CERTIFIKOVANÁ METODIKA

Transkript

1

2 VÝZKUMNÝ ÚSTAV ŽIVOČIŠNÉ VÝROBY,..i. Praha Uhříněes VÝZKUMNÝ ÚSTAV VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ,..i. Brno CERTIFIKOVANÁ METODIKA ZÁKLADY HODNOCENÍ MORFOLOGICKÉHO OBRAZU SPERMIÍ KANCE Autoři Ing. Jan Lipenský, DiS. (podíl práce 40 %) Ing. Alena Lustykoá, Ph.D. (podíl práce 10 %) Ing. Mirosla Rozkot, CSc. (podíl práce 5 %) Ing. Ea Václakoá, Ph.D. (podíl práce 5 %) MVDr. Petra Přinosiloá, Ph.D. (podíl práce 25 %) MVDr. Jarosla Šípek (podíl práce 5 %) MVDr. Monika Kunetkoá (podíl práce 5 %) RNDr. Věra Kopecká, Ph.D. (podíl práce 5 %) Oponenti prof. Ing. Jiří Rozinek, CSc. Česká zemědělská unierzita Praze MVDr. Jan Bažant Státní eterinární spráa Metodika je ýsledkem řešení ýzkumného projektu NAZV č. QI111A

3 ISBN

4 Tato certifikoaná metodika je ěnoána doc. Josefu Čeřoskému DrSc., prof. MVDr. Zdeňku Věžníkoi DrSc. a prof. MVDr. Oldřichu Roboi, DrSc., kteří se zasloužili o rozoj reprodukčních biotechnologií chou hospodářských zířat.

5 OBSAH I. CÍL METODIKY... 6 II. VLASTNÍ POPIS METODIKY Popis metodiky Úod Morfologicky abnormální spermie Vyhotoení nátěru spermatu Barení kančích spermií pro potřeby morfologického yšetření Barení kančích spermií dle Čeřoského Přípraa barících roztoků Vlastní barení preparátu Barení kančích spermií dle Farellyho Přípraa barících roztoků Vlastní barení preparátu Hodnocení morfologického obrazu spermií kance Základní hodnocení Podrobné hodnocení MAS Striktní metoda hodnocení morfologie spermií Hodnocení morfologického obrazu spermií s yužitím počítače DeSMA Počítačoé programy yužíající propojení mikroskopu a počítače Záěr Obrazoý přehled patologických změn kančích spermií III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ IV. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY V. EKONOMICKÉ ASPEKTY VI. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY VII. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE... 32

6 I. CÍL METODIKY Cílem metodiky je předložit odborné eřejnosti a zejména pak praconíkům inseminačních stanic komplexní metodický náod, umožňující snadné proniknutí do popsaného tématu a plně samostatné zládnutí celého procesu hodnocení morfologického obrazu spermií kance. II. VLASTNÍ POPIS METODIKY 1 Popis metodiky Metodika poskytuje ucelenou informaci o šech klíčoých bodech týkajících se hodnocení morfologicky abnormálních spermií kance. Díky ní tak má užiatel možnost seznámit se s procesem přípray zorku hodnoceného semene spolu s postupy a metodami jeho lastního hodnocení. Součástí metodiky je detailní obrazoá dokumentace ad spermií kance. 2 Úod Sledoání a hodnocení morfologického obrazu spermií je spolu s hodnocením motility spermií nejdůležitějším praktickým ukazatelem kality spermatu. Zatímco kantitatiní ukazatele jako objem spermatu nebo koncentrace spermií lze určit elice snadno a rychle, hodnocení kalitatiních ukazatelů spermatu je nepoměrně náročnější, neboť yžaduje mnohem íce znalostí a zkušeností. Vyhodnotit motilitu spermatu je šak pro zkušeného praconíka rutinní úkol, který je sice nezbytný, ale zároeň i elmi rychlý a díky tomu celý proces zpracoání spermatu příliš nezatěžuje. Problém nastáá až případě hodnocení morfologického obrazu spermií. Jedná se o úkon, který klade ysoké nároky na znalosti a zkušenost laboranta, přičemž je lastním proedením značně časoě náročný. Naíc je nutné hodnocený zorek náležitě připrait, tj. nanést na podložní sklíčko e formě nátěru a ten pak fixoat a obarit. Tyto faktory e sém důsledku edou k elmi omezenému sledoání a hodnocení morfologického obrazu spermií e spermatu kanců, resp. inseminačních dákách. Bylo přitom opakoaně zdokumentoáno, že zýšený ýskyt morfologicky abnormálních spermií (MAS) inseminačních dákách má přímý li na ýsledky inseminace, tj. na březost a elikost rhu. V praxi přitom nízká frekence sledoání MAS neodpoídá důležitosti tohoto ukazatele pro lastní reprodukční proces. Nedostatek zkušeností s hodnocením MAS rámci lastních kapacit pak mnohdy nutí management inseminačních stanic k oěřoání ýskytu MAS u externích pracoišť, které ze sé podstaty není ani časté ani rychlé. V horším případě pak může docházet k podcenění rizik spojených se zýšeným ýskytem MAS ejakulátech kanců a inseminačních dákách. 3 Morfologicky abnormální spermie Pojem morfologicky abnormální spermie (MAS) zahrnuje šechny spermie, na kterých se yskytují ady odlišující hodnocenou spermii od morfologicky normálního stau. Zahrnuje sobě jak ady běžně označoané za patologické, tak ady, které lze označit za fyziologické, přičemž se do patologických nezapočítáají. Takoou adou je kapka e stádiu migrace neboli distální protoplazmatická (cytoplazmatická) kapka (kapénka), kterou je možné nalézt na bičíku spermie. V průběhu procesu dozráání mají šechny spermie tuto kapénku. Ta by se měla postupně z bičíku uolnit, přičemž za ideálních okolností 6

