MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2012 Bc. MICHAL MALÍK 1

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Problematika a možnost ovlivnění gushingu ve sladovně Rajhrad Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Tomáš Gregor, PhD. Vypracoval: Bc. Michal Malík 2

3 Brno 2012 PROHLÁŠENÍ STUDENTA Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma,,problematika a možnost ovlivnění gushingu ve sladovně Rajhrad vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. 3

4 podpis autora. PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu diplomové práce Ing. Tomáši Gregorovi, PhD., za možnost vypracovat diplomovou práci na Ústavu technologie potravin, za vstřícný přístup, odborné vedení a cenné rady, které mi pro zpracování diplomové práce poskytl. Dále pak děkuji panu Ing. Jiřímu Šustovi a laborantce Lence Kyselové za odborné 4

5 konzultace, věcné připomínky a možnost provedení pokusů v laboratoři sladovny Bernard v Rajhradě. ANOTACE Práce se zabývá vlivem postřikového agrotechnického opatření při dozrávání ječmene jarního na míru gushingu při výrobě piva. Sledované vzorky byly pěstovány na předem stanoveném počtu odlišných polích v letech v lokalitě Hrubčice na Hané. Součástí práce je též sledování závislosti jednotlivých technologických procesů při výrobě sladu na míru gushingu. Pro vyhodnocení míry gushingu byl užit třídenní test Carslberg a výsledná data byla statisticky zpracována. V závěru práce hodnotí vliv daných opatření a technologických procesů na míru gushingu. ANOTATION Work examines the impact of spray treatment during maturation of spring barley on degree of gushing during beer production. Barley samples were grown on several different fields nearby village Hrubčice in Haná region within years Work examines connection between technological procedures during malt production and gushing degree as a secondary objective. As a gushing measurment method was used Carlsberg three day long test and data were statistically processed. Evaluation of spray treatment and technological procedures impact on gushing degree is works conclusion. 5

6 OBSAH 1. ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ REŠERŠE Historie ječmene Sladovnický ječmen Agrotechnika ječmene jarního Nároky na prostředí a předplodinu Odrůdová skladba Setí Výživa a hnojení Ošetření porostů během vegetace Ochrana proti chorobám Sklizeň a posklizňová úprava jarního ječmene Skladování Požadavky na kvalitu sladovnického ječmene Ukazatele sladovnické jakosti (USJ) Slad Světlý slad Bavorský slad Technologie výroby sladu Nákup, příjem, čištění, třídění a skladování ječmene Máčení ječmene Klíčení ječmene Hvozdění ječmene Úprava hotového sladu Výroba sladu ve sladovně Bernard Technické vybavení Technologie výroby Gushing přepěňování piva Fyzikální faktory ovlivňující gushing Chemické faktory ovlivňující gushing

7 3.9.3 Inhibitory gushingu Technologické možnosti potlačení gushingu Mikrobiální kontaminace Mykotoxiny Důležité aspekty produkce mykotoxinů: Gushing a Fusaria Gushing a Deoxynivalenol (DON) Nivalenol (NIV) Mykotoxiny v pivu Maskované mykotoxiny v pivu Výskyt mykotoxinů v pivech zakoupených na českém trhu v roce Možnosti regulace kontaminace mykotoxiny Výzkum v oblasti mykotoxinů a jeho trendy Související legislativa MATERIÁL A METODIKA Materiál Charakteristika vzorků Agrotechnika a gushing Hypotéza: Polní pokus Charakteristika oblasti Hrubčice Popis pracoviště Přístrojové vybavení Gushingové laboratoře Pomůcky Použitá metodika Použitý test pro stanovení gushingu ječmene a sladu Stanovení obsahu dexynivalenolu a zearalenon (DON, ZON) v ječmeni Metody použité k zpracování výsledků Metody použité ke statistickému zpracování výsledků VÝSLEDKY, JEJICH HODNOCENÍ A DISKUSE Vliv agrotechniky na gushing Vyhodnocení obsahu dexynivalenolu a zearalenon v ječmeni Sledování Gushing Stanovení DON a ZON

8 5.3 Sledování gushingu ve sladovně Bernard Stanovování gushingu během výroby sladu Stanovení gushingu v závislosti na výrobních procesech ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATŮRA SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK, TABULEK, GRARFU, OBRÁZKŮ PŘÍLOHY

9 1. ÚVOD První zprávy o gushingu pocházejí z počátku 20. let minulého století. V tomto období byl poprvé tento jev popsán a publikován v odborné literatuře. Od té doby se začaly pravidelně objevovat podobné případy, což vedlo k hlubšímu zkoumání problematiky gushingu. Díky tomu je pojem gushing znám po celém světě a běžně se již z angličtiny nepřekládá. Gushing piva se vyznačuje tím, že ihned po otevření láhve se vytvoří velké množství jemných bublinek v rámci objemu piva a ty následně rychle stoupají. Vytvářejí pěnu, která následně vytéká z lahve. Toto prudké, samovolné a nadměrné vzpěnění piva zpravidla ustává po několika sekundách. Tento jev - gushing je v pivovarnictví problémem celosvětového významu. V současné době je gushing významnou hrozbou i pro kvalitu českého piva a sladu. Příčinu Gushingu se přes veškeré výzkumy zatím nepodařilo odhalit. Hypotéz co způsobuje tento jev, existuje celá řada a jednu z nich jsem se rozhodl ověřit ve své diplomové práci. Existuje velké množství výzkumů příčin gushingu, které zkoumají vliv nejrůznějších faktorů na jeho výskyt (podnebí, vlhkost, způsob skladování, technologie výroby, atd.) Ve své diplomové práci se zaměřím na hypotézu, která je zcela inovativní a příčinu gushindu hledá již ve fázi pěstování základní suroviny pro výrobu piva ječmene. Ke gushingu piva může dojít z nejrůznějších důvodů a nezáleží pouze na přítomnosti plísní a jejich mykotoxinů v primární surovině, ale i na chemickém složení sladu, varní vodě, celkové hygieně provozu a dodržení všech technologických kroků při výrobě a skladování piva. Tento jev představuje značné riziko pro sládka, potencionálně značné finanční ztráty pro pivovar a možný nepříznivý vliv na zdraví člověka. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem této práce byla problematika a možnost ovlivnění gushingu ve sladovně Bernard v Rajhradě. Dílčí cíle práce: zjištění vlivu agrotechniky na gushing stanovení obsahu DON a ZON sledování výskytu gushingu ve sladovně porovnat výskyt gushingu v letech 2010 a

11 2. LITERÁRNÍ REŠERŠE 3.1 Historie ječmene Ječmen patří mezi nejstarší zemědělské plodiny. Vyskytuje se již v čínské a indické mytologii, archeologicky je doložen již v prehistorických dobách v Evropě, Asii i Africe. Na naše území přinesly ječmen stěhovavé národy z jihozápadní Asie asi před pěti tisíci lety. Již v 19. stol. určoval hanácký a staročeský ječmen jakostní standart pro sladovny a pivovary nejen v Rakousku-Uhersku, ale i v ostatních zemích Evropy. Hanácká odrůda byla výchozím zdrojem pro tvorbu nových odrůd sladovnického ječmene do poloviny minulého století. (PETR, 2004). Vůdčí odrůdou ječmene se po roce 1945 na našem území stal ječmen Valtický, přičemž ale nejvýznamnější pěstovanou odrůdou byl ječmen Diamant. Tato odrůda byla vyšlechtěna doc. Josefem Boumou a byla deklarována jako pozitivní mutace, vniklá po ozáření odrůdy Valtický ječmen rentgenovými paprsky. Tato odrůda dala základ více než 60 domácím a 113 zahraničním odrůdám (Petr, 2004). K rozkvětu sladovnického průmyslu však došlo až v 70. letech 19. století, kdy se zároveň datují počátky exportu sladu v našich zemích (ZIMOLKA et.al.,2006). V dnešní době se většina vypěstovaného ječmene, zejména ozimý ječmen, používá převážně ke krmným účelům. Nejkvalitnější část produkce (v České republice asi 30 % jarních ječmenů) slouží k výrobě sladu. V antice byla ječná kaše běžným jídlem, dodnes se konzumuje na Blízkém Východě. V Evropě ječmen z přímé konzumace vytěsnila hlavně pšenice. Běžné jsou však ječné kroupy a krupky, sloužící jako přísada do polévek a dušených jídel. Konzumaci komplikují pluchy. Na nutriční hodnotě ječmene se podílejí zejména sacharidy (asi 80%). V ječmeni jsou přítomny i vitamíny skupiny B a E. Z ječmene se připravuje také náhražka kávy - melta. Jarní ječmen dvouřadý, v některých zemích i ozimý dvouřadý, se využívá k výrobě sladu, k výrobě whisky a menší část k potravinářským účelům. Pro potravinářské účely se šlechtí odrůdy označované waxy (sklovité, voskovité) a ječmeny bezpluché s vyšším obsahem β-glukanů a biologicky aktivních antioxidantů tokoferolů, tokotrienolů a vitaminu E), které jsou ovšem pro sladařský průmysl nevhodné a to z důvodů vyššího množství bílkovin. (KUČEROVÁ, PELIKÁN a HŘIVNA, 2007). 11

12 3.2 Sladovnický ječmen Za ječmen sladovnický se považují odrůdy ječmene setého dvouřadého (Hordeum vulgare, convar. distichon), z domácí produkce, zapsané do Listiny povolených odrůd, označené jako vhodné pro výrobu pivovarského sladu, nebo z dovozu, pokud svou jakostí odpovídají odrůdám domácím, zapsaným do LPO (PELIKÁN, 2001). 3.3 Agrotechnika ječmene jarního Vzhledem ke krátké vegetační době, slabšímu kořenovému systému a své biologické povaze ječmen citlivě reaguje na stresové podmínky všeho druhu a tedy i na každou pěstitelskou chybu Nároky na prostředí a předplodinu Pěstování jarního ječmene je možné ve všech výrobních oblastech, ovšem kvalitní sladovnický ječmen je možno vyprodukovat pouze v oblastech nejvhodnějších, tj. v Polabské nížině, nižších polohách Středočeské pahorkatiny a na střední Moravě, především na Hané. Ostatní oblasti jsou pro pěstování sladovnického ječmene méně příznivé a rizikovější z pohledu dosažení vysoké sladovnické jakosti. Nároky ječmene na teplotu a vláhu nejsou velké, ale má vysoké nároky na půdu, protože 90% jeho kořenů se nachází v hloubce do 30 cm. Nejvhodnějšími půdami jsou pro jeho pěstování černozemě, hnědozemě, dále pak hlinité, jílovito-hlinité a písčitohlinité půdy. Důležitá je půdní kyselost, která by v řepařské oblasti měla mít ph v rozmezí 6,2 7,2, v bramborářské oblasti 5,8 6,2. Nevhodné jsou půdy se zhutněným podorničím. Jarnímu ječmenu nejlépe vyhovuje stará půdní síla, nejvhodnějšími předplodinami jsou okopaniny (cukrovka, brambory, kukuřice na siláž příp. i na zrno) a řepka. Zaorávání chrástu cukrovky přináší pro ječmen určitá rizika, při pozdním rozkladu chrástu v půdě dochází k pozdnímu uvolňování dusíku a tím k nebezpečí poléhání. Posklizňové zbytky kukuřice mohou být nežádoucím zdrojem infekce houbami rodu Fusarium. Při pěstování jarního ječmene pro sladovnické účely jsou nároky na předplodinu přísnější. Nejvhodnějšími předplodinami jsou okopaniny hnojené chlévskou mrvou. 12

