Speciální hematologická vyšetření. Bourková L., OKH FN Brno

Transkript

1 Speciální hematlgická vyšetření Burkvá L., OKH FN Brn

2 Vyšetřvání anémií

3 Vznik anemie Anemie je subr příznaků, při kterém je v krvi: snížený pčet erytrcytů (ERY) a mnžství hemglbinu (HGB), je spjená s pruchu tvrby erytrcytů neb zánikem či ztrátu erytrcytů Nrmálně na pkles hladiny kyslíku v rganismu reagují ledviny zvýšenu prdukcí hrmnu erytrpetinu (EPO). EPO se přenáší krví d kstní dřeně, kde je vydán signál ke zvýšené prdukci ERY a stav se kmpenzuje. V určitých případech, zejména u nádrvých nemcnění neb u chrnických zánětlivých prcesů je ale tent prces nedstačující a vzniká anemie.

4 Sledvání vyšetření Hdntit: hlubku anémie v KO pčetní změny WBC i PLT mrflgické změny erytrcytů v periferní krvi (barevné, tvarvé, inkluze) mrflgické změny WBC i PLT v celém nátěru mrflgické a mnžstevní změny erytrcytární ppulace v KD mrflgické změny i leukcytární ppulace a MGK kmplexně výsledek celéh KO a nález v KD: může se jednat první příznaky nádrvéh nemcnění suvislst se speciálními vyšetřeními

5 Vyšetření retikulcytů retikulcyty přítmné RNA schpnst tvrby HGB (analýza HGB v Retic) dráží schpnst KD prdukvat RBC během 1 2 dnů dspívá Retic ve zralý erytrcyt pčet Retic aktivace KD (zvyšvání IRF) pčet Retic útlum KD (snižvání IRF) mikrskpicky supravitální barvení RNA v buněčných rganelách (ribzmy, endplazmatické retikulum) analyzátrem analýza pršléh a draženéh světla: prbíhá na precipitvaných síťvých strukturách RNA analýza flurescence: vlákna RNA jsu barvena flurescenčními barvami

6 Cytchemické vyšetření zásbníh železa Zásbní želez Fe 3+ : feritin, hemsiderin Princip vyšetření: (Fe 3+ ) + ferrkyanid draselným - K 4 [Fe(CN) 6 ] + HCl barevný kmplex = berlínská (pruská) mdř - Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 Hdncení: ve 100 NRBC zelenmdrá granula v: erytrcytech (sidercyty), NRBC (siderblasty), NRBC kl 2/3 jádra (prstenčité siderblasty), makrfázích (siderfágy), extracelulárně Nrmální hdnty: % pzitivních NRBC 4 siderfágy Klinický význam: snížení hdnty: siderpenické anémie zvýšené hdnty: siderblastické (přítmné prstenčité siderblasty) hemlytické anémie, megalblastvé anémie MDS, leukémie

7 Základní vyšetření pr hemlytické anémie Obecné testy: vlný hemglbin v plazmě plazmě (základní metdika pr vyšetřvání intravaskulární hemlýzy) smtická rezistence test authemlýzy hemsiderin v mči Testy na průkaz abnrmálních hemglbinů hemglbin F hemglbin A2 elektrfréza hemglbinu Testy na průkaz nedstatku enzymů Heinzva tělíska glukóz-6-fsfátdehydrgenáza pyruvátkináza

8 stanvení vlnéh HGB v plazmě Obecné testy Princip - spektrftmetricky: xidace HGB (Fe 2+ ) methemglbin (Fe 3+ ) + KCN barevný kmplex - hemiglbinkyanid. vyšetření smtické rezistence Princip - makrskpicky: stanvení dlnsti RBC v různě kncentrvaných hyptnických rztcích NaCl (fyzilgickéh r.). nrmál patlgie test authemlýzy Princip - spektrftmetricky: sledvání hemlýzy RBC v prstředí: fyzilgickéh rztku fyzilgickéh rztku s glukózu fyzilgickéh rztku s ATP. vyšetření hemsiderinu v mči Princip - mikrspicky: Fe 3+ v hemsiderinu + HCl + K 4 [Fe(CN) 6 ] krystalky - berlínská (pruská) mdř - Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3