7 by už neměla být ejakulátu přítomna. Názory jak přistupoat k hodnocení distální kapénky se různí, nicméně i když není započítáána do patologií, zůstáá faktem, že se jedná o adu nežádoucí. Vysoký ýskyt této ady je spojoán s horšími ýsledky inseminace. Není bez zajímaosti, že průběhu přípray a skladoání inseminačních dáek může postupně docházet k úbytku distálních kapének na spermiích. Dokonce může dojít k jejich úplnému ymizení. Výskyt této ady ejakulátu může naznačoat, že kanec je příliš přetěžoán, nebo že funkční úroeň jeho pohlaního systému je nízká, předeším pak nadarlat. V ejakulátech se běžně yskytuje i kapénka proximální. Ta už je ošem řazena přímo do ad patologických. Důodem, proč se ěnoat tématu detekce MAS ejakulátech kanců, je ýznamný li ýskytu MAS na ýsledky inseminace. Stanoení množstí MAS ejakulátu tak může hrát důležitou roli možném odhadu fertility kanců. Výskyt některých ad může být roněž průodním znakem špatného zdraotního stau kance, nebo jeho přetěžoání. Na jejich ýskytu se roněž podepisuje široká škála dalších faktorů, četně těch genetických. Známý je kupříkladu li ysokých letních teplot, které se mohou zhledem k dlouhému ýoji spermie projeit až za elmi dlouhou dobu. Určitý li na ýskyt MAS může mít i zkracující se fotoperioda. Druhá poloina roku je tak z pohledu ýskytu MAS obykle horší než prní poloina roku. V neposlední řadě má ýznamný li na ýskyt MAS i lastní úroeň práce s ejakulátem. Neodbornou manipulací může snadno dojít k nežádoucímu poškození spermií. Otázka procentuálního zastoupení patologických spermií ejakulátech je stále předmětem diskusí. Obecným doporučením je nepřekročit maximum 25 % patologických spermií u šech ejakulátů kance použitých inseminaci. Optimálním řešením je zahrnout do tohoto procenta i obsah distálních kapek. Nutno ošem podotknout, že do ýsledků inseminace se může negatině promítnout i yužíání ejakulátů splňujících toto kritérium jen elmi těsně. V této ěci jsou tak mnozí autoři ještě přísnější, přičemž doporučují maximum 20 % jako horní hranici pro ýskyt šech patologických ad ejakulátech určených k inseminaci. Uádí se, že z pohledu inseminace lze poažoat za plně fertilní jen takoé kance, u kterých je ýskyt ad spermií ejakulátu do 10 %. V souislosti s uedenými limity je dobré zmínit fakt, že i elmi kalitní ejakuláty kanců jsou obecně zatíženy alespoň minimálním ýskytem MAS. Lze tedy říci, že každý ejakulát kance obsahuje nějaké nežádoucím způsobem utářené nebo změněné spermie. Morfologické yšetření spermií patří mezi nejobjektinější metody posuzoání kalitatiní úroně ejakulátů. Nicméně schopnost hodnotícího posoudit spráně šechny ady má zásadní li na ýsledek tohoto yšetření. Při posuzoání spermií je pozornost zaměřena na hlaičku, krček, spojoací část a bičík. Výskyt ad tak lze očekáat na šech částech spermie. Základní klasifikace změn na spermiích je podle půodu zniku. Prní skupina jsou ady ýojoé (primární), druhá skupina jsou ady získané (sekundární). Primární ady zahrnují zejména období ýoje spermie. Sekundární změny znikají až po definitiním morfologickém ukončeni ýoje spermie, přičemž mohou zniknout už při procesu dozráání a uchoáání spermií pohlaních ýodných cestách. Vli na jejich znik může mít působení celé řady nějších faktorů, jako je např. změna ph prostředí, chladoý šok, šok z ředění, nehodné ředidlo nebo stárnutí inseminační dáky. K těmto liům je obzláště citliá membrána akrozomu. Z možných ad se zdaleka nejčastěji yskytují cytoplazmatické kapénky (proximální i distální). K dalším častým nálezům lze například řadit zbobtnalý akrozom, ohnutí bičíku až do stádia smyčky, změněnou bázi hlaičky nebo abnormální tar hlaičky. U frekence ýskytu Ekatoriální segment Kalíšek Akrozom Krček Hlaičk Základní popis spermie Spojoací část Hlaní část bičíku Koncoá část bičíku 7

8 ad spermií je zajímaostí, že ejakuláty některých kanců opakoaně tíhnou k zýšenému ýskytu určité ady. Pro některého kance je pak například typický zýšený ýskyt hruškoitých hlaiček, zatímco pro jiného například častější ýskyt určitých defektů akrozomu. 4 Vyhotoení nátěru spermatu Pokud chceme yhodnotit morfologický obraz spermií, je nutné si nejpre připrait nátěr hodnoceného spermatu. Nejyšší ypoídací hodnotu o ýskytu MAS ejakulátu plemeníka mají nátěry připraené z natiního ejakulátu. Důležité je si uědomit, že ýsledné hodnocení bude odrážet sta zorku okamžiku jeho proedení. Vzorek spermatu nebo inseminační dáka, ze které bude nátěr proeden tak yžaduje naprosto stejné zacházení jako zbytek zpracoáaného spermatu nebo inseminačních dáek. Přípraa nátěru je elmi jednoduchý úkon, nicméně jeho proedení a ýsledná kalita mají nemalý li na možnosti jeho dalšího yšetření. Z tohoto důodu nelze opomenout základní zásady jeho přípray. Při jejich ignoroání nebo neznalosti se může stát, že zbytečně zýšíme množstí sekundárních ad spermií, případně bude hodnocení nátěru elice obtížné. Sperma nebo inseminační dáky, ze kterých bude nátěr připraoán, musí být dobře promíchány. V profesionálních podmínkách jsou obykle připraoány minimálně da nátěry. Je tomu tak z důodů zýšení ěrohodnosti záěrů, pro případné poronání ýsledků z různých barících postupů a neposlední řadě z preentiních důodů, tj. předejití nepředpokládaného znehodnocení nátěru. Podložní sklíčka, na která bude nátěr nanesen, by měla být zcela noá a čistá. Sklíčko nesmí být jakkoli mastné a z tohoto důodu je nutné yaroat se dotyku prstů na ploše určené pro lastní nátěr. Sklíčko s nátěrem musí být ždy označeno! Doporučený postup přípray nátěru je i s popisem ueden přiloženém schématu. Základním cílem je tenký a dobře hodnotitelný nátěr spermatu. Pokud příliš ysoká koncentrace spermií znemožňuje i přes kalitní proedení nátěru jeho bezproblémoé yšetření, lze přistoupit k naředění zorku spermatu, ze kterého bude nátěr zhotoen. Vhodným Potřeby na příprau nátěru: ýhřená deska, mikropipeta na 10µl, podložní sklíčka. médiem je např. fyziologický roztok o odpoídajícím ph, tj. hodnota cca 7,2 pro kance. Kalitu yhotoeného nátěru je ždy lepší oěřit pod mikroskopem. To zejména platí případech, kdy si ýsledkem sé práce nejsme jistí, nebo s přípraou nátěrů chybí dostatek zkušeností. K lastnímu oěření stačí mikroskop, který je běžně použíán k hodnocení motility, přičemž zětšení 100 je již plně dostatečné. Jednotlié spermie by měly být dobře iditelné a bez přílišného překrytí. Nátěr je nutné yhotoit znou, obzláště těch případech, kdy došlo k eidentnímu poškození spermií důsledku chybného proedení nátěru, nebo se spermie yskytují e íce rstách a překrýají se tak, že je od sebe nelze dobře rozlišit. Velmi hustý, neodborně proedený nátěr může oko zkušeného laboranta poznat na prní pohled. Takto nehodné proedení se iditelně projeí zejména při následném barení preparátu, kdy dochází k neúměrnému ulpíání použité bary. Příliš silná rsta naneseného spermatu ede nejenom k masinímu překrýání spermií, ale také zabraňuje dostatečnému probarení spermií. Po oěření kality proedení a před jakoukoli další manipulací nechte nátěr zaschnout. K tomu lze yužít ýhřenou desku o teplotě 33 C, případně lze nechat nátěr zaschnout při laboratorní teplotě. 8