13 Zaorávka chrástu cukrovky i zařazení sladovnického ječmene po obilovině se vesměs projevuje zhoršením sladovnické jakosti (zvýšený obsah bílkovin v zrnu). Luskoviny a olejniny jsou jako předplodiny sladovnického ječmene méně vhodné, jeteloviny pak zcela nevhodné (SELGEN, 2011) Odrůdová skladba Základem úspěchu pěstování jarního ječmene je správný výběr odrůdy, vhodné pro danou lokalitu a daný účel (sladovnický, krmný), což současný značně rozsáhlý sortiment registrovaných odrůd umožňuje Setí Výsev jarního ječmene by měl být proveden co nejdříve, ale vždy jen do dobře připravené vyzrálé půdy. Seťové lůžko pro setí jarního ječmene by mělo být vytvořeno v hloubce 3 5 cm. Hloubka setí se doporučuje ne větší než 3 cm, na písčitých půdách do 4 cm. Rozmístění zrn na ploše by mělo být co nejstejnoměrnější, vhodné jsou proto úzkořádkové nebo páskové secí stroje. Kolejové řádky je lépe u ječmene nevynechávat, zejména při určení na sladovnické využití, protože rostliny sousedící s kolejovými řádky silně odnožují a jsou výrazně pozdnější. Tím se zvyšuje počet zelených zrn ve sklizeném obilí (SELGEN, 2011) Výživa a hnojení Jarní ječmen je plodina, která za krátkou vegetační dobu vytváří značné množství organické hmoty, potřebuje proto dostatek živin v přístupné formě a ve vyváženém poměru. Proto je nutno při hnojení vycházet z chemických rozborů půdy, případně listů mladých rostlin a postupovat podle podrobných metodik publikovaných v odborném tisku Ošetření porostů během vegetace Porosty jarního ječmene je nutno během vegetace chránit proti škodlivým biotickým činitelům, tj. proti plevelům, chorobám a škůdcům. Nejlepší - a nejlevnější - 13

14 ochranou je vždy prevence, především tedy výběr vhodné předplodiny, dodržování všech zásad správné agrotechniky a výběr vhodné odrůdy. Teprve když tato opatření nejsou dostatečně účinná, přicházejí ke slovu pesticidy. Chemických přípravků na ochranu rostlin registrovaných k použití v České republice je velké množství a jejich sortiment se stále mění. Jsou registrovány nové a nové přípravky různých firem, proti jednomu škodlivému činiteli bývá na trhu často více pesticidů. Při aplikaci je nutno postupovat podle návodu, dodržovat doporučené dávky, případně kombinace s jinými přípravky a všechny pokyny uvedené na etiketě (SELGEN, 2011) Ochrana proti chorobám V České republice jsou nejvážnějšími chorobami jarního ječmene padlí travní (Blumeria graminis), rez ječná (Puccinia hordei), hnědá skvrnitost (Pyrenophora teres), rynchosporiová skvrnitost (Rhynchosporium secalis) a v posledních letech nabývají na důležitosti fusarioza (Fusarium sp.) a ramularie (Ramularia collo-cygni). Intenzita výskytu a škodlivost jednotlivých chorob v různých letech silně kolísá v závislosti na podmínkách prostředí i úrovni agrotechniky. Nepříznivý vliv na výskyt chorob v jarním ječmeni mají porosty ozimého ječmene v blízkém sousedství, protože jsou zdrojem silné infekce na jaře. Nejlepším a nejlevnějším opatřením proti výskytu chorob je kromě dodržování správné agrotechniky výběr odrůd odolných proti těmto chorobám. V současné době je na trhu mnoho odrůd s různým stupněm rezistence zejména proti padlí travnímu, rzi ječné, hnědé a rynchosporiové skvrnitosti. Šlechtitelé intenzivně pracují na vyšlechtění odrůd s odolností proti fuzariím a proti ramularii (SELGEN, 2011) Sklizeň a posklizňová úprava jarního ječmene Sklizeň jarního ječmene se provádí zásadně až v plné zralosti zrna, kdy jsou zrna tvrdá a 75% nejhořejších kolének je zaschlých. Předčasná sklizeň má za následek snížení výnosu i jakosti. Při opožděné sklizni dochází k větším ztrátám lámáním stébla pod klasem, nepříznivě se mohou projevit plísně a porůstání v klasech. Velmi důležité je minimalizovat mechanické poškození zrna. K nejmenšímu poškození dochází při vlhkosti zrna 17-19%, při nižší vlhkosti se počet poškozených zrn zvyšuje (SELGEN, 2011). 14

15 3.3.8 Skladování Při manipulaci se zrnem a při jeho skladování je nutné předcházet mechanickému i biologickému poškození. V průběhu skladování je nutno pravidelně kontrolovat jeho teplotu, vlhkost a výskyt skladištních škůdců a v případě potřeby učinit potřebná opatření, aby nedošlo ke znehodnocení a ztrátám. 3.4 Požadavky na kvalitu sladovnického ječmene Požadavky na kvalitu sladovnického ječmene jsou v přímé vazbě s požadavky na jakost a jeho využitelnost pro výrobu piva. Formování požadavků na jakost sladovnického ječmene prošlo dlouholetým vývojem, v závislosti na míře poznání a postupujícím rozvoji vědeckotechnických poznatků ve sladařském průmyslu (POLÁK, 1993). Požadavky na kvalitu sladovnického ječmene jsou legislativně vymezeny v ČSN , OBILÍ POTRAVINÁŘSKÉ část 5: Ječmen sladovnický. Tato norma stanovuje požadavky na zrno ječmene setého jako zemědělského výrobku, určeného pro výrobu pivovarského sladu. Tabulka č. 1: Hodnoty jakostních ukazatelů podle ČSN barva pluchy žlutá i méně vyrovnaná vlhkost v hmotnostních %, nejvýše 15,0 přepad zrna nad sítem 2,5 mm v hmotnostních %, nejméně 85,0 zrnové příměsi sladařsky nevyužitelné v hmotnostních %, 3,0 nejvýše zrnové příměsi sladařsky využitelné v hmotnostních %, 6,0 nejvýše neodstranitelná příměs v hmotnostních %, nejvýše 1,0 klíčivost (H2O2) v % z celkového počtu zrn, nejméně 96,0 obsah N-látek v sušině (N x 6,25) v hmotnostních %: a) nejméně b) nejvýše 10,0 12,0 Pramen: ČSN

16 Zrno sladovnického ječmene musí být vyzrálé, zbavené osin, s typickou barvou pluchy a nepoškozené. Dále musí být bez živých škůdců v jakémkoli stadiu vývoje a bez cizích pachů. Musí odpovídat požadavkům na zdravotní nezávadnost a nesmí obsahovat zrna s pluchou zjevně naplesnivělou a plesnivou. Zrno ječmene musí odpovídat smyslovým znakům, a splňovat hodnoty jakostních ukazatelů uvedených v tabulce č. 1. Ukazatele sladovnické jakosti můžeme rozdělit na: A) subjektivní - barva a jemnost pluchy, tvar a velikost zrna, přirozený lesk a zdravá vůně, zlomky a mechanické poškození zrna, zrna se zahnědlými špičkami atd. B) objektivní, které členíme na: 1) mechanické podíl zrna nad sítem 2,5 mm, hektolitrová hmotnost, hmotnost 1000 zrn, poškozená zrna, celkový odpad atd. 2) fyziologické klíčivost atd. 3) chemické vlhkost, obsah dusíkatých látek, obsah škrob atd. 3.5 Ukazatele sladovnické jakosti (USJ) V rámci USJ jsou podle Kosaře a Procházky (2000) hodnoceny tyto znaky: Obsah dusíkatých látek (bílkovin) v obilce nesladovaného ječmene. Optimální hodnoty tohoto znaku se pohybují v oblasti 10,7 11,2 % v sušině. Výrazně vyšší i výrazně nižší hodnoty, než sou uvedeny výše, jsou nežádoucí a způsobují vážné technologické problémy. Obsah extraktu (extraktivnost) v sušině sladu. Za optimum jsou u tohoto významného ekonomického znaku považovány hodnoty vyšší než 82 %. V současné době jsou registrovány odrůdy s extraktem až 83 %. Relativní extrakt při 45 C. Se změnou technologie v pivovarech se změnily i požadavky na tento znak. Dnes je za optimum považována hodnota kolem 37 %. Výrazně vyšší hodnoty jsou nežádoucí. 16

17 Kolbachovo číslo. Také u tohoto znaku se změnily požadavky na optimální hodnotu, která se dnes pohybuje kolem 40. Výrazně vyšší hodnoty jsou nežádoucí. Diastatická mohutnost. S tímto znakem nejsou v současné době výrazné problémy. Všechny sladovnické odrůdy dosahují optimálních hodnot nad 250 j.w.k. (jednotky Windische Kolbacha). Dosažitelný (konečný) stupeň prokvašení. Za optimální jsou u tohoto znaku považovány hodnoty nad 82 %. Friabilita (křehkost). Za optimální jsou považovány hodnoty kolem 85 %. Některé nově vyšlechtěné odrůdy vykazují vyšší moučnatost endospermu a mohou dosáhnout i hodnot nad 90 % friability, což může způsobovat vyšší ztráty při přepravě sladu. Obsah β-glukanů ve sladině. Za optimální jsou u tohoto významného ekonomického znaku považovány hodnoty do 150 mg.l-1. Hodnoty nad 200 mg.l-1 jsou považovány za nežádoucí. V současné době je registrováno jen několik odrůd, které jsou schopny požadavku na nízký obsah β-glukanů ve sladině vyhovět. 3.6 Slad Slad je název pro naklíčené a usušené obilné zrno, převážně ječmenné. Výroba sladu se nazývá sladování a probíhá ve sladovnách. Slad je jedna ze základních surovin pro výrobu piva a whisky. Sladování se provádí proto, aby se rozštěpily v sladu uložené polysacharidy na jednoduché sacharidy vhodné ke kvašení. Nejčastěji vyráběné druhy sladů v České republice jsou světlý slad a bavorský slad. Ostatní druhy jsou v našich zemích vyráběny pouze v malých množstvích pro speciální účely Světlý slad Světlý slad je charakteristický příznivým extraktem a dostatečnou enzymatickou silou, s nízkou barvou. Slouží k výrobě světlého, lehkého a speciálního piva. Pro snadné zpracování ve varně je nutné dokonalé zcukření rmutu, snadné scezení sladiny a nízká barva po povaření. Obsah vody v hotovém sladu se pohybuje okolo 4%. 17

