Využití HPLC v analýze potravin

Transkript

1 Využití HPLC v analýze potravin HPLC aplikace 1

2 HPLC aplikace 2

3 HPLC aplikace 3

4 Stanovení přirozených složek potravin HPLC aplikace 4

5 Lipidy Nasycené a nenasycené triacylglyceroly zpracování potravin Nízká stabilita triacylglycerolů obsahujících nenasycené mastné kyseliny Reakce se světlem a kyslíkem vznik hydroperoxidů ovlivnění chuti a kvality tuků Falšování přídavkem jiných tuků, použití ztužených tuků stanovení obsahu triacylglycerolů (př. falšování olivového oleje) Stanovení triacylglycerolů, hydroperoxidů, sterolů a vitaminů UV-DAD spektra stopy hydroperoxidů nasycené x nenasycené triacylglyceroly Př. nenasycené triacylglyceroly v olivovém oleji charakteristické spektrum Příprava vzorku extrakce petroletherem, rozpuštění v THF HPLC aplikace 5

6 Profil triacylglycerolů Starý slunečnicový olej Odezva při 240 nm hyroperoxidy HPLC aplikace 6

7 Analýza olivového oleje 280 nm konjugované dvojné vazby špatná kvalita oleje HPLC aplikace 7

8 Profil triacylglycerolů v olivovém oleji HPLC aplikace 8

9 Mastné kyseliny Stanovení nenasycených mastných kyselin C 4 -C 22 Př. máslo a margariny se liší v zastoupení kyseliny máselné v triacylglycerolech Stanovení jednotlivých mastných kyselin Hydrolýza (horký metanol a KOH), online derivatizace (bromid fenacylbromidu - zavedení chromoforu) -HPLC/UV HPLC aplikace 9

10 Složení tuku HPLC aplikace 10

11 Sacharidy Glukosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, mannitol, sorbitol, laktosa, maltosa, cellobiosa, sacharosa Nepřítomnost chromoforu nebo fluoroforu: nelze UV-VID nebo FLD RID hladiny mg/kg Elektrochemická detekce - hladiny µg/kg Příprava vzorku (dle matrice): odplynění, filtrace, extrakce, SPE přečištění HPLC aplikace 11

12 Stanovení sacharidů HPLC aplikace 12

13 Vitamíny Přírodní i syntetické Zlepšení nutriční hodnoty potravin Ve vodě rozpustné vitaminy: C, B 6, B 2, B 1, B 12 V tuku rozpustné vitaminy: E, D, A Hladiny µg/kg Labilní (světlo, teplo) UV, DAD kvalitativní i kvantitativní stanovení Elektrochemická detekce HPLC aplikace 13

14 UV detekce HPLC aplikace 14

15 Elektrochemická detekce Vitaminový přípravek HPLC aplikace 15

16 V tuku rozpustné vitaminy UV detekce HPLC aplikace 16

17 V tuku rozpustné vitaminy Elektrochemická detekce HPLC aplikace 17

18 Tokoferoly normální fáze HPLC aplikace 18

19 Stanovení tokoferolů v extraktu margarinu FLD detekce HPLC aplikace 19

20 Biogenní aminy Stanovení biogenních aminů Volné aminy přítomny v potravinách a nápojích (ryby, sýry,víno, pivo) Maximální přípustné hladiny MRL derivatizace HPLC aplikace 20

21 UV detekce Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid) HPLC aplikace 21

22 Aminokyseliny Primární a sekundární aminokyseliny v jednom stanovení Stanovení původu masných výrobků falšování potravin Chirální stacionární fáze stanovení D a L formy Automatická online derivatizace -předkolonová, FLD detekce Příprava vzorku: hydrolýza (HCL, enzym) HPLC aplikace 22

23 STANOVENÍ AMINOKYSELIN Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin - převedení aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy volných aminokyselin Analytická koncovka přesnost, správnost, rychlost HPLC Separace - ionexy (automatické analyzátory aminokyselin) reverzní fázi - oktadecyl (C18), gradientová eluce Detekce a kvantifikace po předchozí deprivatizaci Derivatizace před i za kolonou, UV i fluorescenční detekce interní standard kompenzuje: nižší výtěžky derivatizační reakce ztráty při přípravě vzorku variabilní objem při nástřiku vzorku Jako vnitřní standardy se používají: norleucin, norvalin, α- aminomáselná kyselina, β-aminomáselná kyselina, γ-aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj. HPLC aplikace 23

