05-Enzymov{ kinetika FRVŠ 1647/2012

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "05-Enzymov{ kinetika FRVŠ 1647/2012"

Vojtěch Pavlík
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 C3181 Bichemie I 05-Enzymv{ kinetika FRVŠ 1647/2012 Petr Zbřil 9/23/2014 1

2 Temata Rychlst a aktivita Kinetika Organizace a regulace Praktické aspekty Petr Zbřil 9/23/2014 2

3 Vyjadřv{ní katalytické účinnsti enzymů Vyjádření mnžství (kncentrace) enzymů jak čistých tak v kmplexní prteinvé směsi hmtnstím, látkvým a katalytickým mnžstvím (kncentrací) účinnst enzymu - aktivity - dvzena d rychlsti enzymvé reakce jak mnžství přeměněnéh substrátu či vznikléh prduktu za časvu jedntku. Tat rychlst (dc/dt) se stanvuje vhdnými metdami, s výhdu ftmetricky Jedntky aktivity Smluvní jedntky např. u amylasy - mnžství enzymu, které rzštěpil za 30 min při 40 C dané mnžství škrbu aby ten nedával reakci s jdem IU - mezinárdní jedntky 1961 mnžství enzymu, jež přeměnní 1 µml substrátu za 1 minutu za standardních pdmínek (ph, T, přebytek substrátu, přítmnst aktivátrů) Katal (pdle sustavy SI) mnžství enzymu, jež přemění 1 ml substrátu za 1 sekundu za standardních pdmínek (ph, T, přebytek substrátu, přítmnst aktivátrů) Specifická aktivita aktivita vztažená na celkvé mnžství (kncentraci) vztažnéh parametru( bílkviny) katal/g Čísl přeměny látkvé mnžství substrátu (ml) přeměněné mlem enzymu za časvu jedntku (s) k [s -1 ] Petr Zbřil 9/23/2014 3

4 Rychlst reakce Určující charakteristika dc/dt, z th pak aktivita Metdy stanvení Stanvení [P] neb [S] pak dc/dt Výhdnější [P], ale záleží na mžnstech metdy Spektrální absrpční, flurescenční aj., chemické, elektrchemické (ampermetrie), enzymvé (spřažené reakce) Vliv prstředí Optimální pdmínky aktivita Fter Text 9/23/2014 4

5 Rychlst reakce Pkles dc/dt dc/dt pr t = 0 Fter Text 9/23/2014 5

6 Vliv prstředí na rychlst enzymvé reakce Optimální pdmínky In viv fysilgické prstředí In vitr napdbení snaha I bvykle dpvídá 0,9% NaCl, výjimky, extrémy ph bvykle neutrální, výjimky, extrémy T teplkrevní x studenkrevní, mikrrganizmy aj. Denaturace x syntéza in viv Knvenční hdnty in vitr 30 C Další - regulátry Petr Zbřil 9/23/2014 6

7 Vliv ph Petr Zbřil 9/23/2014 7

8 Vliv teplty Petr Zbřil 9/23/2014 8

9 Linearita Petr Zbřil 9/23/2014 9

10 Kinetika enzymvé reakce Časvý průběh enzymvé reakce prestacinární a stacinární stav Petr Zbřil 9/23/

11 Stacin{rní kinetika k 1 k 3 E + S ES E + P v 1 = k 1.[E].[S] v 2 = k 2.[ES] k 2 k 4 v 3 = k 3.[ES] v 4 = k 4.[E].[P] (= 0) Za stacinárních pdmínek v 1 + v 4 = v 2 + v 3 k 1.[E].[S] + 0 = k 2.[ES] + k 3.[ES] = (k 2 + k 3 ).[ES] [E].[S] / [ES] = (k 2 + k 3 ) / k 1 = K m, pr k 2 k 3 K m = K s v 0 = k. [ES] V lim = k. [E] t = k.([e] + [ES]) V lim. [S] v 0 = K M + [S] Petr Zbřil 9/23/

12 v = f([s] [S]) 0 V lim. [S] v 0 = K m + [S] Rvnice Michaelise-Mentenvé - hyperblický průběh Speciální případy [S] K m [S] K m [S] = K m v 0 = V lim / 2 Petr Zbřil 9/23/