18 3.6.2 Bavorský slad Bavorský slad je charakteristický vysokou barvou a výraznějším aromatem, čehož se dosáhne výrazně hlubším rozluštěním při klíčení. Ječmen pro výrobu bavorského sladu je klíčen (luštěn) o 1-2 dny déle s vyšším obsahem vody a při vyšší teplotě. Zelený slad je přeluštěn. Je odlišně hvozděn, s cílem ještě podpořit tvorbu melanodinů a je dotahován při teplotách okolo 105 C. Obsah vody se pohybuje okolo 2%. 3.7 Technologie výroby sladu Cílem sladování je zajistit řízeným klíčením nejnižší ztráty enzymů a to při aktivaci i syntéze nových enzymů, jejichž katalytického působení se později využívá k přeměně rezervních látek zrna. Nedostatečná tvorba, stejně jako nadbytek enzymů (přeluštění zrna) je nežádoucí, neboť snižuje výtěžek a jakost sladu. Slad se vyrábí ve sladovnách, které jsou buď součástí pivovaru, nebo obchodních sladoven, které slad vyrábějí především pro export a zbytek prodávají pivovarům. (PELIKÁN, 2002). Výrobu sladu lze rozdělit do 5 charakteristických výrobních fází: 1) nakup, příjem, čištění, třídění a skladování ječmene 2) máčení ječmene 3) klíčení ječmene 4) hvozdění ječmene 5) úprava hotového výrobku, jeho skladování a expedice Nákup, příjem, čištění, třídění a skladování ječmene Nákup Nákup sladovnického ječmene se provádí na základě smluv mezi dodavatelem a odběratelem podle ČSN Ječmen se posuzuje dle vymezených jakostních parametrů tzv. obchodovatelná jakost (tab. č. 1). 18

19 Příjem Příjem sladovnického ječmene se provádí na přijímací rampě z vagonů, aut, popř. i z lodí. Každá dodávka je zvážena a odeberou se z ní vzory k analýzám. Čištění Zrno se čistí v čistírně na základě velikosti (síta), specifické hmotnosti (aspiratéry), tvaru a délky (triéry). Třídění Vyčištěný ječmen se třídí na podíl nad sítem 2,5mm (I. třída) a podíl nad sítem 2,2mm (II. třída). Propad pod sítem 2,2mm tvoří zadinu, která se nesladuje a používá se ke krmení. Každá třída se sladuje samostatně. Skladování Zrno skladujeme s nízkým obsahem vody (14-15%), protože chceme zachovat životaschopnost a minimální ztráty dýcháním. V opačném případě dochází k poklesu klíčivosti a klíčívé energie (PELIKÁN, 2002) Máčení ječmene Cílem máčení je zvýšení obsahu vody v ječném zrnu z 12-15% na 42%-48%. Řízeným způsobem se zvýší obsah vody v zrnu pro zahájení enzymatických reakcí a pro klíčení zrna. Při únosné spotřebě vody se odstraní splavky a lehké nečistoty, umyje zrno a ze zrna se vylouží nežádoucí látky. Máčení dnes považujeme za nejdůležitější úsek výroby sladu, který rozhoduje o jeho budoucí kvalitě. Dosažený obsah vody se nazývá stupeň domočení a liší se podle typu vyráběného sladu. Technologicky velmi významným efektem je vyprání ječmene, neboť se z ječmene vylouží barevné a hořké látky, kyselina křemičitá a bílkoviny z pluch. Tyto látky jsou nežádoucí, neboť zhoršují senzorické vlastnosti piva a podporují tvorbu zákalu v pivu. V dobře uskladněném ječmeni je činnost enzymů, důležitých při sladování, výrazně utlumena, přičemž některé skupiny enzymů jsou syntetizovány později. Zvýšení obsahu vody v zrně vede k zahájení projevů života ke klíčení. Podmínkou pro správný průběh klíčení je dostatek vody a vzduchu u namáčeného ječmene. Máčení ječmene probíhá v náduvnících, které byly dříve kamenné, později betonové, dnes výhradně kovové, z legovaných ocelí ať již válcové, nebo čtyřhranné se spádovým kónusem dna 45, aby ječmen mohl samovolně vytékat ven. Dnes se staví 19

20 máčírny obvykle dvoudenní, nejlépe přepouštěcí. Nad namáčecím náduvníkem je zabudován zásobní koš, do něhož je připraven vytříděný a odvážený ječmen k namočení. Namáčecí náduvník se naplní asi do jedné poloviny vodou a ječmen ze zásobního koše se spustí do náduvníku. Současně přitéká namáčecí voda a jsou v činnosti protiprachové trysky nad náduvníkem. Je-li náduvník vybaven větráním tlakovým vzduchem, náduvník se nejprve dokonale převrství vodou, poté následuje sběr splavků za současného přeplavování. Rychlost příjmu vody zrnem ovlivňuje řada faktorů, z nichž nejvýznamnější jsou: teplota vody, velikost zrna, struktura zrna a provětrávání ječmene. V současnosti užívaný postup vzdušného máčení má tyto parametry: 1. namočení na 30 % obsahu vody, tj. 2 6 h pod vodou v závislosti na teplotě vody a stavu zrna (ročníku), následuje vzdušná přestávka h, v závislosti na citlivosti ječmene na vodu. Po sklizni volíme přestávku delší, později kratší, v níž se již v druhé polovině odsává oxid uhličitý. 2. namočení na % obsahu vody, tj h pod vodou, obvykle dle provozních možností a podmínek. Následující vzdušná přestávka, která je nezbytná k obeschnutí ječmene. Během ní se v závislosti na teplotě v náduvníku a v máčírně odsává oxid uhličitý. 3. namočení na % obsahu vody, tj. 4 6 h pod vodou, po spuštění vody a 2 4 h okapávání ječmene se ječmen za sucha vymáčí nebo se s třetí vodou přímo vymáčí do pneumatických klíčidel. Použití technologie vzdušného máčení je nutné při sladování čerstvých, neodleželých ječmenů. Z dalších technologií máčení se používá záplavové máčení, opakované máčení, sprchové máčení a klasické máčení. Klasické máčení je opakem moderního vzdušného máčení, neboť doby namočení ječmene pod vodou jsou dlouhé a vzdušné přestávky jsou krátké. Tento způsob máčení poskytuje vysoce kvalitní slady, ale pouze u ječmenů fyziologicky zdravých, dokonale vyzrálých a odleželých. Vyráběné slady jsou sladovány s vyšší výtěžností, neboť ztráty dýcháním během máčení jsou minimální. Nižší jsou i provozní náklady, neboť odsávání oxidu uhličitého se prakticky neprovádí. Celkové ztráty při máčení by neměly překročit 3 % z hmotnosti namáčeného ječmene. Podílí se na nich prach a nečistoty (asi 0,1 %), vyloužení pluch (asi 0,8 %), splavky (0,1 až 1,0 %), dýchání ječmene během máčení (0,5 až 1,5 %) podle délky a postupu máčení (VŠCHT v Praze, 2011). 20

21 3.7.3 Klíčení ječmene Cílem sladařského klíčení je aktivace a syntéza enzymů, a docílení požadovaného rozluštění (vnitřní přeměny) zrna při minimálních nákladech a únosných sladovacích ztrátách. Čerstvě sklizený ječmen nikdy neposkytne dobře rozluštěný slad. V ječmeni musí proběhnout posklizňové dozrávání, které u našich ječmenů trvá při standardních podmínkách během vegetace a při sklizni 6 až 8 týdnů. V případě nepříznivých podmínek během sklizně je posklizňové dozrávání delší, ječmeny podtržené nikdy nedosáhnou potřebných sladařských vlastností. Neméně důležité je i chemické složení ječmene. Ječmeny s vyšším až vysokým obsahem dusíkatých látek se obtížněji luští ve sladařské terminologii říkáme, že ječmeny jsou tvrdší. Je-li zvýšený obsah bílkovin v zrně způsoben suchým počasím v závěru vegetace, a tím vynuceným dozráním ječmene, je takové zrno obvykle sklovité, těžko přijímá vodu a obtížně se luští. Je-li vyšší obsah bílkovin důsledkem nadměrné dusíkaté výživy, ječmen není sklovitý, ale vyrobený slad má nízký extrakt a jeho výrobní náklady jsou vyšší. Proto je obsah bílkovin základním požadavkem technologické kvality ječmene. Vymočený ječmen má většinou nižší obsah vody (stupeň domočení), než který je potřebný pro průběh klíčení a požadovanému rozluštění zrna (VŠCHT v Praze, 2011). Zatímco při máčení k technologickým inovacím prakticky nedošlo a zvýšení produkce se dosahuje téměř výlučně intenzifikací procesu máčení, klíčení prošlo v posledních letech výraznými technickými změnami. Humnové sladovny se postupně stávají minulostí a ječmen klíčí v pneumatických sladovacích linkách. Hlavní předností moderních zařízení klíčíren je vysoký stupeň automatizace, a především celoroční identické podmínky výroby sladu. Sladovací zařízení lze rozdělit na klasická a moderní. Do klasických řadíme humna, mezi moderní systémy patří například systém Lausmann (KOSAŘ, PROCHÁZKA, et al., 2000). V moderních (pneumatických) sladovnách se ječmen běžně vymáčí s obsahem vody okolo 42 %, ve sladovnách humnových okolo 44 %. Ihned po oschnutí ječmene nikoliv dříve (asi po 24 h) se oschlá hromada pokropí a na humnech ihned obrátí. V pneumatických sladovadlech se kropí a obrací současně. Účinnost kropení má být alespoň 2 % na jedno kropení. Požadovaný a potřebný obsah vody je ovlivněn vlastnostmi zpracovávaného ječmene (odrůda a chemické složení), typem vyráběného sladu a požadovanými parametry jakosti. Při výrobě světlého sladu plzeňského typu je 21

22 obvyklý obsah vody % vody, pro výrobu tmavého bavorského sladu % obsahu vody. Obsah vody musí vycházet a být v souladu s teplotou při klíčení a s délkou klíčení. Tyto tři faktory se účinně využívají při řízení jakosti vyráběného sladu a vzájemnou kombinací umožňují docílení potřebné jakosti sladu. Při zvýšení obsahu vody o 2 % je při stálé teplotě možné zkrácení vedení o jeden den bez ovlivnění jakosti (VŠCHT v Praze, 2011) Humnová sladovna Humnová sladovna má většinou několik pater. Prostory humen mají nosná klenutí, která jsou podpírána nosnými sloupy. Podlahy jsou z hlazeného betonu, nebo dlaždic, spádované k okrajům a kanálům. Zrekonstruované humnové sladovny mají dnes obvykle humna s chlazením, které je zabudováno v podlaze, což umožňuje větší zatížení humen a lze dodržet příznivější podmínky při klíčení. Vlastností humen je značná tepelná setrvačnost i při šetrném větrání, ať již pomocí tahů oken, nebo pomocí ventilátorů. Vzduch na humnech má vysokou relativní vlhkost, která zamezuje vysychání hromad a předčasnému zavadání zeleného sladu. Nevýhodou humnových sladoven je velký obestavěný prostor a i přes používání mechanizace zde stále převažuje namáhavá manuální práce. Dodržování technologie sladování je velmi obtížné. Výhodou je, že slady jsou méně poškozeny a výtěžnost humnového sladování je vysoká. Nevýhodou pak velikost vyrobených partií sladu a jeho nedostatečná homogenita (KOSAŘ, PROCHÁZKA, et al., 2000). 22

