní hladiny IgM porušená produkce specifických protilátek, opakované infekce dýchacích cest, splenomegalie, autoimunity

4 CD3 % CD3 + z lymfocytů 100 NS ** % CD4 + z lymfocytů ** *** % CD8 + z lymfocytů * *** 0 Kontroly IgAD CVID 0 Kontroly IgAD CVID 0 Kontroly IgAD CVID % CD19 + z lymfocytů * NS % CD16,56 + z lymfocytů NS *** 0 Kontroly IgAD CVID 0 Kontroly IgAD CVID (Nechvátalová a kol. 2012)

5 Pacient s CVID ref. rozmezí 55-83% ref. rozmezí 28-57% ref. rozmezí 6-19% ref. rozmezí 7-31% ref. rozmezí 10-39%

6 T-lymfocytární subpopulace

7 T lymfocyty 90% Sekundární lymf. orgány Primární aktivace Cílový orgán Sekundární lymf. orgány Sekundární aktivace Cílový orgán Naivní Efektorové Centrální paměťové Efektorové paměťové Klonální expanze Klonální expanze CD45RA+ CD45RA+ CD45RO+ CD45RO+ CD27+, CD28+, CD62L+, CCR7+ CD27-, CD28-, CD62L-, CCR7- CD27+,CD28+, CD62L+,CCR7+ CD27-, CD28-, CD62L-, CCR7

8 Kontrola Pacienti s CVID

9 Kontrola Pacient s CVID

10 B-lymfocytární subpopulace

11 Vývojová stadia B lymfocytů

12 B lymfocyty tranzientní (CD19 + IgM high CD24 high CD38 high CD21 - ) ref. rozmezí 1 3,6% Morbach et al., 2010

13 Pacienti s CVID Kontrola N S 1 2 * % tra n z ie n tn íc h b u n ě k z C D ly m fo c y tů K o n tro ly Ig A D C V ID

14 B lymfocyty marginální zóny (CD19 + CD27 + IgM hi IgD + CD21 high ) ref. rozmezí 13,4 21,4% Morbach et al., 2010

15 Pacienti s CVID Kontrola

16 B lymfocyty naivní (CD19 + CD27 - IgM + IgD + ) ref. rozmezí 58 72% Morbach et al., 2010

17 Pacienti s CVID Kontrola

18 B lymfocyty izotypově přesmyknuté (CD19 + CD27 + IgM - IgD - ) ref. rozmezí 9,2 18,9% Morbach et al., 2010

19 Pacienti s CVID Kontrola % iz o ty p o v ě p ře s m y k n u tý c h b u n ě k z C D ly m fo c y tů 4 0 *** K o n tro ly *** Ig A D C V ID

20 Plazmablasty (CD19 +/- IgM - CD27 ++ CD38 ++ ) ref. rozmezí 0,6 1,6% Morbach et al., 2010

21 Pacienti s CVID Kontrola % Ig M - p la z m a b la s tů z C D ly m fo c y tů 1 2 *** *** 0.0 K o n tro ly Ig A D C V ID

22 CD19 + CD21 low CD38 low ref. rozmezí 1,8 4,7% Morbach et al., 2010

23 Pacienti s CVID Kontrola

24 CVID heterogenní onemocnění s neznámou patogenezí potřeba rozdělení pacientů s podobným postižením B lymfocytů do skupin Freiburská klasifikace Pařížská klasifikace Klasifikace EUROclass - nové klasifikační schéma CVID navrženo na základě počtu buněk definovaných B-lymfocytárních subpopulací u jednotlivých pacientů (Wehr C, et al., 2008) - nejstabilnější klasifikací (Koopmans W, et al., 2013) CVID >1% B buněk = sk. B+ <1% B buněk = sk. B-

25

26 Heterozygotní IgD deficience kontrola pacient

27

28 Heterozygotní mutace IgD dědeček babička IgD-IgM+CD27- subpopulace matka teta dědeček babička otec pacient otec matka teta pacient

29 IgD deficience IgD deficience pouze myší modely Kompenzační mechanizmy mezi IgM a IgD (Lutz C et al., 1998; Nitschke L et al., 1993) IgM deficience porucha v sekundární protilátkové odpovědi (Guo L et al., 2007) Imunitní systém našich pacientů obsahuje IgD- a IgD+ zralé naivní lymfocyty Kompenzace IgD deficience ze strany IgM? Jaká je role IgD v procesech jako jsou: -homeostáza? - selekce proti auto/polyreaktivitě? - Ag odpověď?

30 DuraClone

31 DuraClone IM B cell Tube T cell subsets Tube FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC A700 APC- A750 PB KO IgD CD21 CD19 CD27 CD24 CD38 IgM CD45 CD45RA CCR7 CD28 PD1 CD27 CD4 CD8 CD3 CD57 CD45 300ul krve 2x promýt v PBS pouze B lymfocytární subpopulace 100ul (promyté) krve přidat do zkumavek s MPL, inkubovat 15min. zlyzovat 2ml VersaLyse 15 min promýt v PBS měřit v PBS

32 D u r a C l o n e

33 CD4+: CD8+:

34 Děkuji za pozornost