9 Schéma přípray nátěru spermatu: Na podložní sklíčko naneseme pipetoací špičkou kapku spermatu o objemu 10 µl. Lze také použít skleněnou tyčinku a nanést s její pomocí kapku spermatu cca 3/4 šíři kratšího okraje podložního sklíčka. Nanesená linie spermatu by neměla být příliš objemná a zároeň je hodné, aby byla umístěna s dostatečným odstupem od kratšího okraje. Takto ponechaný prostor slouží pro popis sklíčka a usnadňuje pozdější manipulaci s nátěrem. Poté si připraíme druhé, tz. roztěroé sklíčko. Jako roztěroé sklíčko lze použít další sklíčko podložní, případně jiné menší sklíčko, přičemž je ždy podmínkou alespoň jedna zcela roná a nepoškozená hrana. Tato roná hrana by zároeň neměla být širší než podložní sklíčko, na kterém lastní nátěr proedeme. Roztěroým sklíčkem se pod mírným úhlem (optimálně 45 ) přibližujeme ke kapce spermatu tak, aby jeho roná hrana byla kontaktu s podložním sklíčkem. V okamžiku, kdy dojde k dotyku přiložené hrany roztěroého sklíčka se spermatem, nanesené sperma ulpí na takto přiloženém sklíčku. Následně můžeme yhotoit lastní nátěr. Roztěroým sklíčkem proedeme jednorázoý plynulý tah do směru, ze kterého jsme se ke spermatu přiblížili. Nikdy naopak! Přitom je nutné udržoat alespoň mírný úhel směrem k půodní linii naneseného spermatu. Zásadou je ždy neztratit kontakt s podložním sklíčkem, nepřerušoat ho průběhu celého tahu a jakkoli se neracet zpět e snaze oprait nedostatky proedeném nátěru. Uedený postup nám umožňuje yhnout se situacím, kdy se sperma dostane před roztěroé sklíčko. Díky tomu tak nedojde k poškození spermií, které by jinak mohly ulpět pod hranou roztěroého sklíčka. Zároeň také platí, že je tímto postupem možné dosáhnout elmi tenkého nátěru, který je pak zárukou kalitně připraeného preparátu. 9

10 kapka spermatu Kontrola hustoty nátěru dobrý nátěr. Kontrola hustoty nátěru hustý nátěr. V praktickém proozu inseminační stanice může ystat potřeba připrait nátěr, který bude barit a yšetřoat někdo jiný. Případnou chybou tak lze znesnadnit pozdější práci nejenom sobě. Vyšetření špatného nátěru trá mimo jiné déle a současně může i ýrazně olinit ýsledné hodnocení. Nechat si yšetřit nátěry spermatu na externím pracoišti nemusí být lené. Přitom hrozí, že špatně proedený nátěr nebude ůbec yšetřen, nebo se komplikace spojené s jeho yšetřením promítnou do ceny služby. Mohou se také rátit ýsledky, které nebudou zcela přesně odpoídat skutečnému stau. Za takoých okolností půjde o ztracenou inestici, která e sých důsledcích může ést k chybným rozhodnutím managementu inseminační stanice. Na tomto místě je šak nutné říci, že odborné pracoiště, které bude hodnocení proádět, by se mělo o ýrazných obtížích spojených s yšetřoáním zaslaných zorků zmínit, seznámit ás s možnými důsledky takoého neobjektiního hodnocení a případně narhnout hodné řešení zniklého problému. Pokud jsou nátěry spermatu posílány popré, nebo s jejich torbou chybí zkušenosti, přičemž není možnost oěřit si ýsledek pod mikroskopem, není nic snazšího, než pro jistotu připrait nátěrů íce. Na kalitu odeslaných nátěrů se lze i přímo zeptat daného pracoiště, které bude hodnocení proádět. Záěrem lze dodat, že precizní proedení nátěru spermatu je snadným úkonem, jehož osojení je otázkou elice krátké doby. Nejjednodušší cestou k zládnutí jeho přípray je zkusit si připrait několik nátěrů nanečisto. Poté se již bude jednat o zcela rutinní úkon. Vhodným způsobem, jak si yzkoušet a osojit techniku přípray nátěru, je účast na spermatoanalytickém kurzu. Pro označení jsou hodná sklíčka matoaná. 10

11 Dobře a špatně proedený nátěr po obarení a mikroskopický snímek špatného nátěru po obarení. 5 Barení kančích spermií pro potřeby morfologického yšetření Barení spermií je metoda, která nám umožňuje mnohem kalitnější mikroskopické posouzení morfologické staby spermií a odhalení případného ýskytu různých abnormalit spermií. Výběr hodné metody barení má nezastupitelnou roli, neboť ne každá metoda je hodná pro zolený druh zířat nebo čloěka. Některé metody ani neumožňují dostatečné probarení určitých struktur spermií nebo jejich ad. Následkem pak býá obtížné hodnocení daného preparátu nebo neodhalení některých yskytujících se ad. Existuje celá řada barících postupů spermií, nicméně pro potřeby této metodiky byly ybrány da základní postupy, které předstaují určitý kompromis mezi kalitou obareného nátěru, rychlostí barícího postupu a náročností přípray barících roztoků spolu s proedením lastního obarení. Jedná se o metody barení spermií podle Čeřoského a podle Farellyho. V případě obou dále popsaných metod přistupujeme k barení až případě, kdy je nátěr již zaschlý. Pokud nátěr není zaschlý dostatečně, může dojít průběhu barení k nežádoucí změně morfologického obrazu některých spermií, případně k jejich uolnění z nátěru. 5.1 Barení kančích spermií dle Čeřoského Barení dle Čeřoského spočíá barení zaschlých nátěrů spermatu nasyceném odním roztoku kongo čereně a dobarení 0,5% odním roztoku krystaloé ioleti. Tato metoda barení je technicky nenáročná a hodná pro praxi. 11