9 Testy na průkaz abnrmálních hemglbinů hemglbin F Princip - mikrskpicky: Inkubace nafixvaných preparátů v kyselém prstředí (ph 3,3). HGB A je z erytrcytů vyplaven. HGB F je vůči prstředí rezistentní, v erytrcytech zůstává. Hdncení [%] : nvrzenci (50-90%), věk<2 rky (0-4%), věk>2 rky (0-4%) hemglbin A2 Princip - chrmatgraficky: Na pzitivně nabité částice pryskyřice se se naváží negativně nabité části HGB, jedntlivé frakce HGB se vymývají pufrem, 1. frakce je s HGB A2, 2. frakce je s HGB S. Hdncení: Pdíly jedntlivých frakcí HGB se stanvují spektrftmetricky. pstupná eluce frakcí elektrfréza hemglbinu Princip: V elektrickém pli a zásaditém prstředí se hemglbiny phybují různě rychle, na základě veliksti negativníh nábje glbinvéh řetězce, v závislsti na přítmných aminkyselinách. Negativně nabité mlekuly HGB se phybují k andě (+).

10 Testy na průkaz nedstatku enzymů Heinzva tělíska Princip - mikrskpicky: Heinzva tělíska znázrňují vysrážený hemglbin v případě, že glyklytické enzymy erytrcytů nejsu schpny zabránit xidaci hemglbinvé mlekuly. Precipitáty se jeví jak válná tělíska v erytrcytech. Objevují se těsně u buněčné membrány, ke které přiléhají, barví se supravitálně brillantcresylvu mdří přím neb p inkubaci s acetylfenylhydrazinem. Retic Heinz. těl. v ery glukóz-6-fsfát dehydrgenáza (G-6-PDH) Princip - spektrftmetricky: Kinetické měření aktivity enzymu v UV blasti. G-6PDH se pdílí na redukci NADP + na NADPH (niktinamid adenin dinukletid fsfát), nárust NADPH je přím úměrná aktivitě G-6-PDH. pyruvátkináza Princip - spektrftmetricky: Kinetické měření aktivity enzymu v UV blasti. V přítmnsti pyruvátkinázy dchází při katalytické reakci ke sptřebě NADPH, jejíž pkles je nepřím úměrné aktivitě pyruvátkinázy.

11 Cytmrflgická vyšetření krevních buněk v suvislcti s nklgicku hematlgií

12 Sledvání vyšetření Hdntit: celý krevní braz pčetní změny WBC, RBC, PLT, přístrjvá hlášení mrflgické změny v periferní krvi WBC splu s diferenciálním rzpčtem, RBC, PLT mrflgické a mnžstevní změny v kstní dřeni u leukcytární, erytrcytární a trmbcytární ppulace, včetně MGK cytchemická vyšetření pčet blastů pr diagnstiku akutní leukémie: dle WHO klasifikace > 20%

13 Příklady mrflgických abnrmalit u akutních lymfblastických leukémií Dělení dle FAB klasifikace ALL L1 mrflgické nálezy: menší blastické buňky vyský N/C (nukle-cytplazmatický) pměr jemnější chrmatin nejasná jadérka ALL L2 mrflgické nálezy: větší, čast plymrfní blastické buňky bhatší cytplazma jasná jadérka ALL L3 mrflgické nálezy: velké buňky bazfilní cytplazma vakulizace (Burkittův lymfm)

14 Příklady mrflgických abnrmalit u akutních myelblastických leukémií Dělení dle FAB klasifikace AML M0 mrflgické nálezy: AML s minimálními znaky myelidní diferenciace agranulární blasty AML M1 mrflgické nálezy: AML bez vyzrávání blasty > 90% z nnerytridní řady Auervy tyče AML M2 mrflgické nálezy: AML s vyzráváním blasty % z nnerytridní řady pdíl mnctárních buňěk <20% Auervy tyče