23 Obrázek č. 1. Humnová sladovna Zdroj: Hvozdění ječmene Na konci klíčení se již produkt nazývá slad (zelený slad). Hvozdění, (neboli sušení) sladu má za cíl zastavit probíhající enzymatické procesy ve sladu a zároveň zajistit jeho dlouhou trvanlivost. Při hvozdění probíhají ve sladu hluboké fyzikální a chemické změny, které závisí na tom, při kterých teplotách, při jakém obsahu vody a jakou rychlostí dochází k odsoušení vody. Podle těchto kriterií se dají při hvozdění odlišit dvě fáze: 1) Fáze předsoušení sladu - u světlých sladů se při předsoušení sníží obsah vody z 40-45% na 10-12% do tzv. prošlápnutí lísky. Je to fáze předsoušení sladu, která by měla u světlých sladů probíhat při teplotách vstupujícího vzduchu max. 55 C a při dostatečném tahu ventilátoru. Matematický popis sušení při předsoušení je konstantní a je pro něj rozhodující nikoliv teplota vzduchu, ale jeho relativní vlhkost a objem. Rychlost sušení stoupá s klesající relativní vlhkostí vstupujícího vzduchu. 2) Fáze zvyšování teplot a dotahování sladu tato druhá fáze hvozdění je velmi důležitá pro tvorbu aromatických a barevných látek, charakteristických pro druh sladu. Průběh sušení v této fázi se nepodařilo jednoduchým matematickým způsobem kvalifikovat. Zde dochází k odsoušení již vázané vlhkosti ze zrna a to závisí na rozdíl od fáze 23

24 předsušení (odsoušení volné vlhkosti) na kvalitě hvozděného sladu, neboli na stupni rozluštění zrna (kyprosti endospermu). Rychlost proudění vzduchu má již význam pouze pro lepší přenos tepla, rozhodující je však teplota vzduchu (KOSAŘ, PROCHÁZKA, et al., 2000). U nás se používají nejčastěji hvozdy dvoulískové, které vyhovují nejlépe pro výrobu plzeňských sladů. Lísky jsou uloženy na roštu z plochých želez. Pletivo lísky je z kónicky lisovaného drátu o světlosti štěrbin 1,5mm. Lísky jsou sklopné. Slad ze spodní lísky se jejím skloněním přemístí do košů na slad a slad z vrchní lísky na lísku spodní. Nastírání a obracení sladu se provádí pomocí vendrů (lopatkové obraceče) v intervalu 4-5 h, aby se vyrovnaly rozdíly v obsahu vody. Intervaly se s narůstající teplotou zkracuji a během dotahování jsou obraceče neustále v chodu (PELIKÁN, 2002). Obrázek č. 2. Dvoulískový hvozd (zdroj: 24

25 3.7.5 Úprava hotového sladu Po hvozdění se slad upravuje odkličováním na odkličovačkách a před expedicí, se také často slady navíc leští. Odkličováním se odstraní zárodečné kořínky, které jsou velmi křehké a lehko se ulamují. Leštěním získává výrobek čistého vzhledu a současně se odstraňuje prach a poškozená zrna. Takto upravený vzhled lze skladovat na sýpkách nebo v silech až 2 roky, bez újmy na jeho kvalitě. Čerstvé slady běžných typů při bezprostředním zpracování hůře zcukřují i zcezují, mohou vyvolat poruchy při kvašení, snižovat pěnivost piva a způsobovat zákal. Jejich jakost se vyrovná odležením, které trvá podle podmínek při sladování několik týdnů až měsíců. Během odležení se regeneruje koloidně-chemická rovnováha sladu narušená hvozděním a oslabené enzymy se opět aktivují. Za nejdůležitější změnu se však pokládá enzymové štěpení bílkovin. Odležením se stává slad křehčím a lépe se zpracovává. 3.8 Výroba sladu ve sladovně Bernard Technické vybavení Máčírna 8 klasických náduvníků pro namáčku 14 t ječmene v jednom náduvníku. V náduvníku je možno odsávat CO2 v průběhu vzdušné přestávky a provzdušňovat tlakovým vzduchem. Klíčírna humnová s celkovou plochou 4850 m2 s možností doplňkového skrápění a podlahovým chlazením. Temperace se provádí větráním a převrstvováním maltomobilem. Hvozd dvoulískový, obdélníkový (8 x 12 m). Sklad skladové kapacity na 2000 t ječmene a 1000 t sladu. Čistička 1 ks o výkonu 6 t/h. Odkličovačka 2 ks, jedna o výkonu 4 t/h. Pulírka 1 ks o výkonu 9 t/h. 25

26 3.8.2 Technologie výroby Příjem, čištění a skladování ječmene Při příjmu se nejprve odebírá vzorek, který je kontrolován v laboratoři, kde musí splnit požadavky sladovny. Stanovuje se přepad zrna, obsah bílkovin, vlhkost a obsah škrobu. Poté je automaticky zváženo, vysypáno do zásobního koše a po průchodu čistící stolicí přesunuto do hradí, nebo sil. Máčení ječmene Máčení je třídenní se třemi vodami (obvyklá délka namáčky je 5 hod., délka vzdušné přestávky pak 17 hod.). Teplota máčecí vody je 12 C a teplota vzduchu 18 C. Na konci namáčky se dosahuje stupně domočení 45 %. Klíčení ječmene Klíčení probíhá na humnech 4 5 dnů, obvykle při 18 C. Obracení sladu se provádí maltomobilem. Na konci klíčení je stupeň domočení přibližně 44 %. Hvozdění ječmene Celkový čas hvozdění je 36 hodin. Regulace teploty mezi lískami se provádí otevíráním studených tahů. Maximální teplota mezi lískami v závěru hvozdění dosahuje 55 C. Po sklopení na spodní lísku trvá náběh na teplotu vyhřívání 5 hodin, náběh na dotahovací teplotu dalších 8 hodin a dotahování při teplotě 85 C trvá 3 hodiny. Odkličkování a skladování Odkličkování se provádí v odkličovačce, odkud jde sladový květ v pytlích do skladu a hotový slad do sil, odkud se dále expeduje. 3.9 Gushing přepěňování piva První zprávy o gushingu pocházejí z počátku 20. let minulého století. Tehdy poprvé byl tento jev popsán a publikován v odborné literatuře. Od té doby se začaly pravidelně objevovat případy gushingu, což vedlo k jeho hlubšímu zkoumání. Díky tomu je pojem gushing znám po celém světě a běžně se již z angličtiny nepřekládá. Gushing můžeme definovat jako nežádoucí nadměrné pěnění sycených nápojů po otevření, bez předchozího míchání. Tento jev lze nalézt také v dalších sycených 26

27 nápojích, jako jsou ovocné šťávy, sycená a šumivá vína. Příčiny výskytu gushingu v pivu mohou být rozděleny do dvou kategorií: 1) Primární, neboli přímé přepěňování má spojitost s napadením obilky ječmene vláknitými houbami, případně plísněmi (Fusarium, Aspergillus, Rhizophus, Penicillium a Nigrospor) a závisí na kvalitě použitého ječmene a sladu. Plísně mají schopnost produkovat mykotoxiny, které jsou příčinou mykotoxikóz nejen u zvířat, ale i u člověka. Vlastní látky způsobující gushing však dosud známé nejsou. Předpokládá se, že jsou vytvářeny jako odezva na předchozí stres organismu. 2) Sekundární, neboli nepřímé přepěňování závisí na výrobních faktorech a protože samotné napadení obilky patogeny nemusí vždy gushing vyvolávat, je nutná přítomnost tzv. iniciátorů uvolňování plynu (defekty v lahvi, usazeniny solí a jiných látek), které rovněž zahrnujeme pod sekundární příčiny gushingu (MURANYIA M.). Z hlediska frekvence výskytu gushingu jej mužem rozdělit na letní a zimní typ. Letní typ se vyskytuje pouze tehdy, když je lahvové pivo skládáno či jinak s ním manipulováno při teplotách v rozsahu C. Zimní typ se vyskytuje, pouze po třepání či skladování piva za chladu (MUNEKATA, 1961) Fyzikální faktory ovlivňující gushing Tabulka č. 2. Fyzikální faktory ovlivňující gushing teplota pohyb Tvar Izomerizované Šťavelan Mikrobiální lahve chmelové vápenatý kontaminace extrakty Pramen: Vlastní konstrukce Ovlivňování gushingu teplotou vyplývá již ze zmíněného rozlišování na letní a zimní gushing. S teplotou souvisí i stupeň přesycení roztoku oxidu uhličitého v okamžiku otevření obalu s nápojem a vznik některých typů dříve zmíněných jader pro spontánní uvolňování oxidu uhličitého. Mechanický pohyb byl již také zmíněn v souvislosti se skladovacím gushingem. Piva skladovaná ve svislé poloze vykazovala nižší tendenci ke gushingu, než piva skladovaná v poloze horizontální. Sklon ke 27

28 gushingu vzrůstá i s dobou skladování a je nejsilnější po 2 10 týdnech, pak opět klesá. Na základě mechanického pohybu je založena celá řada testů pro zjišťování sklonu piva k samovolnému přepěňování (ČEPIČKA, 1993) Chemické faktory ovlivňující gushing Tabulka č. 3. Chemické faktory ovlivňující gushing detergenty Těžké kovy Izomerizované chmelové extrakty Pramen: Vlastní konstrukce Šťavelan vápenaty Mikrobiální kontaminace Již poměrně dlouhou dobu je známo, že některé těžké kovy způsobují gushing v pivu. Těžké kovy vyvolávají gushing už při koncentraci několika ppm. Patří sem například cín, bismut, železo, molybden a nikl. Bylo zjištěno, že význam při vytváření podmínek pro vznik gushingu má uhličitan železnatý, tvořící se na povrchu plynových jader. Většinou jsou však koncentrace těžkých kovů v pivu nižší, než je nezbytné pro vyvolání gushingového jevu (GRAY, 1956) V izomerizovaných extraktech byly zjištěny 2 typy gushingového faktoru. Prvním je dehydratovaná kyselina humilinová, která není normální složkou izomerovaných extraktů, ale může být v jednotlivých případech přítomna v koncentraci až do 5% a v komerčních pivech je schopna vyvolat gushing. Druhým faktorem byl oxidační a degradační produkt iso-alfa hořkých kyselin, schopných vyvolat gushing. Obsah oxidačních produktů v komerčních isoextraktech se pohybuje od 2,5% do 8,8% a čím je vyšší, tím gushingová křivka více stupá. (VÝZKUMNÝ INSTITUT ŽATEC) Šťavelová kyselina je obsažena jako přirozená složka v pivovarských surovinách. Její největší část je vázána ve formě rozpustných sodných a draselných solí, zatímco s vápenatými ionty tvoří nerozpustný šťavelan vápenatý. Šťavelová kyselina přítomná v pivu může už při nízké koncentraci, zvláště ve formě šťavelanu vápenatého, způsobit přepěňování piva (gushing). (BENEŠOVÁ, 2010) 28