13 Stanvení kinetických parametrů Rektifikace vztahu Různé úpravy vynesení (Hanes, Hfstee aj.) Vynesení dle Lineweavera a Burka 1/v 0 = 1/f([S]) Rvnice přímky y = ax + b K M + [S] K M 1 1 1/v 0 = =. + V lim. [S] V lim [S] V lim Petr Zbřil 9/23/

14 Stanvení kinetických parametrů y = a. x + b K M + [S] K M 1 1 1/v 0 = =. + V lim. [S] V lim [S] V lim Petr Zbřil 9/23/

15 Stanvení kinetických parametrů Petr Zbřil 9/23/

16 Význam nalezených knstant K m je míru afinity substrátu k enzymu frmálně disciační knstantu kmplexu [ES] Není závislá na katalytickém mnžství (aktivitě enzymu) v pkusu, pkud pracujeme v blasti lineární závislsti v na [E] viz výše. Lze ji tabelvat a užít jak srvnávací parametr Mění se s externími parametry Liší se pr různé substráty téhž enzymu Alternativní přirzený x umělý, hex- a glukkinasa, izenzymy Ksubstráty NAD apd. (LDH) Vztah k metablickým htvstem pl V lim je ukazatelem aktivity enzymu, závisí na katalytickém mnžství enzymu v experimentu Dá se užít k vyjádření katalytické účinnsti a čistty enzymu. V těcht případech se vypčítá tzv. specifická aktivita jak pměr V lim a mnžství enzymu (typicky v mg bílkviny neznáme-li jeh M r neb pracujeme se směsí hmgenát, krevní sérum apd.) Známe-li látkvé mnžství enzymu, pak specificku aktivitu vztaženu na látkvé mnžství enzymu nazýváme číslem přeměny (TN): V lim / [E] [ml.s -1 /ml] = TN [s -1 ] = k cat Petr Zbřil 9/23/

17 Význam nalezených knstant Petr Zbřil 9/23/

18 Význam nalezených knstant Čísla přeměny Fter Text 9/23/

19 Význam nalezených knstant Knstanta specificity pměr k cat (vyšší účinnější katalýza) a K m (nižší větší afinita enzymu k substrátu) splehlivější ukazatel substrátvé specificity preference substrátů mdelvě estery, specificita k armatickým acylům Petr Zbřil 9/23/

20 Regulační aspekty Vliv [S] na rychlst Michaelisvská kinetika Alsterické enzymy - Oligmerní - Kperativita efektivní regulace - Neřídí se Michaelisvsku kinetiku Fter Text 9/23/

21 Mdulace rychlsti enzymvé reakce Metablický význam in situ Regulace metablismu Studium metablismu in vitr Objasnění mechanizmu půsbení enzymů Sučást regulací jak celku Způsby účinek metablitů, mdifikace apenzymu Mdulátry, efektry Psitivní aktivátry Negativní - inhibitry Petr Zbřil 9/23/

22 Inhibice enzymvé aktivity Typy inhibitrů Ireversibilní Vážu se pevně a nevratně Lze reaktivvat chemicku reakcí -SH inhibitry Reversibilní Interagují s enzymem vratně Dají se dstranit např. dialýzu, gelvu chrmatgrafií snížení [I] Kmpetitivní Nekmpetitivní Akmpetitivní. Další Fter Text 9/23/

23 Ireverzibilní inhibice Mdifikační činidla Studium aktivníh centra Organfsfáty Fter Text 9/23/

24 Ireverzibilní inhibice SH-inhibitry Alkylační činidla, rtuťnaté slučeniny (PCMB) Regenerace SH, ME, BAL Fter Text 9/23/

Reverzibilní inhibice Kmpetitivní Inhibitr se váže d aktivníh místa Strukturní pdbnst se substrátem Sutěžení inhibitru se substrátem Nekmpetitivní