24 Derivatizační činidla o-phthaldialdehyd (OPA) 9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) Ninhydrin Dansylchlorid AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát) Phenylisothiokyanát (PITC) HPLC aplikace 24

25 o-phthaldialdehyd (OPA) Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s primárními aminokyselinami - rychlá, za laboratorní teploty Výhoda - sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenci excitační maxima 340 nm, emisní maxima 450 nm Nevýhoda - reaguje pouze s primárními aminokyselinami HPLC aplikace 25

26 Separace OPA derivátů aminokyselin Chromatografické podmínky Gradient: solvent A: 15 mm Na2HPO4 ph 7,2/tetrahydrofuran (96+4); solvent B: 15 mm Na2HPO4/CH3OH/CH3CN ( ). Průtok: 3,5 ml/min; program: % B/A, 27 min. Kolona: Radial Pak 5 µm C18 cardtridge. HPLC aplikace 26

27 Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel používaných k derivatizaci aminokyselin Charakteristika OPA FMOC-Cl Ninhydrin Dns-Cl AQC PITC Detekce FLD FLD UV UV (FLD) FLD UV Citlivost fmol fmol µmol pmol (nmol) fmol pmol Stabilita derivátu špatná dobrá -- dobrá dobrá střední Rychlost derivatizace rychlá rychlá malá malá rychlá střední Sekundární aminokyseliny ne ano ano ano ano ano Interference reagentu ne ano ne ano ano ano Interference matrice malý střední ne malý ne vysoký HPLC aplikace 27

28 Stanovení aminokyselin v pivu po derivatizaci (OPA) HPLC aplikace 28

29 Stanovení aminokyselin v bramborách (HPLC/FLD v reverzní fází, derivatizace OPA) %F asparagin glutamin homoserin kyselina asparagová kyselina glutamová min Podmínky stanovení: analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5µm) analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) teplota kolony: 30 C mobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mm Na2EDTA; methanol (Merck); ph 6,4 gradientová eluce: 0 15 min % methanolu min. 50 % methanolu průtok: 0,7 ml/min nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo vnástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu FLD detektor: λex = 340 nm; λem = HPLC 455 nm aplikace 29

30 D,L-alanin Chirální separace optických izomerů kolona : 25 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil Chiral-1 eluent : 1 mm vodný roztok (CH3COO)2Cu (ph = 5,6) průtok eluentu : 1,2 ml/min teplota : 60 C detekce : UV 240 nm 1. D-alanin 2. L-alanin HPLC aplikace 30

31 Bílkoviny kolona : 25 cm x 9,4 mm stac. fáze : Zorbax GF-250 eluent : 130 mm NaCl + 20 mm KCl + 50 mm Na2HPO4 (ph = 7,0) průtok: 1 ml/min detekce : UV 210 nm 1. myší IgM, Mh = hovězí thyroglobulin, Mh = β-amylasa z brambor, Mh = hovězí serum albumin, Mh = kuřecí albumin, Mh = hovězí RNAasa, Mh = azid (tmax), Mh = 65 HPLC aplikace 31

32 Stanovení peptidů fytochromu V semenech ovsa rostoucích ve tmě HPLC/UV a MS detekce UV mapování HPLC aplikace 32

33 Stanovení peptidů fytochromu semena ovsa rostoucí ve tmě LC-MS TIC MS spektrum T12 a T58 HPLC aplikace 33

34 Deriváty purinu kolona : 30 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil 50-5 eluent : methanol-voda-dichlormethan 47:17:936 (v/v/v) průtok: 0,8 ml/min detekce: UV 280 nm 1. kofein 2. theofyllin 3. theobromin HPLC aplikace 34

35 HPLC/UV analýza fytoestrogenů (po SPE přečištění) mau A) Daidzein Genistein přečištění SPE min mau B) B) Daidzein Genistein bez přečištění min HPLC aplikace 35