29 3.9.3 Inhibitory gushingu Basařová, et al. (2010) uvádí následující inhibitory gushingu: kyselé proteásy α- a β-glukanasy chmelové silice nenasycené mastné kyseliny startovací kultury plísně Geotrichum startovací kultury mléčných bakterií Technologické možnosti potlačení gushingu Nejlepší prevencí proti gushingu je pečlivý výběr kvalitních surovin, tedy ječmene, sladu a chmele. Ze zkušeností vyplývá, že některé epidemické případy samovolného přepěňování byly způsobeny surovinou, která měla být při přejímce do pivovaru kontrolou vyloučena, jako nevhodná. Vzhledem k významu mikrobiálního poškození ječmene během pěstování a zpracování je nutno dbát na podmínky zrání, sklizně a dozrávání ječmene a především na vysokou hygienu ve sladovně. Vysoké teploty při klíčení mohou též podporovat růst plísní jako Aspergillus amstelodami a Aspergillus fumigatus, které produkují látky vyvolávající gushing. Přídavek desinfekce k namáčecí vodě se ukázal, jako účinná prevence proti gushingu piv, která byla vařena ze sladů napadených Fusarií. Čím vyšší je dávka chmele, tím menší je sklon piva k samovolnému přepěňování. Chmel obsahuje látky podporující i potlačující gushing a jeho protigushingové účinky závisí na odrůdě. Z tohoto hlediska i výběr chmele může být prostředkem v účinné prevenci proti gushingu. V průběhu technologického procesu se sklon pivovarských meziproduktů ke gushingu mění. Gushing hotového piva je možno ovlivnit během technologického procesu například dokonalým vysrážením šťavelanu vápenatého (BEKENIOVÁ, 2008) Mikrobiální kontaminace Plísně jsou mikroorganismy, které řadíme do říše hub. Termín plísně se stal vžitým českým názvem pro vláknité mikroskopické houby, tzv. mikromycety. Některé druhy plísní jsou rozšířeny po celém světě. Velká morfologická rozmanitost a schopnost plísní přizpůsobit se nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje jejich výskyt 29

30 všude tam, kde existuje organická hmota. Spory plísní jsou jednobuněčné či vícebuněčné výtrusy, sloužící k jejich rozmnožování a přežívání. Jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých a odumřelých organismů, na různých předmětech, v krmivech apod. Zvýšený výskyt spor, či fragmentů houbových vláken v ovzduší, závisí mimo jiné na klimatických podmínkách a na stupni porušení biologické rovnováhy v důsledku narušeného životního prostředí. Díky svému enzymatickému vybavení dokáží plísně snadno kontaminovat téměř jakýkoliv substrát, tedy i potraviny (MALÍŘ, 2001). Lze rozlišit 3 skupiny plísní: 1. polní, přítomné v zrnu již při sklizni 2. skladištní 3. polní i skladištní Přesvědčivý důkaz o vyvolání gushingu mikroorganismy rostoucími na ječných zrnech podali američtí výzkumníci, kteří přidávali do sladovací vody, při mikrosladovacích pokusech izobáty 97 mikroorganismů izolovaných z ječných zrn. Výsledek ukázaly, že některé kmeny Fuzarium a Aspergillus způsobovaly změny v analytických hodnotách, jako vzestup rozpustného dusdíku, vzestup aktivity α- amylasy, vzestup diastatické mohutnosti a pokles stability vazby. Z tohoto vyplývá, že gushing není způsobován Fusariemi jako takovými, ale je výsledkem iterakce mezi Fusariemi a klíčicím ječmenem (SYPECKÁ, 2003) Mykotoxiny Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity řady druhů mikroskopických vláknitých hub (plísní), které mohou kontaminovat široké spektrum potravin a krmiv. Producenti těchto nebezpečných kontaminantů vyvolávají různé toxické syndromy, které se souhrnně nazývají mykotoxikózy (VELÍŠEK J., 2002). K tvorbě mykotoxinů dochází po fázi aktivního růstu hub. Některé metabolity tvoří více chemicky příbuzných entit, jiné pouze jednu, nebo velmi omezený počet. Mykotoxiny představují velmi pestrou skupinu sloučenin, jejichž relativní molekulová hmotnost obvykle nepřesahuje 500 Da a většina těchto látek má lipofilní charakter. Kumulují se v tukových frakcích 30

31 rostlin a zvířat. V současné době je známo kolem 350 druhů toxinogenních plísní. Produkce mykotoxinů je silně závislá na genotypu organismu a na fyzikálněchemických faktorech. Mezi hlavní fyzikální faktory, které jsou důležité pro biosyntézu mykotoxinů, patří teplota a vodní aktivita. Mezi chemické faktory ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří dostatečné množství látek, které houby využívají pro zahájení metabolismu. V případě nadbytečného množství těchto látek nedochází k aktivaci enzymatických systémů v houbě, což vede k významnému snížení produkce sekundárních metabolitů. Důležitým biologickým faktorem, který ovlivňuje biosyntézu sekundárních metabolitů je stáří kultury (DRASTICHOVÁ K., 2005). Ke kontaminaci může docházet v průběhu vegetace nebo po sklizni, během skladování a zpracování (SÝKOROVÁ, et al., 2002). Z hlediska časového projevu negativních účinků mykotoxinů je možno je rozdělit na akutní a chronické. Projevy akutní intoxikace, tj. rychlé negativní odezvy organismu člověka na vyšší příjem mykotoxiny kontaminovanými potravinami, jsou v dnešní době známy pouze z různých oblastí Afriky a Asie. Mezi pozdní účinky nepříznivého působení patří v závislosti na druhu mykotoxinu mutagenita, imunotoxicita, neurotoxicita, kancerogenita a teratogenita. V přirozených podmínkách se obvykle vyskytuje více mykotoxinů současně a může docházet k synergickému efektu, kdy se toxické účinky jednotlivých mykotoxinů zesilují. Po infekci rostlin dochází ke značným ekonomickým ztrátám v důsledku poklesu výnosu. V souvislosti s napadením představuje další nebezpečí produkce toxických sekundárních metabolitů v zrnu mykotoxinů, z nichž v cereáliích jsou nejvýznamněji zastoupeny trichothecenové deriváty. Trichotheceny jsou mykotoxiny, které jsou produkovány hlavně různými druhy fusarií. Dělí se na dvě hlavní skupiny, trichotheceny typu A (T-2 toxin, HT-2 toxin, diacetoxycirpenol a neosolaniol) a trichotheceny typu B (DON, nivalenol a další) (SÝKOROVÁ, et al., 2002) Důležité aspekty produkce mykotoxinů: 1. Určitý mykotoxin může být produkován zástupci několika rodů toxinogenních hub 2. Více mykotoxinů může být syntetizováno jedním druhem hub 3. Jeden mykotoxin může produkovat více rodů a druhů hub 31

32 4. Identifikace hub v produktech rostlinné výroby ještě neznamená nutnou přítomnost mykotoxinů 5. Ne všechny kmeny potenciálně toxinogenních hub jsou toxinogenní. (DRASTICHOVÁ K., 2005) Gushing a Fusaria Houby rodu Fusarium se vyskytují na rostlinách a v půdách. Jsou součástí běžné mykoflóry zemědělských komodit. Většina druhů byla izolována v tropických a subtropických oblastech, ale řada z nich je přítomna také v rostlinách a půdách chladnějších oblastí. Rod Fusarium má více než 20 druhů, z nichž se nejběžněji vyskytují druhy F.solani, F. oxysporum, F. poae, F. sporotrichioides,f. graminearum a F. avenaceum (MALÍŘ, 2003). Plísně rodu Fusarium se řadí mezi hlavní producenty trichothecenových mykotoxinů. Převládajícím mykotoxinem nalézaným na ječmeni je DON (deoxynivalenol). Plísně rodu Fusarium způsobují nemoc zvanou Fusarium head blight" (FHB). Touto celosvětově rozšířenou nemocí bývají napadeny zejména obiloviny. FHB je známa již od roku 1890, kdy byla plísní Fusarium infikována úroda ve východní části USA. Další epidemie propukla např. v Německu v letech 1987 a 1991 (SÝKOROVÁ, 2006), (GUDMESTAD,2005). Plísně produkují odolné toxické metabolity, které jsou schopny přežít sladovací a sušící proces a dostat se až do konečného produktu - piva. Přenos mykotoxinů z ječmene do piva záleží na rozpustnosti a tepelné stabilitě jednotlivých mykotoxinů. Nejčastějším mykotoxinem, který bývá stanoven v infikovaném ječmeni je deoxynivalenol. Množství deoxynivalenolu, který je produkován během sladování infikovaného ječmene je různě vysoké a pravděpodobně závisí na jednotlivých odrůdách stejně jako na sladovacích podmínkách (SÝKOROVÁ, 2006), (GUDMESTAD,2005) Toxicita Rod Fusarium způsobuje u lidí a stejně tak i u zvířat řadu onemocnění. Infekce vyvolané Fusarium spp. se obecně nazývají fuzariózy. Vývoj fuzariových infekcí je spojován s poraněním rostlinných či živočišných tkání, nebo s oslabením imunity. V souvislosti s fuzarii byly u lidí popsány keratitidy, záněty středního ucha, záněty žil, záněty čelních dutin a plic, septická artritida, záněty srdečních svalu a jiné onemocnění. 32

33 Rod Fusarium produkuje velké množství mykotoxinů. Konzumace obilí, které je takto napadené, vede ke zvyšování alergických reakcí a při dlouhodobější expozici k výskytu rakoviny. Sekundární metabolity produkovány rodem Fusarium-trichotheceny, jsou známy svými imunosupresivními účinky a inhibicí syntézy proteinů. Mohou způsobovat nervové poruchy, zvracení, podráždění kůže, nechutenství a průjmy (ŠIMÙNEK, 2004), (MALÍŘ, 2001) Mykotoxikózy se mohou vyskytovat v jedné ze tří forem: 1. akutní primární mykotoxikóza - vzniká po požití vyšších dávek mykotoxinů. Jejími následky jsou hematotoxikózy a nekrózy různých tkání, jako je gastrointestinální trakt, kostní dřeň a lymfoidní tkáň. 2. chronická primární mykotoxikóza - vyskytuje se při opakovaném příjmu středních a nízkých množství toxinů a projevují se např. poruchami rozmnožování a imunitního systému, zpomaleným růstem, sníženým váhovým přírůstkem apod. 3. sekundární choroby způsobené přítomností mykotoxinů - vznikají po přijímání velmi nízkých koncentrací specifických mykotoxinů. Jednotlivé trichothecenové mykotoxiny se mírou toxicity velmi liší. Trichotheceny typu A jsou desetkrát toxičtější než trichotheceny typu B. Rozhodujícími faktory pro celkový toxický účinek mykotoxinů jsou dávka a délka doby působení. Podstatnou roli hraje také věk, pohlaví a druh exponovaných živočichů. Také kombinace dvou či více mykotoxinů vyskytujících se v dané surovině současně může působit toxičtěji, než jednotlivé mykotoxiny, v důsledku jejich synergismu. DON je silné centrální emetikum, na které jsou velmi citlivá prasata. Vyvolává zvracení, akutní průjmy, poruchy koordinace pohybů, hemoragie na sliznicích a náhlý úhyn. DON působí na imunitní systém a potlačuje zánětlivé reakce, způsobuje pokles chemotaxe a fagocytózy, inhibici krevních destiček a zvýšení citlivosti k bakteriálním endotoxinům. Tím je zvíře oslabeno ve prospěch bakteriální, virové či plísňové nemoci (ŠIMÙNEK, 2004) Gushing a Deoxynivalenol (DON) Deoxynivalenol (triviálním názvem vomitoxin) byl objeven v roce 1973 Yoshizawou a Moorokem. Deoxynivalenol se nalézá v obilovinách a v obilných 33