15 Příklady mrflgických abnrmalit u akutních myelblastických leukémií Dělení dle FAB klasifikace AML M3 mrflgické nálezy: AML M4 AML - prmyelcytární d nádrvé ppulace buněk zahrnvány blasty i abnrmální prmyelcyty typ M3 hypergranulární Auervy tyče, snpce Auervých tyčí typ M3 variantní dvulalčnatá, mnhlalčnatá jádra až agranulace cytplazmy, válné inkluze, Auervy tyče mrflgické nálezy: AML - myelmnctární většina blastů z nnerytridní řady pdíl mnctárních buněk > 20% v KO bývá mncytóza AML M5 mrflgické nálezy: AML - mncytární typ M5A mnblasty, méně granulace, vakulizace typ M5B více prmncytů, mncytů pdíl mncytární ppulace > 80% M5A M5B

16 Příklady mrflgických abnrmalit u akutních myelblastických leukémií Dělení dle FAB klasifikace AML M6 mrflgické nálezy: erytrleukémie erytrblasty (prerytrblasty + NRBC) > 50% ze všech jaderných buněk statní blasty i z nnerytridních buněk dysplázie v erytrcytární řadě (členitá jádra, karyrexe, vícejaderné NRBC, vakulizace, megalblasty AML M7 mrflgické nálezy: megakarycytární leukémie blasty většinu megakaryblasty dysplatické změny MGK

17 Příklady mrflgických abnrmalit u lymfprliferativních nemcnění základní nálezy změny v pčtu WBC (snížení, nrmální pčet, zvýšení dle typu nemcněí až nad 100x109/l i přes 500x109/l) lymfctóza reaktivní LY, atypické LY (atypie jádra a cytplazmy), mladší lymfcyty, hlá jádra (jaderné/gumprechtvy stíny) mrflgické abnrmality lymfcyt CLL HCL zářezy v jádře jaderné stíny LGL lymfcyt PLL splenický lymfm reaktivní LY vyský N/C pměr prly myelm vilózní LY členitá jádra

18 D - Příklady mrflgických abnrmalit u myelprliferativních nemcnění základní nálezy zvýšený pčet WBC ( čast až 100x i více), zvýšený pčet PLT (mžný extrémní pčet až k 1000x10 9 /l) mžné mrflgické nálezy v návaznsti na typ nemcnění: neutrfilie a mladší vývjvá stádia (myelcyty, metamyelcyty), bazfilie, může být ezinfilie, mžná přítmnst různéh pdílu blastů, v KD hyperplazii granulcytárních řad NRBC v periferní krvi, sledvat mrflgické dchylky RBC (slzičkvité RBC) patlgická mrflgie PLT, i gigantické PLT, v KD zmnžené dysplatické MGK, hlá jádra MGK v periferii mrflgické abnrmality WBC CEL ET MF BASO ET hlé jádr MGK

19 základní nálezy v periferní krvi Labratrní nálezy u myeldysplastickéh syndrmu erytrcyty: anémie, RDW, plychrmázie, pikilcytóza, inkluze v RBC, dysplázie NRBC, RETIC leukcyty: bvykle NE, hyp/hyper(>5segmentů) - segmentace NE, pseud-pelgerva-huëtva anmálie, hyp/hyper/nervnměrná-granulace NE, vakulizace NE, evt. přetrvávající bazfílie cytplazmy NE, abnrmální mn/prmncyty trmbcyty: většinu PLT, PDW, makr PLT, hypgranulární PLT, fragmenty cytplazmy MGK, mikr MGK, jádra MGK základní nálezy v kstní dřeni dyserytrpéza: pdbné dysplatické změny jak v PK, dále: jádr: mezijaderné můstky, karyrexe, vícejadernst, megalidní rysy, znekruhlení jádra cytplazma: vakulizace, nervnměrná barvitelnst dysgranulpéza: pdbné dysplatické změny jak v PK, dále: asynchrnie vyzrávání jádra a cytplazmy, Auervy tyče, pseud-chediakva-higashih granula dysmegakarypéza: mikr/brvské MGK, hyp/hyper - lbularizace MGK, vícejaderné MGK, vakulzace, hypgranulace MGK Sledvat: charakter dysplazie pr rzlišení typu MDS pčet blastů v PK a KD cytpenie v KO (bez dysplastických změn by neměla být návaznst na diagnstiku MDS)