36 Stanovení glykoalkaloidů v rajčatech LC-MS/MS VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\ D) VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\ D) mau 250 Porovnání HPLC-UV a LC-MS/MS metody R40 56,8mg/kg RT:0,00-14,99 SM:15G Tomatin 77,01 mg/kg RT: 11,30 MA: SN: 1333 NL: 1,04E7 m/z= 1016,0-1017,0 F: + c ESI SRM ms2 1034,60@34,00 [ 1015, ,60] MS R Relative Abundance ST 37 µg/ml Dehydrotomatin 2,51 mg/kg RT: 9,84 MA: SN: 439 NL: 1,94E5 m/z= 1014,0-1015,0 F: + c ESI SRM ms2 1032,90@38,00 [ 1013, ,50] MS R Time(min) min HPLC-UV a LC-MS/MS chromatogram vzorku R40 (zelené rajče) LC-MS/MS 20x nižšího LOD, lepší opakovatelnost a výtěžnost ve srovnání s HPLC-UV (vhodná pro zralá rajčata) Parametry metody HPLC-UV LC-MS/MS Analyty Tomatin Dehydrotomatin Tomatin Dehydrotomatin Opakovatelnost 4% 2,6% 3,1% Výtěžnost Detekční limit (LOD) Mez kvantifikace (LOQ) 85,0% (100 mg/kg) 2 mg/kg 6 mg/kg 94,4% (9 mg/kg) 82,9% (0,9mg/kg) Nelze stanovit 0,1 mg/kg HPLC aplikace 0,05 mg/kg 36 0,3 mg/kg 0,15 mg/kg

37 Potravinářská aditiva HPLC aplikace 37

38 Acidulanty a regulátory kyselosti Kyselina sorbová a citrónová Octová, propionová, jantarová, adipová, mléčná, fumarová, jablečná, vinná kyselina Ochucovadla - zintenzivnění chuti, maskování nežádoucích pachutí Pufrování kontrola ph (zpracování potravin, finální výrobky) Konzervační prostředky, zamezení růstu mikroorganismů Prevence žluknutí a hnědnutí antioxidační účinky Úprava viskozity pečených výrobků Přídavky při tavení - tavené sýry, cukrovinky Zlepšení barvy a chuti při konzervování masa Destilace s vodní parou, SPE HPLC UV/DAD HPLC aplikace 38

39 Bílé víno HPLC aplikace 39

40 Citrónová kyselina ve vodce HPLC aplikace 40

41 Antioxidanty HPLC aplikace 41

42 HPLC/UV-VIS (DAD) antioxidantů Žvýkačka HPLC aplikace 42

43 Konzervační prostředky Benzoová kyselina Sorbová kyselina Propionová kyselina Methyl-, ethyl-, propyl- estery p-hydroxy benzoové kyseliny (PHB.methyl, PHB-ethyl, PHB-propyl Inhibice růstu mikroorganismů Prodloužení životnosti potravin HPLC aplikace 43

44 HPLC/UV-VIS (DAD) HPLC aplikace 44

45 Umělá sladidla Acesulfam Aspartam Sacharin Nízkokalorická sladidla: nápoje Regulace hladin legislativa Možný toxický účinek HPLC aplikace 45

46 Aspartam On-column derivatizace, PR chromatografie Srovnání spektra derivatizovaného (OPA) a nederivatizovaného aspartamu HPLC aplikace 46

47 Syntetická barviva Použití: při zpracování potravin ve farmaceutickém průmyslu v chemickém průmyslu Zakrytí kazů, zvýraznění barvy potravin, zamaskování vlivů zrání a stárnutí Zlepšení přitažlivosti potravin Kontrola kvality, stanovení stopových koncentrací původních látek a degradačních produktů vývoj citlivých a selektivních analytických metod HPLC/UV-VIS -charakteristická maxima 400 nm (žlutá) 500 nm (červená) nm (zelená, modrá, černá ) HPLC aplikace 47

48 Syntetická barviva v limonádě Spektra žlutého, červeného, modrého a černého barviva HPLC aplikace 48

49 Ochucovadla Zlepšení chuti potravin Nejčastěji použité látky: Esenciální oleje (silice), hořké látky, ostré pálivé látky Příklady: Lupulon a humuklon (hořké látky chmele) Vanilin Naringenin a hesperidin (hořké látky) Nejčastěji používaná metoda: GC (head-space, SPME) HPLC málo těkavé látky, tepelně nestabilní látky HPLC aplikace 49

50 Vanilin HPLC/UV, RP Kvalita extraktu vanilinu HPLC aplikace 50

51 Stanovení vanilinu v koňaku Identifikace srovnáním spekter HPLC aplikace 51

52 Hořké látky: hesperidin a naringenin Pomerančový džus HPLC/UV, RP HPLC aplikace 52

53 Rezidua a kontaminanty HPLC aplikace 53

54 Aplikace v reziduální analýze Analýza stopových množství sledovaných látek: -vysoká citlivost analytické metody -nízké meze stanovitelnosti (závisejí na citlivosti a šumu použitého detektoru, na zředění látky při průchodu kolonou a na rušivých vlivech daných složkami mobilní fáze či kontaminanty v mobilních fázích nebo v analyzovaném vzorku. Pro ideální (gaussovský) profil píku lze odvodit vztah mezi výškou píku, zaznamenaného detektorem, a koncentrací látky ve vzorku, dávkovaném do chromatografu, Zlepšení citlivosti -ovlivnění faktorů na pravé straně rovnice, tak aby byla výška píku maximální. Snížení mezí detekce -zvýšení odstupu signálu od šumu Snížení šumu - termostatovaná kolona a cela detektoru, použití čerpadel se stabilním hladkým průtokem, mobilních fází připravených z velmi čistých složek (zejména při gradientové eluci), důkladně odplyněných a přečištěním vzorku HPLC aplikace 54