34 výrobcích, např. v dětských výživách z obilovin, v pečivu, v těstovinách, v ječmeni a ve výrobcích na bázi ječmene, v kukuřici, rýži, prosu, otrubách, sojových bobech, česneku, bramborách, pivu a v mnohých dalších potravinách (MALÍŘ, 2003). K nejčastěji se vyskytujícím fusariovým toxinům (trichothecenového typu) řadíme především deoxynivalenol (DON někdy také označován názvem vomitoxin, jelikož hlavním příznakem akutní otravy je zvracení, neboli vomitus). Jeho největšími producenty jsou F. graminearum a F. culmorum a DON se vyskytuje obvykle v několikanásobně vyšších koncentracích, než ostatní trichotheceny (T-2 toxin, HT-2 toxin, acetylovaný deoxynivalenol, nivalenol atd.) a zearalenon. Přechod mykotoxinů z ječmene do piva je závislý na jejich rozpustnosti a tepelné stabilitě (SCHWARZ, 1995) Nivalenol (NIV) Nivaleon patří stejně jako deoxynivalenol do skupiny mykotoxinů produkovaných rodem Fusarium. Zejména ho produkuji Fusarium cekalis a Fusarium poae, mezi méně významné producenty patří Fusarim culmorum (MALÍŘ, 2003) Mykotoxiny v pivu Přechod mykotoxinů z ječmene do piva je závislý na jejich rozpustnosti a tepelné stabilitě. Produkce DON v průběhu sladování je velmi různorodá a pravděpodobně závisí jak na odrůdě ječmene, tak na technologických podmínkách sladování. Nalézané koncentrace DON ve sladu se obvykle pohybují na nižších hladinách než v ječmeni. Ačkoli je DON rozpustný ve vodě, nedochází k jeho výraznému úbytku přechodem do máčecích vod v průběhu máčení ječmene, ale spíše dochází k jeho další tvorbě během máčení a klíčení (probíhá při optimálních teplotách a vlhkosti pro růst dalšího houbového mycelia). DON patří mezi inhibitory proteinové syntézy, a tudíž může potenciálně ovlivňovat i proces klíčení sladu. V průběhu hvozdění pak dochází ke zničení mycelia a zastavení produkce DON, nikoli však k jeho odstranění, či degradaci na netoxické degradační produkty. V průběhu dalšího technologického kroku výroby piva, rmutování, dochází obvykle k odstranění % DON. Ačkoli jeho rezidua díky vysoké tepelné stabilitě mohou přecházet do dalšího meziproduktu, je třeba si uvědomit, že při vaření piva dojde ještě k dalšímu osmi až desetinásobnému zředění jeho koncentrace. Např. v průběhu sledování výskytu DON v komerčně prodávaných pivech (6 studií zahrnujících analýzu 327 piv z USA, Kanady a 34

35 Evropy) nebyl u většiny vzorků vůbec detekován, a pokud ano, jeho koncentrace se pohybovala mezi 5-20 ppb. V tomto případě by tedy musel jedinec zkonzumovat najednou několik stovek litrů piva, aby požil letální dávku DON (akutní toxicita, pro myš LD50 DON při orálním podání je 46 mg/kg tělesné hmotnosti, tj. dávka, která způsobí akutní uhynutí 50 % experimentálních zvířat) (SYPECKÁ, HAVLOVÁ a NEVRKLOVÁ, 2003) Maskované mykotoxiny v pivu Vedle volných mykotoxinů se mohou v cereáliích vyskytovat také tzv. maskované formy. První (nepřímé) úvahy o existenci skrytých zdrojů toxických sekundárních metabolitů vláknitých hub napadajících obiloviny, se objevily již v polovině 80. let 20. století (MALACHOVÁ, et al., 2010). V roce 1992 (Sevard) byl v buněčné kultuře kukuřice uměle kontaminované DON objeven hlavní metabolit DON - deoxynivalenol-3-glukosid (D3G; Obr. 3), avšak v přirozeně kontaminované pšenici a kukuřici byl tento metabolit DON objeven až v roce 2005 (BERTHILLER, 2005, BERTHILLER, 2007). Po konzumaci potraviny či krmiva kontaminované D3G je osud tohoto konjugátu v organismech savců neznámý a měl by být proto považován za potencionálně nebezpečný pro zdraví člověka i zvířat. Lze očekávat aditivní účinek DON a D3G po deglykosylaci v trávicím traktu (BERTHILLER, 2007). D3G je také jediným rostlinným maskovaným mykotoxinem, pro který je komerčně dostupný analytický (EFSA call, 2009) standard a tudíž je možné jej rutinně stanovovat. I přesto jej většina laboratoří běžně nestanovuje a data týkající se jeho výskytu jsou omezená. Na Ústavu chemie a analýzy potravin Vysoké školy chemicko-technologické v Praze bylo poprvé na světě odhaleno uvolňování maskovaného D3G v průběhu sladařské a pivovarské technologie (LANCOVÁ, 2008), kdy za nejkritičtější kroky těchto technologických operací jsou považovány klíčení (sladařství) a rmutování (pivovarství). V souvislosti s touto skutečností byly identifikovány i další maskované formy DON DON-di-glukosid a DON-tri-glukosid v pivu vyrobeném z uměle infikovaného ječmene (HAJŠLOVÁ, 2007) a posléze také ve vzorcích sladu. Fumonisiny jsou další skupinou fusariových mykotoxinů, které podléhají konjugaci. První konjugované fumonisiny byly objeveny v tepelně zpracovaných potravinách, kdy docházelo po tepelné úpravě ke konjugaci fumonisinů s cukry, 35

36 aminokyselinami a bílkovinami (např. N-karboxymethyl-fumonisin B1). Existence rostlinných metabolitů fumonisinů byla potvrzena až v roce 2008 (Dall Asta), kdy byly objeveny maskované fumonisiny v nezpracované kukuřici (BERTHILLER, 2009). Obrazek. č. 3. Struktura maskovaného mykotoxinu D3G Pramen: MALACHOVÁ, et al., Výskyt mykotoxinů v pivech zakoupených na českém trhu v roce 2010 Kontaminace piv mykotoxiny se mění a závisí především na výběru vhodné vstupní suroviny, takže se hladiny mykotoxinů v této komoditě mohou rok od roku výrazně lišit. Z tohoto důvodu byl v roce 2010, stejně jako v minulých letech, (KOSTELANSKA, 2009) proveden monitoring obsahu mykotoxinů v pivech z domácí produkce. Celkem bylo analyzováno 52 vzorků světlých, polotmavých a tmavých piv, zakoupených v maloobchodní síti ČR. Konkrétně se jednalo o 13 vzorků nealkoholických piv, 20 piv s obsahem alkoholu 4-4,9%, 14 piv s obsahem alkoholu 5-5,9% a 5 piv s více než 6% alkoholu (BERTHILLER, 2009). Z výsledků analýz vyplývá, že majoritními mykotoxiny vyskytujícími se v této komoditě jsou DON a jeho glukosylovaná forma D3G. Kromě těchto dvou nejčastějších mykotoxinů byly u některých vzorků detekovány také nivalenol, 3- acetyldeoxynivalenol, ochratoxin A, alternariol, alternariol-methylether, zearalenon, ergosin a ergocryptin (Tab. č. 4), jejich hladiny se však pohybovaly velmi nízko, většinou těsně nad hranicí limitu stanovitelnosti. Co se týká incidence DON a jeho metabolitu D3G, jejich konkrétní hladiny v jednotlivých pivech jsou patrné z Obr. č 4 (koncentrace D3G je zde vyjádřena jako obsah samotného DON v glukosylované molekule). Nejnižší koncentrace zmíněných mykotoxinů obsahovala piva nealkoholická (6,3 µg/l DON a 7,5 µg/l D3G). Příčina zřejmě souvisí s technologií jejich výroby. Při produkci nealkoholických piv se totiž, 36

37 buď uplatňují speciální kmeny kvasinek vykazující sníženou produkci alkoholu, nebo se tato piva vyrábí ředěním mladiny, čímž dochází k naředění extraktu, potažmo mykotoxinů. Nejvyšší průměrné hodnoty mykotoxinů vykazovala piva se 4% až 4,9% alkoholu (20,9 µg/l DON a 26,5 µg/l D3G) a piva s 5% až 5,9% alkoholu (21,1 µg/l DON a 24,5 µg/l D3G). Piva s více než 6% alkoholu pak obsahovala průměrně 17,4 µg/l DON a 17,3 µg/l D3G.(HAJŠLOVÁ, 2011) Vzhledem k hodnotě tolerovatelného denního příjmu (TDI) stanoveného pro DON na 1 µg/kg tělesné váhy (COMMISION REGULATION, 2007), je oprávněné považovat přítomnost těchto mykotoxinů v pivu za závažnou. Vezmeme-li v úvahu průměrnou hodnotu DON a D3G v analyzovaných alkoholických pivech, tj. 19,8 DON a 22,7 D3G µg/l, člověk vážící 75 kg by dosáhl hodnoty tolerovatelného denního příjmu po vypití přibližně tří půllitrů. (HAJŠLOVÁ, 2010). Tabulka č. 4. Přehled mykotoxinové kontaminace vyšetřovaných vzorků piv, limity kvantifikace (LOQ) jednotlivých 37

38 mykotoxinů. Pramen: Hajšlová, 2010 Obrazek č. 4. Hladiny DON a D3G v jednotlivých vzorcích piv (koncentrace D3G je zde vyjádřena jako obsah samotného DON v glukosylované molekule). 38

39 Pramen: Hajšlová, Možnosti regulace kontaminace mykotoxiny Principem prevence je zamezit vytvoření optimálních podmínek prostředí, které mikroorganismy pro růst, rozmnožovaní a produkci toxinů potřebují. Tyto podmínky jsou dány zejména teplotou a vlhkostí, ale i dalšími faktory, jako např. množství počátečního infekčního substrátu, odolnost hostitele a další. Základem pro prevenci výskytu mykotoxinů v rostlinných produktech je dodržování zásad správné zemědělské a zpracovatelské praxe. Pro zamezení vstupu kontaminované suroviny do potravinářského řetězce je důležitý účinný systém kontroly, který by měl být postaven na aplikaci vhodných detekčních metod. Pokud jsou rostlinné produkty již jednou mykotoxiny kontaminovány, jsou možnosti snížení jejich obsahu omezené. V úvahu připadá zejména třídění nebo čištění, založené např. u obilovin a na separaci zlomků nečistot a lehčích obilek, u ovoce na vytřídění nahnilých a poškozených plodů. Mykotoxiny obecně jsou poměrně stabilní sloučeniny, které se v průběhu zpracování nerozkládají buď vůbec, nebo v závislosti na druhu mykotoxinu a podmínkách prostředí pouze částečně. Výjimkou je do jisté míry patulin, který je relativně termolabilní a lze jej tepelnou úpravou významně eliminovat (PRUGAR, 2008). 39