25 Reverzibilní inhibice Kmpetitivní Inhibitr se váže d aktivníh místa Strukturní pdbnst se substrátem Sutěžení inhibitru se substrátem Nekmpetitivní Inhibitr se váže jinak Substrát nevlivní vazbu inhibitru Akmpetitivní Inhibitr se váže na kmplex ES Alsterická Vazba na jinu pdjedntku Fter Text 9/23/

26 Kmpetitivní inhibice Inhibice SDH malnátem Jantaran (sukcinát) je substrátem enzymu sukcinátdehydrgenasy (vzniká fumarát) Malnát je kmpetitivním inhibitrem SDH (nelze h dehydrgenvat) Strukturní pdbnst, někdy bývá méně názrná (el. hustty) Určení typu inhibice kineticky Fter Text 9/23/

27 Kmpetitivní inhibice Inhibice DHF reduktasy Antimetablit, cytstatikum Další analga Fter Text 9/23/

28 Kmpetitivní inhibice Kmpetitivní inhibitr reaguje s vlným enzymem a sutěží se substrátem vazné míst v aktivním centru. Může se navázat puze na vlný enzym V reakční směsi se pak vyskytuje mim E, S a ES ještě EI (kmplex enzym-inhibitr), který se tvří vratně mezi vlným enzymem a inhibitrem Fter Text 9/23/

29 Kmpetitivní inhibice Kinetická analýza Oprti neinhibvané reakci zahrnuje dále K i = [E]. [I] / [EI] a pak [E] t = [E] + [EI] + [ES] v = V lim. [S] / [K m (1+ [I]/ K i ) + [S]], kde K m (1+ [I]/ K i ) = K app a p rektifikaci 1/v = 1/ V lim + K app / V lim. 1/[S] Výraz K app nazýváme zdánlivu Michaelisvu knstantu V lim se nemění je vyšší než skutečná přím úměrně [I] a nepřím K i vliv kmpetice Fter Text 9/23/

30 Kmpetitivní inhibice Grafické vyjádření tét závislsti vidíme na vynesení dle Lineweavera a Burka Fter Text 9/23/

31 Nekmpetitivní inhibice Inhibitr není pdbný substrátu - váže se jak na vlný E tak kmplex ES - Vytváří kmplex EI - [EI] nezávisí na [S], ale puze [I] E t + I = EI Fter Text 9/23/

32 Nekmpetitivní inhibice Zavedením d základní rvnice Michaelise a Mentenvé pak dstáváme v = (V lim. [S]) / (K m + [S]).(1+ [I]/K i ) a p rektifikaci 1/v = (1/ V lim + K m /V lim. 1/[S]). (1+ [I]/K i ) K m se nemění V lim se snižuje úměrně pměru [I]/K i Fter Text 9/23/

33 Nekmpetitivní inhibice Grafická analýza dle Lineweavera a Burka Fter Text 9/23/

34 Stejná aktivita Liší se apenzym Pdjedntkvé slžení Kinetické dlišnsti Příklad LDH Isenzymy Fter Text 9/23/

35 Orgánvá specificita Isenzymy Fter Text 9/23/

36 Zymgeny - prenzymy Neaktivní frmy Psttranslační mdifikace Význam prteázy Fter Text 9/23/

37 Organizace enzymů Efektivita reakcí Typy Katablické jedndušší Anablické význam rganizvansti enzymy vlně rzpuštěné (cytplasma glyklýza) multienzymvé kmplexy (zvl. pr anablické pchdy syntéza MK, ale i katablické pchdy využití energie) membránvě vázané enzymy (rganizvanst, vektriální průběh reakcí využití energie xidační a ftsyntetická fsfrylace) Fter Text 9/23/

38 Praktické využití enzymů Průmyslvé využití Prací prstředky Krmivářství Ptravinářství Farmacie Lékařství Diagnstika Analyt, nástrj Terapie Substituční, pdpůrná, speciální Bianalytická chemie Stanvení substrátů Stanvení inhibitrů Enzymvá katalýza v rganické chemii Stereselektivita, kmbinace metd Fter Text 9/23/

Podobné dokumenty

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í ENZYMY

= látky, které... bilgické reakce I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í 1. Vedu reakci reakčním mechanismem, který má nižší... energii 2. Reakce katalyzvané enzymy prbíhají za mírnějších