12 5.1.1 Přípraa barících roztoků Nasycený roztok kongo čereně Roztok připraíme rozpuštěním baria kongo čereně destiloané odě při laboratorní teplotě. Aby znikl nasycený roztok, je třeba postupně rozpouštět takoé množstí baria a do té doby, kdy toto bario již není schopno se dále rozpouštět. Zárukou nasycenosti je lehce iditelný nerozpuštěný zbytek baria na dně. Tuto část usazeného baria nikdy nepoužíáme k barení. Barící roztok je hodné mít před aplikací yrobený předem. Nepodléhá zkáze a je tedy možné ho použíat po delší dobu. Roztok je použitelný k mnohonásobnému barení, není nutná ýměna roztoku po každém barení. Uskladnění je možné při laboratorní teplotě suchu a uzařené tmaé nádobě. Nedoporučuje se ystaení přímému slunečnímu sětlu. Roztok musí být před lastním použitím odstátý (sedlý), žádném případě se nesmí před použitím protřepáat. Kdybychom roztok protřepali, docházelo by při barení k ulpíání nerozpuštěných zrníček baria na sklíčku, a tím by se ýrazně zhoršila kalita obareného preparátu. Doporučeným postupem pro barení je šetrně si odlít dostatečné množstí roztoku do jiné barící nádoby. Tímto způsobem si odlijeme pouze plně rozpuštěnou složku, nikoli usazeninu ze dna zásobní nádoby, která je typickým znakem nasyceného roztoku. 0,5% roztok krystaloé ioleti Roztok připraíme rozpuštěním baria krystaloé ioleti destiloané odě při laboratorní teplotě. Koncentrace roztoku udáá množstí rozpuštěné látky určitém množstí nebo objemu hotoého roztoku. Výsledný roztok tedy připraíme rozpuštěním 0,5 g baria krystaloé ioleti menším množstí destiloané ody při laboratorní teplotě a doplněním destiloanou odou na 100 ml. Důležité je nechat krystaly dokonale rozpustit, proto roztok necháme rozpouštět do druhého dne za občasného míchání. Abychom měli jistotu, že roztok neobsahuje žádné nerozpuštěné krystaly, je hodné ho přefiltroat. K tomu postačí běžný papíroý filtr. V případě horšího rozpouštění můžeme roztok zahříat e odní lázni. Při zahříání bario rozpouštíme necelém objemu destiloané ody, po zchladnutí na laboratorní teplotu se tepre roztok doplní destiloanou odou na konečný objem. Roztok uskladňujeme při laboratorní teplotě uzařené tmaé nádobě suchu a temnu, nedoporučuje se ystaení přímému slunečnímu sětlu. V případě barení dle Čeřoského je roztok krystaloé ioleti použitelný k mnohonásobnému barení, není nutná ýměna roztoku po každém barení Vlastní barení preparátu nerozpuštěný zbytek baria 1) Po zaschnutí ponoříme sklíčko s nátěrem na 20 sekund do nasyceného roztoku kongo čereně tak, aby byl ponořený celý nátěr. Po yjmutí z baria sklíčko uchopené e ertikální poloze krátce a šetrně opláchneme pod mírně tekoucí odoodní odou. Sklíčko je zbareno mírně do čerena. Pro dosažení maximální kality preparátu je hodné nechat sklíčko dostatečně oschnout. 12

13 2) Následně sklíčko ponoříme pro konečné dobarení na 5 sekund do 0,5% roztoku krystal ioleti stejným způsobem, jako tomu bylo u kongo čereně. Poté opět krátce a šetrně opláchneme pod mírně tekoucí odou e ertikální poloze. Stanoenou dobu barení je nutné dodržet a nepřekročit, jinak by se mohl preparát přebarit. Zbarení sklíčka i spermií je e ýsledku modrofialoé. 3) Takto obarený preparát necháme bez dalších zásahů zaschnout při laboratorní teplotě. Po zaschnutí je preparát připraen k mikroskopickému posouzení. 5.2 Barení kančích spermií dle Farellyho Tato barící metoda spočíá e fixaci zhotoeného nátěru spermatu fixačním roztokem, jeho následným obarením 5% roztoku anilinoé modři a dobarením 0,5% odním roztoku krystaloé ioleti. Vlastní proedení této metody je rychlé a jednoduché, přičemž ýsledkem je ýrazná a kalitní kresba spermie. Náročnější je tomto případě přípraa fixačního roztoku. Jestliže nejsou k dispozici nezbytné podmínky a ybaení pro příprau potřebných roztoků, lze jednotlié komponenty zakoupit, nebo je možné se domluit se specializoanou laboratoří, která tyto roztoky připraí. Všechny potřebné roztoky lze připrait předstihu a do zásoby. Při skladoání anilinoé modři a krystal ioleti je opět elice důležité uchoáat oba roztoky suchu a temnu. V těchto podmínkách nebude docházet k znehodnocení uedených bare, které jinak nemají stanoenou dobu exspirace Přípraa barících roztoků Fixační roztok Nejpre je nutné si připrait fixační roztok. Ten připraíme smícháním 10 dílů 35% formalínu a 90 dílů fyziologického roztoku, který je ypufroaný Sörensenoým fosfátoým pufrem na ph 6,8. Přípraa fixačního roztoku je nejnáročnějším úkonem celého procesu. Zatímco je přípraa ostatních barících roztoků relatině jednoduchá a nenáročná, u tohoto fixačního roztoku lze doporučit ponechat jeho příprau na specializoané laboratoři. 13

14 5% anilinoá modř Roztok připraíme rozpuštěním 5 g anilinoé modři menším množstí destiloané ody při laboratorní teplotě a doplněním destiloanou odou na 100 ml. Důležité je nechat krystaly dokonale rozpustit. Z tohoto důodu necháme roztok rozpouštět do druhého dne za občasného míchání. Abychom měli jistotu, že roztok neobsahuje žádné nerozpuštěné krystaly, je hodné ho přefiltroat. K tomu postačí běžný papíroý filtr. Roztok skladujeme při laboratorní teplotě suchu a temnu. 0,5% roztok krystaloé ioleti Viz. kapitola 5.1 Barení kančích spermií dle Čeřoského Vlastní barení preparátu A) Mřížkoá metoda K lastnímu barení potřebujeme připraené roztoky, obyčejnou odu z odoodu, pipetu na 1 ml, aničku a mřížku pro preparát. Mřížka může být zhotoena ze dou delších nosných tyček, které jsou nazájem napeno spojeny tak, aby na ně bylo možné položit sklíčko s nátěrem. Mřížka nám umožňuje i sklíčko naklonit. Takto ytořený stojánek položíme nad aničku, která bude sloužit k zachytáání použitých roztoků. 1) Nejpre je nutné pokapat celý nátěr fixačním roztokem, který necháme 15 sekund působit. Na pokapání celého nátěru ětšinou postačí cca 0,5 až 1 ml roztoku. Následně, nakloněním stojánku, z preparátu slijeme do kádinky fixační roztok a preparát opláchneme odoodní odou, kterou na nakloněný preparát lijeme z kádinky, případně z kelímku opatřeného hubičkou. 2) Pomocí pipety pokapeme celou plochu preparátu 5% roztokem anilinoé modři a necháme 15 sekund působit. Potom ihned nakloněním stojánku bario slijeme a preparát opláchneme odou. Stanoenou dobu 15 sekund je důležité nepřekročit, jinak by se mohl preparát přebarit. 3) Na sklíčko nakapeme rstu 0,5% roztoku krystaloé ioleti a necháme působit 15 sekund. Potom ihned nakloněním preparátu slijeme použité bario a znou opláchneme odou. Uedenou dobu barení je opět nutné přísně dodržoat, aby nedošlo k přebarení preparátu. 14

15 4) Takto obarený preparát necháme bez dalších zásahů zaschnout na zduchu. Po zaschnutí je preparát připraen k mikroskopickému posouzení. B) Kyetoá metoda Preparát je také možné obarit pomocí kyet. Jedná se o metodu, kdy se použíají nádobky, které mají unitř zářezy sloužící k uchycení sklíčka e sislé poloze. Kyetoá metoda je na proedení jednodušší. Tři kyety naplníme příslušnými roztoky. Sklíčko se na určenou dobu ponoří přímo do nádobky s požadoaným roztokem. Pro manipulaci se sklíčkem použíáme pinzetu a mezi jednotliými kroky nesmíme zapomenout na šetrné oplachoání nátěru odou. Kyetoá metoda má ýhodu jednodušší manipulaci při barení sklíček, nicméně její yužití přináší i několik neýhod. Při použíání bare dochází k jejich postupnému ředění a ubýání. Pokud se nebudou roztoky čas yměňoat, mohou zniknout barené odchylky. Preparáty čerstém roztoku se pak budou barit jinak než preparáty e starším roztoku. Další neýhodou této metody je, že při ní může docházet k částečnému uolňoání spermií z preparátu do barícího roztoku. Z tohoto důodu je hodné barící roztoky praidelně filtroat. Uolněné spermie se totiž mohou přilepit na jiný preparát a mohou tak olinit jeho ýsledné hodnocení. Těmto neýhodám se yhneme při použití postupu barení na mřížce popsaném ýše. 15