55 Nejčastější aplikace Stanovení reziduí léčiv (stanoveny MRL) (dobytek drůbež, maso, mléko, vejce ; působení rezistence) Chemoterapeutika (sulfonamidy, antibiotika ) Antiparazitika hormony Mykotoxiny Polyaromatické uhlovodíky Pesticidy Příklady: HPLC aplikace 55

56 Rezidua léčiv ve vzorcích vajec HPLC/UV-VIS (DAD); RP HPLC aplikace 56

57 Stanovení reziduí tetracyklinů v mase HPLC/UV-VIS (DAD); RP LOD 0,1 mg/kg HPLC aplikace 57

58 Mykotoxiny: Fumonisiny - Fusarium monoliformae LC/MS MS spektra fumonisinu B1, 2, 3 HPLC aplikace 58

59 Identifikace fumonisinů ve vzorcích kukuřice, Následná konfirmace dle fragmentových iontů HPLC aplikace 59

60 Mykotoxiny HPLC aplikace 60

61 Mykotoxiny HPLC aplikace 61

62 Mykotoxiny Aflatoxiny HPLC UV/FLD HPLC aplikace 62

63 HPLC/FLD stanovení zearalenonu Porovnání přečištění pomocí SPE a GPC LU 250 FLD1 A, Ex=235, Em=440 (ZEARAL~1\ZEARAL~1\MNZ60302\SPIKE1A.D) A P Ř E Č IŠTĚNI SPE IMUNOAFINITNÍ SORBENT ZEA (32 ng) LU FLD1 A, Ex=235, Em=440 (ZEARAL~1\ZR200202\SARKA-I.D) B PŘEČIŠTĚNI GPC Bio Beads S-X ZEA (25 ng) Area: min min Zearalenon manuálně x ASPEC SPE -výtěžnost 109 % 92 % SPE -opakovatelnost 31 % 3 % HPLC aplikace 63

64 Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt z tuňáka; 0,2 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace 64

65 Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt ze sardinek; 20 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace 65

66 Pesticidy Rezidua pesticidů ve vzorku salátu Carbendazim výtěžnost pouze 40% HPLC aplikace 66

67 Stanovení reziduí pesticidů ve vzorcích papriky HPLC aplikace 67

68 Karbamáty Nesystémové insekticidy HPLC/FLD Pokolonová derivatizace (OPA/NaOH) Materiál: ovoce, zelenina HPLC aplikace 68

69 Karbamáty Analýza standardů HPLC aplikace 69

70 Glyfosát systémový herbicid HPLC/FLD Pokolonová derivatizace Standard HPLC aplikace 70

71 FUNGICIDY oextrace z ovoce: dichlormetan Kolona: Nucleosil 7 C18 eluent : 5 g/l kys. mravenčí + NaOH o (ph 7,5) 40 % se 60 % methanolu o 1. thiabendazol 2. o-fenylfenol 3. Difenylamin 4. Ethoxychin 5. bifenyl HPLC aplikace 71

72 PAH HPLC/DAD UV spektrum HPLC aplikace 72

73 Parametry DAD a FLD stanovení HPLC aplikace 73

74 LOD: DAD, FLD HPLC aplikace 74

75 IDENTIFIKACE / KVANTIFIKACE - HPLC/FLD (po GPC přečištění) LU FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\DATAHP~1\DATA98\MT98OLEJ\ D) olej, 10 mg matrice v nástřiku l ex/em 216/336 nm Naph Ace Fln Phe Ant Flt Pyr B[a]A Chr B[b]F B[k]F B[a]P DB[ah]A B[ghi]P I[cd]P LU FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\HPCHEM\FLD154-4\DATA\MT00X904\ D) l ex/em 216/336 nm jablka, 250 mg matrice v nástřiku min Naph Ace Fln Phe Ant Flt Pyr B[a]A Chr B[b]F B[k]F B[a]P DB[ah]A B[ghi]P I[cd]P 100 HPLC aplikace min