40 Výzkum v oblasti mykotoxinů a jeho trendy V rámci Evropské unie je problematika mykotoxinů a jejich producentů jednou z priorit výzkumu. Je kladen důraz na studium genetiky a biologie syntézy mykotoxinů, studia rezistence rostlinných hostitelů vůči toxinogenním mikroorganismům, na vývoj citlivých, nedestruktivních a rychlých detekčních metod a na vývoj metod pro dekontaminaci komodit po sklizni. Toxikologie se ve vyspělých zemích v současné době zaměřuje na výzkum účinků nízkých (subchronických) koncentrací mykotoxinů, kterým je lidský organismus vystavený po dlouhou dobu, studium pozdních vyvolané, tj. neakutních účinků a výzkum současného působení více mykotoxinů najednou (PRUGAR, 2008) Související legislativa Základ národní legislativy, týkající se potravin určených pro výživu lidí, jakož i potravinových doplňků representuje : Zákon č. 110/1997 Sb. ze dne 24. dubna 1997 ve znění předpisu č. 120/2008 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, a příslušná Vyhláška č. 335/1997 Sb. ze dne 12. prosince 1997 ve znění 289/2004 Sb., kterou se provádí 18 písm. a), d), h), i), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro nealkoholické nápoje a koncentráty k přípravě nealkoholických nápojů, ovocná vína, ostatní vína a medovinu, pivo, konzumní líh, lihoviny a ostatní alkoholické nápoje, kvasný ocet a droždí. Piva a výrobků na bázi piva se pak týká oddíl 3, Požadavky na zrno ječmene setého jako zemědělského výrobku, určeného na výrobu pivovarského sladu, stanovuje Norma ČSN Obilí potravinářské, Část 5: Ječmen sladovnický, platná od 1. ledna Hodnoty jednotlivých stanovovaných jakostních parametrů zrna sladovnického ječmene, jak v případě smluvních vztahů, tak také minimální požadavky na jakost jsou dány články 3.1. Zdravotní a hygienická nezávadnost článkem 4. Kromě požadavků, stanovených v této normě, by měl ječmen sladovnický odpovídat požadavkům stanoveným v normě ČSN Společná ustanovení pro obiloviny, luštěniny a olejniny od roku 2002 neplatné, která udává, že ječmen musí být 40

41 zdravý, vyzrálý, bez škůdců a cizích pachů, nesmí obsahovat zrna s pluchou zjevně naplesnivělou a plesnivou. Norma ČSN Slad, platná od 1. října Platí pro obchodování se sladem vyrobeným z vyčištěného a vytříděného sladovnického ječmene, pšenice, pšenice špaldy, žita a žitovce (triticale) sladováním a případně pražením za podmínek typických pro výrobu daného druhu sladu. Dozor nad výrobou a uváděním piva a nápojů na bázi piva do oběhu, provádí Státní zemědělská a potravinářská inspekce (SZPI) podle zákona č. 146/2002 Sb. ze dne 20. března 2002 ve znění 291/2009 Sb. o Státní zemědělské a potravinářské inspekci a o změně některých souvisejících zákonů. V rámci EU jsou v současné době stanoveny i požadavky na maximální obsah mykotoxinů v potravinách a v surovinách pro jejich výrobu Nařízením Komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách. Jsou zde uvedeny limity pro aflatoxiny (aflatoxin B1 a sumu aflatoxinů B1, B2, G1 a G2, ochratoxin A, deoxynivalenol a zearalenon). Doplňujícím nařízení komise (ES) č. 1126/2007 ze dne 28. září, jsou určeny také limity pro obsah fumonisinů (suma B1 a B2) v kukuřici a výrobcích z nich. V přípravě je již delší dobu regulace obsahu T-2 a HT-2 toxinů v obilovinách. Nařízení komise (ES) č. 401/2006 ze dne 23. února, stanoví metody odběru vzorků a metody analýzy pro úřední kontrolu množství mykotoxinů v potravinách. Mykotoxiny nejsou v potravinách rozmístěny homogenně, z toho důvodu je velmi důležitý správný postup při odběru vzorků. Vzhledem k významu tohoto kroku pro vypovídací hodnotu vlastní analýzy, je tato problematika také předmětem legislativy. 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál 41

42 4.1.1 Charakteristika vzorků Pro účel této diplomové práce byly použity vzorky odrůdy Forum jarního sladovnického ječmene. Ty to vzorky byly vypěstovány firmou PLANT SELECT ve šlechtitelské stanici v Hrubčicích. V roce 2010 bylo otestováno 24 vzorků a to v ošetřené a neošetřené variantě, v roce 2011 bylo otestováno 36 vzorků a to také ve dvou variantách. Celkem bylo otestováno 120 vzorků, u kterých byl proveden Gushingový test. V roce 2011 byl proveden navíc test na přítomnost DON, ZON v ječmeni Agrotechnika a gushing Při dlouhodobém pozorování gushingu v souvislosti s ročníkem výskytu bylo zjištěno, že gushing se vyskytoval nejenom u ročníku s vyšší průměrnou vlhkostí, ale i u ročníku suchých. Toto zjištění vedlo ke zkoumání, zda agrotechnika má či nemá vliv na gushing. Pro diplomovou práci jsem se rozhodl ověřit teorii o správné agrotechnice, viz. kapitola 3.3, při pěstování ječmene jarního v době dozrávání. Jedná se o možnost ovlivnit gushing prostřednictvím postřiků, které jsou aplikovány v konkrétním termínu a při určité teplotě okolí při samotné aplikaci. Aplikace postřiků, v době dozrávání zrna a vysoké teploty okolí, by na základě této hypotézy mohla ovlivnit výskyt gushingu v pivu Hypotéza: Aplikace čisté vody postřikem, v době dozrávání zrna ječmene jarního za teploty minimálně 26 C bude působit jako stresující faktor pro mikroorganismy žijící na obilce. Způsobený šok mikroorganismy donutí k produkci enzymů způsobujících následný Gushing konečném produktu pivu Polní pokus V roce 2010 byl na základě zmíněné teorie proveden první polní pokus. Tento pokus byl proveden v lokalitě Hrubčice. Výsev byl proveden dne a to ve dvou variantách na pozemcích o rozloze 4 m 2. První parcela byla ponechána bez 42

43 ošetření. Druhá parcela byla ošetřena, v termínu postřikem čistou vodou a to v době, kdy okolní teplota dosahovala 29 C. Aplikace byla provedena ručním postřikovačem přímo na klas. Sklizeň obou parcel proběhla dne Následně byly odebrány vzorky k otestování Gushingovým testem. V roce 2011 byl tento pokus založen opět. Výsev byl proveden dne a to opět ve dvou variantách. První parcela byla ošetřena čistou vodou stejným postupem jako předešlý rok. Termín aplikace byl dne při okolní teplotě 31 C. Sklizeň parcel proběhla dne a opět byly odebrány vzorky k otestování Charakteristika oblasti Hrubčice Obec Hrubčice leží asi 8 km jihovýchodním směrem od města Prostějova v okrese Prostějov, kraj Olomoucký. Olomoucký kraj disponuje velmi bohatým zemědělským fondem. Orná půda činí zhruba 40% území kraje, půdy třídy ochrany 1 a 2 zaujímají velkou část z této půdy. (ČSÚ, 2011) Tabulka č. 5. Vybrané ukazatele z Olomouckého kraje - podnebí Průměrná teplota vzduchu ( o C) Olomouc 8,9 8,6 9,0 10,5 10,5 10,0 8,7 Úhrn srážek (mm/rok) Olomouc 510,5 455,2 513,1 475,2 484,8 580,4 734,7 Trvání slunečního svitu (h/rok) Olomouc 1 762, , , , , , ,4 Pramen: Český hydrometeorologický ústav v Praze Popis pracoviště Sladovna v obci Rajhrad původně vznikla jako Rolnická akciová sladovna, jejíž provoz byl zahájen roku Po následném požáru ji koupila firma Moravia, která úspěšně pokračovala ve sladovnické činnosti, až do dalšího požáru koncem druhé světové války. Výroba byla obnovena v roce

44 Rodinný pivovar BERNARD koupil sladovnu v Rajhradu v září roku Sladovna dnes produkuje zhruba 6 tisíc tun tradičního českého sladu, který zpracovává Rodinný pivovar BERNARD v Humpolci při vaření svého nepasterizovaného piva a část prodává obchodním partnerům. Sladovna má vlastní zdroj provozní vody i čistírnu odpadních vod a v současné době patří mezi poslední tradiční humnové sladovny v České republice. Kvalitní sladovnický ječmen nakupuje v okolí Brna, doplňkově i z oblasti Vysočiny. Pro nezbytnou kontrolu kvality vyráběného sladu jsou v laboratoři sladovny prováděna vstupní vyšetření přijímaného zrna, pří kterých se stanovuje objemová hmotnost, podíl předního zrna, zlomky, příměsi, obsah bílkovin, obsah škrobu, vlhkost, plísně a senzorické posouzení. Pro kontrolu hotového sladu se stanovuje vlhkost, rychlost zcukření, barva sladiny, extrakt v sušině sladu, relativní extrakt při 45 C, zaplesnivění, zlomky, příměsi. Nově je zřízena laboratoř, určená výhradně pro stanovení gushingu Přístrojové vybavení Gushingové laboratoře o váha Kern N, o stolní mixér ETA Ergo, o destilační kolona pro výrobu destilované vody, o odstředivka Centrifuge IEC CL40, o elektrický plotnový vařič Tesla EPK 7229, elektrický plotýnkový vařič SENCOR SCP 2251, o elektrická vodní lázeň BM 1115, o třepačky GFL 3016 (3x), o korunkovačka Pomůcky o rtuťový teploměr, o laboratorní sklo - kádinky (800 ml, 600 ml), tyčinky, nálevky, odměrný válec, o filtrační papír (Ø 320 mm, very fast), filtrační aparatura 44

45 4.2 Použitá metodika 4.2.1Použitý test pro stanovení gushingu ječmene a sladu Princip Ke stanovení gushingu ve sladu byl použit třídenní test, vyvinutý v laboratořích Carlsberg, který je vhodný jak pro nesladované zrno, tak pro již hotový slad. Metoda je založena na předpokladu, že markery přepěnění jsou ve vodě rozpustné, aktivní a rozpustné i po povaření a aktivní za podmínek převládajících v pivu (VAAG, et al., 1993). Postup 100g naváženého zrna ječmene, nebo sladu mixujeme 1 min. ve 400ml destilované vody při laboratorní teplotě a maximálních otáčkách mixeru. Vzniklou suspenzi kvantitativně přelijeme do plastových nádob a odstřeďujeme po dobu 5 min a 4000 otáček za min. Po odstředění opatrně slijeme do kádinky o objemu 800ml a varem odpaříme na 200ml. Koagulát odstraníme přes papírový filtr. Tento filtrát vytemperujeme na 20 C a 50 ml vpravíme do lahve chladného (4 10 C) negushingového piva, ze kterého jsme předtím odebrali 50 ml. Z důvodu kontroly se vždy test provádí ve dvou opakováních pro jeden vzorek. Uzavřeme ručně korunkovačkou. Poté pivo pasterizujeme ve vodní lázni 15 min při 65 C. Z důvodů potencionálního výskytu gushingu u piva, určeného k testu, se vždy pasteruje i jedna lahev jako kontrolní vzorek. Po zchlazení lahve třepeme horizontálně 3 dny při 70 kmitech za min. Vyhodnocení Po 3 dnech lahve zvážíme a postavíme do vertikální polohy na 10 min. Po 10 minutách lahve 3x otočíme o 180 a po 30s lahve otevřeme. Osušené lahve i s korunkou opět zvážíme a odečtením hmotnosti piva před otevřením a po otevření zjistíme množství vyřinutého piva (gushing) v ml/500 ml Stanovení obsahu dexynivalenolu a zearalenon (DON, ZON) v ječmeni 45