16 6 Hodnocení morfologického obrazu spermií kance Mikroskopické yšetření nátěru kance yžaduje určité množstí praktických zkušeností a znalostí možných abnormalit spermií četně některých příčin jejich zniku. Celý proces yšetření je také časoě náročný. Ašak při dostatečných zkušenostech a praxi lze detailně posoudit potřebný počet spermií do 15 min, případě ysokého ýskytu MAS může být tato doba o něco delší. Nicméně, i přes počáteční nesnáze, je zbytečné nechat se úodními obtížemi odradit. Pro získání nezbytného ciku hodnocení spermií je hodné opakoaně zkoušet posuzoání několika připraených preparátů. Mnoho ad spermií je snadno odhalitelných a brzy se še stane jen otázkou rutiny a praxe. Pro snadné rozpoznání a odhalení možných MAS je této metodice přiloženo schéma nejčastějších ad spermií kance spolu s obrazoou galerií. K lastnímu yšetření je zapotřebí přistupoat zodpoědně a nepodceňoat ýznam barení. Je pradou, že morfologický obraz spermií lze do určité míry yšetřit i bez obarení. Je k tomu šak nezbytná elmi kalitní mikroskopická technika. Také zkušenosti hodnotitele hrají tomto případě mnohem ětší úlohu. Vyšetření nebarených preparátů s sebou nese daleko ětší obtíže, přičemž řada MAS nemusí být odhalena ůbec. Za takoých okolností je téměř nemožné některé ady odhalit. Výsledek Neobarené spermie kance. takoého hodnocení býá často íce či méně zkreslený a mnohdy zůstáá jen orientačním ukazatelem. Orientace hodnotitele pouze na základní, izuálně dobře odhalitelné ady, může snadno ést k yužíání nezpůsobilých ejakulátů, které se přitom yznačují záažným poškozením elkého počtu spermií. Ošem i yšetření obareného preparátu má sá úskalí. Nejíce chyb zniká prostou neznalostí některých ad, neschopností rozeznat některé méně běžné nebo hůře iditelné ady, případně zbrklostí při hodnocení. Pozor je třeba dát i na artefakty prostředí, které mohou být mylně pokládány za adu spermie, neboť jejich přítomnost může ýsledný obraz spermie nežádoucím způsobem olinit. Po obarení a následném zaschnutí nátěru můžeme přistoupit k jeho yšetření. K tomu je zapotřebí mikroskop umožňující použití olejoé imerze a zětšení spadající do rozmezí 1000 až Běžně je yužíán objekti pro olejoou imerzi 100 spolu s příslušným okulárem (např. 10 nebo 15 ). Principem hodnocení spermií je stanoení počtu normálně utářených spermií a počtu patologicky změněných spermií s udáním charakteru změn. Vlastní pohyb objektiu nad sklíčkem se proádí meandroým postupem posunu obrazu zorném poli. Při mikroskopickém posouzení se optimálně hodnotí 200 spermií, z nichž je následně yjádřen procentuální podíl MAS. Množstí normálních spermií a počet zachycených ad je nutné průběhu yšetření zaznamenáat. Způsobů zaznamenáání je íce a záleží tak hlaně na postupu, jakým chceme spermie hodnotit. Pro zjednodušení lze tyto způsoby rozdělit na základní neboli prosté hodnocení, podrobné hodnocení a striktní hodnocení neboli hodnocení detailní, které rozlišuje počet ad zachycených na jedné spermii. KANEC Příklad meandroého posunu objektiu mikroskopu nad sklíčkem. 16

17 Schématický nákres morfologicky abnormálních spermií kance: Změněná báze - zúžená 2. Změněná báze - zúžená 3. Zúžená hlaička 4. Makrocefalie (gigantická hlaička) 5. Mikrocefalie (zmenšená hlaička) 6. Kuloitá hlaička 7. Amorfní hlaička 8. Perzistující akroblast 9. Perzistující akroblast 10. Kondenzace akrozomu 11. Defekt akrozomu 12. Zbobtnání akrozomu - počínající 13. Zbobtnání akrozomu - pokročilé 14. Uolnění akrozomu 15. Proximální cytoplazmatická kapénka 16. Distální cytoplazmatická kapénka 17. Ohnutý bičík o distální kapénku (smyčka) 18. Ohnutý bičík 19. Primární sinutí bičíku - Dag defekt 20. Hypogeneze bičíku 21. Hypogeneze bičíku 22. Zlomený bičík 23. Ztluštělá spojoací část 24. Parciální absence mitochondriální spirály 25. Abnormální inzerce bičíku retroaxiální nasazení 26. Abnormální inzerce bičíku abaxiální nasazení 27. Zdojený bičík 17