20 Příklady mrflgických abnrmalit u myeldysplastickéh syndrmu hypersegmentace heterzygt hmzygt hmzygt hypsegmentace dysplázie NE blast hypsegmentace hypgranulace hypsegmentace hypgranulace dysplatický MGK hypsegmentace hypgranulace pseud- Chediakva-Higashih granula Auervy. tyče dysplatický MGK dysplázie NRBC makrfág dysplatický MGK mitóza NRBC

21 Cytchemická vyšetření fixace nátěru substrát inkubační rztk + enzym (glykgen, lipidy) buňka barvené precipitáty v místech přítmnsti enzymu (substance) v buňce hdncení -mikrskpicky: negativní (0) až pčet (+) intenzita zbarvení je úměrná mnžství enzymu (glykgenu, lipidů) Cytcemická barvení: neutrfilní alkalická fsfatáza myelerxidáza chlracetátesteráza sudanvu černí PAS (Peridic Acid Schiff) nespecifická esteráza (s blkádu fluridem sdným) kyslá fsfatáza (s rezistencí na kyselinu L-vinnu)

22 neutrifilní alkalická fsfatáza Cytchemická vyšetření hdncení: v periferní krvi, neutrfilní tyče a segmenty klinický význam: ALP u chrnické myelidní leukémie, ALP u chrnické neutrfilní leukémie myelperxidáza hdncení: v primární granulaci NE, EO, MO (mnžství enzymu se zvyšuje s vyzráváním buněk), lymfcyty jsu vždy negativní, sledvání přítmnsti Auervých tyčí klinický význam: rzlišení myelblastické neb mnblastické leukémie d lymfblastické PAS hdncení: typ pzitivity (difúzní, jemně neb hrubě pzitivní granula) fyzilgická: myel.buňky (difúzní), mncytárníbuňky (jemná granula), lymfcyty (mhu být výraznější granula), NRBC (negativní) patlgická: LY u CLL (většinu výrazná granulární pzitivita), lymfblasty u ALL (většinu pzitivní), NRBC hrubzrná pzitivita klinický význam: leukémie, MDS, anémie

23 Cytchemická vyšetření nespecifická esteráza s blkádu fluridem sdným princip: enzym reaguje se substrátem neb je reakce blkvána NaF (sučasné barvení dvu nátěrů) hdncení: p inkubace bez blkády: myelidní buňky a lymfcyty pzitivní (0/+), mncyty (+/+++) p inkubaci s NaF: pzitivita u myelidních buněk a lymfcytů stejná neb jen lehce zeslabená, u mncytů zeslabení (0/+) klinický význam: k průkazu AML M4 a AML M5 před blkádu p blkádě NaF kyselá fsfatáza s rezistencí na kyselinu L-vinnu princip: enzym reaguje se substrátem neb je reakce blkvána kyselinu L-vinnu, pkud je v buňce přítmen isenzym -5, ptm je reakce na kyselinu L-vinnu rezistentní (sučasné barvení dvu nátěrů) hdncení: p inkubace bez blkády: granulcyty, mncyty, lymfpcyty pzitivní na (0/+) p inkubaci s kyselinu L-vinnu: pzitivita zůstává puze v lymfcytech s izenzymem-5 klinický význam: pzitivita v lymfcytech p inkubaci s kyselinu L-vinnu služí k diagnstice klasické frmy HCL před blkádu HCL p blkádě k. L-vinnu