46 Analýza obsahu deoxynivalenolu a zearalenon, byla provedena v laboratoři Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského v Brně. Pro určení obsahu DON a ZON byla použita kvantitativní imunoenzymatická metoda ELISA Imunoenzymatické metody (ELISA) Imunoenzymatická reakce (ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay) je založena na reakci antigenu (mykotoxinu) s protilátkou, u níž se měří množství navázaných látek pomocí přidání enzymem značeného antigenu či protilátky. Měření se provádí spektrofotometricky. Mykotoxiny zpravidla nevyvolávají imunitní odezvu s tvorbou protilátek, ale působí jako hapteny. To znamená, že k tvorbě protilátek dochází až po navázání na vhodný nosič (např. bílkovina). Imunochemické metody slouží pro screeningové stanovení vybraných mykotoxinů v potravinách a zemědělských komoditách a byli využity i k detekci produktů mykotoxinů s DNA nebo proteiny Metody použité k zpracování výsledků Data získaná při stanovování jednotlivých parametrů byla pro přehlednost zapracována do tabulek a přidána do příloh. V případech, kdy byla nalezena vysoká, nebo z pohledu této práce důležitá, vzájemná souvislost mezi jednotlivými sledovanými znaky, byly pro větší názornost z těchto dat vytvořeny grafy Metody použité ke statistickému zpracování výsledků Pro statistické zpracování bylo použito programů Microsoft Excel 2007 a Statistica 9,0. Pro zpracování dat, naměřených ve sladovně byly použity metody: aritmetického průměru, Dancanův test, Dunnettův test, T-test a popisná statistika. 5 VÝSLEDKY, JEJICH HODNOCENÍ A DISKUSE 5.1 Vliv agrotechniky na gushing 46

47 V roce 2010 byl gushing testován na 24 vzorcích. Pro porovnání vlivu agrotechniky na gushing byl pokus založen ve dvou variantách. První varianta byla ponechána bez ošetření a druhá byla ošetřena čitou vodou. O rok později byl pokus opakován a rozšířen o další vzorky, na celkových 36. Pro každý vzorek bylo provedeno jedno stanovení ve dvou opakováních. V případech, kdy výsledky opakování mezi sebou vykazovaly značné rozdíly, bylo provedeno kontrolní stanovení a to opět ve dvou opakováních. Tím jsme snížili chybu měření a upřesnili výsledek stanovení. V roce 2010 tak bylo stanoveno 48 vzorků neošetřené varianty a 48 vzorků ošetřené varianty. V roce 2011 bylo stanoveno 62 vzorků neošetřené varianty a 62 vzorků ošetřené varianty. Následně bylo opakování vzorku zprůměrováno. Konkrétní čísla jsou uvedena v příloze č. 1, 2. Základní číselná statistika obou let je uvedena v tabulce č. 6 a zobrazena v grafu č. 1. Statistické vyhodnocení v souvislosti gushingu s agrotechnikou bylo provedeno pomocí Duncanova testu, Dunnettovova testu a T-testu. Tyto testy nám potvrdily předpokládanou závislost gushingu s agrotechnikou. Výsledky jsou zpracovány do tabulek č 7, 8. Tabulka č. 6 Základní číselná statistika Proměnná N platných Průměr Minimum Maximum Sm.odch. ošetřené 60 15, ,4 22,17672 neošetřené 60 2, ,5 9,14604 Pramen: Vlastní konstrukce V grafu č. 1 je názorně ukázáno, jak velkého rozdílu ve výskytu gushingu, mezi ošetřenou a neošetřenou variantou. Graf č. 1 Průměr variant 47

48 Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 7 Duncanův test, proměnná ošetřená Přibližné pravděpodobnosti pro post hoc testy Chyba: meziskup. P =,19118, sv = 16,000 č. buňky neošetřená (1) 0,23529 (2) 0, , ,60832 Pramen: Vlastní konstrukce V grafu č. 2 je vidět, že varianty mají malý rozsah intervalu spolehlivosti, čímž se zvyšuje spolehlivost výsledků. Graf č. 2 Interval spolehlivosti 48

49 Pramen: Vlastní konstrukce Dunnettův test, zobrazen v tabulce č. 8, nám potvrdil vzájemnou závislost mezi postřikem dozrávajícího ječmene a teplotou okolního okolí v době postřiku. Pokud je postřik aplikován při teplotě nad 26 C bude působit jako stresový faktor pro mikroorganismy, které začnou produkovat enzymy způsobující Gushing. Tabulka č. 8 Dunnettův test, proměnná neošetřená Pravděpodobnosti pro post hoc testy (2-stranný) č. Chyba: meziskup. PČ = 419,68, sv = 46,000 buňky ošetřená (1) 2, ,00551 Pramen: Vlastní konstrukce T-test byl použit k porovnání, zda výsledky měření v první variantě se výrazně liší od výsledků měření v druhé variantě. Výsledky měření se u obou variant výrazně odlišovaly. V ošetřené variantě byly výsledky mření vyšší což dokazuje, že postřik čistou vodou v období dozrávání ječmene způsobuje větší výskyt Gushinu. Naopak 49

50 v neošetřené variantě byly výsledky měření řádově nižší, což dále potvrzuje vliv postřiku na výskyt Guhing. Výsledky jsou zapsány v tabulkách č. 9, 10 a11. Tabulka č. 9 T-test pro rok 2010,2011 Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 10 T-test pro rok 2010 Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 11 T-test pro rok 2011 Pramen: Vlastní konstrukce 5.2 Vyhodnocení obsahu dexynivalenolu a zearalenon v ječmeni Jak uvádí Sýkorová (2002), přítomnost a množství DON ve vzorcích ječmene a sladu nelze jednoznačně označit za přímý faktor ovlivňující gushing. Z polních pokusů, provedených během let , nebyl zjištěn přímý vztah mezi obsahem DON a gushingem. Z výsledků bylo zjevné, že slady s nízkým obsahem DON mohou mít velmi vysoký gushing a naopak s vysokým obsahem DON žádný gushing (FEIGERL,2011). Přechod mykotoxinů z ječmene do piva je závislý na jejich rozpustnosti a tepelné stabilitě. Produkce DON a ZON v průběhu sladování je velmi různorodá a pravděpodobně závisí na odrůdě ječmene a na technologických podmínkách sladování. Nalezené koncentrace DON a ZON ve sladu se obvykle pohybují na nižších hladinách, než v zrnu ječmene. Ačkoliv DON a ZON je rozpustný ve vodě, nedochází k jeho výraznému úbytku přechodem do máčecích vod během máčení ječmene, ale spíše dochází k jeho další tvorbě během máčení a klíčení. DON a ZON patří mezi inhibitory 50

51 proteinové syntézy, a tudíž může potenciálně ovlivnit i proces klíčení sladu (NESVATBA, HORÁČKOVÁ a ŠUSTA, 2009). Z finančních důvodů nákladnosti analýzy mykotoxinů bylo provedeno pouze jedno stanovení a to v roce Stanovena byla jak ošetřená, tak neošetřená varianta ječmene. Ze stejných důvodů bylo stanovení omezeno na DON, ZON a další mykotoxiny stanoveny nebyly. V tabulce č. 12 jsou uvedeny maximální hodnoty DON a ZON pro je ječmen. Tabulka vychází z Nařízení komise (ES) č. 1881/2006. Tabulka č. 12 Sladovnický ječmen Mykotoxiny Maximální limity µg/kg Deoxynivalenol 1250 Zearalenon 100 Pramen: Nařízení komise (ES) č. 1881/ Sledování Gushing Stanovení DON a ZON V roce 2011 bylo pro gushing stanoveno 36 vzorků ve 2 variantách. Pro finanční náročnost stanovení DON a ZON bylo smícháno všech 36 vzorků. Byly vybrány 3 průměrné vzorky a to pro obě varianty. To znamená, že byly stanoveny 3 vzorky ošetřené varianty a 3 vzorky neošetřené varianty. Výsledky jsou zpravovány do tabulek č. 13, 14, 15, 16. Žádny ze stanovených vzorků nepřekročil maximální limit stanovený pro DON a ZON. Tabulka č. 13 Ošetřená varianta DON Vzorek koncentrace v µg/kg Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 14 Nešetřená varianta DON 51

52 Vzorek koncentrace v µg/kg Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 15 Ošetřená varianta ZON vzorek koncentrace v µg/kg 1 6, , ,772 Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 16 Nešetřená varianta ZON vzorek koncentrace v µg/kg 1 10, , ,547 Pramen: Vlastní konstrukce 5.3 Sledování gushingu ve sladovně Bernard Stanovování gushingu během výroby sladu Ve sladovně Bernard se odebírají vzorky během výroby a to ve fázích, namáčky, prvního hvozdu a druhého hvozdu. Tyto odebrané vzorky jsou posléze analyzovány na výskyt gushingu v gushingové laboratoři a to dvakrát týdně. Pro každý vzorek bylo provedeno jedno stanovení ve dvou opakováních. V případech, kdy výsledky opakování mezi sebou vykazovaly značné rozdíly, bylo provedeno kontrolní stanovení a to opět ve dvou opakováních. Tím jsme snížili chybu měření a upřesnili výsledek stanovení. Výroba byla sledována během roku 2010 a Z obou let je vypracovaná základní statistika, pro možnost porovnání výskytu gushingu. Tab. č. 17, 18. Dále pro lepší názornost jsou data zobrazeny v grafech č. 3,4. Tabulka č. 17 Výskyt gushingu ve sladovně Bernard pro rok

53 Pramen: Vlastní konstrukce Graf č. 3 Výsky gushingu ve sladovně Bernard pro rok 2010 Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 18 Výsky gushingu ve sladovně Bernard pro rok

54 Pramen: Vlastní konstrukce Graf č. 4 Výsky gushingu ve sladovně Bernard pro rok 2011 Pramen: Vlastní konstrukce Stanovení gushingu v závislosti na výrobních procesech 54

55 Ze stanovených vzorků jsme dále vyhodnocovali závislost gushingu na výrobních procesech ve sladovně. A to na namáčce, prvním hvozdu a druhém hvozdu. Výsledky byly zpracovány do tabulek č. 19, 20 a grafu č. 5, 6. Analýza byla provedena v letech 2010 a Z analýzy nevyplívá žádná závislost mezi technologickými operacemi a sklonem ke gushingu. Dále byl proveden Duncanův test, který vyšel negativně a tím potvrdil, že neexistuje závislost mezi technologickými operacemi a gushingem. Tabulka č. 19 Výskyt gushingu ve sladovně Bernard pro rok 2010 Pramen: Vlastní konstrukce Graf č. 5 Výsky gushingu ve sladovně Bernard pro rok 2010 Pramen: Vlastní konstrukce Tabulka č. 20 Výsky gushingu ve sladovně Bernard pro rok

56 Pramen: Vlastní konstrukce Graf č. 6 Výsky gushingu ve sladovně Bernard pro rok 2011 Pramen: Vlastní konstrukce 56