18 6.1 Základní hodnocení Nejjednodušším způsobem yšetření preparátu je prosté počítání normálních a morfologicky abnormálních spermií. Takoéto yšetření je poměrně jednoduché, nicméně neposkytuje žádné informace o charakteru ad spermií a tím pádem ani o jejich záažnosti. Pro tento způsob hodnocení spermií stačí obyčejný papír, kde lze počty spermií průběžně zapisoat. Praktičtější řešení je použití některé formy elektronického počítadla. Plně dostačující jsou tomto případě i obyčejné, lené a snadno dostupné laboratorní stopky. Jedno tlačítko (např. ukazatel minut) pak bude předstaoat množstí normálních spermií, zatímco druhé (např. ukazatel sekund) bude předstaoat množstí zachycených MAS. 6.2 Podrobné hodnocení MAS Elektronické laboratorní počítadlo. V případě podrobného hodnocení je každá morfologicky abnormální spermie zaznamenána i s příslušnou adou, přičemž je na záěr možné získat přehled o frekenci ýskytu těchto ad. Princip a současně i neýhoda tohoto způsobu hodnocení spočíá tom, že ke každé hodnocené MAS je pro zjednodušení přiřazena pouze jedna ada. Ašak na některých spermiích se může yskytoat ad íce. V takoém případě se do záznamu přednostně zapisuje ada podle předem stanoené priority. Nejyšší prioritu zápisu mají obykle ady ýojoé, zejména pak ady hlaičky a akrozomu. Naopak nejnižší prioritu zápisu má ýskyt cytoplazmatických kapének. Druhou neýhodou tohoto řešení je e sronání se základním hodnocením yšší časoá náročnost, plynoucí z nutnosti zapsat každou spermii s adou. Vhodným způsobem zápisu je ytisknout si protokol morfologie spermií s příslušnými kolonkami pro každou možnou adu. Dobrým způsobem, jak proádět toto hodnocení, je kombinoat tištěný protokol s elektronickým počítadlem. Na tomto počítadle už pak jen stačí zaznamenáat celkoý počet hodnocených spermií. Ideálním řešením průběžného zápisu je yužití specializoaného programu DeSMA, iz. kapitola 6.3 Striktní metoda hodnocení morfologie spermií a samostatná kapitola 7.1 DeSMA. 6.3 Striktní metoda hodnocení morfologie spermií Tato metoda přináší nejkomplexnější možnost posouzení frekence ýskytu MAS ze šech tří uedených metod hodnocení spermií. Striktní metoda hodnocení už bere potaz šechny ady yskytující se na jedné spermii. Nedochází tak ke ztrátám jakýchkoli údajů o zachycených adách. Z tohoto důodu je průběhu yšetření nutné eidoat počet šech hodnocených spermií, počet MAS a počet jednotliých zachycených ad. Na základě těchto údajů lze nejenom zjistit procentické zastoupení MAS, ale i tz. index teratospermie neboli index počtu jednotliých ad připadajících na jednu morfologicky abnormální spermii. I tomto případě je použití tištěného protokolu pro zápis zachycených ad možné, nicméně je již méně praktické. Nejhodnějším a současně elice praktickým řešením je yužít možností specializoaného počítačoého programu DeSMA, e kterém lze jednotlié ady průběžně zaznamenáat. DeSMA tím lastně plní roli elektronického protokolu. Využitím tohoto programu se pak prakticky stírá rozdíl mezi předchozím uedeným způsobem hodnocení MAS a striktní analýzou, neboť DeSMA ze zápisu zachycených ad še potřebné automaticky ypočítá. Přitom časoá náročnost takoého zápisu není yšší než zápis ad do tištěného protokolu. 7 Hodnocení morfologického obrazu spermií s yužitím počítače Jak již bylo naznačeno předchozím textu, při hodnocení morfologického obrazu spermií lze yužít možností k tomu určených počítačoých programů. K dispozici je kupříkladu program DeSMA, který praktickým způsobem nahrazuje edení klasických ručně psaných poznámek. Dalším stupněm yužití jsou programy ycházející z propojení mikroskopu a počítače prostřednictím kamery. Jejich cílem je předeším usnadnění lastního yšetření preparátu. Pokročilejší programy pak dokáží íce či méně samostatně yhodnotit užiatelem pořízený obraz. 18

19 7.1 DeSMA Detailní analýza morfologie spermií (DeSMA) je nástupcem dříe použíaného programu SASMO. Jedná se o elice jednoduchý, hardwaroě i užiatelsky nenáročný počítačoý program disponující střícným užiatelským prostředím. Program DeSMA předstauje ýznamnou pomoc oblasti objektiizace morfologického hodnocení kality ejakulátů. A to jak medicíně eterinární, tak humánní a e šech inseminačních proozech a proozech asistoané reprodukce. Jednou z jeho nejětších ýhod je, že umožňuje současně yhodnotit eškeré změny, které na spermii najdeme, což je zásadní předpoklad striktní analýzy. Všechny ypočtené ukazatele pak mají ýznam pro detailnější interpretaci získaných ýsledků. Průběžně zachycené ady kládáme do programu, e kterém se automaticky sčítají. Po yhodnocení požadoaného množstí spermií získáme podrobný protokol, který neobsahuje jen pouhý ýčet patologií, ale ukáže nám i další jejich souislosti, jako je množstí ýojoých a získaných ad. Díky jednoduchému systému archiace je samozřejmostí možnost racet se k rozpracoaným nebo dokončeným protokolům. Ty je pak možné dále editoat. Rozdělení jednotliých patologií je tomto programu řešeno podle částí spermie, na které se yskytují. Jedná se o patologie hlaičky, krčku, spojoací části a bičíku. Distální kapénky zde toří samostatnou kategorii. V záěru je nutné podotknout, že program byl naržen pro široké spektrum zířat, stejně jako pro čloěka. Některé ady, které program umožňuje sledoat, se e spermatu kance neyskytují nebo běžně nesledují. Užiatelské rozhraní programu DeSMA. 19

20 Získaná data jsou protokolu yjadřoána: - počtem normálních spermií a patologicky změněných spermií - stanoením četnosti nálezů jednotliých kritériích - přepočtem stanoených změn na jednu patologickou spermii tj. yjádření indexu teratospermie - frekencí jednotliých změn na počet šech hodnocených spermií - frekencí jednotliých změn na počet patologických spermií - ýčtem změn dle jejich četnosti - klasifikací změn dle geneze na ýojoé a získané Příklad protokolu určeného pro průběžný zápis zaznamenaných MAS: Kanec: Typ zorku (natiní - N, ins. dáka - ID): Datum odběru: Datum yšetření: Hlaička Makrocefalie (gigantická) Mikrocefalie (zmenšená) zúžená Hruškoitá Kuloitá změněná báze Amorfní Špendlíčkoitá Hřebenoitá Zdojená olná hlaička z Akrozom perzistující akroblast kondenzace akrozomu taroý defekt zbobtnání akrozomu z uolnění akrozomu z bez akrozomu z Krček abnormální nasazení bičíku proximální cytoplazmatická kapénka Spojoací část distální cytoplazmatická kapénka ztluštěná spojoací část parciální absence mitochondriální spirály Bičík primárně sinutý ageneze (hypogeneze) Zdojený Ohnutý z Stočený z Zalomený z CELKEM SPERMIÍ: z toho normálních: % abnormálních spermií: = ýojoá ada z = získaná změna spermie 20

21 7.2 Počítačoé programy yužíající propojení mikroskopu a počítače Základní programy umožňující zachycení obrazu a jeho následné hodnocení na monitoru jsou určené ke zjednodušení klasického yšetření preparátu. Jejich yužití je ýhodné předeším pro začátečníky, neboť zde mimo jiné odpadá problém s případnou nejistotou, která spermie už byla započítána a která ne. V užiatelském prostředí programu je možné každou spermii označit a přidat k ní zolenou adu. Celá tíha posuzoání ýskytu ad je ošem stále na užiateli. V záěru program sám yhotoí ýsledný protokol. Pokročilejší programy již umožňují yužití techniky analýzy obrazu. Programy disponující poloautomatickým systémem analýzy obrazu užiateli automaticky yhledáají spermie na pořízeném obrazu a informují ho o dosažení požadoaného počtu spermií. Užiatel šak stále musí ke každé z nich přiřadit odpoídající adu z nabídky programu. Oba zmíněné přístupy jsou určené předeším pro zjednodušení práce. Příliš mnoho dalších ýhod oproti klasickému mikroskopickému hodnocení šak nepřináší. Nejdokonalejší systémy umožňují plně automatickou detekci izuálně dobře odhalitelných ad na spermiích spolu s detailní morfometrií. Operátor zde zdánliě nemusí disponoat přílišnou zkušeností s hodnocením spermií, neboť tu má primárně na starost daný program. Nezkušený užiatel šak jen těžko pozná, zdali program neudělal hodnocení chybu, jelikož ji sám nebude schopen odhalit. Některé ady nemusí být programem zachyceny ůbec a může se také stát, že ada bude přiřazena k analyzoané spermii chybně. Naíc platí, že ne šechny ady jdou tímto způsobem hodnotit. Detekce mnoha ad tak býá mimo možnosti těchto programů. Role kalitního laboranta je tak stále nezastupitelná. Neýhodou může být i skutečnost, že tyto programy pracují pouze s naprogramoanými metodami barení. V případě, že je použita metoda jiná, nemusí ýsledky odpoídat skutečnému stau. Příklad poloautomatického hodnocení morfolog. obrazu spermií (program SCA) - program sám detekuje spermie, příslušnou adu k nim přiřazuje užiatel. Příklad automatické analýzy obrazu morfometrie spermie (program SCA). 8 Záěr Ačkoli má na ýsledky inseminace li celá řada faktorů, základním předpokladem úspěchu je kalitní inseminační dáka. Ta musí obsahoat dostatečné množstí normálně utářených, funkčních a oplození schopných spermií. Naše schopnost odhalit případné ady spermií a nežádoucí odchylky pak sehráá důležitou roli procesu umělé inseminace. Mít možnost téměř obratem zjistit kalitu ejakulátů noě pořizoaných kanců, nebo práě odebraných kanců ustájených na inseminačních stanicích, má sou nezastupitelnou cenu. Vzhledem ke zýšeným nárokům na schopnosti personálu a k yšší časoé náročnosti je praxi analýza morfologického obrazu spermií tak trochu přehlížena. Přitom důody, proč ěnoat této analýze íce pozornosti než maximálně jedno dříe doporučoané yšetření za měsíc, zde jsou. Pro ty, kteří si chtějí noě osojit schopnost posuzoat morfologický obraz spermií kance, je určena tato metodika. K plnému osojení techniky yšetřoání morfologického obrazu spermií lze roněž doporučit absoloání tímto směrem zaměřeného spermatoanalytického kurzu. V takoém případě se tato metodika stáá hodnou učební pomůckou a manuálem umožňujícím plynulé přeedení nabytých znalostí a zkušeností do praktického proozu. 21

22 9 Obrazoý přehled patologických změn kančích spermií (barení podle Farellyho) Obr.1 Normospermie Obr.2 Patologické spermie 22

23 Obr.3 Makrocefalie Obr.4 Makrocefalie Obr.5 Makrocefalie Obr.6 Špendlíkoitá hlaička Obr.7 Mikrocefalie Obr.8 Mikrocefalie Obr.9 Zúžená hlaička Obr.10 Hruškoitá hlaička Obr.11 Hruškoitá hlaička 23

24 Proximální kapénka Proximální kapénka Parciální absence mitochondriální spirály Obr.12 Kuloitá hlaička Obr.13 Hřebenoitá hlaička Obr.14 Amorfní hlaička Obr.15 Změněná báze - široká Obr.16 Změněná báze zúžená Obr.17 Změněná báze - zúžená Dag defekt Obr.18 Zdojená hlaička Obr. 19 Zdojená hlaička Obr.20 Volná hlaička 24

25 Obr.21 Zbobtnání akrozomu Obr.22 Zbobtnání akrozomu Obr.23 Zbobtnání akrozomu Obr.24 Uolňující se akrozom Obr.25 Spermie bez akrozomu Obr.26 Spermie bez akrozomu Proximální kapénka Obr.27 Kondenzace akrozomu Obr.28 Kondenzace akrozomu Obr.29 Perzistující akroblast 25

26 Obr.30 Proximální kapénka Obr.31 Proximální kapénka Obr.32 Proximální kapénka Obr.33 Distální kapénka Obr.34 Distální kapénka Obr.35 Distální kapénka Obr.36 Abnormální inzerce bičíku abaxiální nasazení Obr.37 Abnormální inzerce bičíku - paraaxiální nasazení Obr.38 Abnormální inzerce bičíku retroaxiální nasazení 26

27 Obr.39 Parciální absence mitochondriální spirály s nahloučením mitochondrií předním a zadním úseku spojoací části Obr.40 Parciální absence mitochondriální spirály Obr.41 Parciální absence mitochondriální spirály 27

28 Obr.42 Ohnutý bičík Obr.43 Ohnutý bičík o distální kapénku Obr.44 Ohnutý bičík Obr.45 Zlomený bičík Obr.46 Stočený bičík Obr.47 Stočený bičík 28

29 Bez akrozomu Obr.48 Stočený bičík Obr.49 Stočený bičík Obr.50 Primárně sinutý bičík Obr.51 Primárně sinutý bičík Obr.52 Primárně sinutý bičík - Dag defekt Obr.53 Zdojený bičík 29

30 Multiparametrické hodnocení ad Zbobtnalý akrozom Proximální kapénka Bez akrozomu Proximální kapénka Dag defekt Retroaxiální nasazení bičíku Distální kapénka bičík Perzistující akroblast Ohnutý bičík Distální kapénka Ohnutý bičík Změněná báze Bez akrozomu Abnormální inzerce bičíku Hruškoitá hlaička 30

31 III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ Popsané metodické postupy sobě zahrnují oěřené metody hodnocení spermatu kance četně praktických doporučení, nejnoějších poznatků a trendů současné doby, četně yužití možností detailní morfologické analýzy spermatu pomocí k tomu určeného počítačoého programu. Metodika tak podáá jedinečným způsobem ucelenou informaci o šech klíčoých bodech týkajících se hodnocení morfologicky abnormálních spermií kance. Obsah je přitom zpracoán jednoduché a názorné formě tak, aby popsané metody byly přístupné široké praktické eřejnosti, pro kterou je primárně určen. IV. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY Metodika reaguje na zrůstající potřebu detailní kontroly kality ejakulátu kance. Je určena předeším pro laboratorní praconíky inseminačních stanic, eterinární lékaře a ýzkumná pracoiště nebo praconíky ysokých škol, kteří se chtějí zaměřit na hodnocení morfologického obrazu spermií. Zároeň se jedná o hodnou učební pomůcku pro účastníky a absolenty spermatoanalytických kurzů zaměřených předeším na oblast inseminace prasat. Cíloou skupinou užiatelů jsou zejména praconíci inseminačních stanic, kterým poskytuje náod a šechny souisející informace potřebné pro základní hodnocení morfologie spermatu kance. Řada popsaných postupů šak nalézá uplatnění i při hodnocení morfologie spermií široké škály dalších druhů hospodářských, zájmoých a exotických zířat. V. EKONOMICKÉ ASPEKTY Mezi zabřezááním po inseminaci a obsahem morfologicky abnormálních spermií existuje prokázaný negatiní ztah. Kalitní inseminační dáka je přitom jedním ze základů úspěšné inseminace a ýsledků reprodukce choech. Schopnost inseminačních stanic dodáat kalitní dáky s precizně kontroloanou kalitou je ošem nejenom ekonomickou nezbytností, ale i otázkou prestiže a poskytuje cennou konkurenční ýhodu. Na základě dostupných informací lze usuzoat, že i zýšení ýskytu abnormálních spermií z pouhých 10 % na 20 % (tedy stále rámci obecně uznáaného limitu) může průměru snížit březost o 0,6 %, přičemž zýšení ýskytu abnormálních spermií o 10 % také znamená snížení průměrné elikosti rhu o 0,1 selete. Praidelnou kontrolou ejakulátu kanců a inseminačních dáek tak lze předcházet ýznamným ekonomickým ztrátám, jejichž půod lze spatřoat e yužíání ejakulátů kanců obsahujících nadlimitní množstí morfologicky abnormálních spermií. Aplikace této metodiky je roněž přínosná možném snížení záislosti inseminačních stanic na externích službách zajišťujících hodnocení kality spermatu. VI. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY Britz MD., Bonet S., Pinart B., Egozcue J., Camps R.: Comparatie study of boar sperm coming from the caput, corpus, and cauda regions of the epididymis. J Androl, 1995, 16, Feitsma H., Bergsma R., Laar, A.: Effect of morphological abnormal sperm cells on farrowing rate and litter size in pigs. Proceedings 7th International Conference on Pig Reproduction, Abstracts of pousters, June, Rolduc, The Netherlands, 2005, s. 90 Čeřoský J., Frydrychoá S., Lustykoá A., Rozkot M.: Changes in boar semen with a high and low leel of morphologically abnormal spermatozoa. Czech J. Anim. Sci., 50, 2005 (7): s Čeřoský J., Lustykoá A., Frydrychoá S., Rozkot M.: Morphologically abnormal spermatozoa changes as a tool for semen quality assessment of the boars. Research in pig breeding, number 1, ol.1, 2007, s Čeřoský J.: Metoda barení kančích spermií pro morfologické hodnocení. Žiočišná ýroba, 1976, 21, s Gadea J.: Sperm under the microscope. Pig International, 2002, 3:

32 Lipenský, J., Lustykoá, A.: Analýza obrazu nejen inseminaci prasat. Náš cho č. 11, s Lipenský J., Lustykoá A., Čeřoský J.: Effect of season on boar semen morphology. Journal of Central European Agriculture, 2010, 11 (4), s Věžník Z., Šecoá D., Zajícoá A., Přinosiloá P.: Repetitorium spermatologie a andrologie, metodiky spermatoanalýzy. ISBN , VÚVeL, 2004, 266 s., 60 příloh. Věžník Z., Matouškoá O, Šecoá D., Zajícoá A.: The use of the computer technology for the ealuation of the strict morphological sperm analysis. Vet Med-Czech, 2001, 46: Věžník Z., Šecoá D., Zajícoá A.: Hodnocení semene pro asistoanou reprodukci a ýběr plemeníků, Striktní analýza spermatické morfologie SASMO. Brno: VÚVeL, 2000, 141 s. VII. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE Lipenský J., Lustykoá A.: Analýza obrazu nejen inseminaci prasat. Náš cho č. 11, s Lipenský J., Lustykoá A., Čeřoský J.: Effect of season on boar semen morphology. Journal of Central European Agriculture, 2010, 11 (4), s Přinosiloá P., Věžník Z., Zajícoá A., Šecoá D.: Morphology analysis of dog sperm. In The 6th International Symposium on Canine and Feline Reproduction, Wiena, Austria, July 9-11th, 2008, pp Věžník Z., Zajícoá A., Kunetkoá M., Šecoá D., Přinosiloá P.: Uniersal sperm quality index (UKIE) for an assessment of oerall boar sperm quality. In: Research in PigBreeding, International Workshop, Kostelec n. Orlicí, September 9th p22. Věžník Z., Matouškoá O., Šecoá D., Zajícoá, A., Přinosiloá, P.: Software pro yhodnocení striktní morfologické analýzy spermií SASMO. Autorizoaný software, Čeřoský J., Frydrychoá S., Lustykoá A., Rozkot M.: Relationship between abnormal spermatozoa and seminal plasma free amino acids in boars. Czech J. Anim. Sci., 52, 2007 (2): s Čeřoský J., Lustykoá A., Frydrychoá S., Rozkot M.: Morphologically abnormal spermatozoa changes as a tool for semen quality assessment of the boars. Research in pig breeding, number 1, ol.1, 2007, s Čeřoský J., Frydrychoá S., Lustykoá A., Rozkot M.: The relation of the percentage of morphologically abnormal spermatozoa to seminal plasma components and PRLR gene. Reproduction in Domestic Animals, 2006, roč.41, č.4, s.320. Přinosiloá P., Vinkler A., Věžník Z.: Morphological image of fresh and cryopresered dog semen and its ealuation by the Strict Analysis of Sperm Morphology method, using Sperm Quality Analyzer (SQA IIc) ealuation. ACTA VET, Brno, 2006, 75: Věžník Z., Šecoá D., Zajícoá A., Přinosiloá P., Slaíkoá M.: Funkční yhodnocení ejakulátů kanců. Náš cho, 2006, 6: Čeřoský J., Frydrychoá S., Lustykoá A., Rozkot M.: Beziehung zwischen dem Gehalt on morphologisch abnormalen Spermien im Ebersperma der Jahreszeit und der Fertilität on Kűnstlich hesamten Zuchtsauen. In: Kurzfassungen 11. Mitteldeutscher Schweine Workshop in Bernburg, Besamungsmanagement und Fruchtbarkeit, , Hochschule Anhalt (FH) Bernburg, 2 s Čeřoský J., Frydrychoá S., Lustykoá A., Rozkot M.: Changes in boar semen with a high and low leel of morphologically abnormal spermatozoa. Czech J. Anim. Sci., 50, 2005 (7): s Čeřoský J., Frydrychoá S., Lustykoá A., Rozkot M.: Changes of morphologically abnormal spermatozoa content in A.I. boars. Reproduction in Domestic Animals, 2005, roč.40, č.4, s.355. Z. Věžník, D. Šecoá, A. Zajícoá, P. Přinosiloá: Functional ealuation of boar ejaculates 14. ročník mezinárodní konference Aktuální problémy šlechtění, chou, zdraí a produkce prasat. 2005, České Budějoice, sborník z konference Věžník Z., Šecoá D., Zajícoá A., Přinosiloá P.: Repetitorium spermatologie a andrologie, metodiky spermatoanalýzy. ISBN , VÚVeL, 2004, 266 s., 60 příloh. Věžník Z., Šecoá D., Zajícoá A., Přinosiloá P.: Úloha plemeníka choech a hodnocení kality ejakulátů. Veterinářstí, 2004, 12,

33 Vydal: Výzkumný ústa žiočišné ýroby,..i. Přátelstí 815, Praha Uhříněes Náze: Základy hodnocení morfologického obrazu spermií kance Autoři: Ing. Jan Lipenský, DiS. (podíl práce 40 %) Ing. Alena Lustykoá, Ph.D. (podíl práce 10 %) Ing. Mirosla Rozkot, CSc. (podíl práce 5 %) Ing. Ea Václakoá, Ph.D. (podíl práce 5 %) MVDr. Petra Přinosiloá, Ph.D. (podíl práce 25 %) MVDr. Jarosla Šípek (podíl práce 5 %) MVDr. Monika Kunetkoá (podíl práce 5 %) RNDr. Věra Kopecká, Ph.D. (podíl práce 5 %) Oponenti: prof. Ing. Jiří Rozinek, CSc. Česká zemědělská unierzita Praze MVDr. Jan Bažant Státní eterinární spráa ISBN Dedikace metodiky Metodika je ýsledkem řešení ýzkumného projektu NAZV č. QI111A166. Vydáno bez jazykoé úpray. Výzkumný ústa žiočišné ýroby,..i., Praha Uhříněes